药 学 学 报 Acta Pharmacetica Sinica 2015, 50 (9): 1167 1173 1167 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 研 究 美 洛 昔 康 与 β- 环 糊 精 的 相 互 作 用 1, 王 彩 芬 2 1,, 李 卓 2, 王 小 波 1, 李 海 燕 2 1,, 张 继 稳 2*, 孙 立 新 1* (1. 沈 阳 药 科 大 学, 辽 宁 沈 阳 110016; 2. 中 国 科 学 院 上 海 药 物 研 究 所, 上 海 201203) 摘 要 : 药 物 与 环 糊 精 的 结 合 速 率 常 数 解 离 速 率 常 数 是 药 物 从 给 药 系 统 中 解 离 吸 收 的 基 本 动 力 学 常 数, 但 现 有 研 究 多 集 中 于 结 合 平 衡 常 数 K 本 文 基 于 定 量 亲 和 色 谱 技 术 (qantitative high-performance affinity chromatography), 发 展 了 测 定 药 物 环 糊 精 超 分 子 表 观 解 离 速 率 常 数 (k off,app ) 的 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 方 法 采 用 质 谱 检 测 器, 经 色 谱 峰 拟 合 获 得 不 同 流 速 下 药 物 和 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 在 β- 环 糊 精 柱 上 的 保 留 时 间 与 半 峰 宽, 计 算 药 物 与 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 的 塔 板 高 度 (H R 与 H M,C ); 根 据 药 物 和 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 的 扩 散 系 数 差 异 与 静 态 流 动 相 传 质 阻 抗, 计 算 获 得 理 论 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度 H M,T 以 (H R -H M,T ) 对 k/(1+k) 2 进 行 线 性 回 归, 根 据 斜 率 计 算 得 到 多 流 速 条 件 下 美 洛 昔 康 和 对 照 药 物 ( 对 乙 酰 氨 基 酚 ) 的 k off,app 分 别 为 0.13 ± 0.00 和 4.83 ± 0.10 s 1 根 据 美 洛 昔 康 的 结 合 平 衡 常 数 K (12.53 L mol 1 ), 计 算 得 到 表 观 结 合 速 率 常 数 k on,app 为 1.63 L mol 1 s 1 本 法 简 便 快 速 重 复 性 好, 为 评 价 药 物 与 β- 环 糊 精 相 互 作 用 动 力 学 提 供 了 新 的 方 法 关 键 词 : 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 ; 美 洛 昔 康 ; β- 环 糊 精 ; 解 离 速 率 常 数 中 图 分 类 号 : R917 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 0513-4870 (2015) 09-1167-07 Determination of the interaction kinetics between meloxicam and β-cyclodextrin sing the qantitative high-performance affinity chromatography copled with mass spectrometry WANG Cai-fen 1, 2, LI Zho 1, 2, WANG Xiao-bo 1, LI Hai-yan 2, ZHANG Ji-wen 1, 2*, SUN Li-xin 1* (1. Shenyang Pharmacetical University, Shenyang 110016, China; 2. Shanghai Institte of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China ) Abstract: The association rate constant and dissociation rate constant are important parameters of the drg-cyclodextrin spermolecle systems, which determine the dissociation of drgs from the complex and the frther in vivo absorption of drgs. However, the crrent stdies of drg-cyclodextrin interactions mostly focs on the thermodynamic parameter of eqilibrim constants (K). In this paper, a method based on qantitative high performance affinity chromatography copled with mass spectrometry was developed to determine the apparent dissociation rate constant (k off,app ) of drg-cyclodextrin spermolecle systems. This method was employed to measre the k off,app of meloxicam and acetaminophen. Firstly, chromatographic peaks of drgs and non-retained solte (racil) on β-cyclodextrin colmn at different flow rates were acqired, and the retention time and variance vales were obtained via the fitting the peaks. Then, the plate heights of drgs (H R ) and racil (H M,C ) were calclated. The plate height of theoretical non-retained solte (H M,T ) was calclated based on the differences of diffsion coefficient and the stagnant mobile phase mass transfer between drgs and racil. Finally, the k off,app was calclated from the slope of the regression eqation between (H R -H M,T ) and k/(1+k) 2, 收 稿 日 期 : 2015-01-23; 修 回 日 期 : 2015-03-23. 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (81373358). * 通 讯 作 者 Tel / Fax: 86-21-20231980, E-mail: jwzhang@simm.ac.cn; Tel: 86-24-23986365, Fax: 86-24-23986259, E-mail: slx04@163.com
1168 药 学 学 报 Acta Pharmacetica Sinica 2015, 50 (9): 1167 1173 (0.13 ± 0.00) s 1 and (4.83 ± 0.10) s 1 for meloxicam and acetaminophen (control drg), respectively. In addition, the apparent association rate constant (k on,app ) was also calclated throgh the prodct of K (12.53 L mol 1 ) and k off,app. In smmary, it has been proved that the method established in or stdy was simple, efficiently fast and reprodcible for investigation on the kinetics of drg-cyclodextrin interactions. Key words: qantitative high performance affinity chromatography-mass spectrometry; meloxicam; β- cyclodextrin; dissociation rate constant 环 糊 精 包 合 是 改 善 药 物 水 溶 性 稳 定 性 的 重 要 制 剂 技 术 之 一 [1 3], 在 环 糊 精 (cyclodextrin, CD) 超 分 子 给 药 系 统 中, 药 物 与 环 糊 精 能 发 生 可 逆 性 结 合 解 离, 其 结 合 速 率 常 数 与 解 离 速 率 常 数 能 够 直 接 影 响 药 物 的 释 放 与 吸 收 目 前 有 关 药 物 与 大 分 子 相 互 作 用 的 研 究 方 法 分 为 动 态 法 和 静 态 法 [4], 其 中 静 态 法 无 法 体 现 药 物 与 大 分 子 的 动 态 规 律 动 态 法 中 表 面 等 离 子 共 振 技 术 应 用 较 广 泛, 研 究 中 等 ~ 较 强 相 互 作 用 ( 结 合 常 数 K > 10 5 L mol 1 ) 时, 准 确 度 和 重 现 性 较 好 但 由 于 其 是 直 接 检 测 生 物 传 感 器 表 面 的 小 分 子, 不 适 合 研 究 低 浓 度 或 难 溶 性 小 分 子 以 及 较 弱 ~ 中 等 强 度 相 互 作 用 [5,6] 定 量 亲 和 色 谱 (qantitative high performance affinity chromatography) 将 可 逆 结 合 的 溶 质 与 配 体 中 的 一 方, 与 固 相 载 体 偶 联 后 填 充 制 备 亲 和 柱, 当 溶 质 随 流 动 相 流 经 亲 和 柱 时, 会 与 固 定 相 发 生 选 择 性 相 互 作 用, 据 此 计 算 热 力 学 和 动 力 学 参 数 由 于 可 通 过 多 种 检 测 器 进 行 色 谱 峰 的 检 测, 其 在 低 浓 度 难 溶 性 溶 质, 以 及 较 弱 ~ 中 等 强 度 相 互 作 用, 尤 其 是 解 离 速 率 常 数 的 测 定 方 面 独 具 优 势 [7 9] 美 洛 昔 康 与 对 乙 酰 氨 基 酚 是 临 床 常 用 的 抗 炎 与 解 热 镇 痛 药 物, 对 乙 酰 氨 基 酚 与 β-cd 包 合 后, 溶 解 性 增 大, 并 起 到 缓 释 作 用 从 而 降 低 毒 性 [10] ; 美 洛 昔 康 水 溶 性 差 生 物 利 用 度 低 的 缺 点 限 制 了 其 应 用, 与 β-cd 形 成 包 合 物 可 以 提 高 药 物 的 溶 解 度 和 稳 定 性 ( 已 有 市 售 包 合 物 ), 增 强 其 生 物 利 用 度 [11] 本 文 以 与 环 糊 精 相 互 作 用 动 力 学 性 质 较 清 楚 的 对 乙 酰 氨 基 酚 为 参 照, 在 前 期 以 紫 外 检 测 器 检 测 药 物 测 定 其 与 β- 环 糊 精 相 互 作 用 的 表 观 解 离 速 率 常 数 (k off,app ) 基 础 上 [12,13], 利 用 质 谱 作 检 测 器, 建 立 基 于 塔 板 高 度 校 正 技 术 的 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 法, 获 得 美 洛 昔 康 与 β- 环 糊 精 的 k off,app, 再 结 合 平 衡 常 数 K 计 算 获 得 表 观 结 合 速 率 常 数 k on,app, 评 价 药 物 与 β- 环 糊 精 的 相 互 作 用 动 力 学 基 本 理 论 环 糊 精 及 其 衍 生 物 可 以 与 多 种 客 分 子 形 成 包 合 物, 在 环 糊 精 包 合 物 体 系 中, 药 物 (D) 与 环 糊 精 (CD) 及 包 合 物 (D-CD) 三 者 之 间 存 在 结 合 与 解 离 的 动 态 平 衡 [14] (1) k k on K = (2) off 其 中, 结 合 平 衡 常 数 (K) 是 衡 量 结 合 程 度 的 热 力 学 参 数, 结 合 速 率 常 数 (k on ) 解 离 速 率 常 数 (k off ) 是 反 映 包 合 物 形 成 解 离 的 动 力 学 参 数 峰 轮 廓 (peak profiling) 法 测 定 k off,app 的 定 量 亲 和 色 谱 理 论 峰 轮 廓 法 是 以 常 规 溶 剂 为 流 动 相, 对 低 浓 度 小 体 积 的 溶 质, 采 用 线 性 洗 脱, 测 定 溶 质 的 洗 脱 时 间 和 峰 宽 [7 9], 前 者 反 映 了 主 分 子 与 客 分 子 结 合 的 强 弱, 后 者 与 相 互 作 用 的 动 力 学 过 程 相 关, 具 有 进 样 量 少 (pmol~nmol 水 平 ) 和 易 实 现 高 通 量 测 定 的 特 点 根 据 van Deemter 方 程 [15,16], 导 致 色 谱 峰 展 宽 的 因 素 包 括 涡 流 扩 散 (A 项 ) 纵 向 扩 散 (B 项 ) 和 传 质 阻 抗 (C 项 ) B H= A+ + C (3) H 为 塔 板 高 度, 为 线 速 度, A 项 与 色 谱 柱 的 填 充 均 匀 程 度 和 填 料 的 粒 径 大 小 有 关, B 项 主 要 由 待 测 物 质 的 分 子 扩 散 系 数 决 定, C 项 表 示 由 待 测 物 质 与 固 定 相 间 相 互 作 用 而 导 致 的 色 谱 峰 展 宽, 是 静 态 流 动 相 传 质 阻 抗 (C sm ) 和 固 定 相 传 质 阻 抗 (C s ) 之 和 根 据 Denizot 和 Delaage [17] 的 色 谱 统 计 理 论, 在 实 验 条 件 ( 即 流 动 相 色 谱 柱 等 ) 相 同 的 情 况 下, 对 于 溶 质 和 不 保 留 物 质, 色 谱 峰 展 宽 因 素 中 A 项 B 项 和 C sm 相 近 ; 此 外, 由 于 理 论 不 保 留 物 质 与 固 定 相 间 不 存 在 相 互 作 用, 故 按 照 公 式 (3) 其 固 定 相 传 质 阻 抗 为 零 (C s 为 零 ), C 项 为 C sm 溶 质 和 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度 中, 仅 固 定 相 传 质 C s 不 同, 对 于 给 定 的 亲 和 柱, 有 如 下 公 式 [8,18,19] : H - H = C = 2k R M S 2 koff,app (1 + k) (4) H R 为 溶 质 的 塔 板 高 度, H M 为 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度, k 为 溶 质 的 保 留 因 子 (H R -H M ) 对 k/(1+k) 2 作
王 彩 芬 等 : 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 研 究 美 洛 昔 康 与 β- 环 糊 精 的 相 互 作 用 1169 图, 由 线 性 斜 率 即 可 求 得 k off,app 理 论 不 保 留 物 质 塔 板 高 度 的 计 算 按 照 公 式 (4), 由 于 理 论 不 保 留 物 质 不 与 固 定 相 作 用, C s 为 零, 故 其 van Deemter 方 程 应 为 : BT H M, T = AT + + Csm, T (5) H M,T 为 理 论 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度 ; A T 与 B T 为 理 论 不 保 留 物 质 的 A 项 与 B 项 ; C sm,t 为 理 论 不 保 留 物 质 的 静 态 流 动 相 传 质 阻 抗 但 实 际 测 定 中, 常 规 不 保 留 物 质 如 硝 酸 钠 亚 硝 酸 钠 和 尿 嘧 啶 等, 均 会 与 固 定 相 环 糊 精 发 生 相 互 作 用, 而 且 由 于 其 分 子 尺 寸 较 待 测 物 质 小, 故 其 B 项 也 不 同 于 待 测 物 质 因 此, Denizot 和 Delaage [17] 理 论 中 的 与 待 测 物 质 B 项 相 近 且 不 与 固 定 相 作 用 的 不 保 留 物 质, 仅 是 理 论 上 的, 实 际 不 存 在 因 此, 实 际 测 定 中 常 规 不 保 留 物 质 的 van Deemter 方 程 为 : BC H M, C = AC + + ( Csm,C + Cs, C ) (6) H M,C 为 常 规 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度, A C 和 B C 分 别 为 常 规 不 保 留 物 质 的 A 项 与 B 项, C sm,c 和 C s,c 分 别 为 常 规 不 保 留 物 质 的 静 态 流 动 相 和 固 定 相 传 质 阻 抗 通 过 实 验, 只 能 测 得 公 式 (6) 中 的 H M,C, 公 式 (5) 中 的 H M,T 不 能 够 直 接 通 过 实 验 测 定, 只 能 根 据 H M,C 计 算 得 到 对 于 同 一 根 色 谱 柱, 公 式 (5) 中 的 A T 与 公 式 (6) 中 的 A c 相 同, 因 此 对 于 公 式 (5) 只 需 要 计 算 B T 与 C sm,t 前 期 工 作 中, 本 文 在 已 有 色 谱 理 论 基 础 上, 根 据 药 物 和 不 保 留 物 质 的 扩 散 系 数 差 异 与 静 态 流 动 相 传 质 阻 抗, 对 常 规 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度 H M,C 进 行 校 正, 可 获 得 理 论 不 保 留 物 质 的 H M,T, 即 将 公 式 (5) 转 化 为 公 式 (7): H BC AC + + C λ M,T = sm, T (7) 具 体 而 言, 通 过 拟 合 常 规 不 保 留 物 质 的 van Deemter 方 程, 可 以 得 到 A C 和 B C, 再 根 据 药 物 和 不 保 留 物 质 扩 散 系 数 的 差 异 可 计 算 得 到 校 正 因 子 λ 根 据 色 谱 柱 填 料 的 粒 径 保 留 因 子 及 扩 散 系 数 等 计 算 C sm,t, 将 A C B T 及 C sm,t 代 入 公 式 (7), 即 可 计 算 H M,T [12, 13, ( 详 细 过 程 参 见 文 献 20 22] ) 材 料 与 方 法 仪 器 和 试 剂 Agilent 1260 液 相 色 谱 仪, 包 括 G1312C 型 二 元 输 液 泵 G1367E 型 自 动 进 样 器 G1316A 型 柱 温 箱 G1322A 型 脱 气 机 ( 美 国 Agilent 公 司 ); G6460A 型 三 重 四 极 杆 串 联 质 谱 仪, 配 备 电 喷 雾 电 离 源 (ESI 源 ) 以 及 MassHnter B.03.01 数 据 采 集 软 件 ( 美 国 Agilent 公 司 ); Micro 21R 离 心 机 ( 美 国 Thermo Fisher 公 司 ); β- 环 糊 精 柱 (50 mm 2.1 mm, 5 μm) 由 中 国 科 学 院 大 连 化 学 物 理 研 究 所 提 供 ; 美 洛 昔 康 对 乙 酰 氨 基 酚 和 尿 嘧 啶 ( 纯 度 > 99%) 购 自 大 连 美 仑 生 物 技 术 有 限 公 司 美 洛 昔 康 供 试 品 溶 液 取 美 洛 昔 康 对 照 品 适 量, 加 甲 醇 制 成 约 0.2 mg ml 1 美 洛 昔 康 储 备 溶 液 取 该 储 备 溶 液 适 量, 用 流 动 相 稀 释 成 约 2.0 μg ml 1, 作 为 美 洛 昔 康 供 试 品 溶 液 对 乙 酰 氨 基 酚 供 试 品 溶 液 取 对 乙 酰 氨 基 酚 对 照 品 适 量, 加 甲 醇 制 成 约 1.0 mg ml 1 对 乙 酰 氨 基 酚 储 备 溶 液 取 该 储 备 溶 液 适 量, 用 流 动 相 稀 释 成 约 0.5 μg ml 1, 作 为 对 乙 酰 氨 基 酚 供 试 品 溶 液 尿 嘧 啶 取 尿 嘧 啶 对 照 品 适 量, 加 水 制 成 约 1.0 mg ml 1 尿 嘧 啶 储 备 溶 液 取 该 储 备 溶 液 适 量, 用 流 动 相 稀 释 成 约 0.1 μg ml 1, 作 为 尿 嘧 啶 供 试 品 溶 液 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 β- 环 糊 精 柱 (50 mm 2.1 mm, 5 μm); 流 动 相 为 10 mmol L 1 NH 4 Ac (ph 6.80) 乙 腈 (83 17); 流 速 为 0.3 0.4 0.5 和 0.6 ml min 1 ; 进 样 量 为 5 μl; 柱 温 为 25 质 谱 条 件 采 用 电 喷 雾 离 子 源 (ESI 源 ), 离 子 检 测 方 式 为 多 反 应 监 测 (MRM), 干 燥 气 (N 2 ) 流 速 为 8 L min 1, 干 燥 气 温 度 为 300 ; 鞘 气 (N 2 ) 流 速 为 10 L min 1, 鞘 气 温 度 为 350 ; 雾 化 气 压 力 为 310 kpa; 碎 裂 电 压 和 碰 撞 能 量 分 别 为 110 V 和 4 ev ( 美 洛 昔 康 ) 122 V 和 16 ev ( 对 乙 酰 氨 基 酚 ) 和 80 V 和 13 ev ( 尿 嘧 啶 ); 用 于 定 量 分 析 的 离 子 反 应 分 别 为 m/z 350 286 ( 美 洛 昔 康 ) m/z 152 110 ( 对 乙 酰 氨 基 酚 ) 和 m/z 111.1 42 ( 尿 嘧 啶 ) k off,app 的 测 定 以 美 洛 昔 康 为 测 定 药 物, 对 乙 酰 氨 基 酚 为 对 照 药 物, 尿 嘧 啶 为 常 规 不 保 留 物 质, 分 别 于 不 同 流 速 (0.3 0.4 0.5 和 0.6 ml min 1 ) 下 进 样 分 析, 采 集 其 在 β- 环 糊 精 柱 上 的 色 谱 峰 (n = 3) 采 用 Peakfit 4.12 软 件, 按 照 指 数 修 正 的 高 斯 分 布 (EMG) 函 数, 对 色 谱 峰 进 行 拟 合 ( 拟 合 相 关 系 数 > 0.99), 得 到 保 留 时 间 和 半 峰 宽, 计 算 对 应 的 塔 板 高 度 采 用 Origin 8SR4 软 件, 根 据 van Deemter 方 程, 对 尿 嘧 啶 的 线 速 度 与 塔 板 高 度 H M,C 的 关 系 进 行 拟 合, 得 到 B C 和 (C sm,c +C s,c ) 由 Wilke-Chang 方 程 可 知, 色 谱 条 件 相 同 ( 即 溶 剂 相 同 ) 时, λ 为 药 物 与 尿 嘧 啶 正 常 沸 点 摩 尔 体 积 2/3 次 幂 (V 2/3 [12, ) 的 比 值 13] 再 根 据 β- 环 糊 精 柱 填 料 粒 径 d p (5 μm), 得 到 C sm,t ( 详 见 参 考 文
1170 药 学 学 报 Acta Pharmacetica Sinica 2015, 50 (9): 1167 1173 [12, 献 13] ), 进 而 由 公 式 (7) 计 算 得 到 H M,T 最 后, 以 k/(1+k) 2 为 横 坐 标, H R -H M,T 为 纵 坐 标, 进 行 线 性 回 归, 斜 率 即 为 2/k off,app 结 果 与 讨 论 1 理 论 不 保 留 物 质 塔 板 高 度 H M,T 的 计 算 药 物 环 糊 精 超 分 子 系 统 中, 环 糊 精 与 小 分 子 的 作 用 弱 (K < 10 5 L mol 1 ) 结 合 范 围 广 特 异 性 相 对 较 差, 主 要 体 现 在 环 糊 精 与 常 规 色 谱 不 保 留 物 质 均 有 相 互 作 用 [23], 导 致 实 际 色 谱 测 定 中 难 以 找 到 与 环 糊 精 不 发 生 相 互 作 用 的 不 保 留 物 质, 仅 是 理 论 存 在 的 因 此, 本 文 对 常 规 定 量 亲 和 色 谱 法 进 行 改 进, 通 过 测 定 常 规 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度, 对 其 进 行 校 正, 获 得 理 论 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度, 使 定 量 亲 和 色 谱 法 可 以 应 用 于 药 物 环 糊 精 超 分 子 体 系 的 k off,app 测 定 通 过 色 谱 测 定 色 谱 峰 拟 合 获 得 了 不 同 流 速 条 件 下 (0.3 0.4 0.5 0.6 ml min 1 ) 美 洛 昔 康 的 塔 板 高 度 (H R ) 与 尿 嘧 啶 的 塔 板 高 度 (H M,C ) 图 1 为 塔 板 高 度 H 与 线 速 度 的 关 系 图 对 于 美 洛 昔 康, 随 着 线 速 度 的 增 加, 其 塔 板 高 度 H R 由 0.028 3 cm 增 加 到 0.055 0 cm, 且 H R 与 线 性 关 系 良 好 (r = 0.994), 表 明 固 定 相 传 质 阻 抗 是 导 致 色 谱 峰 展 宽 的 主 要 因 素 但 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 的 塔 板 高 度 H M,C 明 显 小 于 美 洛 昔 康 的 H R, 且 随 着 线 速 度 的 增 加, H M,C 虽 有 增 加, 但 幅 度 不 大 ( 在 0.009 0~0.015 0 cm 内 ), H M,C 与 之 间 线 性 关 系 相 对 较 差 (r = 0.980) 根 据 公 式 (3) [15, 16], 美 洛 昔 康 与 β- 环 糊 精 柱 的 相 互 作 用 明 显 强 于 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 根 据 van Deemter 方 程, 对 美 洛 昔 康 和 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 的 H- 关 系 进 行 了 拟 合 ( 表 1) 美 洛 昔 康 和 不 保 留 物 质 尿 嘧 啶 的 van Deemter 方 程 拟 合 结 果 中, C 项 均 大 于 A 项 B 项, 分 别 是 0.194 4 和 0.071 7 cm, 表 Table 1 Fitting reslts of the van Deemter eqation for meloxicam and racil on β-cyclodextrin colmn Parameter Meloxicam Uracil A 0.003 2 0.011 5 B 0.000 4 0.001 6 C 0.194 4 0.071 7 Adj. R 2 0.962 5 0.997 6 明 它 们 的 塔 板 高 度 (H) 主 要 由 药 物 与 β- 环 糊 精 结 合 的 动 力 学 过 程 贡 献 理 论 不 保 留 物 质 应 不 与 β- 环 糊 精 发 生 相 互 作 用, 塔 板 高 度 (H M,T ) 中 C 项 应 比 较 小 或 接 近 于 零, 但 尿 嘧 啶 的 van Deemter 方 程 中 以 C 项 为 主, 因 此 有 必 要 根 据 公 式 (7) 对 尿 嘧 啶 的 塔 板 高 度 H M,C 进 行 校 正, 获 得 理 论 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度 H M,T 此 外, 表 1 中 尿 嘧 啶 的 B 项 ( 大 于 美 洛 昔 康 的 B 项 约 4 倍 ), 校 正 后 为 0.000 8 cm 2 s 1, 接 近 美 洛 昔 康 的 B 项, 进 一 步 说 明 由 于 尿 嘧 啶 分 子 量 小, 扩 散 系 数 D 较 大, 故 B 项 对 尿 嘧 啶 的 色 谱 峰 展 宽 贡 献 较 大, 需 要 校 正 2 单 流 速 条 件 下 k off,app 的 测 定 当 流 速 由 低 到 高 变 化 时, 美 洛 昔 康 对 乙 酰 氨 基 酚 在 β- 环 糊 精 柱 上 的 保 留 逐 渐 减 弱, 保 留 时 间 t R 逐 渐 减 小, 分 别 为 41.12~21.28 min 和 1.31~0.65 min; 色 谱 峰 变 窄, 半 峰 宽 W 1/2 逐 渐 降 低, 分 别 为 7.28~ 5.26 min 和 0.16~0.11 min ( 图 2) Figre 2 Typical mltiple reaction monitoring chromatograms for drgs on β-cyclodextrin colmn at different flow rates. A: Meloxicam; B: Acetaminophen Figre 1 Plate heights for meloxicam and racil on β-cyclodextrin colmn. : Plate heights for meloxicam (H R); : Plate heights for racil (H M,C); : Plate heights for theoretical non-retained sbstance (H M,T); n = 3, x ± s 在 计 算 得 到 H M,T 的 基 础 上, 根 据 公 式 (4) 可 计 算 k off,app 不 同 流 速 条 件 下 (0.3 0.4 0.5 和 0.6 ml min 1 ), 在 β- 环 糊 精 柱 上 保 留 强 出 峰 晚 的 美 洛
王 彩 芬 等 : 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 研 究 美 洛 昔 康 与 β- 环 糊 精 的 相 互 作 用 1171 昔 康, 其 k off,app 分 别 为 0.18 ± 0.01 0.17 ± 0.01 0.15 ± 0.01 和 0.15 ± 0.00 s 1, 对 乙 酰 氨 基 酚 的 k off,app 分 别 为 14.72 ± 0.29 9.52 ± 0.43 7.98 ± 0.28 和 7.25 ± 0.24 s 1 ( 表 2) 上 述 数 据 表 明, 单 流 速 计 算 k off,app 时, 随 着 流 速 增 加, 美 洛 昔 康 对 乙 酰 氨 基 酚 与 β- 环 糊 精 相 互 作 用 的 k off,app 逐 渐 减 小 ( 图 3), 由 此 可 见, 仅 通 过 单 流 速 测 定 k off,app, 结 果 误 差 较 大 3 多 流 速 条 件 下 k off,app 的 测 定 根 据 公 式 (4), 以 美 洛 昔 康 0.3 0.4 0.5 0.6 ml min 1 4 个 流 速 条 件 下 的 H R -H M 对 (k)/(1+k) 2 作 图 ( 图 4), 线 性 关 系 良 好 ( 相 关 系 数 为 0.992), 直 线 斜 率 为 15.70 ± 0.54, 截 距 为 0.01 ± 0.00 ( 接 近 于 零 ), 进 一 Table 2 The k off,app vales of meloxicam and acetaminophen by the single and mltiple flow rate methods. n = 3, x ± s k off,app /s 1 Method /cm s 1 Meloxicam Acetaminophen Single flow rate 0.147 6 0.18 ± 0.01 14.72 ± 0.29 0.197 2 0.17 ± 0.01 9.52 ± 0.43 0.246 5 0.15 ± 0.01 7.98 ± 0.28 0.296 6 0.15 ± 0.00 7.25 ± 0.24 Mltiple flow rate 0.13 ± 0.00 4.83 ± 0.10 Figre 3 Effect of the flow rate on the k off,app determined by the single flow rate method. n = 3, x ± s Figre 4 Plot of (H R-H M,T) verss (k)/(1+k) 2 according to Eq. 4 for injections of meloxicam and racil on β-cyclodextrin colmn [the fitting eqation is y = (15.70 ± 0.54) x (0.01 ± 0.00)], with the correlation coefficient of 0.992, n = 3 步 表 明 美 洛 昔 康 的 塔 板 高 度 主 要 受 固 定 相 传 质 阻 抗 影 响 根 据 直 线 的 斜 率 可 计 算 美 洛 昔 康 与 β- 环 糊 精 相 互 作 用 的 k off,app, 即 多 流 速 条 件 下 的 k off,app 为 0.13 ± 0.00 s 1 由 于 流 速 对 k off,app 的 测 定 结 果 有 一 定 影 响, 本 文 考 察 了 对 乙 酰 氨 基 酚 的 流 速 范 围 (0.2~0.8 ml min 1 ) 是 否 适 用 于 美 洛 昔 康 结 果, 由 于 美 洛 昔 康 与 环 糊 精 作 用 相 对 较 强, 流 速 为 0.3 ml min 1 时, 美 洛 昔 康 的 保 留 时 间 已 约 为 41 min, 半 峰 宽 约 为 7 min, 当 流 速 为 0.2 ml min 1 时, 已 不 能 将 药 物 很 好 洗 脱, 且 溶 质 与 β- 环 糊 精 的 相 互 作 用 会 达 到 平 衡, 不 能 反 映 其 动 力 学 过 程 ; 当 流 速 为 0.8 ml min 1 时, 则 柱 压 较 高, 会 损 耗 色 谱 柱 的 寿 命 因 此, 考 虑 到 实 验 效 率 及 色 谱 柱 寿 命 两 方 面 因 素, 选 择 0.3 0.4 0.5 和 0.6 ml min 1 进 行 测 定 不 同 药 物 之 间 进 行 推 广 时, 以 能 把 药 物 洗 脱 下 来, 又 具 有 可 以 接 受 的 柱 压 为 主 要 原 则, 考 虑 到 误 差 计 算 时 涉 及 到 线 性 回 归, 应 3 个 流 速 进 行 测 定 此 外, 本 文 对 比 了 单 流 速 与 多 流 速 的 测 定 结 果 ( 表 2), 单 流 速 法 中 高 流 速 的 测 定 结 果 与 多 流 速 法 接 [18, 19] 近, 与 文 献 结 果 一 致 以 弱 保 留 的 对 乙 酰 氨 基 酚 为 例, 在 0.3 ml min 1 时 k off,app 是 14.72 ± 0.29 s 1, 约 为 高 流 速 结 果 (7.25 ± 0.24 s 1 ) 的 2 倍, 为 多 流 速 拟 合 结 果 (4.83 ± 0.10 s 1 ) 的 3 倍, 差 异 较 大 考 虑 到 上 述 流 速 的 影 响, 对 于 本 文 中 的 β- 环 糊 精 柱 (50 mm 2.1 mm, 5 μm), 单 流 速 测 定 时 0.6 ml min 1 可 获 得 相 对 较 为 准 确 可 靠 的 k off,app [24] 文 献 报 道 采 用 毛 细 管 电 泳 (ECEEM) 方 法, 测 定 4 种 非 甾 体 抗 炎 药 与 α-cd β-cd 的 动 力 学 常 数 本 文 结 果 (k off,app 在 0.13~14.72 s 1 之 间 ) 与 ECEEM 法 测 定 得 到 的 结 果 (k off,app 在 4.3~33 s 1 之 间 ) 较 为 接 近 [25], 表 明 本 法 k off,app 测 定 结 果 准 确 可 靠 由 于 对 乙 酰 氨 基 酚 在 前 期 实 验 中 对 样 品 浓 度 流 速 流 动 相 组 成 等 因 素 研 究 的 比 较 深 入, 且 保 留 时 间 短, 故 作 为 内 部 参 照 对 象, 用 于 柱 效 的 监 控 本 文 测 得 对 乙 酰 氨 基 酚 的 k off,app 为 (4.83 ± 0.10 s 1 ), 较 前 期 测 定 结 果 相 对 偏 大 [ 前 期 以 10 mmol L 1 NH 4 Ac 为 流 动 相 (ph 6.80), 紫 外 检 测 器, 多 流 速 法 测 得 对 乙 酰 氨 基 酚 的 k off,app 值 为 1.82 ± 0.01 s 1 [12] ] 原 因 是 本 文 为 更 好 地 洗 脱 美 洛 昔 康, 流 动 相 中 加 入 了 17% 乙 腈, 有 机 溶 剂 的 添 加 会 使 k off,app 增 大 [13] 本 文 结 果 表 明 已 建 立 的 基 于 塔 板 高 度 校 正 技 术 的 定 量 亲 和 色 谱 法, 除 适 用 于 紫 外 检 测 器 外, 同 样 适 用 于 质 谱 检 测, 大 大 扩 展 了 可 检
1172 药 学 学 报 Acta Pharmacetica Sinica 2015, 50 (9): 1167 1173 测 药 品 的 范 围 同 时, 高 灵 敏 度 能 降 低 供 试 品 浓 度, 有 利 于 延 长 β- 环 糊 精 色 谱 柱 的 使 用 寿 命, 同 时 也 为 多 种 药 物 k off,app 的 同 时 测 定 奠 定 了 理 论 基 础 动 力 学 参 数 k on,app 表 示 药 物 与 β- 环 糊 精 结 合 快 慢 的 正 向 结 合 速 率 常 数, k off,app 表 示 反 向 解 离 速 率 常 数, 结 合 平 衡 常 数 K 则 反 映 药 物 与 β- 环 糊 精 间 亲 和 能 力 的 大 小 [26] 本 文 测 得 美 洛 昔 康 在 ph 为 6.80 温 度 为 25 条 件 下, k off,app 为 0.13 ± 0.00 s 1, K 为 12.53 L mol 1 ( 由 相 溶 解 度 法 测 定 [27] ), 通 过 公 式 (1) 计 算 k on,app 为 1.63 L mol 1 s 1 结 论 本 文 基 于 定 量 亲 和 色 谱 技 术, 对 常 规 不 保 留 物 质 的 塔 板 高 度 进 行 了 校 正, 发 展 了 测 定 药 物 -β- 环 糊 精 超 分 子 表 观 解 离 速 率 常 数 k off,app 的 定 量 亲 和 色 谱 质 谱 方 法, 测 得 多 流 速 条 件 下 美 洛 昔 康 的 k off,app 为 0.13 ± 0.00 s 1, 进 而 得 到 表 观 结 合 速 率 常 数 k on,app 为 1.63 L mol 1 s 1 利 用 质 谱 检 测 器 高 灵 敏 度 的 优 点, 大 大 降 低 了 待 测 物 质 的 进 样 浓 度, 有 利 于 延 长 色 谱 柱 的 使 用 寿 命 本 法 简 便 快 速 重 复 性 好, 为 评 价 药 物 与 β- 环 糊 精 相 互 作 用 动 力 学 提 供 了 新 的 方 法 References [1] Bai XL, Gao YL. Combined effect of cosolvent and cyclodextrin on solbilization of insolble drgs [J]. Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2006, 41: 950 955. Acta [2] Xia Y, Qi LY, Jin Y. Preparation and characterization of indomethacin/poly(n-isopropylacrylamide)-β-cyclodextrin complex with temperatre-sensitivity [J]. ( 药 学 学 报 ), 2005, 40: 187 192. Acta Pharm Sin [3] Li X, Go Z, Hao JB, et al. Synergetic taste masking of lipid coating and β-cyclodextrin inclsion [J]. 学 学 报 ), 2014, 49: 392 398. Acta Pharm Sin ( 药 [4] Banker MJ, Clark TH. Plasma/serm protein binding determinations [J]. Crr Drg Metab, 2008, 9: 854 859. [5] He XY, Coombs D, Myszka DG, et al. A theoretical and experimental stdy of competition between soltion and srface receptors for ligand in a biacore flow cell [J]. Math Biol, 2006, 68: 1125 1150. Bll [6] Edwards DA. Refining the measrement of rate constants in the BIAcore [J]. Math Biol, 2004, 49: 272 292. [7] Tong ZH, Hage DS. Characterization of interaction kinetics between chiral soltes and hman serm albmin by sing high-performance affinity chromatography and peak profiling [J]. J Chromatogr A, 2011, 1218: 6892 6897. [8] Schiel JE, Hage DS. Kinetic stdies of biological interactions by affinity chromatography [J]. J Sep Sci, 2009, 32: 1507 1522. [9] Hage DS, Angizola JA, Bi C, et al. Pharmacetical and biomedical applications of affinity chromatography: recent trends and developments [J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 69: 93 105. [10] Zhang H. Electrochemical and florescence spectral stdy on inclsion complexes of p-acetaminophen with β-cyclodextrin [J]. J Ningxia Univ Nat Sci ( 宁 夏 大 学 学 报 自 然 科 学 ), 2011, 32: 258 261. [11] Wang RL, Sn TJ, Pei XL, et al. Inclsion Interaction of meloxicam with β-cyclodextrin derivatives [J]. Chin J Appl Chem ( 应 用 化 学 ), 2008, 25: 1221 1224. [12] Li HY, Ge JW, Go T, et al. Determination of the kinetic rate constant of cyclodextrin spramoleclar systems by high performance affinity chromatography [J]. J Chromatogr A, 2013, 1305: 139 148. [13] Wang CF, Ge JW, Zhang JW, et al. Mltianalyte determination of the kinetic rate constants of drg-cyclodextrin spermolecles by high performance affinity chromatography [J]. J Chromatogr A, 2014, 1359: 287 295. [14] Bohne C. Spramoleclar dynamics stdied sing photophysics [J]. Langmir, 2006, 22: 9100 9111. [15] Kirkp L, Foot M, Mlholland M. Comparison of eqations describing band broadening in high-performance liqid chromatography [J]. J Chromatogr A, 2004, 1030: 25 31. [16] Walker EA, Palframan JF. Techniqes in gas chromatography. 2. Developments in van Deemter rate theory of colmn performance a review [J]. Analyst, 1969, 94: 609. [17] Denizot FC, Delaage MA. Statistical-theory of chromatography-new otlooks for affinity chromatography [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1975, 72: 4840 4843. [18] Yoo MJ, Hage DS. Evalation of silica monoliths in affinity microcolmns for high-throghpt analysis of drg-protein interactions [J]. J Sep Sci, 2009, 32: 2776 2785. [19] Hage DS, Angizola J, Barnaby O, et al. Characterization of drg interactions with serm proteins by sing highperformance affinity chromatography [J]. Crr Drg Metab, 2011, 12: 313 328. [20] Wilke CR, Chang P. Correlation of diffsion coefficients in dilte soltions [J]. Am Inst Chem Eng, 1955, 1: 264 270. [21] Poling BE, Prasnitz JM, John Pal OC. The Properties of Gases and Liqids: Chapter for [M]. 5th ed. New York: Pressre-Volme-Temperatre Relationships of Pre Gases and
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