项目编号 : 项目类别 : 农业转基因生物安全评价申报书项目名称 : 转 dmo 基因抗麦草畏除草剂大豆 MON 进口用作加工原料的安全证书申请单位 : 孟山都远东有限公司

项目编号 : 项目类别 : 农业转基因生物安全评价申报书转 dmo 基因抗麦草畏除草剂大豆 MON 87708 进口用作加工原料的安全证书 ( 上册 : 申请书正文 ) 孟山都远东有限公司 2015 年 10 月 26 日中华人民共和国农业部制

项目编号 : 项目类别 : 农业转基因生物安全评价申报书项目名称 : 转 dmo 基因抗麦草畏除草剂大豆 MON 87708 进口用作加工原料的安全证书申请单位 : 孟山都远东有限公司地址 : 北京市朝阳区曙光西里甲 5 号院凤凰置地广场 F 座 8 层邮政编码 :100028 填报日期 :2015 年 10 月 26 日中华人民共和国农业部制

孟山都公司文件 2015 孟山都公司版权所有本申请书受中华人民共和国著作权法世界知识产权组织 (WIPO) 著作权公约和 WIPO 表演及录音制品公约的保护本申请书及其附带材料仅供受理的政府监管机构使用, 并仅用于支持孟山都公司的相应申请除非相关法律法规及政府主管部门另行规定, 其他任何对本申请书及其附带资料的其他应用拷贝及包括互联网公布在内的传播都必须事先得到孟山都公司的书面同意本申请中描述的或附带的知识产权信息以及材料已经由孟山都公司申报专利或者获得专利, 为孟山都公司所有孟山都公司提交本申请书不表示孟山都公司将本申请书中描述或包含的材料信息或知识产权授权给其他任何个人或实体

填写说明 1. 在填写申报书之前, 应认真阅读农业转基因生物安全管理条例农业转基因生物安全评价管理办法农业转基因生物进口安全管理办法等有关法规, 了解相关要求 2. 此申报书同样适用于法规规定的报告类实验研究和中间试验的报告, 名称分别改为农业转基因生物实验研究报告书和农业转基因生物中间试验报告书 3. 申报书内容应当包括以下部分 : 申请表项目内容摘要工作目的和意义国内外研究的相关背景资料安全性评价试验方案相关附件资料本单位农业转基因生物安全小组审查意见本单位审查意见所在省 ( 市自治区 ) 的农业行政主管部门的审查意见 4. 申请实验研究的, 申请表按表 2 填写, 项目名称应包含转基因性状受体生物名称实验研究所在省 ( 市自治区 ) 名称和实验研究阶段等内容, 如转基因抗虫棉花在河北省的实验研究一份申报书只能包含同一物种的受体生物和相同的转基因性状安全性评价可不填写试验方案包括研究目标外源基因的名称和来源载体构建图谱转化方法和规模地点安全控制措施等相关附件资料包括法人证书和营业执照的复印件, 若涉及合作项目, 应提交双方合作或转让协议等所在省 ( 市自治区 ) 的农业行政主管部门的审查意见可不填写, 申报材料报送农业部时, 抄送实验研究所在省 ( 市自治区 ) 的农业行政主管部门 5. 申请中间试验的, 申请表按表 2 填写申报书中安全性评价试验方案和相关附件资料依照农业转基因生物安全评价管理办法附录 I II III 要求逐条填写所在省 ( 市自治区 ) 级农业行政主管部门的审查意见可不填写, 申报材料报送农业部时, 抄送中间试验所在省 ( 市自治区 ) 级农业行政主管部门 6. 申请环境释放和生产性试验的, 申请表按表 2 填写 ; 申报书中安全性评价试验方案和相关附件资料依照农业转基因生物安全评价管理办法附录 I II III 要求逐条填写对于已批准过的环境释放或生产性试验, 在试验结束后, 若同一转基因生物在原批准地点以相同规模重复试验, 在申报时安全性评价部分可省略 7. 申请农业转基因生物安全证书的, 申请表按表 3 填写 ; 申报书中安全性评价和相关附件资料依照农业转基因生物安全评价管理办法附录 I II III 要求逐条填写, 试验方案不用填写 ; 转基因植物的品种命名应符合农业植物品种命名规定 ; 首次申请农业转基因生物品种 ( 或品系 ) 生产应用安全证书的, 需提供农业转基因生物品种 ( 或品系 ) 生产应用综合评价报告, 主要包括对我国生产贸易社会等方面影响 8. 首次申请农业转基因生物生产性试验和安全证书的, 在申请截止日 30 个工作日前提供所申报转基因生物活性样品和技术资料样品要求 : 符合要求的, 有活性的植物种子 2.5kg, 动物 5ml 血样或 3g 组织各三份, 微生物 3 批次, 各 10 管样品技术资料要求 : 申请生产性试验提供外源片段整合进基因组的 Southern 杂交结果拷贝数及检测方法等 ; 申请安全证书提供外源插入片段信息及转化体特异性 PCR 检测方法等 9. 申报书应当用中文填写, 一式十份, 一律使用 A4 纸, 正文用小四宋体打印, 标准字间距和单倍行距, 并提供光盘对于不符合要求的申报书, 不予受理 10. 申请者可以注明哪些资料需要保密并说明理由 11. 受理时间 : 每年 3 次, 截止日期分别为 3 月 1 日 7 月 1 日和 11 月 1 日 12. 受理单位 : 农业部行政审批综合办公室科教窗口地址 : 北京市朝阳区农展馆南里 11 号邮政编码 :100125 收款单位 : 农业部科技发展中心 ; 开户行 : 中信银行北京朝阳支行 ; 帐号 :7111110189800000419

目录安全评价技术报告目录... I 保密商业资料 (CBI) 声明... III 农业部关于 MON 87708 的批复信函... IV 孟山都公司关于农业部批复信函的说明... VIII 一申请表... 1 二项目内容摘要... 3 三工作目的和意义... 7 四国内外研究的相关背景材料... 9 五安全性评价... 13 1 受体植物的安全性评价... 13 2 基因操作的安全性评价... 30 3 转基因植物的安全性评价... 70 4 转基因植物产品的安全性评价... 149 六相关附件资料... 164 七本单位农业转基因生物安全小组审查意见... 315 八本单位审查意见... 316 九所在省 ( 市自治区 ) 的农业行政主管部门的审查意见... 317

安全评价技术报告目录 ( 所有技术报告附于申请书中下册, 页码独立编排未与上册正文部分衔接 ) 申请书中册编号报告题目页码报告 1: 报告 2: 报告 3: 报告 4: 报告 5: 报告 6: 报告 7: 报告 8: 报告 9: 报告 10 报告 11: 11a 抗麦草畏大豆 MON 87708 的分子生物学特性分析 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0023278( 为 MSL0022670 的修订版本 )) 2008 年美国田间试验生产的 MON 87708 大豆组织中总 DMO 蛋白表达水平评价 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0022510) 抗麦草畏大豆 MON 87708 多个世代叶片样品中 DMO 蛋白的 Western 印迹分析 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0021459) 2008 年美国和加拿大田间试验中耐麦草畏大豆 MON 87708 的表型特性及环境互作影响评价 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0022920 ( 为 MSL0022814 的修订版本 )) MON 87708 大豆种子中纯化分离的麦草畏单加氧酶 (DMO) 的特性鉴定 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0022497) 用 AD_2014 TOX_2014 PRT_2014 EST_2014 NT_2014 和 NR_2014 数据库对 MON 87708 的生物信息学分析 ( 孟山都公司研究报告 :RAR-2014-0112) MON 87708 大豆产生的麦草畏单加氧酶蛋白 (DMO) 对小鼠进行的急性经口毒性研究 ( 孟山都公司研究编号 :CRO-09-419) 麦草畏单加氧酶 (DMO) 蛋白在模拟胃液 (SGF) 和模拟肠液 (SIF) 中的体外消化率评价 ( 孟山都公司研究报告 : MSL0022502) 加热处理对麦草畏单加氧酶 (DMO) 功能活性的影响 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0023043) 用大豆过敏病人血清进行的 MON 87708 对照和参考品种与人类 IgE 结合的定量 ELISA 分析 ( 孟山都公司研究报告 : MSL0022638) MON 87708 大豆组成成份分析 2008 年美国田间试验种植的 MON 87708 秸秆和籽粒的营养成份分析 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0022378) <1> <79> <109> <135> <296> <362> <397> <508> <562> <590> <642> I

申请书下册编号报告题目页码报告 11: MON 87708 大豆组成成份分析 11b 11c 11d 报告 12 报告 13 报告 14 报告 15 报告 16 对 2008 年美国田间试验种植的 MON 87708 大豆秸秆和籽粒成份数据进行的第二次统计分析报告 ( 孟山都公司研究报告 : RAR-10-407) 2008 年美国种植的 MON 87708 籽粒材料矿物质和 B 族维生素的分析 ( 孟山都公司研究报告 :RAR-2011-0484) 2008 年美国种植的 MON 87708 大豆种子的维生素 K 1 分析 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0026970) 大肠杆菌产 MON 87708 麦草畏单加氧酶 (MON 87708 DMO) 的小鼠 28 天经口饲喂 ( 饲料 ) 研究 ( 孟山都公司研究报告 : WIL-50372) 用于 28 天饲喂研究的大肠杆菌表达 DMO 和 DMO+27 蛋白与植物表达蛋白的等同性分析 ( 孟山都公司研究报告 : RAR-2012-0153) 转基因大豆 MON 87708 的食用安全性检测 ( 农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心 ( 北京 )) 转基因大豆 MON 87708 的抗营养因子检测转基因大豆 MON 87708 的 90 天大鼠喂养试验转基因大豆 MON 87708 的环境安全性检测 ( 农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心 ( 长春 )) MON 87708 喷施麦草畏除草剂后大豆籽粒豆粕和豆油中的残留量 ( 孟山都公司研究报告 :MSL0026428) <894> <1026> <1067> <1128> <1195> <1209> <1236> <1273> 报告 17 MSL0026197 中大肠杆菌来源 MON 87708 DMO 与 MON 87708 来源 MON 87708 DMO 的比较 ( 孟山都公司研究报告 : RAR-2015-0242) <1285> 报告 18 报告 19 大肠杆菌 MON 87708 DMO 蛋白灌胃对 CD-1 小鼠的急性毒性研究 -2000mg/kg bw( 孟山都公司研究报告 :MSL0026197) 大肠杆菌 MON 87708 DMO 蛋白灌胃对 CD-1 小鼠的急性毒性研究 -5000mg/kg bw( 孟山都公司研究报告 :MSL0026776) <1307> <1514> II

保密商业资料 (CBI) 声明本申请书包含了许多属于孟山都公司开发并拥有的商业保密资料 (CBI, Confidential Business Information) 这些商业保密资料 (CBI) 是由孟山都公司投入巨大的人力物力, 经过长时间的研究获得的, 包括研究路线的制定各种表达调控元件的 DNA 序列遗传操作策略和各种安全评价的数据等资料孟山都公司目前只向世界各国农业转基因生物行政主管部门提交这些商业保密资料, 用于法规安全评价和审批一旦孟山都公司的竞争对手获得这些资料, 竞争对手将会以很少人力物力投入在很短的时间内开发出类似 MON 87708 的相应产品, 这对孟山都公司来说是不公平的孟山都公司在中国国内外面临着许多技术实力很强的竞争对手因此, 孟山都公司依据农业转基因生物安全评价管理办法第三章第二十七条的有关规定以及本申请书的填写说明, 要求对本申请书的商业保密资料进行保密 III

农业部关于 MON 87708 的批复信函一 2015 年 10 月农业部批复信函 IV

二 2015 年 6 月农业部批复信函 V

三 2015 年 1 月农业部批复信函 VI

四 2013 年 6 月农业部批复信函 VII

孟山都公司关于农业部批复信函的说明一孟山都公司对 2015 年 10 月农业部批复信函的回复说明问题 : 急性毒性试验未按照标准蛋白经口急性毒性试验 ( 农业部 2031 号公告 -16-2013) 的要求完成说明 : 根据农业部 2015 年 10 月的批复意见, 孟山都公司在本次申请中补充提交了新的急性经口毒性试验报告, 新提交报告的试验剂量为 5000 mg/kg 体重新提交的报告详见技术报告 19, 该试验按照 EPA OPPTS 870.1100( 该指南与 OECD TG 425 的要求一致 ) 进行, 也基本符合农业部 2031 号公告 -16-2013 中最大耐受剂量法 (MTD) 的要求, 最终报告于 2015 年 9 月完成试验采用 CD-1 小鼠, 每个处理受试动物为 20 只 ( 雌雄各 10 只 ) 由于进行剂量为 5000mg/kg bw 的急性毒性试验需要大量 DMO 蛋白, 用大肠杆菌表达蛋白进行了本研究 ( 蛋白特性鉴定与等同性分析见技术报告 17) 试验还设置了牛血清蛋白对照组和溶剂对照组试验开始第 0 天口服灌胃给药 2 次, 总的给药剂量为 5000 mg/kg 体重给药后, 临床观察 14 天, 然后进行大体解剖观察和病理学观察试验结果表明, 未发现大肠杆菌表达的 MON 87708 DMO 蛋白对雄鼠和雌鼠产生与 DMO 相关的不利效应因此,MON 87708 DMO 的 NOAEL 为 5000 mg/kg 体重即使假定所有消费大豆均为 MON 87708, 根据中国一般人群大豆的膳食摄入水平 (0.5 g/kg bw/d, 翟凤英和杨晓光 (2006) 的调查数据 ) 和 MON 87708 大豆资料中 DMO 蛋白表达水平 (43 µg/g fwt), 在 NOAEL 为 5000 mg/kg 体重的情况下, 计算得到的 MON 87708 DMO 蛋白膳食摄入暴露限值 (MOE) 至少为 230000 倍 ( 相当于一个体重 50kg 的成年人每天吃超过 5 吨大豆才可以接触到的 DMO 蛋白暴露水平 ) 抗麦草畏除草剂大豆 MON 87708 在按要求完成国内食用和环境安全检测后, 于 2014 年 10 月被提交申请获得进口用作加工原料安全证书当时提交的有关毒性安全性的数据包括急性经口毒性试验 (140 mg/kg 植物提取蛋白的灌胃剂量和至少为 6500 的 MOE) 28 天蛋白小鼠喂养试验 90 天大鼠喂养试验与已知毒性蛋白的生物信息学分析等这些试验和分析结果均表明 MON 87708 表达的 DMO 蛋白对人类和动物不具有任何毒性, 是安全的 2015 年 1 月收到农业部批复意见, 认为急性毒性试验剂量过低, 未按农业部 2031 号公告 -16-2013 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白经口急性毒性试验进行对此, 孟山都公司于 2015 年 2 月再次提交申请, 并对利用植物提取蛋白进行更高灌胃剂量的试验的可行性以及 MON 87708 表达的 DMO 蛋白的安全性进行了进一步的解释和说明 2015 年 6 月农业部再次批复认为急性毒性试验未按照标准转基因产品及衍生物的食品安全检测 - 蛋白经口急性毒性试验 ( 农业部 2031 号公告 -16-2013) 完成为此, 孟山都公司在 2015 年月的第三次申请中补充提交了新的急性经口毒性试验数据 ( 利用大肠杆菌表达的蛋白使灌胃剂量达到 2000 mg/kg 体重,MOE 至少为 93000), 该试验参考了农业部 2031 号公告 -16-2013 中最大耐受剂量法 (MTD) 的要求根据针对急性经口毒性, 孟山都公司于 2015 年 10 月又收到同样的问题, 因此本次申请提交了 5000mg/kg bw 灌胃剂量的新试 VIII

验报告综上所述, 从 2014 年 10 月至 2015 年 10 月先后提交的 3 个急性毒性试验报告 (140mg/kg bw 植物提取蛋白 2000mg/kg bw 大肠杆菌表达蛋白 5000mg/kg bw 大肠杆菌表达蛋白 ), 均可保证足够大的 MOE 值 ( 针对中国人群至少为 6500), 也均得到了相同的试验结果, 即未发现任何与测试蛋白相关的对小鼠健康的不良影响根据 MON 87708 DMO 基因供体生物安全性受体生物安全性长期安全食用历史与已知毒性蛋白的生物信息分析 DMO 蛋白的作用机理分析模拟消化试验热稳定性试验急性毒性试验动物喂养试验等分析, 可以认为 MON 87708 中被引入的 DMO 蛋白不具有毒性, 是安全的事实上,MON 87708 已经被包括美国巴西阿根廷欧盟日本韩国等相关种植和进口国家审查和批准, 这些国家的法规监管机构也均认为 MON 87708 的 DMO 蛋白不具有毒性, 是安全的引入 DMO 蛋白的 MON 87708 大豆与目前被广泛商业化应用的耐草甘膦除草剂大豆中引入的 CP4 EPSPS 蛋白作用机制不同麦草畏除草剂能有效控制草甘膦除草剂难以防除和对草甘膦产生抗性的阔叶杂草, 其与耐草甘膦性状的联合应用也可以大大减缓抗性杂草的发生因此,MON 87708 的商业化对北美和南美广大种植户意义重大, 预期商业化后, 含有 MON 87708 性状的大豆籽粒将占主要大豆生产国生产及出口量的很大比重 EPA OPPTS 870.1100 和 OECD TG 425 均推荐对有证据表明不太可能具有毒性或预期毒性很低的物质用限定剂量法 (limit dose) 进行评价, 并将限定剂量界定为 2000 mg/kg bw 虽然限定剂量法中也提及可考虑将灌胃剂量提高至 5000mg/kg bw 进行试验, 但也特别强调, 出于动物福利的考虑, 只有预期试验结果极可能与保护人类健康或环境有直接关联时才考虑进行更高剂量的急性毒性试验, 如果有资料能够表明测试物质不太可能对人类或动物健康有影响, 不鼓励进行超过 2000 mg/kg 的限定剂量法研究是否需用高至 5000mg/kg bw 的剂量水平进行经口急性毒性试验, 除了动物福利等伦理学方面的考虑需要慎重决定外, 用 5000mg/kg bw 的剂量灌胃, 在灌胃溶液制备以及喂饲给药上均存在困难和挑战, 高浓度大体积灌胃溶液的多次给予, 会增加实验动物的压力, 从而增加影响实验结果, 扰乱对试验蛋白自身毒性评价的机会考虑到不同转基因蛋白理化性质对灌胃蛋白溶液制备的影响以及转基因蛋白可能的人类暴露水平很低和不太可能具有危害的特点, 对不同蛋白急性毒性试验的要求应遵循个案分析的原则, 如果蛋白灌胃剂量不能达到限定剂量水平, 推荐根据是否能够保证足够大的 MOE( 如 MOE 100) 评判灌胃剂量是否适宜 (Faustman et al, 2008) 参考文献 : 翟凤英, 杨晓光. 2006. 中国居民营养与健康状况调查报告之二 (2002)- 膳食与营养素摄入状况, pp. 21-33, 人民卫生出版社. OECD (2008), Test No. 425: Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procedure, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris. DOI: http://dx.doi.org/10.1787/9789264071049-en. Faustman, E.M. and G.S. Omenn. 2008. Risk assessment. Pages 107-128 in Casarett and Doull's Toxicology - The Basic Science of Poisons. Seventh Edition. C.D. Klassen (ed.). McGraw-Hill, New York, New York. IX

二孟山都公司对 2015 年 6 月农业部批复信函的回复说明问题 : 急性毒性试验未按照标准蛋白经口急性毒性试验 ( 农业部 2031 号公告 -16-2013) 的要求完成说明 :MON 87708 是抗麦草畏除草剂大豆产品, 能够表达来自于嗜麦芽寡氧单孢菌的麦草畏单加氧酶 (DMO) 蛋白 MON 87708 及其表达的 DMO 蛋白的食用和饲用安全性评价数据于 2012 年 10 月首次提交, 完成中国国内环境安全和食用安全检测后于 2014 年再次提交针对本次批复意见, 我公司补充提交了利用大肠杆菌表达蛋白进行的新急性经口毒性试验 ( 详见技术报告 18) 新急性毒性试验根据 EPA OPPTS 870.1100 进行, 试验设计也与农业部 2031 号公告 -16-2013 中的要求一致农业部 2031 号公告 -16-2013 中描述了两种方法 :LD50 和 MTD 与国内外的相关试验标准和指南一致, 该标准没有指定 MTD 法的最小可接受的剂量水平, 但描述了 LD50 的危害分级标准 LD50 的危害分级标准并不适用于本安全性评价, 因为根据对 MON 87708 DMO 安全性的证据权重分析,MON 87708 DMO 对人类和动物不可能存在任何毒理学效应, 不会导致动物死亡基于 MON 87708 籽粒中的蛋白表达量, 人类对 MON 87708 DMO 的暴露量也不可能达到 LD50 法中用于分级的高限剂量水平此外, 作为重要的膳食组成成分, 绝大多数蛋白都不具有毒性, 人类和动物对膳食蛋白具有长期的安全食用历史自 1996 年以来, 已经对很多转基因蛋白进行过急性毒性研究, 均未发现动物致死现象因此, MTD 法是对 MON 87708 DMO 蛋白进行危害评价的适宜方法由于农业部 2031 号公告 -16-2013 中并未指定 MTD 方法的可接受剂量水平, 新急性毒性研究的剂量选择参考了 EPA OPPTS 870.1100 和 OECD TG 425 中的限定剂量法 (limit dose) EPA OPPTS 870.1100 和 OECD TG 425 均为通用的急性毒性试验指南, 而不是特别针对蛋白急性毒性研究制定的, 这两个指南中界定的限定剂量为 2000 mg/kg bw 或更高 OECD TG 425 中也特别指出, 出于动物福利的考虑, 如果有资料能够表明测试物质不太可能对人类或动物健康有直接影响, 不鼓励进行超过 2000 mg/kg 的限定剂量法研究除了动物福利因素外, 一些与蛋白溶解度和灌胃制剂制备相关的技术性困难也可能限制急性毒性试验中蛋白的最高灌胃剂量 ( 即便是 2000 mg/kg bw) 高剂量给药需要准备高浓度的灌胃制剂, 这对某些蛋白可能是无法实现的, 如某些蛋白由于在给药溶剂中的溶解度有限, 不可能得到高度浓缩的蛋白, 从而无法达到 g/kg 级的灌胃剂量水平在这种情况下, 应该根据合理的高安全性限值 ( 如 MOE) 进行剂量选择鉴于现有 MON 87708 DMO 的证据权重评价数据支持其不可能对人类和动物具有不良影响的结论, 新的验证性急性毒性研究的灌胃剂量确定为 2000 mg/kg bw 该灌胃剂量相当于体重 50kg 的成年人单日消费平均日常大豆类食品消费量 93,000 倍的大豆类食品达到的暴露水平 (MOE 至少为 9.3x10 4 ), 单日摄入如此大量的大豆类食品是不可能的 2000 mg/kg 的 MTD 法是一种高度保守的转基因蛋白试验剂量水平灌胃剂量为 2000 mg/kg bw 的 MTD 法能够保证试验有足够的敏感性, 能够检测任何可能的毒性效应, 也可以减少试验动物用量, 降低制备灌胃制剂的困难 X

由于进行剂量为 2000mg/kg bw 的新急性毒性试验需要大量蛋白, 从植物材料中直接提取如此大量的 MON 87708 DMO 蛋白技术上难以实现, 因此用大肠杆菌表达 MON 87708 DMO 进行了研究为了最大程度的模拟蛋白在植物中的自然状态, 在大肠杆菌中分别表达两种形式的 DMO 蛋白 (MON 87708 DMO 蛋白和 MON 87708 DMO+27 蛋白 ) 后, 模拟两种形式蛋白在植物体中的自然比例混合后进行灌胃大肠杆菌表达蛋白的特性鉴定及其与 MON 87708 表达蛋白的等同性分析见技术报告 17 试验中各处理组均有雌雄各 10 只 CD-1 小鼠, 大肠杆菌表达蛋白 MON 87708 DMO 单日分两次灌胃小鼠, 总灌胃剂量为 2000 mg/kg bw 对照组灌胃等同剂量的牛血清白蛋白 (BSA) 作为蛋白对照组或灌胃等体积溶剂作为溶剂对照组所有动物在灌胃前均进行禁食处理, 灌胃后连续 14 天每天观察两次中毒症状或是否出现动物死亡, 在第 14 天所有动物进行大体解剖未发现任何与处理相关的对存活率临床观察体重体重增加食物利用率或大体病理学影响因此, 本研究确定的未观察到损害作用的剂量 (NOAEL) 为 2000 mg/kg bw, 该剂量也是测试的最高剂量即最大耐受剂量 (MTD) 根据 2002 年中国营养与健康调查 ( 翟凤英和杨晓光, 2006) 中报道的中国人均大豆消费数据, 以及 MON 87708 DMO 在 MON 87708 大豆籽粒中的表达量, 利用新急性毒性试验的 NOAEL(2000mg/kg bw) 计算得到的中国人群对 MON 87708 DMO 的暴露限值 (MOE) 至少为 9.3x10 4 正如预期,2015 年急性毒性试验的结果并未提供任何新的关于 MON 87708 DMO 安全性的信息, 与 2010 年进行的 MON 87708 DMO 急性毒性试验以及对其他作物同源 DMO 蛋白进行的急性毒性试验结果相同, 这些试验结果都未观察到 DMO 蛋白对动物健康产生影响, 都可以保证足够大的 MOE 2015 年进行新的急性毒性研究并非由于已经提交 2010 年急性毒性试验结果或 MON 87708 DMO 的安全性存在问题相反, 对 MON 87708 DMO 安全性的证据权重分析以及 2010 年急性毒性试验均证实了 MON 87708 DMO 的安全性对 2010 年急性毒性试验以及 MON 87708 DMO 安全性的进一步分析如下 : 膳食中存在的植物和动物蛋白具有长期的安全食用历史绝大多数摄入的蛋白都会经过水解和 / 或蛋白酶解过程而最终转化为单个氨基酸或小肽, 并被最终用于机体蛋白质合成和其他代谢通路 (Delaney, et al. 2008) 因此, 作为重要营养素, 绝大数据蛋白质是无毒的也有极少数蛋白对一些生物是有毒的, 这些已知的毒素蛋白大部分通过急性机制发挥毒性效应 (Hammond and Fuchs 1998) (Pariza and Johnson 2001) (Sjoblad, et al. 1992) (Hammond, et al. 2013), 少数例外也有发生, 主要是某些抗营养蛋白如植物凝集素引入的外源蛋白是否与这些特例蛋白存在结构和功能相似性能够用生物信息学方法进行确认 (Hammond et al 2013) 根据国内外转基因作物评价的指南, 当引入蛋白的安全性以及蛋白安全食用历史能够用证据权重 (weight of evidence) 的方法进行证实时, 对急性毒性检测并无特别要求, 一般可根据个案分析的原则确定是否需要急性毒性检测如农业部颁布的转基因植物安全评价指南 (2010) 中指出当新表达蛋白无安全食用历史, 安全性资料不足时, 必须提供急性经口毒性资料 ; 同样, 食品法典委员会 (Codex) 出版的指南 (Codex Alimentarius 2009) 也推荐对重组 DNA 植物的 XI

食用安全性评价应用证据权重法 Codex (2009) 指出如食品中的蛋白与之前已经被安全消费的蛋白无相似性, 可能需要进行合适的经口毒理学研究这些评价指南中包含的原则也与毒理学中危害确认的原则一致, 危害确认需应用 :1) 结构活性分析 ;2) 体外实验 ;3) 动物生测 ; 和 4) 流行病学 (Faustman and Omenn 2008) MON 87708 DMO 的安全性评价遵循了国内外安全性评价指南以及毒理学通常采用的原则, 应用证据权重方法进行风险确认与暴露估计具体的分析包括 : 生物信息学检索 ( 结构活性分析 ); 安全食用历史 ( 流行病学分析 ); 模拟肠胃液消化性分析和热稳定性分析 ( 体外实验 ); 表达蛋白的急性毒性研究 ( 动物生测 ) 具体结果如下 : 1) 生物信息学分析表明 MON 87708 DMO 序列与已知对人类或动物健康有害的蛋白序列不存在任何有意义的氨基酸序列匹配, 推导 MON 87708 DMO 与已知毒素或抗营养蛋白无结构或功能同源性 ( 详细的生物信息学分析见申请书第五部分和技术报告 6) 2) DMO 属于 Rieske 非血红素铁氧化酶蛋白家族, 该家族蛋白在植物 ( 包括粮食作物 ) 和细菌中普遍存在, 已经被人类和动物广泛消费, 具有长期安全食用历史 (Ferraro, et al. 2005) (Schmidt and Shaw 2001),MON 87708 DMO 与大量食品中被安全消费的蛋白同源 ( 详细的安全食用历史见申请书第五部分 ) 3) MON 87708 DMO 在模拟胃肠液中很容易被消化 (30 秒内即可被完全消化 ) 因此, 人类和动物不可能暴露于结构和功能完整的 MON 87708 DMO( 详细的消化性评价见申请书第五部分和技术报告 8) 4) MON 87708 DMO 被加热至 55 C 及以上时即完全失活因此, 大豆类食品加工及烹饪过程中的热处理会使其迅速失活, 从另一方面表明人类和动物不可能暴露于结构和功能完整的 MON 87708 DMO( 详细的热稳定分析见申请书第五部分和技术报告 9) 5) MON 87708 DMO 在大豆籽粒中表达量相对较低 (43 µg/g 鲜重,0.011% 总籽粒蛋白 ), 从而限制了暴露水平一个体重 50kg 的成年中国人需单日摄入至少为平均日常大豆类食品消费量的 6500 倍 ( 相当于 160kg 大豆籽粒 ) 的大豆类食品, 其 DMO 蛋白的暴露水平才能达到 2010 年 MON 87708 DMO 蛋白小鼠经口急性毒性试验的未观察到损害作用的剂量 (NOAEL=140 mg/kg bw), 单日消费如此大量的大豆类食品在生理上是不可能的 ( 详细的暴露量估计见申请书第五部分的蛋白膳食暴露评估 ) 由于氧化酶家族蛋白具有安全食用历史, 以及采用证据权重分析能够表明 MON 87708 DMO 对人类和动物是安全的根据证据权重法原则及国内外安全性评价指南, 针对 MON 87708 DMO 蛋白的急性毒性试验并非是证明其安全性所必需的但如果要进行毒性研究来确认证据权重分析, 可以依据在保守人类暴露估计下一个足够高的目标暴露限值 (MOE) 来确定灌胃剂量, 这种剂量选择方法是符合毒理学试验要求的, 因为在保守人类暴露量估计下能够提供足够大安全性因子 ( 如 MOE 100) 的剂量水平可以用于确认物质安全性是被广泛接受的毒理学原则 (Faustman and Omenn, 2008) XII

确定急性毒性试验的灌胃剂量的另外一个考虑是, 在确保达到试验目标和人类健康安全的前提下充分考虑动物福利与对动物的人道处理全球很多国家的法规监管机构都支持减少和限制不必要的应用动物试验的风险评估方式, 提倡尽可能应用其他试验 ( 如体外热稳定性或消化性实验 ( 实验室分析 ) 和生物信息学 ( 电脑模拟分析 ) 得到的数据进行安全性评价 (EFSA 2009) OECD 也极不鼓励进行不能提供任何更多安全性信息的动物试验 (OECD, 2008) 因此, 在无任何可检测假设的情况下进行高剂量的急性毒性试验既没有必要也不科学 2010 年急性毒性试验对上述急性毒性试验设计的考量因素均进行了考虑 2010 年急性毒性试验用的 MON 87708 DMO 蛋白是从 MON 87708 大豆籽粒中直接提取的 MON 87708 籽粒来源的 GMO 蛋白因为剪切不同会形成两种 DMO 蛋白形式 (MON 87708 DMO 蛋白和 MON 87708 DMO+27 蛋白, 见申请书 2.2.3 部分 ), 植物来源的 MON 87708 DMO 可以保持了两种蛋白形式的自然比例和三聚体活性形式 MON 87708 DMO 在籽粒组织中表达量相对较低 ; 同时从植物材料中纯化 DMO 蛋白很困难, 需要将一系列复杂的技术和多步色谱分离联合应用, 仅有不足 10% 的初始表达 MON 87708 DMO 蛋白能够被回收因此, 也限制了从籽粒获得可以用于安全性评价的蛋白量 2010 年完成的 MON 87708 DMO 急性毒性研究是根据 EPA OPPTS 870.1100 指南进行的 ( 该指南与 OECD TG 425 的要求一致 ), 其试验设计也与农业部后来颁布的转基因生物及其产品食用安全性检测蛋白质经口急性毒性试验 ( 农业部 2031 号公告 -16-2013) 中的要求相符, 详细的试验设计及结果见本申请书第五部分及技术报告 7 研究中选择的灌胃剂量为 140 mg/kg bw, 该灌胃剂量已经能够保证足够高的膳食暴露限值 ( 对中国人群的 MOE 6500) 该保守的暴露量估计并未考虑生产加工和体内消化过程对蛋白完整性和活性的影响而实际上, 经历生产加工处理以及被消化道的消化酶消化后, 人类暴露于完整的 MON 87708 DMO 蛋白的可能性极低该研究中的最高灌胃剂量即为最大耐受剂量 (MTD), 试验结果未发现任何与处理相关的不良反应, 未观察到损害作用的剂量 (NOAEL) 确定为 140mg/kg bw 进一步证实了 MON 87708 DMO 蛋白对人类和动物健康是安全的除了急性毒性研究外, 孟山都公司还用大肠杆菌表达 MON 87708 DMO 蛋白进行了 28 天小鼠蛋白饲喂研究, 该研究未观察到任何与处理相关的效应, NOAEL 为 171 mg/kg/day ( 最高测试剂量 )( 详见申请书第五部分和技术报告 12) 此外, 还对抗麦草畏玉米和棉花中表达的, 与 MON 87708 DMO 来源相同 ( 嗜麦芽寡养单孢菌 ) 且序列高度一致的 DMO 蛋白进行了急性毒性研究抗麦草畏玉米 DMO 的急性毒性研究中 (Smedley, 2014)NOAEL 为 1000 mg/kg bw 同样, 抗麦草畏棉花中 DMO 蛋白的急性毒性研究中得到的 NOAEL 为 283 mg/kg bw 基于现有证据权重评价数据 2010 年完成的 MON 87708 DMO 急性毒性试验以及 28 天小鼠饲喂试验, 欧洲食品安全局 (EFSA) 在对 MON 87708 的食用与饲用安全性评价结论中指出 DMO 蛋白能够被蛋白水解酶降解, 生物信息学分析表明其与已知毒素和致敏原蛋白无相似性, 小鼠 28 天和急性毒性研究中也未观察到毒性效应综上所述,EFSA 转基因生物专家组认为在目标用途下, MON 87708 大豆与其常规对照和非转基因参考品种的安全性和营养价值等同 XIII

除欧盟外,MON 87708 DMO 的安全性评价数据也通过了全球很多法规监管机构的审查, 并最终得到的批准截止目前,MON 87708 已经在美国和加拿大获得了商业化种植批准, 在澳大利亚 / 新西兰欧盟日本韩国墨西哥菲律宾越南和中国台湾地区获得了进口批准 ( 详细的审批情况见申请书第六部分附件资料 ) 综上所述, 证据权重评价已有的安全食用历史和对 DMO 蛋白进行的 4 个急性毒性试验和一个 28 天研究中均未发现任何不良效应的事实, 证实了 MON 87708 DMO 的食用和饲用安全性据 ISAAA 统计, 截止 2014 年, 全球有超过 170 种转基因作物产品获得了种植批准, 这些产品中含有包括 CP4 EPSPS PAT 和 Bt 蛋白等被人们熟知的蛋白 (Clive, 2014b; CERA, 2015) 所有转基因作物在商业化应用前均经过了严格的技术审查, 安全评价均依据证据权重的方法 2014 年全球转基因作物 ( 主要是耐除草剂和抗虫作物 ) 的种植面积已达 1.8 亿公顷, 占全球总播种面积的 49%,1996-2014 年间转基因作物的累积种植面积更达 18 亿公顷之多 (Clive, 2014a) 此外, 自 1996 年抗草甘膦作物上市以来, 含有转基因作物的饲料已经饲喂了超过 1000 亿头牲畜, 其中绝大部分为抗草甘膦作物, 未发现牲畜的健康或繁殖力发生任何不良改变, 也没有发现用转基因饲料饲喂的动物产品在营养价值上存在任何差别 (Van Eenennaam and Young 2014) 这些事实也证明采用证据权重法来评价转基因作物的安全性是正确的和可行的参考文献翟凤英, 杨晓光. 2006. 中国居民营养与健康状况调查报告之二 (2002)- 膳食与营养素摄入状况, pp. 21-33, 人民卫生出版社. 转基因植物安全评价指南 (2010), 农业部. Center for Environmental Risk Assessment (CERA). 2015. GMO crop database. [accessed Jun 10, 2015] Clive, J. 2014a. Global status of commercialized biotech/gm crops: 2014. ISAAA Brief No. 49. International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications. Ithaca, NY. USA. Clive, J. 2014b. Executive summary. Global status of commercialized biotech/gm crops: 2014. ISAAA Brief No. 49. International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications. Ithaca, NY. USA. http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/49/executivesummary/default.asp Codex Alimentarius. 2009. Foods derived from modern biotechnology. Codex Alimentarius Commission, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. Delaney, B., J.D. Astwood, H. Cunny, R.E. Conn, C. Herouet-Guicheney, S. MacIntosh, L.S. Meyer, L. Privalle, Y. Gao, J. Mattsson and M. Levine. 2008. XIV

Evaluation of protein safety in the context of agricultural biotechnology. Food and Chemical Toxicology 46:S71-S97. EFSA. 2009. Scientific opinion of the scientific committee: "Existing approaches incorporating replacement, reduction and refinement of animal testing: Applicability in food and feed risk assessment". EFSA Journal 1052:1-77. Faustman, E.M. and G.S. Omenn. 2008. Risk assessment. Pages 107-128 in Casarett and Doull's Toxicology - The Basic Science of Poisons. Seventh Edition. C.D. Klassen (ed.). McGraw-Hill, New York, New York. Ferraro, D.J., L. Gakhar and S. Ramaswamy. 2005. Rieske business: Structure-function of Rieske non-heme oxygenases. Biochemical and Biophysical Research and Communications 338:175-190. Hammond, B., J. Kough, C. Herouet-Guicheney and J.M. Jez. 2013. Toxicological evaluation of proteins introduced into food crops. Crit Rev Toxicol 43:25-42. Hammond, B.G. and A. Cockburn. 2008. The safety assessment of proteins introduced into crops developed through agricultural biotechnology: A consolidated approach to meet current and future needs. Pages 259-288 in Food Safety of Proteins in Agricultural Biotechnology. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. Hammond, B.G. and R.L. Fuchs. 1998. Safety evaluation for new varieties of food crops developed through biotechnology. Pages 61-79 in Biotechnology and Safety Assessment. Second Edition. J.A. Thomas (ed.). Taylor & Francis, Philadelphia, Pennsylvania. Hammond, B.G. and J.M. Jez. 2011. Impact of food processing on the safety assessment for proteins introduced into biotechnology-derived soybean and corn crops. Food and Chemical Toxicology 49:711-721. Kuiper, H.A., E.J. Kok and H.V. Davies. 2013. New EU legislation for risk assessment of GM food: no scientific justification for mandatory animal feeding trials. Plant Biotechnology Journal 11:781-784. Liener, I.E. 1994. Implications of antinutritional components in soybean foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 34:31-67. OECD (2008), Test No. 425: Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procedure, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris. DOI: http://dx.doi.org/10.1787/9789264071049-en Pariza, M.W. and E.A. Johnson. 2001. Evaluating the safety of microbial enzyme preparations used in food processing: Update for a new century. Regulatory Toxicology and Pharmacology 33:173-186. Schmidt, C.L. and L. Shaw. 2001. A comprehensive phylogenetic analysis of Rieske and Rieske-type iron-sulfur proteins. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 33:9-26. XV

Sjoblad, R.D., J.T. McClintock and R. Engler. 1992. Toxicological considerations for protein components of biological pesticide products. Regulatory Toxicology and Pharmacology 15:3-9. Van Eenennaam, A.L. and A. E. Young. 2014. Prevalence and impacts of genetically engineered feedstuffs on livestock populations. Journal of Animal Science. 2014 92: 10: 4255-4278. XVI

三孟山都公司对 2015 年 1 月农业部批复信函的回复说明问题 1: 急性毒性试验剂量过低, 未按农业部 2031 号公告 -16-2013 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白经口急性毒性试验进行说明 : 蛋白是维持生命所必需的膳食组成部分, 大多数蛋白能够被迅速消化为氨基酸或短肽等营养物质被利用少数蛋白具有哺乳动物毒性, 对已知毒蛋白的结构和功能都进行过鉴定联合国粮农组织和世界卫生组织联合建立的国际食品法典委员会 (Codex Alimentarius Commissionhas)2009 年发布了一个目前国际上广泛接受的指南, 该指南推荐应用证据权重方式评价转基因植物来源食品的安全性 Codex 对现代生物技术来源食品的风险评估原则包括危害确认和暴露评价 Codex 指南与国际广泛接受的毒理学经典著作 Casarett and Doull s Toxicology 第 7 版中描述的毒理学危害确认原则是一致的该书认为风险确认应该应用 1) 结构活性分析 ;2) 体外检测 ;3) 动物生物测定分析 ; 和 4) 流行病学分析 (Faustman and Omenn, 2008) 与 Codex 指南和毒理学惯例一致, 孟山都公司应用结构活性分析 ( 生物信息学检索 ) 流行病学 ( 安全应用历史 ) 体外检测 ( 热稳定性和模拟胃肠液消化 ) 和动物生物测定分析 ( 应用纯化活性蛋白进行的急性毒性研究 ) 为 MON 87708 DMO 的风险确认和暴露评估构建了证据权重这些数据建立的证据权重表明 MON 87708 DMO 对人类和动物消费是安全性的, 理由如下 : 1) 由于与已知毒素或抗营养蛋白无结构和功能同源性, 对 MON 87708 DMO 没有确认任何危害该结论是基于生物信息学分析做出的, 生物信息学分析没有发现 MON 87708 DMO 与对人类或动物健康存在危害的蛋白存在有意义的氨基酸序列相似性 ( 详见本申请书 3.3.1 部分 ) 2) MON 87708 DMO 与很多食物中存在的能够被安全消费的蛋白同源, 进一步支持该蛋白缺乏危害的结论 DMO 属于单加氧酶家族 (Rieske 非血红素铁氧化酶 ), 该家族蛋白在细菌和植物等生物中均存在, 已经被人类和动物广泛消费因此, 该氧化酶家族蛋白具有长期安全使用历史 (Ferraro et al., 2005; Schmidt and Shaw, 2001)( 详见本申请书 3.3.1 部分 ) 3) MON 87708 DMO 容易被模拟胃肠消化液中的胃蛋白酶和胰酶消化, 支持不可能暴露于结构和功能完整的 MON 87708 DMO 的结论分析结果表明 MON 87708 DMO 能够被胃蛋白酶在 30s 内消化, 胰酶单独消化时的结果也相似 ( 详见本申请书 3.3.1 部分 ) 4) MON 87708 DMO 在大豆类食品加工过程中普遍应用的热处理条件下不稳定, 也支持不可能通过膳食暴露接触结构和功能完整的 MON 87708 DMO 的结论 (Hammond and Jez, 2011) 结果表明 MON 87708 DMO 加热 55 C 或更高时能够完全失活 ( 详见本申请书 3.3.1 部分 ) 5) MON 87708 DMO 在籽粒组织中表达量相对较低 (43 µg/g FW,0.011% 总籽粒蛋白 ), 进一步支持通过 MON 87708 来源食品对蛋白的暴露量非常有限的结论 ( 详见本申请书 3.3.1 部分 ) XVII

由于植物来源蛋白为两种形式 DMO 蛋白 (MON 87708 DMO 蛋白和 MON 87708 DMO+27 蛋白, 见申请书 2.2.3 部分 ) 的混合物,MON 87708 的经口急性毒性研究用的蛋白是从植物中提取的植物来源 MON 87708 DMO 保持了两种蛋白的自然比例和三聚体活性形式 MON 87708 DMO 在籽粒组织中表达量相对较低, 从植物材料中纯化蛋白很困难, 需要将一系列复杂的技术和多步色谱分离联合应用, 仅有不足 10% 的初始表达 MON 87708 DMO 蛋白能够被回收本哺乳动物毒理学研究剂量选择的依据能够充分支持 Codex 和其它国际公认的风险分析原则中推荐的证据权重建立 MON 87708 DMO 的安全性 ( 中国法规指南没有最低剂量要求 ) 剂量水平相对于保守的人类暴露估计能够提供足够大的安全因子是被普遍接受的物质安全性的适宜指标 (Faustman and Omenn, 2008 中指出的暴露限值 MOE 100), 因此这一剂量设置方式符合毒理学试验要求急性毒性研究根据与 OECD 测试指南 425 一致的 EPA OPPTS 870.1100 指南进行本急性毒性研究中选择了一个在保守人类暴露评估中能够保证大暴露限值 (MOE 1000) 的剂量水平进行测试根据 NOAEL 和 MON 87708 DMO 的低表达水平, 该灌胃剂量相当于体重 50kg 的成人单日消费 >160kg 大豆籽粒所能暴露的 DMO 蛋白量,160kg 大豆籽粒比体重的 3 倍还多, 单日摄入如此大量大豆是不可能的进口到中国的 MON 87708 大豆的急性膳食风险评估 (DRA) 为理解中国人群人均大豆来源食品平均消费水平的高度保守估计提供了背景资料 DRA 估计日人均大豆来源食品摄入量为 0.5g/kg/day, 假定所有大豆来源食品均来源于 MON 87708 且加工过程中蛋白无损失, 相当于日消费 21.5 µg/kg/daymon 87708 DMO 因此, 本急性毒性研究中 MON 87708 DMO 的灌胃剂量比高度保守的暴露量估计高至少 6500 倍灌胃 140 mg/kg 体重蛋白后, 对小鼠的观察未发现任何与处理相关的不良影响, 证实在灌胃剂量远高于人类可能暴露量的情况下 MON 87708 DMO 对小鼠无毒性效应这是证明通过消费 MON 87708 大豆来源食品而对 MON 87708 DMO 的膳食暴露对人类健康无实质风险的有力证据本急性小鼠毒性研究足以证明 MON 87708 人类暴露的安全性考虑 Codex 风险分析的证据权重原则, 鉴于目前研究没有发现任何不良效应存在和高的 MOE, 以更高的剂量进行新的急性毒性试验不会提供任何新的有意义的 MON 87708 食用和饲用安全性信息在缺乏可检测假设的前提下, 根据普遍接受的动物使用与福利指南, 仅应在有理由预期可能比现有安全性评价提供更好信息的前提下才进行动物测试不需要进行进一步动物毒理学检测的另一个理由是用 DMO 同源蛋白进行的其它毒理学研究没有确认任何危害其中一个研究是为了研究长期暴露于 MON 87708 DMO 的效应用大肠杆菌表达蛋白进行了 28 天膳食毒理学研究 ( 详细结果见本申请书第 3.3.1 部分和技术报告 12) 用大肠杆菌表达蛋白是由于该研究所需纯化 MON 87708 DMO 量过大 (30 g 蛋白 ) 转基因作物的蛋白安全性评价一般用大肠杆菌表达系统等异源表达体系中表达的蛋白进行 (Harrison et al., 1996, Hammond, 2013, Bushey, 2014). 28 天研究中所需蛋白量需要从超过 10 吨 XVIII

的脱脂豆粕中提取纯化 MON 87708 DMO( 大约 17 吨大豆籽粒 ) 为了使大肠杆菌表达蛋白能够模拟 MON 87708 植物来源的蛋白, 将两种形式 DMO 蛋白在大肠杆菌中分别表达后, 按照近似于 MON 87708 大豆中的蛋白比例 (Crowley et. al., 2012) 进行混合, 用于试验 28 天小鼠膳食研究未观察到任何与处理相关的效应, NOAEL 为 171 mg/kg/day ( 最高测试剂量 ) 此外, 还对抗麦草畏玉米 MON 87419 和抗麦草畏棉花 MON 88701 中表达的同样来源于嗜麦芽寡氧单胞菌的两种 DMO 蛋白进行了急性毒性研究这两种 DMO 蛋白与 MON 87708 中蛋白的 DMO 编码序列一致性 >99%( 蛋白序列比较如下图所示 ) 与 MON 87708 DMO+27 蛋白相同, 抗麦草畏玉米和抗麦草畏大豆中 DMO 蛋白编码序列 N 端也残留了部分来源于不同植物的叶绿体转移肽序列 (CTP) CTP 用于指导 DMO 蛋白向叶绿体的转运 (Herrmann 1995; Klee et al, 1987), 不同物种中叶绿体转移肽序列的剪切形式不同 (Behrens, et al., 2007; Clark and Lamppa, 1992) 由于叶绿体转移肽序列在具有长期安全使用历史的植物基因中普遍存在 (Hammond et al., 2013), 这些微小差别不会对安全性产生影响 N- 端 CTP 序列剪切形式的不同, 和这些 DMO 蛋白编码序列 >99% 的一致性对蛋白的作用模式结构与表型相关的功能活性或底物特异性等无影响不同抗麦草畏作物中表达的 DMO 蛋白序列比较此外, 抗麦草畏大豆玉米和棉花中表达的 DMO 都表现出了相同的麦草畏抗性对不同抗麦草畏作物中表达 DMO 蛋白的全面生物化学特性分析证实其底物特异性也相同这与预期相符, 因为不同蛋白间存在足够的线性序列一致性和相似性时, 蛋白也具有相似的三级结构以及相似的功能活性同源蛋白具有相似的二级结构和三维折叠 (Pearson, 2000) 因此,MON 87708 DMO 的毒性评价可参考这些同源蛋白的急性毒性研究数据抗麦草畏玉米中 DMO 蛋白小鼠急性经口毒性研究的未观察到损害作用的剂量 (NOAEL) 为 1,000mg/kg 体重, 抗麦草畏棉花中 DMO 的 NOAEL 为 283mg/kg 体重这些剂量设置是符合毒理学规范的, 因为剂量水平相对于保守人类暴露评 XIX

估可提供足够大的安全因子是普遍接受的物质安全性的适宜指标 (Faustman and Omenn, 2008 中指出的暴露限值 MOE 100) 对抗麦草畏棉花中 DMO 蛋白的膳食暴露可忽略不计, 因为人类不食用棉籽, 供人类食用的加工产品 ( 精炼漂白和除臭的棉籽油和棉绒 ) 含有的蛋白量可忽略不计对抗麦草畏玉米,DMO 急性毒性研究中的剂量水平为最高可能测试剂量 (1000 mg/kg bw), 该剂量可以避免灌胃溶液中共同存在的铁浓度过高的影响 (DMO 含有 Rieske 结构域和一个含铁的非血红素铁中心 ), 高浓度铁可能干扰对 DMO 蛋白潜在毒性进行评价的能力抗麦草畏玉米 DMO 急性毒性研究的剂量也可得到大的 MOE 综上所述, 根据 Codex 证据权重风险分析没有发现 MON 87708 中表达的 DMO 存在任何危害足够大的膳食消费暴露限值和对同源 DMO 蛋白进行的急性毒性研究无任何不良发现, 均支持 MON 87708 DMO 的证据权重安全性评价根据 Codex 证据权重风险分析,MON 87708 DMO 在籽粒中表达量相对较低, 易受热处理以及胃蛋白酶和胰酶消化的影响, 对结构和功能完整的 DMO 蛋白的膳食暴露可忽略不计因此, 综合考虑无可见危害和无有意义的暴露支持含有 MON 87708 DMO 的食品对人类消费无风险的结论欧州食品安全委员会的科学评议也得到了相同的结论, 认为在小鼠 28 天和急性毒性研究中未观察到 DMO 蛋白存在毒性和安全性评价没有发现 MON 87708 大豆或其表达的 DMO 蛋白存在任何毒性和致敏性风险此外,MON 87708 及其表达的 DMO 蛋白已经在包括澳大利亚 / 新西兰加拿大日本韩国墨西哥菲律宾中国台湾和美国在内的国家或地区获得了食用饲用或种植批准, 欧盟的科学审查意见也对安全性给予了肯定以上法规监管机构都得出了 MON 87708 DMO 对人类和动物消费是安全的,MON 87708 大豆与常规品种安全性与营养价值相当的结论参考文献 : Behrens, M.R., N. Mutlu, S. Chakraborty, R. Dumitru, W.Z. Jiang, B.J. Lavallee, P.L. Herman, T.E. Clemente and D.P. Weeks. 2007. Dicamba resistance: Enlarging and preserving biotechnology-based weed management strategies. Science 316: 1185-1188. Clark, S.E. and G.K. Lamppa. 1992. Processing of the precursors for the light-harvesting chlorophyll-binding proteins of photosystem II and photosystem I during import and in an organelle-free assay. Plant Physiology 98: 595-601. Codex Alimentarius. 2009. Foods derived from modern biotechnology. Second Edition, World Health Organization, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy Crowley, KS, TC Lee and E Bell. 2012. Comparison of the Ecoli produced MON 87708 DMO used in MSL0023246 to MON 87708 DMO produced from MON 87708. Monsanto Technical Report RAR-2012-0153. Monsanto Company. St. Louis, Missouri. USA Faustman, E.M., & Omenn, G.S. (2008). Risk Assessment. In C.D. Klaassen (ed.), Casarett and Doull s Toxicology (pp 107-128). New York: McGraw Hill Medical. XX

Ferraro, D.J., L. Gakhar and S. Ramaswamy. 2005. Rieske business: Structure-function of Rieske non-heme oxygenases. Biochemical and Biophysical Research and Communications 338: 175-190. Hammond, B.G. and Jez, J. M. 2011. Impact of food processing on the safety assessment for proteins introduced into biotechnology-derived soybean and corn crops. Food and Chemical Toxicology 49: 711-721. Hammond, B., Kough, J., Herouet-Guicheney, C., Jez, J.M.ILSI International Food Biotechnology Committee Task Force on Use of Mammalian Toxicology Studies in Safety Assessment of GM Foods, 2013. Toxicological evaluation of proteins introduced into food crops. Crit. Rev. Toxicol. 43, 25 42. Herrmann, K.M. 1995. The shikimate pathway: Early steps in the biosynthesis of aromatic compounds. Plant Cell 7:907-919.Pearson, W. R. (2000). "Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package." Methods in Molecular Biology 132: 185-219. Klee, H.J., Y.M. Muskopf and C.S. Gasser. 1987. Cloning of an Arabidopsis thaliana gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase: Sequence analysis and manipulation to obtain glyphosate-tolerant plants. Molecular and General Genetics 210:437-442 Schmidt, C.L. and L. Shaw. 2001. A comprehensive phylogenetic analysis of Rieske and Rieske-type iron-sulfur proteins. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 33: 9-26. 问题 2: 未提供大豆种子大豆豆粕大豆油豆粉等相关产品中除草剂麦草畏的残留量数据说明 : 麦草畏学名 3,6- 二氯 -2- 甲氧基苯甲酸 (3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid), 是一种内吸性选择除草剂, 其除草机理与 2,4-D 类相似, 通过破坏阔叶杂草的天然激素平衡, 干扰敏感植物的正常生长, 达到除草目的 MON 87708 大豆中表达的麦草畏单加氧酶 (DMO) 能迅速使麦草畏去甲基化, 形成二氯水杨酸 (DCSA) 和甲醛, 从而使麦草畏失去除草活性, 使得 MON 87708 大豆植株耐受麦草畏除草剂 DCSA 可以进一步代谢成 2,5- 二氯 -3,6- 二羟基苯甲酸 (DCGA) 在无 DMO 蛋白存在的情况下, 麦草畏除草剂本身能通过自然代谢过程产生 DCSA DCGA 和 5- 羟基麦草畏在新的抗除草剂性状商业化种植之前, 会按照良好农业规范 (Good Agricultural Practices,GAP) 标准进行田间试验, 按照推荐剂量和方法喷施除草剂, 分析确定直接收获的农产品及其加工组分中的除草剂残留水平除草剂在籽粒不同组分中残留水平可能存在差异, 在某些组分中相对富集, 而在其他组分中相对较少加工组分中的相对残留浓缩水平用浓缩系数 (concentration factors, CF) 表示, 计算公式如下 :CF= 加工组分残留水平 / 未加工籽粒残留水平 MON87708 为全球首个研发的抗麦草畏大豆产品,2008 年在美国进行了抗麦草畏大豆 MON 87708 的田间残留试验 ( 技术报告 16) 按照推荐剂量和方法在出苗前和生长季节喷施麦草畏除草剂, 收获后测定大豆麦草畏残留量按照美 XXI

国环保署关于作物产品和加工组分中残留研究指南 (EPA, 1996a; b), 如果加工组分中残留水平预期会低于加工之前的残留水平, 甚至低于残留分析检测极限, 指南建议田间试验时适当提高除草剂的喷施剂量因此在 MON 87708 田间残留试验 22 个试验点中的 2 个试验点, 按照标签推荐总剂量的 1.5 倍喷施麦草畏, 用于测定大豆籽粒加工组分的残留量, 目的是能够最大限度的对可能存在的除草剂残留进行测定, 并确定加工组分残留量浓缩系数 (CF) 对收获的 MON 87708 大豆籽粒, 及按照特定的大豆加工程序对籽粒进行加工后得到的豆粕和大豆油中的麦草畏及麦草畏代谢物 DCSA 5- 羟基麦草畏和 DCGA 水平进行测定, 将麦草畏及上述代谢产物含量水平加合后作为残留量数据, 在除草剂使用标签不变的前提下,MON 87708 大豆的残留量数据将被作为该类作物的基础数据, 用于支持所有其他应用相同作用机制 ( 如通过引入 DMO 蛋白 ) 的麦草畏抗性大豆的残留数据 MON 87708 大豆籽粒豆粕粗炼大豆油和精炼大豆油中的麦草畏残留量如下表所示表中大豆油和豆粕残留量的中位数和最大值是根据未加工大豆籽粒中的最大残留量和加工组分中的浓缩因子 (CF) 计算得到的粗炼及精炼大豆的 CF<0.1, 豆粕的 CF 为 1.3 目前, 国际食品法典委员 (Codex) 设定的麦草畏在大豆籽粒上的最大残留限量水平为 10ppm 该最大残留限量水平是基于在常规大豆收获前直接喷施麦草畏设定的 2008 年的残留试验结果表明, 在抗麦草畏大豆上直接喷施麦草畏, 所收获大豆的残留量最高检测值为 0.6ppm, 远远低于 Codex 最大残留限量因此, 现有的 Codex MRL 既适用于常规大豆, 也适用于抗麦草畏除草剂大豆如果大豆加工组分检测到的残留量水平明显高于大豆籽粒上设定的 MRL 值,Codex 或许会针对加工组分设定专门的 MRL 值但由于豆粕大豆油等组分中检测到的麦草畏的残留量远低于籽粒上的 MRL 值 (10ppm), 因此没有专门设立加工组分的 MRL 值抗麦草畏大豆残留试验总结及 Codex 最大残留限量水平 (MRL) 1 麦草畏残留水平麦草畏中位数组织类型 Codex MRL ( 范围 ) ppm ppm <0.09 大豆籽粒 10 (<0.05-0.6) 2 <0.01 粗炼大豆油 (<0.01 0.06) 5 未设定 3 <0.01 精炼大豆油 (<0.01 0.06) 5 未设定豆粕 4 <0.12 (<0.07-0.8) 5 未设定 1. 残留试验和加工组分残留分析结果用于支持麦草畏除草剂用于抗麦草畏大豆上的农药标签审批残留水平为麦草畏和麦草畏代谢物 DCSA DCGA 和 5- 羟基麦草畏含量之和 2. 又名脱胶大豆油 XXII

3. 又名精炼脱色脱臭大豆油 4. 又名脱脂烘焙豆粕 5. 加工组分中的残留水平中位数和范围依据籽粒残留水平和相应组分浓缩因子 (CF) 计算得到, 其中粗炼油和精炼油 CF<0.1, 豆粕 CF=1.3 农药最大残留限量 (MRL) 是指食品或农产品内部或表面法定允许的农药最大浓度, 以每千克食品或农产品中农药残留的毫克数表示 (mg/kg 或 ppm) 农药最大残留限量 (MRL) 是通过对农药进行广泛的毒理学试验和相对于曝露量的膳食风险评估, 确定的可接受的农药残留水平, 以保证不会对人类健康产生不良影响农药最大残留限量实际上是农药合理使用和农产品贸易所需要遵从的标准有些国家依据法律法规的要求, 会制定本国农产品最大残留限量标准, 而 Codex MRL 作为国际食品法典委员会食品标准的一部分, 由 Codex 农药残留委员会依据 FAO/WHO 农药残留联席会议 (JMPR) 的建议制定的 JMPR 是由联合国粮农组织和世界卫生组织专家共同组成的科学顾问组织,JMPR 通过对农药毒理学数据和残留数据进行评价, 依据评价结论, 向国际食品法典委员会 (Codex) 建议最大残留限量标准 (MRL) 总之, 通过残留试验, 分析检测了抗麦草畏大豆籽粒和籽粒加工组分 ( 豆粕豆油 ) 中麦草畏的残留水平在籽粒中检测到的最高残留量远低于 Codex 在常规大豆上设立的最大残留限量水平相对于大豆籽粒, 大豆油中的麦草畏残留水平降低, 而豆粕相比大豆籽粒, 麦草畏残留水平稍微浓缩, 但无论是豆粕还是大豆油, 麦草畏残留量都远低于 Codex 在大豆籽粒上设定的 MRL 值目前, 中国进口的大豆产品主要为大豆籽粒豆粕粗炼大豆油和精炼大豆油大豆籽粒和大豆种子是两种可以互换的说法, 只是大豆种子主要用于种植, 因此, 大豆种子中的残留水平与大豆籽粒中相同大豆粉可由籽粒直接加工而来, 也可榨油后磨碎得到, 无论哪种形式的大豆粉, 其除草剂的残留量分别与大豆籽粒或豆粕相类似, 均低于 Codex 在大豆籽粒上设定的 MRL 值参考文献 : U.S. EPA (1996a). Residue chemistry test guidelines. OPPTS 860.1500, Crop Field Trials. Washington, D.C., U.S. Environmental Protection Agency. U.S. EPA (1996b). Residue chemistry test guidelines. OPPTS 860.1520, Processed Food/Feed. Washington, D.C., U.S. Environmental Protection Agency. XXIII

四孟山都公司对 2013 年 6 月农业部批复信函的回复说明问题 : 未提供农业部委托检测机构出具的转基因大豆的环境和食用安全检测报告说明 : 按照农业部科技发展中心关于抗麦草畏大豆 MON 87708 的环境安全和食用安全检测任务下达通知, 由农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心 ( 长春 ) 暨吉林省农科院和农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心 ( 北京 ) 暨中国农业大学分别完成了 MON 87708 大豆的环境安全和食用安全检测任务, 相关检测报告分别见申请书下册技术报告 14 和技术报告 15 环境安全检测结果表明 : 除草剂耐受性鉴定 :MON87708 大豆对麦草畏除草剂具有良好的耐受性喷施推荐剂量 2 倍推荐剂量和 4 倍推荐量的麦草畏除草剂, 对转基因大豆 MON87708 植株的生长发育无明显影响生存竞争能力检测 :(1) 在荒地试验条件下, 转基因大豆 MON87708 虽然可以生长结实, 但繁育系数很低, 不具备杂草化趋势 ;(2) 在栽培地试验条件下, 转基因大豆 MON87708 可正常生长, 株高覆盖度都与其对应的非转基因大豆无显著差异, 繁育系数略高于其对应的非转基因大豆及当地常规大豆对照, 差异不显著对生物多样性影响检测 : 转基因大豆 MON87708 对田间节肢动物群落组成群落结构田间主要节肢动物种群的发生规律对大豆主要病害的影响对大豆根瘤菌的影响等方面, 较之对应的非转基因大豆没有显著差异食用安全检测结果表明 : 大鼠 90 天喂养试验中, 各组大鼠均未发现明显中毒症状, 无中毒死亡情况发生检测结果表明, 转基因大豆组与同等剂量的非转基因大豆组相比, 大鼠的体重增量总进食量脏体比无统计学差异, 食物利用率血清生化血常规等部分指标有统计学差异, 但结合组间分析和组织病理学检查证实该差异不具有生理学意义, 与长期食用受试物转基因大豆无关未观察到该转基因大豆 MON87708 在实验期内对大鼠产生营养和毒性方面的不良作用, 且未发现非预期的不良影响对 MON 87708 和常规对照 A3525 籽粒中抗营养因子的检测结果也表明, MON 87708 和常规对照的抗营养因子含量相当 XXIV

一申请表农业转基因生物安全证书申请表流水号 : 02030020151026-1 项目名称转 dmo 基因抗麦草畏除草剂大豆 MON 87708 进口用作加工原料的安全证书项目来源孟山都公司类别动物植物微生物转基因生物名称 MON 87708 Glycine max 受体中文名大豆学名 L. Merr 生物分类学豆科大豆属品种 ( 品系 ) 名称 A3525 安全等级 1 地位大豆种目的名称 dmo 供体生物嗜麦芽寡养单孢菌转基因生物学功能表达麦草畏单加氧酶前体蛋白, 可使大豆植株耐受麦草畏除草剂基目的名称供体生物因生物概基因生物学功能基因生物学功能目的名称功能供体生物基因目的生物学名称供体生物况载体 PV-GMHT4355 供体生物大肠杆菌标记基因 cp4 epsps( 已去除 ) 供体生物农杆菌 CP4 菌株报告基因无供体生物无转基因方法农杆菌介导转化基因操作类型 2 转基因生物安全等级 1 转基因生物产品安全等级 1 试验中间试验情况转基因生物名称及编号试验的时间地点和规模 1

概况环境释放情况转基因生物名称及编号批准文号批准时间地点和规模转基因生物生产性试验名称及编号批准文号情况批准时间地点和规模拟申请使用范围 ( 省自治区直辖市 ) 全国拟申请使用年限 5 单位名称孟山都远东有限公司法人代表申请单位概况研制单位概单位性质境外企业单位单位地址北京市朝阳区曙光西里甲 5 号院凤凰置地广场 8 层邮编 100028 申请人姓名电话传真电子邮箱联系人姓名电话传真电子邮箱单位名称孟山都公司法人代表联系人姓名电话传真电子邮箱主要完成人姓名性别出生年月学历专业技术职务何时何地曾从事何种基因工程工作参与完成人姓名年龄学历职称单位在本项目中的分工况 2

二项目内容摘要麦草畏学名 3,6- 二氯 -2- 甲氧基苯甲酸 (3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid), 是一种内吸性选择除草剂, 其除草机理与 2,4-D 类相似, 通过破坏阔叶杂草的天然激素平衡, 干扰敏感植物的正常生长, 达到除草目的麦草畏对一年生和多年生阔叶杂草有显著除草效果, 通常用于防除小麦田杂草, 双子叶植物大豆棉花等对麦草畏比较敏感, 植物接触后容易产生药害孟山都公司开发的 MON 87708 大豆 (OECD 唯一识别编号 MON-877Ø8-9) 含有一个来自嗜麦芽寡养单孢菌 (Stenotrophomonas maltophilia) 的麦草畏单加氧酶基因 (dmo), 该基因表达的麦草畏单加氧酶 (DMO) 能迅速使麦草畏去甲基化, 形成二氯水杨酸和甲醛, 从而使麦草畏失去除草活性, 使得 MON 87708 大豆植株耐受麦草畏除草剂由于麦草畏可以有效地控制对草甘膦除草剂产生抗性的阔叶类杂草或木本植物, 因此将抗麦草畏与抗草甘膦性状结合应用可以更有效地控制阔叶类和禾本科杂草产生对除草剂的抗性 MON 87708 是利用含双 T-DNA 的质粒载体 PV-GMHT4355, 通过农杆菌介导法转化 A3525 常规大豆分生组织获得的 PV-GMHT4355 质粒载体含有两个 T-DNA,T-DNA I 含有 dmo 基因表达盒 ;T-DNA II 含有 cp4 epsps 基因表达盒这两个 T-DNA 分别由独立的左右边界区分开转化过程中, 两个 T-DNA 都被插入大豆基因组 cp4 epsps 基因表达盒作为转化过程中的选择标记, 用来筛选转化细胞和转化植株然后通过常规育种过程, 使两个 T-DNA 分离, 选择仅含有 dmo 基因表达盒 (T-DNA I) 的植株, 从而得到不含 cp4 epsps 基因表达盒 (T-DNA II) 的 MON 87708 抗麦草畏大豆 Southern 杂交结果表明 MON 87708 基因组的一个基因座上存在单一拷贝的 T-DNA I 插入, 且可以在多个育种世代稳定遗传 Southern 杂交同时证明 MON 87708 不含有 T-DNA II (cp4 epsps 表达盒 ) 的遗传元件, 也不含有任何质粒骨架序列 PCR 结合 DNA 序列分析的结果表明,MON 87708 的插入序列来自转化载体 PV-GMHT4355, 大小为 3003 bp, 各遗传元件的排列顺序与质粒载体相同,MON 87708 的插入序列包括完整的 dmo 基因表达盒, 即包括花生黄化条纹花叶病毒启动子 (PC1SV) 烟草蚀纹病毒 (TEV) 前导 Rubisco 小亚基 (RbcS) 转移肽序列 dmo 基因编码序列以及豌豆 (Pisum sativum)e9 3 非翻译区其中目的基因 dmo 的编码序列大小为 1023 bp DNA 序列分析也表明与插入序列相连的基因组侧翼序列为大豆基因组序列对插入位点的生物信息学分析表明,MON 87708 中外源片段的插入未影响大豆内源基因的表达, 也不可能产生新的致敏或毒性蛋白在检测的 MON 87708 的多个育种世代中, 实际观察分离比例与预期分离比例间的卡方值不存在显著性差异, 表明 MON 87708 中的 dmo 基因表达盒插入到大豆基因组的单一位点上, 并且按照孟德尔遗传定律遗传 MON 87708 的 dmo 表达盒编码 MON 87708 DMO 前体蛋白, 前体蛋白在质体中可被加工成两种形式 :MON 87708 DMO 蛋白和 MON 87708 DMO+27 蛋白其中 MON 87708 DMO 蛋白表观分子量为 39.8 kda, 是一个含有 339 个氨基酸的单链多肽 ; 而 MON 87708 DMO+27 蛋白分子量比较高, 大约 42 kda, 是一个含 3

有 367 个氨基酸的单链多肽不论是 MON 87708 DMO 还是 MON 87708 DMO+27, 都必须是由三个 DMO 单体组成三聚体 ( MON 87708 DMO 或 MON 87708 DMO+27 单独形成的三聚体, 或两种蛋白共同参与形成的三聚体 ), 才能发挥催化作用本申请书中所提到的 MON 87708 DMO 蛋白包括 MON 87708 DMO 蛋白 MON 87708 DMO+27 蛋白以及所有形式的三聚体对 MON 87708 大豆表达的 DMO 的特性分析结果表明,MON 87708 DMO 蛋白和 MON 87708 DMO+27 蛋白的表观分子量分别为 39.8 kda 和 42.0 kda, 且都能被抗 DMO 抗体所识别 N- 末端序列分析和 MALDI-TOF 质谱肽段指纹图谱分析也证实 MON 87708 DMO 蛋白和 MON 87708 DMO+27 蛋白的序列与推导氨基酸序列相符 MON 87708 DMO 没有发生糖基化此外, 利用与麦草畏结构相似的 DMO 大豆内源底物进行测试, 发现 MON 87708 DMO 对麦草畏具有催化专一性 MON 87708 DMO 供体生物嗜麦芽寡养单胞菌 (S. maltophilia) 是一种喜氧型革兰氏阴性菌, 在人类生活环境中无处不在, 也存在于健康人群体内, 但目前还没有其发生致病性或过敏性的报道 MON 87708 DMO 与广泛分布在环境中的细菌和植物体内多种类型的氧化酶在不同水平上 ( 如 : 一级结构二级或三级结构 ) 具有蛋白同源性, 人类和动物经常接触这些结构相似性的蛋白, 也没有任何产生不良影响的报道因此可以说 MON 87708 DMO 具有安全应用历史生物信息学分析结果表明 :MON 87708 DMO 与任何已知对人类和动物有害的毒素蛋白过敏源蛋白及麦谷蛋白和醇溶蛋白不存在结构上的相似性利用 MON 87708 大豆籽粒中提取并纯化的 MON 87708 DMO 进行小鼠急性经口毒性试验, 结果在灌喂剂量为每公斤体重 140 mg 水平 ( 实验所能达到的最大灌喂剂量 ) 下小鼠存活率临床观察表现体重体重增加量食物消耗量和解剖结果都没有观察到与处理相关的不利影响因此,MON 87708 DMO 未观察到损害作用的剂量 (NOAEL) 确定为至少 140mg/kg bwt 根据农业部批复意见, 2015 年又对 MON 87708 DMO 进行了两次小鼠经口急性毒性研究, 也未观察到任何与处理相关的不良影响, 研究得到的 NOAEL 为 2000mg/kg bw 和 5000mg/kg bw MON 87708 DMO 在模拟胃液中孵育 30 s, 就能被迅速消化至 SDS-PAGE 或 Western 免疫检出限 (LOD) 以下利用 55 C 或更高温度处理 MON 87708 DMO 15 分钟或更长时间后, 蛋白的活性降低到定量分析检测限 (LOQ) 以下, 表明该蛋白对热处理不稳定 MON 87708 DMO 在籽粒全蛋白中所占的比例很小 ( 大约 0.011%), 因此致敏的可能性极小膳食曝露风险评估结果表明, 中国一般人群通过消费 MON 87708 大豆及其衍生产品而接触 MON 87708 DMO 的曝露限值 (MOE) 至少为 6500( 根据 2010 年小鼠急性毒性试验结果 ) 上述这些食用安全性评价结果表明,MON 87708 大豆所表达的 MON 87708 DMO 不会对人类和动物产生毒性或致敏性风险 2008 年孟山都公司在美国田间试验期间, 自 5 个不同的试验地点采集 MON 87708 和对照 A3525 组织, 利用经过验证的酶联免疫方法 (ELISA) 对 MON 87708 不同大豆组织中的 MON 87708 DMO 含量水平进行了分析分析结果表明,MON 87708 DMO 几乎在大豆全株表达, 全部试验点所有组织中蛋白表达含量测定范围较大, 为 3.9-180 µg/g dwt( 干重 ) 就平均数而言,OSL-4(V14-V16) 叶片中的平均含量最高, 为 69 µg/g dwt; 其次是秸秆, 平均值为 53 µg/g dwt; 4

项 目 编 号 : 项 目 类 别 : 农 业 转 基 因 生 物 安 全 评 价 申 报 书 项 目 名 称 : 转 dmo 基 因 抗 麦 草 畏 除 草 剂 大 豆 MON 87708 进 口 用 作 加 工 原 料 的 安 全 证 书 申 请 单 位 : 孟 山 都 远 东 有 限 公 司

项目编号 : 项目类别 : 农业转基因生物安全评价申报书项目名称 : 转 dmo 基因抗麦草畏除草剂大豆 MON 87708 进口用作加工原料的安全证书申请单位 : 孟山都远东有限公司