液 相 色 谱 / 离 子 阱 质 谱 和 包 含 400 种 药 物 的 MS 2 和 MS 3 的 谱 库 确 认 样 品 中 滥 用 药 物 的 存 在 应 用 法 医 / 毒 理 作 者 Michael Zumwalt Agilent Technologies, Inc Englewood, C USA Georges Tsoupras Agilent Technologies Geneva, Switzerland Kolbjorn Zahlsen and Anders Brunsvik Department of Clinical Pharmacology St. lav s Hospital Trondheim, Norway Henry Kaliciak and Stuart Huckin Department of Toxicology Riverview Hospital Coquitlam, BC, Canada Costas Georgakopoulos Doping Control Lab of Athens Athens, Greece 摘 要 在 三 个 独 立 实 验 室 中 使 用 包 含 近 400 种 滥 用 药 物 和 药 用 化 合 物 的 MS/MS (MS 2 ) 和 MS/MS/MS (MS 3 ) 谱 库 对 样 品 进 行 了 分 析, 样 品 中 滥 用 药 物 的 存 在 得 到 了 证 实 在 分 析 的 碎 片 裂 解 阶 段 通 过 梯 升 碰 撞 能 量, 产 生 了 重 现 的 子 离 子 谱 图 在 离 子 阱 中 进 行 实 验, 所 得 谱 图 代 表 了 裂 解 的 特 征 过 程 为 了 在 真 实 样 品 中 鉴 定 化 合 物, 样 品 中 子 离 子 的 生 成 同 样 采 用 了 梯 升 碰 撞 能 量 确 认 过 程 包 括 样 品 数 据 中 化 合 物 谱 图 的 生 成, 以 及 随 后 的 拟 合 逆 向 拟 合 谱 库 纯 度 匹 配 等 基 于 NIST 的 评 分 MS 谱 图 的 检 索 未 包 含 在 内, 因 为 基 质 干 扰 可 导 致 得 分 偏 低 另 外,MS 扫 描 中 出 现 的 母 离 子 在 MS 2 和 MS 3 水 平 的 扫 描 中 也 有 记 录 最 后, 提 供 了 一 种 数 据 处 理 的 自 动 程 序, 包 括 化 合 物 谱 图 的 生 成 检 索, 到 打 印 结 果 打 印 仅 局 限 于 那 些 识 别 出 的 化 合 物, 但 是 每 个 化 合 物 的 总 体 得 分 考 虑 到 多 级 裂 解 产 生 的 多 重 谱 图 可 能 与 谱 库 中 不 同 化 合 物 的 谱 图 相 匹 配 结 合 MS 2 和 MS 3 级 的 谱 图 匹 配 使 得 离 子 阱 谱 库 检 索 不 仅 成 为 独 特 的 鉴 定 工 具, 而 且 如 果 产 生 子 离 子 的 技 术 可 重 现, 如 应 用 梯 升 碰 撞 能 量, 结 果 则 更 为 可 靠 在 本 文 的 研 究 工 作 中, 由 Riverview Hospital 使 用 安 捷 伦 LC/MSD Trap XCT 质 谱 仪 产 生 谱 库, 设 定 碰 撞 能 量 的 30 % 至 200 % 作 为 梯 升 碰 撞 能 量 范 围, 此 处 设 定 的 碰 撞 能 量 为 1 V 梯 升 电 压 0.3 V 至 2.0 V 持 续 40 毫 秒 从 单 独 的 母 离 子 产 生 MS 2 谱 如 果 有 可 能, 重 复 这 个 过 程, 由 MS 2 中 分 离 得 到 母 离 子 裂 解 生 成 MS 3 谱
Riverview Hospital 使 用 该 谱 库 对 分 析 样 品 中 某 些 药 物 的 存 在 进 行 了 确 认 然 后, 在 St. lav's Hospital 和 Athens Doping Center 分 别 用 各 自 的 安 捷 伦 LC/MSD Trap 系 统 通 过 谱 库 进 行 样 品 识 别 在 每 种 情 况 下 显 示 的 谱 图 匹 配 都 证 明 了 安 捷 伦 LC/MSD Trap 质 谱 仪 产 生 的 子 离 子 具 有 重 现 性 同 时 还 证 明 实 现 了 自 动 分 析 引 言 离 子 阱 质 谱 具 有 最 高 的 全 扫 描 MS 2 采 集 灵 敏 度 碎 片 离 子 谱 被 认 为 是 分 子 的 指 纹 谱 图, 因 为 它 们 包 含 与 分 子 总 体 结 构 的 较 小 部 分 相 关 的 子 离 子 质 量 信 息 尽 管 其 它 的 质 谱 如 QQQ 和 QTF 也 能 产 生 子 离 子, 其 过 程 并 不 尽 相 同, 因 此 导 致 不 同 的 碎 片 离 子 谱 图 特 征 对 于 QQQ 和 QTF 仪 器, 均 产 生 真 正 的 MS/MS 谱, 子 离 子 不 仅 代 表 母 离 子 的 一 级 裂 解, 同 时 还 有 二 级 裂 解 三 级 裂 解 等 等 即 母 离 子 裂 解 后 仍 处 在 碰 撞 池 入 口 附 近 时, 裂 解 的 碎 片 离 子 可 能 在 飞 往 第 三 个 四 极 杆 之 前 产 生 进 一 步 的 裂 解 结 果,QQQ 或 QTF 产 生 的 最 终 MS/MS 谱 包 括 母 离 子 或 其 它 子 离 子 产 生 的 子 离 子 因 此, 裂 解 途 径 是 未 知 的 而 另 一 方 面, 离 子 阱 对 于 母 离 子 的 裂 解 选 择 性 更 好 进 行 分 离 后, 根 据 母 离 子 的 振 动 频 率 给 系 统 加 以 能 量 振 动 频 率 与 母 离 子 的 质 量 直 接 相 关 母 离 子 吸 收 外 加 的 能 量 进 而 裂 解 这 就 是 所 谓 的 共 振 激 发 然 而, 由 于 从 前 体 产 生 的 碎 片 离 子 有 不 同 的 质 量, 因 此 具 有 不 同 的 振 动 频 率, 它 们 不 吸 收 外 加 的 能 量 而 不 产 生 进 一 步 裂 解 结 果,MS/MS 谱 中 的 子 离 子 是 直 接 由 母 离 子 产 生 的 裂 解 后 对 子 离 子 进 一 步 分 离, 所 产 生 的 子 离 子 同 样 存 在 反 推 回 母 离 子 的 直 接 途 径 因 此, 离 子 阱 被 认 为 是 一 种 比 QQQ 或 QTF 更 轻 松, 但 是 更 具 专 属 性 的 质 谱 此 外, 离 子 阱 产 生 的 子 离 子 谱 图 比 其 它 仪 器 更 清 楚 进 一 步 产 生 MS 3 子 离 子 的 步 骤 提 高 了 对 母 离 子 结 构 的 专 属 性, 使 得 离 子 阱 成 为 结 构 解 析 的 独 特 仪 器 对 于 MS 3 质 谱 图 的 产 生 存 在 的 困 难 是 : 在 MS 2 级 可 能 没 有 留 下 足 够 的 母 离 子 以 在 MS 3 级 产 生 适 宜 的 信 号, 或 MS 2 碎 片 离 子 可 能 过 于 稳 定 不 易 裂 解 这 两 种 情 况 下, 都 不 可 能 产 生 MS 3 谱 MS 3 谱 图 的 采 集 在 提 高 专 属 性 的 同 时, 还 有 一 系 列 的 好 处 其 中 一 个 就 是 许 多 化 合 物 可 能 只 裂 解 生 成 失 水 离 子 (M + H - H 2 ) +, 不 能 很 好 地 提 供 信 息 在 MS 3 谱 图 中 进 一 步 产 生 碎 片 离 子 可 大 量 地 增 加 信 息 内 容 另 一 个 产 生 MS 3 谱 图 的 好 处 是 共 洗 脱 且 质 量 相 等 的 干 扰 物 在 MS 2 级 产 生 子 离 子, 可 在 MS 3 级 得 到 区 别 因 此,MS 3 谱 图 尤 其 清 楚 安 捷 伦 的 LC/MSD Trap 与 其 它 同 类 产 品 相 比 更 出 色, 是 由 于 其 具 备 的 附 加 特 点, 即 能 够 产 生 具 有 重 现 性 的 子 离 子 谱 这 种 从 仪 器 到 仪 器 之 间 的 重 现 性 主 要 是 基 于 SmartFrag 技 术, 即 在 离 子 阱 的 裂 解 过 程 中 梯 升 裂 解 能 量 ( 电 压 ) 默 认 的 范 围 是 30 % 至 200 %, 设 定 电 压 为 1 V, 这 是 典 型 设 置, 因 为 0.3 V (30 %) 对 于 大 多 数 母 离 子 不 足 以 产 生 裂 解, 而 2.0 V (200 %) 则 过 高 然 而, 使 用 如 此 宽 的 范 围 意 味 着 对 于 任 何 特 定 的 分 子 离 子, 裂 解 的 轰 击 总 是 在 此 范 围 内 通 常, 裂 解 轰 击, 即 产 生 碎 片 的 最 低 电 压 导 致 较 高 质 量 碎 片 离 子 的 产 生 通 过 梯 升 至 较 高 电 压, 产 生 了 越 来 越 小 的 碎 片 离 子 总 的 结 果 就 是 产 生 的 碎 片 离 子 具 有 宽 的 质 量 范 围, 这 对 于 谱 库 鉴 定 非 常 重 要 ( 工 作 原 理 见 图 1 ) 而 且, 如 此 宽 的 范 围 考 虑 到 不 同 的 离 子 阱 根 据 离 子 阱 质 量 分 析 器 的 几 何 学 和 缓 冲 气 压 力 所 引 起 的 微 妙 差 异 这 就 使 得 在 一 个 仪 器 上 产 生 谱 库, 有 可 能 在 其 它 仪 器 上 使 用 谱 库 进 行 检 索 2
Intens. x10 6 1.5 1.0 0.5 A CH 3 CH 3 CH 2 H H + All MS, 0.3min (#23) 359.1 [M+H] + 0.0 Intens. x10 6 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Intens. x10 5 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 186.9 B 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z CH 3 CH 3 + MS/MS(359), 0.9min (#45) 359.1 CH 2 H H [M+H _ 2(18)] + [M+H _ 18] + [M+H] + 313.2 341.1 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z + MS/MS(359), 1.3min (#57) 341.1 C 212.9 267.0 237.1 253.1 277.0 287.0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z [M+H _ 2(18)] + CH CH 2 H 3 CH 3 H 313.0 323.0 295.0 305.0 [M+H _ 18] + 图 1. 使 用 SmartFrag 产 生 泼 尼 松 的 宽 质 量 范 围 的 子 离 子 谱 图 的 图 解 谱 图 A 表 示 根 本 未 裂 解 谱 图 B 表 示 典 型 裂 解 电 压 1 V 下, 产 生 非 常 少 的 裂 解 谱 图 C 是 使 用 SmartFrag 的 结 果, 梯 升 电 压 0.3 至 2.0 V, 产 生 具 有 宽 质 量 范 围 的 碎 片 离 子 注 意 在 谱 图 C 中 没 有 母 离 子 强 度 存 在 3
表 1. Drugs_lib 谱 库 中 386 种 药 物 化 合 物 列 表 7- 乙 酰 氨 基 氯 硝 西 泮 7- 乙 酰 氨 基 硝 西 泮 8- 氯 茶 碱 醋 丁 洛 尔 乙 酰 氨 基 氯 硝 西 泮 对 乙 酰 氨 基 酚 乙 酰 唑 胺 醋 酸 己 脲 乙 酰 氨 基 苯 乙 哌 啶 酮 乙 酰 可 待 因 乙 酰 普 鲁 卡 因 胺 阿 昔 洛 韦 阿 芬 太 尼 阿 法 罗 定 阿 普 唑 仑 金 刚 烷 胺 氨 基 氯 硝 西 泮 氯 基 氟 硝 西 泮 氨 鲁 米 特 乙 胺 碘 呋 酮 氨 磺 必 利 阿 米 替 林 氨 氯 地 平 异 戊 巴 比 妥 阿 莫 沙 平 安 非 他 明 脱 水 芽 子 碱 脱 水 芽 子 碱 甲 酯 阿 尼 利 定 阿 普 比 妥 阿 替 洛 尔 阿 托 西 汀 阿 托 品 阿 扎 他 定 AZT 巴 氯 芬 巴 美 生 苯 甲 酰 芽 子 碱 苯 甲 酰 爱 康 宁 苯 扎 托 品 波 生 坦 除 草 定 溴 西 泮 溴 敌 隆 溴 苯 那 敏 丁 哌 卡 因 丁 丙 诺 啡 安 非 他 酮 仲 丁 巴 比 妥 布 他 比 妥 布 托 啡 诺 布 替 林 咖 啡 因 卡 托 普 利 卡 马 西 平 卡 马 西 平 环 氧 化 物 羧 基 四 氢 大 麻 酚 卡 溴 脲 卡 立 普 多 塞 来 考 昔 头 孢 氨 苄 西 替 利 嗪 利 眠 宁 氯 喹 扑 尔 敏 氯 丙 嗪 氯 磺 丙 脲 氯 普 噻 吨 西 咪 替 丁 甲 氰 咪 胍 西 酞 普 兰 克 仑 特 罗 氯 巴 占 氯 米 帕 明 氯 硝 西 泮 可 乐 宁 氯 氮 平 古 柯 乙 烯 可 卡 因 可 待 因 秋 水 仙 碱 皮 质 甾 酮 可 的 松 可 替 宁 赛 克 利 嗪 环 苯 扎 林 环 磷 酰 胺 赛 庚 啶 异 喹 胍 地 莫 西 泮 Desalkyl- 丙 吡 胺 Desalkyl- 氟 西 泮 地 昔 帕 明 去 甲 基 氯 氮 卓 去 甲 基 氯 巴 占 去 甲 基 氯 米 帕 明 去 甲 基 利 血 平 去 甲 基 多 虑 平 去 甲 基 氟 硝 西 泮 去 甲 基 马 普 替 林 去 甲 基 甲 琥 胺 去 甲 基 萘 普 生 去 甲 基 曲 米 帕 明 地 塞 米 松 右 美 沙 芬 地 西 泮 二 氮 嗪 双 氯 芬 酸 二 乙 胺 苯 丙 酮 双 氢 麦 角 胺 地 尔 硫 卓 乐 果 地 乐 酚 苯 海 拉 明 地 芬 诺 酯 苯 拉 林 双 嘧 达 莫 丙 吡 胺 多 奈 哌 齐 多 巴 胺 多 虑 平 多 西 拉 敏 氟 哌 利 多 Ecognine EDDP 依 米 丁 依 那 普 利 恩 卡 尼 麻 黄 碱 依 普 罗 沙 坦 红 霉 素 乙 基 吗 啡 Fenazepam 芬 氟 拉 明 非 诺 洛 芬 非 诺 特 罗 芬 太 尼 氟 卡 尼 氟 康 唑 醋 酸 氟 氢 可 的 松 氟 桂 利 嗪 氟 硝 西 泮 氟 西 汀 氟 哌 噻 吨 氟 奋 乃 静 氟 西 泮 氟 伏 沙 明 呋 塞 米 加 巴 喷 丁 庆 大 霉 素 格 列 齐 特 格 列 吡 嗪 格 列 本 脲 草 甘 膦 愈 创 木 酚 甘 油 醚 氟 哌 啶 醇 海 洛 因 海 索 比 妥 氢 氯 噻 嗪 氢 可 酮 氢 化 可 的 松 氢 吗 啡 酮 羟 基 阿 普 唑 仑 羟 基 阿 莫 沙 平 羟 基 安 非 他 酮 羟 氯 喹 羟 基 地 昔 帕 明 羟 基 氟 哌 啶 醇 羟 基 利 培 酮 羟 基 三 唑 仑 羟 嗪 布 洛 芬 丙 咪 嗪 吲 哚 美 辛 异 烟 肼 异 丙 肾 上 腺 素 伊 曲 康 唑 氯 胺 酮 凯 他 唑 仑 酮 康 唑 酮 基 布 洛 芬 酮 咯 酸 拉 贝 咯 尔 拉 莫 三 嗪 Leviteracetam 左 旋 多 巴 左 啡 诺 利 多 卡 因 洛 哌 丁 胺 劳 拉 西 泮 洛 沙 平 LSD 马 普 替 林 马 吲 哚 MDA 4
表 1. Drugs_lib 谱 图 库 中 386 种 药 物 化 合 物 列 表 ( 续 ) MDA-NH 3 loss MDEA MDMA Z-[(4- 氯 - 邻 用 苯 基 ) 氧 ] 丙 酸 甲 灭 酸 褪 黑 激 素 哌 替 啶 美 芬 妥 英 普 罗 米 那 甲 哌 卡 因 甲 丙 氨 酶 斯 卡 灵 3- 甲 氧 基 肾 上 腺 素 二 甲 双 胍 美 沙 酮 甲 基 苯 丙 胺 美 沙 吡 林 安 眠 酮 美 索 巴 莫 氨 甲 蝶 呤 甲 氧 异 丁 嗪 甲 琥 胺 甲 基 氯 硝 西 泮 甲 基 多 巴 甲 基 爱 康 宁 哌 甲 酯 甲 泼 尼 龙 甲 乙 哌 酮 甲 氧 氯 普 胺 美 托 洛 尔 甲 硝 唑 美 西 律 咪 达 唑 仑 米 氮 平 吗 氯 贝 胺 单 乙 酰 吗 啡 吗 啡 吗 啡 葡 糖 苷 酸 纳 多 洛 尔 纳 洛 酮 纳 曲 醇 纳 曲 酮 萘 普 生 奈 法 唑 酮 烟 碱 硝 基 安 定 呋 喃 妥 英 诺 米 芬 新 去 甲 氯 氮 平 去 甲 可 卡 因 去 甲 可 待 因 去 甲 芬 太 尼 去 甲 氟 西 汀 去 甲 氯 胺 酮 去 甲 哌 替 啶 去 甲 美 沙 酮 去 甲 吗 啡 去 甲 氧 可 酮 去 甲 羟 吗 啡 酮 去 甲 右 丙 氧 芬 去 甲 阿 米 替 林 奥 氮 平 奥 芬 那 君 奥 沙 西 泮 xbutynin 奥 卡 西 平 奥 卡 西 平 代 谢 物 氧 烯 洛 尔 氧 可 酮 羟 吗 啡 酮 羟 基 保 泰 松 罂 粟 碱 百 草 枯 帕 罗 西 汀 帕 吗 啉 青 霉 胺 戊 唑 辛 戊 巴 比 妥 己 酮 可 可 碱 哌 氰 嗪 奋 乃 静 非 那 西 丁 苯 环 利 定 苯 甲 曲 嗪 苯 乙 肼 苯 乙 双 胍 非 尼 拉 敏 苯 巴 比 妥 芬 特 明 保 泰 松 去 氧 肾 上 腺 素 盐 酸 苯 丙 醇 胺 苯 妥 英 福 尔 可 定 毒 莠 定 匹 莫 齐 特 吲 哚 洛 尔 哌 泊 噻 嗪 吡 罗 昔 康 苯 噻 啶 PMA 普 拉 西 泮 哌 唑 嗪 泼 尼 松 龙 泼 尼 松 丙 胺 卡 因 扑 米 酮 普 鲁 卡 因 胺 普 鲁 卡 因 丙 氯 拉 嗪 丙 环 啶 异 丙 嗪 普 罗 帕 酮 右 丙 氧 芬 普 萘 洛 尔 普 罗 替 林 伪 麻 黄 碱 二 甲 -4- 羟 色 胺 美 吡 拉 敏 吡 乙 二 酮 奎 的 平 奎 尼 丁 奎 宁 雷 米 普 利 雷 尼 替 丁 瑞 波 西 汀 瑞 芬 太 尼 利 培 酮 哌 醋 甲 酸 酒 石 酸 卡 巴 拉 汀 沙 丁 胺 醇 水 杨 酸 盐 东 莨 菪 碱 司 可 巴 比 妥 5- 羟 色 胺 舍 曲 林 西 布 曲 明 西 地 那 非 索 他 洛 尔 司 坦 唑 醇 士 的 宁 舒 芬 太 尼 磺 胺 嘧 啶 磺 胺 甲 口 恶 唑 柳 氮 磺 吡 啶 磺 吡 酮 磺 胺 异 口 恶 唑 舒 林 酸 舒 必 利 舒 马 普 坦 替 马 西 泮 特 布 他 林 睾 酮 丁 苯 那 嗪 四 环 素 四 氢 大 麻 醇 茶 碱 硫 乙 拉 嗪 硫 喷 妥 硫 丙 拉 嗪 甲 硫 哒 嗪 替 沃 噻 吨 噻 洛 芬 酸 噻 吗 洛 尔 妥 拉 磺 脲 甲 苯 磺 丁 脲 托 吡 酯 曲 马 多 反 苯 环 丙 胺 曲 唑 酮 曲 安 西 龙 氨 苯 喋 啶 三 唑 仑 三 氟 拉 嗪 苯 海 索 阿 利 马 嗪 甲 氧 苄 氨 嘧 啶 曲 米 帕 明 曲 吡 那 敏 文 拉 法 辛 维 拉 帕 米 氨 己 烯 酸 华 法 令 育 亨 宾 扎 来 普 隆 扎 那 米 韦 齐 拉 西 酮 唑 吡 坦 佐 美 酸 佐 匹 克 隆 珠 氯 噻 醇 5
本 文 中, 实 验 部 分 分 成 以 下 几 部 分 : 谱 库 的 生 成, 世 界 上 的 两 个 不 同 实 验 室 (Riverview Hospital 和 Athens Doping Lab) 将 谱 库 应 用 于 样 品, 以 及 第 三 个 实 验 室 (St. lav's Hospital) 以 自 动 的 方 式 进 行 化 合 物 的 鉴 定 和 报 告 实 验 部 分 第 1 部 分 建 立 谱 库 本 次 研 究 中 使 用 的 谱 库 包 括 表 1 中 的 化 合 物, 是 由 Riverview Hospital(Coquitlam,BC, 加 拿 大 ) 的 实 验 室 用 HPLC 和 LC/MSD Trap XCT 质 谱 仪 进 行 分 析 的 谱 库 简 称 为 Drugs_lib 液 相 色 谱 用 于 除 去 杂 质 产 生 的 背 景 干 扰, 这 些 杂 质 甚 至 可 能 存 在 于 化 合 物 标 样 中 在 标 样 溶 液 比 较 纯 的 情 况 下, 使 用 注 射 泵 直 接 进 样 也 是 可 以 的 每 种 化 合 物 以 其 标 样 注 入 液 相 色 谱 仪 进 行 快 速 洗 脱, 洗 脱 时 间 在 一 分 钟 左 右 色 谱 的 详 细 信 息 根 据 样 品 的 变 化 而 变 化, 因 此 不 在 此 处 列 出 另 外, 一 些 化 合 物 在 电 喷 雾 (ESI) 负 电 离 模 式 下 有 更 好 的 光 谱 信 号, 而 另 一 些 化 合 物 使 用 大 气 压 化 学 电 离 (APCI) 无 论 正 电 离 还 是 负 电 离 都 有 更 好 的 信 号 然 而, 大 部 分 化 合 物 在 ESI 电 离 模 式 有 最 佳 光 谱 响 应, 尤 其 是 后 来 在 St. lav's Hospital 和 Athens Doping Lab 的 分 析 中 得 到 了 证 实 用 于 产 生 谱 库 的 最 为 相 关 的 采 集 设 置 见 表 2 使 用 安 捷 伦 LC/MSD Trap XCT 质 谱 仪 采 集 谱 图, 其 中 包 括 一 张 MS/MS (MS 2 ) 谱 图 和 至 少 一 张 MS/MS/MS (MS 3 ) 谱 图 从 每 个 母 离 子 得 到 子 离 子 的 谱 图 是 特 定 的, 为 了 得 到 各 个 化 合 物 清 楚 的 子 离 子 谱 图 需 要 的 时 间 比 表 示 该 化 合 物 峰 宽 的 平 均 时 间 长 然 后 把 每 个 化 合 物 的 谱 图 转 入 谱 库, 因 此 相 关 的 谱 库 条 目 中 仅 包 含 一 张 MS/MS (MS 2 ) 谱 和 一 张 或 多 张 MS/MS/MS (MS 3 ) 谱 ( 图 2) 需 要 对 谱 库 中 用 什 么 谱 图 做 一 些 说 明 首 先, 尽 管 采 集 了 全 扫 描 MS,MS 谱 图 可 用 于 确 定 那 个 母 离 子 得 到 了 分 离 和 裂 解, 但 一 级 MS 本 身 并 未 用 于 谱 库 原 因 有 两 方 面, 一 是 MS 谱 中 可 能 包 含 共 洗 脱 的 干 扰 物 质 从 而 影 响 谱 图, 使 其 难 以 用 于 未 知 物 的 鉴 定 安 捷 伦 离 子 阱 软 件 使 用 的 将 每 个 未 知 化 合 物 的 谱 图 与 谱 库 相 匹 配 的 鉴 定 算 法 是 以 NIST 算 法 为 基 础 的 因 此, 从 每 次 谱 图 匹 配 可 得 到 拟 合 (F) 逆 向 拟 合 (RFit) 和 纯 度 (P) 的 得 分 拟 合 得 分 与 谱 库 谱 图 中 存 在 的 质 谱 峰 和 同 时 在 未 知 物 中 发 现 的 质 谱 峰 的 个 数 直 接 相 关 反 过 来 则 是 逆 向 拟 合 得 分, 与 未 知 物 中 的 质 谱 峰 和 同 时 在 谱 库 谱 图 中 出 现 的 质 谱 峰 的 个 数 相 关 因 此, 如 果 谱 库 谱 图 中 包 含 的 质 谱 峰 个 数 多 于 未 知 物 的 质 谱 峰 个 数, 则 拟 合 得 分 变 低 如 果 用 于 谱 库 的 谱 图 采 集 时 存 在 共 洗 脱 干 扰 物 的 话, 这 在 MS 谱 中 是 有 可 能 的 如 果 未 知 物 谱 图 存 在 干 扰, 则 其 逆 向 拟 合 得 分 会 变 低 结 果, 更 可 取 的 办 法 就 是 不 考 虑 采 用 MS 谱 用 作 鉴 定 其 次, 在 MS 谱 中 的 最 为 重 要 的 信 息, 即 母 离 子 质 量, 存 在 于 MS 2 和 MS 3 谱 中, 因 为 它 们 都 是 从 母 离 子 经 过 一 定 的 裂 解 途 径 产 生 的 如 图 2 所 示, 每 个 化 合 物 条 目 包 括 一 个 MS 2 谱 和 通 常 至 少 一 个 MS 3 谱 CAS 号 化 学 分 子 式 和 结 构 式 图 另 外, 每 个 谱 图 中 的 质 量 列 表 经 过 了 筛 选, 即 丰 度 小 于 10 的 m/z 值 不 包 括 在 谱 图 中 这 样 做 的 原 因 是 最 大 的 m/z 被 归 一 化 至 999, 丰 度 为 10 表 示 约 为 1.0 % 1.0 % 阈 值 相 当 于 分 离 过 程 后 的 残 余 信 号 即, 分 离 进 离 子 阱 的 母 离 子 大 于 99 %, 而 不 是 正 好 100 % 因 此, 随 着 母 离 子 的 分 离, 可 以 最 多 有 1% 的 m/z 信 号 未 进 入 分 离 窗 口 由 于 残 余 部 分 不 能 代 表 母 离 子 裂 解 的 碎 片, 因 此 从 谱 库 中 将 其 除 去 了 表 2. 用 于 建 立 谱 库 的 质 谱 采 集 设 置 参 数 设 定 值 梯 升 碰 撞 能 量 0.3 2.0 V 母 离 子 分 离 宽 度 4 amu 采 集 的 谱 图 1 MS, 1 MS 2, and 1 MS 3 ( 如 可 能 ) 6
图 2. 谱 库 条 目 为 可 卡 因 化 合 物, 包 括 一 张 MS 2 谱 和 一 张 MS 3 谱 第 2 部 分 将 谱 库 用 于 鉴 定 例 1 (Riverview Hospital) 使 用 该 谱 库 鉴 定 或 确 认 存 在 药 物 化 合 物 的 第 一 个 例 子 是 在 Riverview Hospital 中 进 行 病 人 血 液 提 取 物 中 药 物 化 合 物 的 鉴 定 尽 管 Drugs_lib 谱 库 中 的 谱 图 是 在 相 同 的 LC/MSD Trap XCT 仪 器 上 运 行 标 样 得 到 的, 但 是 病 人 样 品 中 含 有 血 液 提 取 基 质, 可 能 因 为 与 目 标 化 合 物 共 洗 脱 而 干 扰 被 测 物 的 信 号 因 此, 对 于 谱 库 的 第 一 次 应 用 证 明 了 MS 2 能 选 择 性 地 排 除 样 品 基 质 的 干 扰 对 病 人 样 品 的 分 析 使 用 AutoMS (3) ( 图 10) 进 行 谱 图 采 集, 在 MS 模 式 或 全 扫 描 MS 模 式 进 行 信 号 监 测 当 允 许 选 择 窗 口 中 任 何 离 子 的 强 度 超 过 最 小 阈 值, 该 离 子 即 被 设 为 母 离 子 并 被 裂 解 每 个 MS 谱 中 最 多 可 选 择 2 个 母 离 子 一 旦 母 离 子 发 生 裂 解, 超 出 阈 值 的 子 离 子 即 进 一 步 裂 解 产 生 MS 3 谱 图 每 个 MS 2 谱 图 中 仅 选 择 1 个 母 离 子 7
由 于 产 生 的 结 果 文 件 中 包 含 MS MS 2 和 MS 3 谱 图, 使 用 软 件 中 的 一 个 特 殊 算 法 产 生 相 应 的 化 合 物, 每 个 化 合 物 包 括 MS,MS 2 和 MS 3 谱, 在 1 分 钟 的 时 间 窗 口 中, 这 些 MS,MS 2 和 MS 3 谱 彼 此 相 关 时 间 窗 口 很 重 要, 因 为 如 果 后 面 有 一 个 具 有 相 同 m/z 母 离 子 质 量 的 化 合 物 被 洗 脱 的 话, 合 适 的 时 间 窗 口 可 保 证 它 不 会 与 前 面 洗 脱 的 化 合 物 相 混 淆 图 3 是 对 一 个 病 人 样 品 数 据 文 件 应 用 特 殊 算 法 的 结 果, 该 算 法 也 被 称 为 Find-Compounds AutoMS (n) 基 于 算 法 中 的 用 户 定 义 参 数 设 置, 发 现 10 个 化 合 物, 每 个 至 少 都 包 含 MS 谱 和 MS 2 谱, 一 些 有 MS 3 谱, 如 图 所 示 下 一 步 是 用 Drugs_lib 鉴 定 这 些 化 合 物, 谱 库 中 同 样 包 含 MS 2 谱, 大 多 数 化 合 物 还 有 MS 3 谱 在 这 点 上, 必 须 注 意 的 是 MSD Trap 软 件 中 的 鉴 定 算 法 设 置 成 忽 略 样 品 数 据 文 件 中 化 合 物 的 MS 谱 因 此, 只 有 样 品 中 的 MS 2 和 MS 3 谱 和 谱 库 中 的 MS 2 和 MS 3 谱 相 比 较 样 品 数 据 文 件 中 忽 略 MS 谱 有 两 点 理 由 首 先,MS 谱 中 包 含 共 洗 脱 干 扰 物, 可 能 降 低 光 谱 匹 配 的 NIST 得 分 其 次,MS 谱 中 仅 有 的 重 要 信 息 是 母 离 子 质 量, 这 也 存 在 于 MS 2 和 MS 3 谱 中 以 后 如 果 加 钠 峰 或 加 钾 峰 用 于 鉴 定,MS 数 据 仍 有 用 于 进 一 步 的 研 究 的 意 义 图 3. 病 人 血 液 提 取 样 品 数 据 文 件 名 为 1141bg 中 发 现 的 10 个 化 合 物 注 意 : 化 合 物 的 鉴 定 基 于 用 户 自 定 义 参 数 设 置 8
在 对 化 合 物 进 行 识 别 后, 未 得 到 识 别 的 化 合 物 可 使 用 图 4 所 示 Visual Basic script 将 其 从 分 析 列 表 中 删 除 通 过 运 行 此 script, 相 关 化 合 物 的 数 目 由 10 个 减 为 5 个, 见 图 5 所 示 这 5 个 化 合 物 的 识 别 见 图 6 显 然, 化 合 物 4 和 5 是 同 一 个 化 合 物, 表 示 一 个 强 度 很 大 的 峰, 其 洗 脱 时 间 超 过 1 分 钟 图 4. 删 除 未 能 用 谱 库 识 别 的 化 合 物 所 用 的 Visual Basic script 这 能 使 所 报 告 的 结 果 更 简 洁 图 5. 在 对 样 品 数 据 文 件 进 行 化 合 物 谱 图 检 索 后, 只 有 5 个 化 合 物 得 到 了 谱 库 的 识 别 图 4 中 所 示 script 删 除 了 未 识 别 的 化 合 物 9
图 6. 病 人 血 液 提 取 样 品 中 鉴 定 出 的 化 合 物, 包 括 阿 替 洛 尔 替 马 西 泮 阿 扎 他 定 和 维 拉 帕 米 图 6 中 显 示 的 得 分 ( 拟 合 Fit' 逆 向 拟 合 RFit' 和 纯 度 Purity') 是 考 虑 了 样 品 化 合 物 和 谱 库 中 包 括 MS 2 和 MS 3 级 的 多 种 光 谱 匹 配 程 度 的 有 效 得 分 例 如 : 考 虑 阿 替 洛 尔 的 得 分 计 算 有 效 得 分 的 公 式 如 下 : 库 中 一 张 MS 2 谱 与 化 合 物 1 的 MS 2 谱 相 匹 配, 匹 配 值 最 大 为 1,000,MS 3 谱 也 是 一 样 如 果 一 张 MS 3 谱 与 MS 2 谱 相 匹 配, 则 匹 配 值 为 500 因 此, 有 效 拟 合 得 分 Fit' 为 [(991 1000+1000 1000)/ (2 10 6 )] 1/2 1000=998, 如 图 6 所 示 每 个 光 谱 的 拟 合 逆 向 拟 合 和 纯 度 得 分 都 是 由 NIST 算 法 得 来 的, 对 于 多 重 谱 图 的 匹 配 和 不 同 级 的 MS n 的 处 理 是 MSD Trap 数 据 分 析 软 件 所 独 有 的 这 是 导 出 被 讨 论 化 合 物 的 总 体 得 分 或 有 效 得 分 的 智 能 化 方 式 Score' 表 示 有 效 得 分, 而 Score 表 示 数 据 文 件 中 每 个 匹 配 光 谱 的 得 分 N 值 是 所 有 光 谱 数,M 是 识 别 光 谱 数 匹 配 得 分 与 用 户 定 义 匹 配 参 数 有 关 参 见 数 据 文 件 中 阿 替 洛 尔 的 结 果 ( 见 图 7), 化 合 物 1 的 识 别 光 谱 MS 2 谱 的 单 独 拟 合 得 分 是 991,MS 3 谱 是 1,000 如 果 谱 看 一 下 实 际 光 谱 匹 配, 仍 以 阿 替 洛 尔 为 例 图 8 显 示 了 图 6 谱 库 报 告 中 的 MS 2 和 MS 3 谱 图 匹 配 情 况 图 6 同 样 显 示 化 合 物 1 只 能 被 识 别 为 阿 替 洛 尔, 而 不 是 谱 库 中 的 其 它 药 物 这 证 明 了 同 时 使 用 MS 2 和 MS 3 谱 图 作 为 鉴 定 的 能 力, 同 时 证 明 了 使 用 梯 升 碰 撞 能 量 在 很 宽 的 质 量 范 围 形 成 碎 片 离 子 的 重 现 性 图 7. 化 合 物 1 的 单 独 谱 库 检 索 得 分 MS 2 谱 图 的 拟 合 得 分 是 991,MS 3 谱 的 拟 合 得 分 是 1,000, 可 能 是 最 大 值 10
样 品 2 (Athens Doping Lab) 使 用 梯 升 碰 撞 能 量 或 SmartFrag 的 定 向 MS 2 谱 同 时 对 尿 样 中 存 在 的 皮 质 激 素 进 行 了 确 认 和 定 量 测 定 虽 然 使 用 确 定 的 碰 撞 能 量 可 更 好 地 定 量, 但 执 行 SmartFrag 能 提 供 用 于 鉴 定 的 光 谱 的 同 时 仍 能 提 供 高 灵 敏 度 的 MS 2 全 扫 描 图 在 一 个 被 称 为 CMX_12 的 样 品 中, 通 过 谱 库 鉴 定 确 认 了 曲 安 西 龙 皮 质 甾 酮 氢 化 可 的 松 泼 尼 松 龙 泼 尼 松 甲 泼 尼 龙 地 塞 米 松 的 存 在 并 进 行 了 定 量 测 定 图 9A 和 9B 显 示 了 两 个 例 子 尽 管 在 这 个 样 品 中 没 有 采 集 到 MS 3 数 据,MS 2 谱 的 匹 配 得 分 均 大 于 900 然 而, 应 该 注 意 的 是, 如 果 也 能 获 得 MS 3 谱, 其 有 效 得 分 将 更 接 近 1000 没 采 集 MS 3 谱 的 原 因, 是 因 为 要 节 省 时 间 以 获 取 足 够 的 MS 2 信 号 用 于 定 量 Compound 1 MS 2 Library Compound 1 MS 3 Library 图 8. 化 合 物 1 谱 图 与 Drugs_lib 中 阿 替 洛 尔 谱 图 的 匹 配 11
Compound 8 MS 2 Library 图 9A. 化 合 物 8 谱 图 与 Drugs_lib 中 氢 化 可 的 松 谱 图 的 匹 配 Compound 10 MS 2 Library 图 9B. 化 合 物 9 谱 图 与 Drugs_lib 中 泼 尼 松 龙 谱 图 的 匹 配 由 于 没 能 同 时 检 索 MS 3 谱, 谱 库 报 告 中 报 告 的 有 效 得 分 使 用 上 式 计 算, 与 图 9A 和 9B 所 示 相 同 另 外, 值 得 注 意 的 是 尽 管 质 量 分 配 最 多 改 变 了 0.3 amu, Riverview Hospital 的 安 捷 伦 离 子 阱 和 Athens Doping Lab 的 安 捷 伦 离 子 阱 得 到 的 谱 图 在 数 据 比 较 的 表 现 上 惊 人 的 相 似 事 实 上, 两 种 离 子 阱 组 件 也 是 不 同 的 Athens Doping Lab 的 离 子 阱 是 LC/MSD Trap SL, 是 Riverview Hospital 的 离 子 阱 较 早 型 号 LC/MSD Trap XCT 12
第 3 部 分 用 谱 库 自 动 筛 分 在 St. lav's Hospital( 特 隆 赫 姆, 挪 威 ) 的 临 床 药 理 部 (DCP) 使 用 LC/MS 进 行 了 滥 用 药 物 的 高 通 量 检 测, 一 年 进 行 一 百 万 次 以 上 的 分 析 传 统 的 检 测 是 通 过 免 疫 测 定 进 行 的, 与 LC/MS 相 比, 费 用 高 且 选 择 性 差 传 统 的 方 法 是 在 检 测 过 程 中 发 现 阳 性 样 品 后 采 用 GC/MS 进 行 确 认, 这 需 要 在 样 品 制 备 过 程 中 进 行 衍 生 化 在 这 种 情 况 下, 使 用 LC/MS/MS 谱 库 以 自 动 方 式 进 行 化 合 物 存 在 的 确 认 就 非 常 有 价 值 在 这 一 部 分, 使 用 DCP 的 安 捷 伦 LC/MSD Trap XCT 质 谱 仪 进 行 的 确 认 分 析 结 果 得 到 了 证 明 同 样 的, 也 使 用 了 SmartFrag 这 一 次 通 过 LC/ 离 子 阱 分 析 被 检 测 样 品 中 的 化 合 物, 使 用 Data-Dependent 采 集 方 式, 其 中 参 考 了 一 系 列 的 母 离 子 因 此, 再 次 用 到 了 AutoMS (3), 但 是 对 于 这 次 得 到 证 实 的 分 子 离 子, 有 一 个 相 应 的 包 含 m/z 值 的 列 表 通 过 这 种 方 式, 离 子 阱 检 测 采 集 MS 谱 时, 看 在 特 定 的 背 景 阈 值 下 是 否 有 这 些 离 子 出 现, 如 果 出 现, 离 子 阱 将 把 它 们 分 离 并 裂 解 如 果 MS 2 阶 段 的 任 何 子 离 子 超 出 用 户 定 义 水 平, 则 该 相 应 的 子 离 子 将 被 分 离 和 进 一 步 裂 解 采 集 谱 图 的 参 数 设 置 如 图 10 所 示 图 10 中 显 示 的 在 Include 列 表 中 包 含 的 离 子 见 表 3 序 列 中 每 个 数 据 文 件 的 数 据 采 集 一 完 成, 数 据 文 件 就 会 自 动 转 到 LC/MSD 数 据 分 析 程 序, 其 中 应 用 了 一 种 Visual Basic script 以 首 先 发 现 数 据 文 件 中 的 所 有 化 合 物 这 是 按 照 前 面 的 讨 论 ( 见 图 3) 进 行 的, 生 成 所 有 可 能 的 MS MS 2 和 MS 3 提 取 离 子 流 色 谱 图 (EICs) 后, 对 这 些 EICs 中 的 色 谱 峰 进 行 定 位, 然 后 根 据 基 于 MS 的 母 离 子 m/z 及 其 来 源 将 质 谱 图 与 色 谱 峰 一 一 关 联 每 组 光 谱 对 应 一 个 化 合 物 图 10. 确 认 采 集 的 AutoMS (3) 设 置 表 3. 用 于 Data-Dependent MS 2 和 MS 3 的 母 离 子 列 表 母 离 子 (m/z) 化 合 物 母 离 子 (m/z) 化 合 物 136.2 安 非 他 明 286.2 吗 啡 150.2 甲 基 苯 丙 胺 300.2 可 待 因 166.2 麻 黄 碱 310.0 美 沙 酮 180.2 MDA 314.2 乙 基 吗 啡 194.2 MDMA 316.2 氧 可 酮 244.2 苯 环 利 定 399.2 福 尔 可 定 13
然 后 将 化 合 物 的 MS 2 和 MS 3 谱 用 Drugs_lib 谱 库 数 据 库 自 动 进 行 检 索, 计 算 每 个 光 谱 对 应 于 谱 库 中 光 谱 的 NIST 拟 合 逆 向 拟 合 和 纯 度 得 分 为 利 用 LC/MS Trap 在 MS 2 上 保 留 特 征 路 径 信 息 的 优 点, 仅 检 索 谱 库 中 的 MS 2 谱 图 用 于 与 样 品 化 合 物 的 MS 2 谱 图 相 比 较 在 MS 3 谱 中, 尽 管 不 同 的 MS 2 子 离 子 以 不 同 的 途 径 发 生 裂 解, 但 得 到 的 许 多 子 离 子 是 相 同 的 因 此, 如 果 MS 2 子 离 子 有 差 异, 检 索 算 法 允 许 样 品 化 合 物 MS 3 谱 与 谱 库 MS 3 谱 进 行 比 较 不 过, 即 使 MS 2 子 离 子 可 能 有 差 异, 所 有 检 索 仅 限 于 在 进 行 样 品 化 合 物 光 谱 和 谱 库 光 谱 MS 2 差 异 比 较 的 同 时, 也 比 较 相 应 的 MS 3 谱 最 后, 未 得 到 识 别 的 化 合 物 通 过 使 用 自 动 script 将 其 从 报 告 中 删 除, 同 图 4 所 示 使 用 离 子 阱 谱 库 的 一 个 好 例 子 是 自 动 生 成 图 11 和 图 12 所 示 的 谱 库 报 告, 数 据 文 件 名 为 012-1901 所 涉 及 的 样 品 通 过 安 捷 伦 LC/MSD 单 四 极 杆 质 谱 仪 进 行 检 测, 检 出 安 非 他 明 甲 基 苯 丙 胺 和 可 待 因 尿 样 中 的 可 待 因 的 含 量 为 6.5 µg/ml, 其 它 两 个 药 物 的 含 量 太 低, 无 法 准 确 测 得 报 告 中 的 结 果 不 仅 证 明 了 该 方 法 识 别 样 品 中 已 知 化 合 物 的 能 力, 而 且 灵 敏 度 高 可 检 出 在 监 测 过 程 中 未 发 现 的 两 个 化 合 物 吗 啡 和 MDMA 报 告 中 显 示 的 得 分 是 根 据 MS 2 和 MS 3 的 匹 配 经 数 学 计 算 得 到 的 有 效 得 分 图 12 表 示 在 St. lav's 实 验 室 分 析 的 样 品 和 在 Riverview Hospital 实 验 室 得 到 的 谱 库 中 可 待 因 的 光 谱 匹 配 程 度 高 使 用 MS 3 谱 的 重 要 性 通 过 以 下 事 实 得 到 了 证 明 : MS 2 的 匹 配 单 独 得 分 均 低 于 900, 而 MS 3 的 得 分 均 接 近 1000, 因 此 图 11 中 显 示 的 总 有 效 得 分 均 高 于 900 图 11. 得 到 识 别 的 化 合 物 报 告 的 第 1 页 14
图 12. 报 告 中 显 示 光 谱 匹 配 的 一 页 结 论 使 用 梯 升 碰 撞 能 量 获 得 的 MS 2 和 MS 3 谱 是 确 认 样 品 中 化 合 物 存 在 的 有 效 技 术 MS 3 谱 增 加 了 分 析 的 专 属 性, 并 且 一 种 全 面 得 分 技 术 需 要 同 时 计 算 MS 2 和 MS 3 水 平 的 光 谱 匹 配 从 单 独 的 NIST 得 分 计 算 有 效 得 分 考 虑 了 对 感 兴 趣 化 合 物 的 全 面 鉴 定 为 提 高 效 率, 数 据 处 理 化 合 物 鉴 定 和 报 告 必 须 自 动 进 行 15
www.agilent.com/chem/cn 更 多 信 息 关 于 此 项 技 术 概 述 的 详 细 信 息 请 联 系 安 捷 伦 公 司 的 Michael Zumwalt 工 程 师 如 需 有 关 我 们 产 品 和 服 务 的 更 多 信 息, 请 访 问 我 们 的 网 站 :www.agilent.com/chem/cn 安 捷 伦 对 本 材 料 中 的 错 误 与 设 备 性 能 或 本 品 的 使 用 有 关 的 意 外 伤 害 或 由 此 造 成 的 损 坏 不 负 任 何 责 任 本 文 中 的 信 息, 说 明 和 指 标, 如 有 变 更, 恕 不 另 行 通 知 安 捷 伦 科 技 有 限 公 司,2006 2006 年 12 月 中 国 印 刷 5989-5861CHCN