不 同 方 法 检 测 乙 型 肝 炎 血 清 学 标 志 物 的 结 果 比 较 王 岚 沈 立 松 ( 上 海 第 二 医 科 大 学 附 属 新 华 医 院 检 验 科, 上 海 200092) 摘 要 : 目 的 探 讨 不 同 方 法 在 乙 肝 血 清 学 标 志 物 临 床 检 测 中 的 应 用 价 值 方 法 用 3 种 试 剂 (EIA TRF MEIA) 对 乙 肝 初 诊 患 者 血 清 进 行 五 项 标 志 物 检 测 结 果 TrF 试 剂 检 测 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 均 优 于 EIA 试 剂 ; TrF 试 剂 的 最 低 可 检 测 稀 释 度 与 MEIA 试 剂 基 本 相 同 结 论 与 EIA 试 剂 相 比,TrF 试 剂 在 乙 肝 五 项 临 床 检 测 中 具 有 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 检 测 灵 敏 度 较 高 的 优 势 关 键 词 : 乙 型 肝 炎 血 清 学 标 志 物 试 剂 Comparative study of different methods in clinical tests of five seromarkers of hepatitis B WANG Lan, SHEN Lisong. Department of clinical Laboratory, Xinhua Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092,China Abstract: Objective To evaluate the value of different methods in clinical tests of seromarkers of hepatitis B. Methods Sera from hepatitis B patients were measured by three reagents (EIA TRF MEIA) for five seromarkers. Results the relative sensitivity, speciality and total accordant ratio of HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb were measured by TRF reagent are superior to EIA reagent, the minimum detectable diluted concentration of TRF reagent is similar to MEIA reagent. Conclusions Compared with EIA reagent, the relative sensitivity, speciality and detectable sensitivity of five seromarkers of hepatitis B in clinical tests by TRF reagent is more preferable. Key words: Different methods;hepatitis B;Seromarkers 乙 型 肝 炎 血 清 学 标 志 物 (HBV-M) 检 测 是 了 解 机 体 是 否 感 染 或 感 染 过 HBV 以 及 机 体 对 HBV 感 染 的 免 疫 状 态 的 重 要 指 标, 在 乙 肝 患 者 诊 断 治 疗 及 流 行 病 学 调 查 等 方 面 具 有 重 要 意 义, 现 有 多 种 检 测 方 法 应 用 于 临 床, 我 们 用 酶 免 法 (enzyme immunoassay, EIA) 时 间 分 辨 荧 光 (time-resolved fluorescence, TrF) 法 和 微 粒 子 酶 免 疫 分 析 (microparticle enzyme immunoassay, MEIA) 试 剂 对 临 床 血 清 标 本 进 行 乙 肝 5 项 标 志 物 的 检 测, 探 讨 其 应 用 价 值, 现 报 道 如 下 材 料 和 方 法 1
一 材 料 1. 检 测 血 清 标 本 来 自 随 机 选 择 自 2002 年 8 月 ~11 月 间 本 院 住 院 或 门 诊 患 者, 采 静 脉 血 及 时 分 离 血 清, 置 -70 C 保 存 备 测 2. 各 指 标 系 列 稀 释 梯 度 灵 敏 度 测 定 的 强 阳 性 样 本 由 上 海 新 波 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供 二 仪 器 和 试 剂 1. MEIA 试 剂 和 仪 器 为 美 国 Abbott Axsym 全 自 动 免 疫 分 析 系 统 :HBsAb 定 量 检 测 范 围 为 0-1000 miu/ml, 其 余 HBV-M 无 线 性 检 测 范 围 ;HBsAg 以 S/N <2 为 阴 性,HBsAb 值 < 10mIU/ml 为 阴 性,HBeAg 以 S/co <1 为 阴 性,HBeAb 以 S/co >1 为 阴 性,HBcAb 以 S/co 1~3 为 阴 性 2. 时 间 分 辨 荧 光 分 析 仪 Anytest2000 及 配 套 试 剂 由 上 海 新 波 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供 ; TrF 试 剂 检 测 五 项 HBV-M 的 线 性 范 围 如 下 :HBsAg:0.2-150ng/ml HBsAb:5-640mIU/ml HBeAg:0.03-8 Ncu/ml HBeAb:0.6-16 Ncu/ml HBcAb:0.08-8 Ncu/ml 3.EIA 检 测 采 用 国 内 某 公 司 的 一 步 法 EIA 试 剂, 酶 标 仪 R-530 及 洗 板 机 为 Organon Teknika 产 品 EIA 试 剂 HBV-M 无 线 性 检 测 范 围 三 方 法 1. 按 试 剂 盒 说 明 书 操 作 和 判 定 结 果 2. 检 测 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb 和 HBcAb 指 标 的 血 清 样 品 分 别 为 383 309 309 307 和 309 份, 每 个 指 标 均 用 3 种 试 剂 (MEIA TrF 及 EIA) 检 测 3. 各 指 标 强 阳 性 系 列 稀 释 梯 度 测 定 灵 敏 度 比 较 : 各 指 标 强 阳 性 样 本 作 10 个 浓 度 稀 释, 用 3 种 试 剂 检 测 结 果 一 以 MEIA 检 测 结 果 为 标 准, 计 算 TrF 试 剂 EIA 试 剂 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率, 结 果 见 表 1:5 项 检 测 指 标 中,TrF 试 剂 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 均 大 于 96%; 其 中 HBsAg TrF 试 剂 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 与 MEIA 试 剂 一 致 性 皆 达 100%;TrF 试 剂 检 测 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb 四 个 指 标 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 均 优 于 EIA 试 剂 ; HBcAb 指 标 由 于 MEIA,TrF 用 原 倍 血 清 检 测, EIA 用 1:30 倍 血 清 检 测, 因 此 三 者 不 具 有 可 比 性 表 1 TrF 试 剂 与 EIA 试 剂 检 测 临 床 标 本 结 果 : 2
TrF EIA 组 别 标 本 数 相 对 灵 敏 度 (%) 相 对 特 异 性 (%) 总 符 合 率 (%) 相 对 灵 敏 度 (%) 相 对 特 异 性 (%) 总 符 合 率 (%) HBsAg 383 100 100 100 96.15 98.69 98.17 HBsAb 309 97.12 97.07 97.09 93.27 90.24 91.26 HBeAg 309 96.15 100 99.68 84.62 98.94 97.73 HBeAb 307 96.58 97.89 97.39 86.32 88.95 87.95 HBcAb 309 96.79 96.7 96.76 真 阳 性 数 真 阴 性 数 注 : 相 对 灵 敏 度 ( 真 阳 性 率 )= 100% ; 相 对 特 异 性 ( 真 阴 性 率 )= 100%; 真 阳 + 假 阴 真 阴 + 假 阳 真 阴 性 数 + 真 阳 性 数 总 符 合 率 = 100% 真 阴 + 假 阴 + 真 阳 + 假 阳 二 3 种 试 剂 的 最 低 可 检 测 稀 释 度 :TrF 试 剂 的 最 低 可 检 测 稀 释 度 与 MEIA 试 剂 基 本 相 同, 其 中 HBeAb TrF 试 剂 高 于 MEIA 试 剂 ; 除 HBcAb 外, 其 余 指 标 TrF 试 剂 的 最 低 可 检 测 稀 释 度 皆 高 于 EIA 试 剂 表 2 3 种 方 法 对 不 同 项 目 强 阳 性 样 本 的 最 低 可 检 测 稀 释 度 项 目 TrF MEIA EIA HBsAg 1:400000 1:400000 1:100000 HBsAb 1:160000 1:160000 1:30000 HBeAg 1:1024 1:1024 1:256 HBeAb 1:6400 1:3200 1:3200 HBcAb 1:3200 1:3200 1:3200 讨 论 实 验 显 示, 五 个 检 测 指 标 中,TrF 试 剂 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 均 大 于 96%, 此 试 剂 检 测 除 HBcAb 以 外 的 四 个 指 标 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 均 优 于 EIA 试 剂, 而 其 相 对 特 异 性 总 符 合 率 和 最 低 检 测 稀 释 度 皆 高 于 EIA 试 剂, 究 其 原 因 可 能 与 二 者 采 用 不 同 反 应 原 理 有 关 3
TrF 试 剂 采 用 稀 土 离 子 (Eu 3+ ) 螯 合 物 作 为 标 记 物, 二 步 法 检 测 ;EIA 试 剂 以 酶 作 为 标 记 物, 一 步 法 检 测 [1] TrF 技 术 利 用 稀 土 离 子 螯 合 物 的 光 谱 特 点 时 间 分 辨 ( 即 稀 土 离 子 螯 合 物 所 产 生 的 荧 光 半 寿 期 比 样 品 中 蛋 白 质 类 的 本 底 荧 光 及 其 他 非 特 异 荧 光 衰 变 时 间 长, 可 通 过 延 缓 测 量 时 间 有 效 降 低 自 然 本 底 及 非 特 异 荧 光 的 干 扰 ) 和 波 长 分 辨 ( 指 激 发 光 和 发 射 光 之 间 有 一 较 大 的 Stokes 位 移, 有 利 于 消 除 非 特 异 荧 光 的 干 扰, 增 强 荧 光 信 号 检 测 的 特 异 性 ), 并 采 用 独 特 的 荧 光 解 离 - 增 强 (DELFIA) 技 术 ( 即 通 过 加 入 增 强 液, 标 记 物 Eu 3+ 在 DELFIA 体 系 中 有 非 常 优 良 的 可 检 测 性, 可 使 有 效 荧 光 效 率 增 强 约 100 万 倍 ), 从 而 灵 敏 度 明 显 比 ELISA 高, 并 具 有 定 量 检 测 功 能 有 文 献 报 道 TrF 对 HBsAg 的 最 小 可 测 值 为 0.05ng/ml 以 下, 而 采 用 振 荡 反 应 并 适 当 延 长 孵 育 时 间, 更 有 助 于 提 高 灵 敏 度, 降 低 本 底 [2] EIA 一 步 法 缩 短 了 实 验 时 间, 但 大 量 研 究 显 示, 如 标 本 中 HBsAg 浓 度 过 高 会 因 钩 状 效 应 导 致 漏 检 [3,4], 尤 其 在 没 有 检 测 乙 肝 五 项 而 只 检 测 HBsAg 时 ; 另 有 研 究 揭 示 EIA 检 测 HBsAg [5] 浓 度 在 5ng/ml 以 下 约 有 2.92% 的 假 阳 性 率 采 用 经 典 的 二 步 法 检 测 是 解 决 因 钩 状 效 应 而 导 致 漏 检 的 最 可 靠 方 法 [6],TRF 两 步 法 加 振 动 孵 育 可 避 免 钩 状 效 应 及 提 高 检 测 灵 敏 度, 这 也 许 是 本 实 验 TRF 检 测 HBsAg 与 MEIA 结 果 完 全 符 合 的 原 因 之 一 EIA 检 测 HBeAg 时 如 血 液 标 本 没 有 离 心 彻 底 易 导 致 假 阳 性, 检 测 抗 -HBe 时, 血 清 中 存 在 HBeAg 极 易 产 生 前 带 现 象 而 导 致 假 阳 性 [7] ; 当 前, 许 多 医 院 为 了 方 便 患 者 就 医, 于 抽 血 当 日 发 出 检 验 报 告, 由 此 会 出 现 因 血 液 [8] 不 完 全 血 球 沉 降 不 充 分 标 本 溶 血 等 现 象 而 改 变 显 色 程 度 导 致 假 阳 性 结 果 TRF 技 术 以 稀 土 离 子 作 为 标 记 物 避 免 了 这 些 因 素 的 影 响, 这 也 许 是 本 实 验 TRF 的 四 个 检 测 指 标 的 相 对 灵 敏 度 相 对 特 异 性 和 总 符 合 率 均 优 于 EIA 试 剂 的 原 因 所 在 TrF 技 术 对 低 浓 度 HBsAg 的 有 效 检 测 在 流 行 病 学 筛 查, 临 床 诊 断, 尤 其 是 血 站 系 统 献 血 员 的 筛 查, 保 证 输 血 和 血 制 品 安 全, 控 制 医 源 性 感 染 有 较 大 帮 助 此 外,TrF 技 术 的 定 量 检 测 功 能 在 HBV-M 临 床 检 测 的 意 义 可 简 述 为 :1) 可 了 解 药 物 疗 效 大 小, 为 医 生 选 药 提 供 线 索 ;2) 有 利 于 动 态 观 察 病 情, 为 选 择 治 疗 方 案 提 供 依 据 ; 3) 有 利 于 对 免 疫 状 况 进 行 评 估, 为 注 射 乙 肝 疫 苗 提 供 指 导 EIA 检 测 不 能 提 供 HBV-M 的 具 体 含 量, 无 法 动 态 观 察 病 情 疗 效 变 化 及 详 细 了 解 免 疫 状 况 TrF 技 术 作 为 一 种 灵 敏 的 定 量 检 测 方 法, 具 有 特 异 性 强 灵 敏 度 高 线 性 范 围 宽 标 准 [1] 曲 线 稳 定 性 好 无 放 射 污 染 易 于 自 动 化 等 多 项 优 点, 具 有 广 阔 的 发 展 潜 力 4
参 考 文 献 [1] 李 振 甲, 陈 泮 藻. 时 间 分 辨 荧 光 分 析 技 术 与 应 用 [M]. 科 学 出 版 社,1996.21-26. [2] 额 尔 敦, 其 其 格, 郭 美 香, 等. 双 抗 HBsAg 抗 体 夹 心 时 间 分 辨 免 疫 荧 光 分 析 方 的 建 立 [J]. 中 国 免 疫 学 杂 志,1999,15:508 [3] 李 秋 生, 肖 韶 英, 杨 华 文, 等. 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 检 测 中 假 阴 性 问 题 探 讨 [J]. 临 床 输 血 与 检 验,2002, 4(2):34-35. [4] 单 桂 秋, 李 秋 生, 肖 韶 英. 检 测 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 的 一 步 法 试 剂 的 钩 状 效 应 分 析 [J]. 中 华 检 验 医 学 杂 志,2002,2:107-108. [5] 张 运 洪, 秦 苏, 何 静 波, 等. ELISA 结 合 MEIA 能 有 效 检 测 低 水 平 HBsAg[J]. 临 床 检 验 杂 志,2002,20(2):103. [6] 郭 红 亮. 酶 联 免 疫 一 步 法 试 剂 检 测 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 的 钩 状 效 应 及 其 对 策 [J]. 实 用 全 科 医 学,2003,1(1):72-73. [7] 腾 龙, 陈 钢, 洪 加 林. 酶 免 疫 竞 争 一 步 法 检 测 乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 抗 体 的 影 响 因 素 探 讨 [J]. 中 华 检 验 医 学 杂 志,2003,2,26(2):111-112. [8] 赵 友 云, 刘 光 中, 马 煜 南, 等. 酶 免 法 检 测 HBeAg 假 阳 性 原 因 分 析 [J]. 临 床 检 验 杂 志,2000,18(5):263. 5