新 款 适 用 于 UHPLC/HPLC 的 SEC 色 谱 柱 的 介 绍 东 曹 ( 上 海 ) 生 物 科 技 有 限 公 司 Jan, 015
为 了 改 进 SEC 色 谱 柱 的 分 离 表 现 - 色 谱 填 料 - 1. 更 小 的 粒 径 更 高 的 理 论 塔 板 数 更 高 的 反 压, 更 小 的 孔 隙 容 量. 更 大 的 孔 隙 容 量 ( 校 准 曲 线 的 斜 率 更 为 平 缓 ) 分 离 系 数 ; 需 要 被 分 离 的 两 个 峰 的 距 离 填 料 刚 性 被 减 弱 权 衡 好 粒 径 和 孔 隙 容 量 的 关 系 是 非 常 重 要 的!
SEC 中 的 峰 距 校 准 曲 线 的 斜 率 和 分 离 度 理 论 塔 板 数 和 分 离 度 1 logm logm 1 斜 率 陡 分 离 系 数 小 分 离 范 围 宽 TP 高 高 斜 率 缓 分 离 系 数 大 分 离 范 围 窄 TP 低 低 3
色 谱 柱 的 特 点 色 谱 柱 是 一 款 针 对 生 物 大 分 子 开 发 的 SEC 色 谱 柱 采 用 um 的 硅 胶 作 为 基 质, 并 用 二 醇 基 进 行 表 面 修 饰 填 料 孔 隙 性 质 被 优 化 到 校 准 曲 线 斜 率 较 为 平 缓 的 程 度, 使 得 对 于 单 抗 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 具 有 很 高 的 分 离 度 填 料 表 面 性 质 与 现 有 的 SW 系 列 色 谱 柱 产 品 几 乎 相 同 种 色 谱 柱 尺 寸 可 供 选 择, 4.6 mm I.D. x 15 cm 的 规 格 可 用 于 超 高 速 的 分 离 4.6 mmi.d. x 30 cm 的 规 格 可 用 于 超 高 分 辨 率 的 分 析 可 同 时 兼 容 于 UHPLC 和 HPLC 系 统 必 须 使 用 半 微 型 液 相 系 统, 即, 较 小 死 体 积 的 液 相 系 统 才 能 实 现 较 为 理 想 的 色 谱 柱 性 能 4
填 料 性 质 色 谱 柱 UP-SW3000 UltraSW Aggregate SuperSW mab HR G3000SW XL 色 谱 柱 尺 寸 4.6 mm I.D. x 15 cm 4.6 mm I.D. x 30 cm 7.8 mm I.D. x 30 cm 基 质 硅 胶 硅 胶 官 能 团 二 醇 基 二 醇 基 粒 径 µm 3 µm 4 µm 5 µm 孔 径 5 nm 30 nm 5 nm 排 阻 极 限 ( 蛋 白 质 ) 分 离 范 围 ( 蛋 白 质 ) 应 用 抗 体 的 超 高 速 分 析 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 800 kda,500 kda* 800 kda 10 k 500 kda 10 k,000 kda 10 k 500 kda 抗 体 的 超 高 分 辨 率 分 析 ( 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 ) 抗 体 的 高 分 辨 率 分 析 ( 多 聚 体 ) 抗 体 的 高 分 辨 率 分 析 ( 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 ) 各 种 蛋 白 抗 体 的 搞 分 辨 率 分 析 ( 二 聚 体 / 单 体 ) * 预 估 值 5
产 品 线 分 析 柱 货 号 产 品 名 粒 径 (um) 色 谱 柱 尺 寸 (mm I.D. x cm) 排 阻 极 限 (kda)* 003449 4.6 x 15 800 003448 4.6 x 30 800 * 水 溶 性 蛋 白 保 护 柱 货 号 产 品 名 色 谱 柱 尺 寸 (mm I.D. x cm) 备 注 003451 TSKgel guardcolumn UP-SW DC 4.6 x 出 口 端 配 有 连 接 头 003450 TSKgel guardcolumn UP-SW 4.6 x 两 款 保 护 柱 都 可 以 对 接 任 何 一 款 分 析 柱 UP-SW DC 能 够 不 使 用 连 接 管 直 接 与 分 析 柱 对 接 6
对 标 准 蛋 白 的 校 准 曲 线 - 与 市 售 UHPLC-SEC 色 谱 柱 的 对 比 - 1 1 色 谱 柱 : ACQUITY UPLC BEH 00SEC 色 谱 柱 尺 寸 : 4.6 mm I.D. x 15 cm 洗 脱 液 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l Na SO 4 3 + 0.05% NaN 3 流 速 : 0.35 ml/min 4 5 温 度 : 5 检 测 器 : UV 80 nm 上 样 量 : 5 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白 (MW 640,000) (1 甲 状 腺 球 蛋 白 多 聚 体 ). 丙 球 蛋 白 (MW 155,000) ( 丙 球 蛋 白 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白 (MW 47,000) 4. 核 糖 核 酸 酶 A (MW 13,700) 5. 对 - 氨 基 苯 甲 酸 (MW 137) 如 图 所 示 UP-SW 在 丙 球 蛋 白 分 子 量 区 域 具 有 更 平 缓 的 斜 率 7
与 UHPLC 色 谱 柱 竞 争 产 品 的 对 比 - 1 - 对 标 准 蛋 白 的 分 离, 30cm 长 色 谱 柱 - (µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) ACQUITY UPLC BEH 00SEC (1.7µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) 条 件 色 谱 柱 : A), μm B ) ACQUITY UPLC BEH 00SEC, 1.7 μm 色 谱 柱 尺 寸 : 4.6 mm I.D. x 30 cm 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : 0.35 ml/min 温 度 : 5 C 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 进 样 量 : 样 品 : 10 μl, 通 过 Rheodyne Model 815 进 样 1. 甲 状 腺 球 蛋 白, 640,000 Da (1 甲 状 腺 球 蛋 白 二 聚 体 ). 丙 球 蛋 白, 155,000 Da ( 丙 球 蛋 白 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白, 47,000 Da 4. 核 糖 核 酸 酶 A, 13,700 Da 5. 对 - 氨 基 苯 甲 酸, 137 Da 色 谱 柱 N (peak 4) As (peak 4) 压 力 A) 48,896 1.14 30 MPa B) commercial UHPLC-SEC 57,668 1.15 33 MPa UP-SW3000 色 谱 柱 在 甲 状 腺 球 蛋 白,1 号 峰 和 丙 球 蛋 白, 号 峰 上 显 示 出 更 高 的 分 离 度, 同 时, 也 显 示 出 更 高 的 排 阻 极 限 8
与 UHPLC 色 谱 柱 竞 争 产 品 的 对 比 - - 丙 球 蛋 白 的 分 离, 30cm 长 色 谱 柱 - A) 1 =.40 色 谱 柱 : A) B) ACQUITY UPLC BEH 00SEC 色 谱 柱 尺 寸 : 4.6 mm I.D. x 30 cm 洗 脱 液 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l Na SO 4 + 0.05% NaN 3 流 速 : 0.35 ml/min 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 温 度 : 5 进 样 量 : 10 μl (Rheodyne 815) 样 品 : 丙 球 蛋 白 ( 化 血 研 惠 赠 ) 1 号 峰 ; 二 聚 体 ; 号 峰 ; 单 体 B) 1 =.9 UP-SW3000 显 示 出 对 丙 球 蛋 白 二 聚 体 (1 号 峰 ) 和 单 体 ( 号 峰 ) 更 高 的 分 辨 率! 9
与 UHPLC 色 谱 柱 竞 争 产 品 的 对 比 - 3 - 治 疗 性 抗 体 的 分 离, 30cm 长 色 谱 柱 - 3 色 谱 柱 : A) B) ACQUITY UPLC BEH 00SEC 色 谱 柱 尺 寸 : 4.6 mm I.D. x 30 cm 洗 脱 液 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l Na SO 4 + 0.05% NaN 3 A) 1 1 3 4 流 速 : 0.35 ml/min 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 温 度 : 5 进 样 量 : 10 μl (Rheodyne 815) 样 品 : 治 疗 性 抗 体 (mouse-human chimeric) 1 号 峰 : 三 聚 体 ; 号 峰 : 二 聚 体 ;3 号 峰 ; 单 体 ; 4 号 峰 : 片 段 B) 色 谱 柱 (peak 1/) 4 (peak /3) (peak 3/4) A).16 5.0.56 UP-SW3000 色 谱 柱 显 示 了 在 三 聚 体 (1 号 峰 ) 二 聚 体 ( 号 峰 ) 单 体 (3 号 峰 ) 有 着 更 高 的 分 离 度 并 且, 片 段 (4 号 峰 ) 与 单 体 峰 有 着 更 清 楚 的 分 离 ( 完 全 分 离 ) B) commercial Tosoh Bioscience UHPLC-SEC Shanghai 1.64 Co., Ltd. 4.66.57 10
与 UHPLC 色 谱 柱 竞 争 产 品 的 对 比 - 4 - 标 准 蛋 白 的 分 离, 15cm 长 色 谱 柱 - mau 1 3 4 5 色 谱 柱 : A) B) ACQUITY UPLC BEH 00SEC 色 谱 柱 尺 寸 : 4.6 mm I.D. x 15 cm 洗 脱 液 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) A) B) 1 1 1 3 4 5 min 流 速 : + 100 mmol/l Na SO 4 + 0.05% NaN 3 0.35 ml/min 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 温 度 : 5 压 力 : A) 15 MPa, B) MPa 进 样 量 : 5 μl (Rheodyne 815) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白 (MW 640,000) (1 甲 状 腺 球 蛋 白 多 聚 体 ). 丙 球 蛋 白 (MW 155,000) ( 丙 球 蛋 白 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白 (MW 47,000) 4. 核 糖 核 酸 酶 A (MW 13,700) 5. 对 - 氨 基 苯 甲 酸 (MW 137) UP-SW3000 色 谱 柱 在 1 号 峰 甲 状 腺 球 蛋 白 和 号 峰 丙 球 蛋 白 处 显 示 了 更 高 的 分 离 度, 同 时 也 有 更 高 的 排 阻 极 限 11
与 UHPLC 色 谱 柱 竞 争 产 品 的 对 比 - 5 - 治 疗 性 抗 体 的 分 离, 15cm 长 色 谱 柱 - 新 開 発 カラム(µm) (µm, 4.6 mm I.D. x 15 cm) (4.6 mm I.D. x 30 cm) 条 件 色 谱 柱 : A), μm B) ACQUITY UPLC BEH 00SEC, 1.7 μm 色 谱 柱 尺 寸 : 4.6 mm I.D. x 15 cm 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : 0.35 ml/min 温 度 : 5 C 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 进 样 量 : 5 μl, (Rheodyne Model 815) 样 品 : mouse-human chimeric IgG, monoclonal 1. 三 聚 体. 二 聚 体 3. 单 体 4. 片 段 色 谱 柱 (peak 1/) ACQUITY UPLC BEH 00SEC (1.7µm, 4.6 mm I.D. x 15 cm) (peak /3) A) 1.5 3.56 B) commercial UHPLC-SEC 1.5 3.47 UP-SW3000 色 谱 柱 显 示 了 在 三 聚 体 (1 号 峰 ) 二 聚 体 ( 号 峰 ) 单 体 (3 号 峰 ) 有 着 更 高 的 分 离 度 并 且, 片 段 (4 号 峰 ) 与 单 体 峰 有 着 更 好 的 分 离 1
与 既 有 SW 色 谱 柱 产 品 的 对 比 - 标 准 蛋 白 的 分 离 - (µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) TSKgel SuperSW3000 (4µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) TSKgel G3000SWXL (5µm, 7.8 mm I.D. x 30 cm) 条 件 色 谱 柱 : A) μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm B) TSKgel SuperSW3000 4 μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm C) TSKgel G3000SW XL, 5 μm, 7.8 mm I.D. x 30 cm 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : 温 度 : 检 测 器 : 进 样 量 : 样 品 : A,B) 0.35 ml/min, C) 1.0 ml/min 5 C UV 80 nm A,B) 微 型 检 测 池 C) 标 准 检 测 池 10 μl 1. 甲 状 腺 球 蛋 白, 640,000 Da (1 甲 状 腺 球 蛋 白 二 聚 体 ). 丙 球 蛋 白, 155,000 Da ( 丙 球 蛋 白 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白, 47,000 Da 4. 核 糖 核 酸 酶 A, 13,700 Da 5. 对 - 氨 基 苯 甲 酸, 137 Da 色 谱 柱 粒 径 N (peak 4) As (peak 4) A) μm 45,65 0.95 B) TSKgel SuperSW3000 4 μm 4,419 1.0 与 现 有 的 SW 色 谱 柱 具 有 相 似 的 分 离 选 择 性 具 有 更 高 的 理 论 塔 板 数 C) TSKgel G3000SWXL Tosoh Bioscience 5 μm Shanghai Co., 18,35 Ltd. 1.05 13
与 G3000SWXL 色 谱 柱 的 对 比 - 治 疗 性 抗 体 的 分 离 - 色 谱 柱 : A) B) A) 1 3 3 4 5 4 5 =1.19 (Peak /3) =.70 (Peak 3/4) =.16 (Peak /3) =5.0 (Peak 3/4) =.56 (Peak 4/5) B) TSKgel G3000SWXL 色 谱 柱 尺 寸 : A) 4.6 mm I.D. x 30 cm B) 7.8 mm I.D. x 30 cm 洗 脱 液 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l Na SO 4 + 0.05% NaN 3 流 速 : A) 0.35 ml/min, B) 1.0 ml/min 检 测 器 : UV 80 nm, A) 微 型 检 测 池, B) 普 通 检 测 池 温 度 : 5 进 样 量 : 10 μl (Rheodyne 815) 样 品 : 治 疗 性 抗 体 (mouse-human chimeric) 色 谱 峰 1; 四 聚 体, ; 三 聚 体, 3; 二 聚 体, 4; 单 体, 5; 片 段 抗 体 的 单 体 和 片 段 通 过 一 支 UP-SW3000 色 谱 柱 被 完 全 分 离 三 聚 体 / 二 聚 体 / 单 体 之 间 的 分 离 度 比 G3000SWXL 更 好 此 外, 四 聚 体 被 UP-SW3000 色 谱 柱 清 晰 地 分 离 出 14
与 G3000SWXL 的 对 比 (30 cm 长 色 谱 柱 x ) - 治 疗 性 抗 体 的 分 离 - TSKgel G3000SW XL (5µm, 7.8 mm I.D. x 30 cm x ) 条 件 色 谱 柱 : A) TSKgel G3000SW XL 5 μm, 7.8 mm I.D. x 30 cm x B) μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : 温 度 : 检 测 器 : 进 样 量 : 样 品 : A) 1.0 ml/min, B) 0.35 ml/min 5 C UV 80 nm 10 μl mouse-human chimeric IgG, monoclonal 1. 三 聚 体,. 二 聚 体, 3. 单 体, 4. 片 段 色 谱 柱 规 格 mm I.D. x cml (µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) (peak 1/) (peak /3) (peak 3/4) A) TSKgel G3000SWXL x 7.8x30+7.8x30 1.60 3.63 1.77 比 较 了 单 支 UP-SW3000 和 支 串 联 G3000SW XL 色 谱 柱 对 单 抗 的 分 离 结 果 单 支 UP-SW3000 在 各 个 色 谱 峰 之 间 都 显 示 了 比 G3000SW XL 更 高 的 分 离 度, 同 时, 分 析 时 间 也 更 短 B) 4.6 x 30.16 5.0.56 15
流 速 和 压 降 条 件 色 谱 柱 : ( μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm, 4.6 mm I.D. x 15 cm) 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : 0.05-0.59 ml/min 温 度 : 5 C (µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) (µm, 4.6 mm I.D. x 15 cm) 标 准 流 速, 0.35 ml/min 的 压 降 值 4.6 mm I.D. x 15 cm 18 MPa 4.6 mm I.D. x 30 cm 6 Mpa 在 较 高 流 速, 0.5 ml/min 时 的 压 降 值 4.6 mm I.D. x 15 cm 4 Mpa 与 普 通 HPLC 系 统 也 兼 容 16
范 第 姆 特 曲 线 4 μm μm (µm, 4.6 mm I.D. x 30 cm) 对 于 大 分 子, 流 速 越 低, 柱 效 越 高 um 粒 径 的 填 料 即 使 在 较 高 的 流 速 下 也 能 保 持 较 高 的 柱 效 17
标 准 蛋 白 的 高 速 分 离 (µm, 4.6 mm I.D. x 15 cm) 条 件 色 谱 柱 : μm, 4.6 mm I.D. x 15 cm 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : A) 0.35 ml/min, B) 0.50 ml/min 温 度 : 5 C 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 进 样 量 : 5 μl, (Rheodyne Model 815) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白, 640,000 Da (1 甲 状 腺 球 蛋 白 二 聚 体 ). 丙 球 蛋 白, 155,000 Da ( 丙 球 蛋 白 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白, 47,000 Da 4. 核 糖 核 酸 酶 A, 13,700 Da 5. 对 - 氨 基 苯 甲 酸, 137 Da 在 短 柱 (15 cm 长 ) 上,5min 内 可 以 获 得 对 标 准 蛋 白 很 好 的 分 离 18
在 较 低 流 速 下 对 抗 体 的 超 高 分 辨 率 分 离 条 件 色 谱 柱 : μm, 4.6 mm I.D. x 30 cm 流 动 相 : 100 mmol/l phosphate buffer (ph 6.7) + 100 mmol/l NaSO4 + 0.05 % NaN3 流 速 : A) 0.35 ml/min, B) 0.05 ml/min 温 度 : 5 C 检 测 器 : UV 80 nm, 微 型 检 测 池 进 样 量 : 10 μl, (Rheodyne Model 815) 样 品 : mouse-human chimeric IgG, monoclonal 1. 四 聚 体. 三 聚 体 3. 二 聚 体 4. 单 体 5. 片 段 流 速 (peak 1/) (peak /3) (peak 3/4) (peak 4/5) A) 0.35 ml/min 0.88.0 5.07.5 B) 0.05 ml/min 1.49 3.51 7.00 3.34 将 流 速 降 低 至 0.05 ml/min 时, 从 四 聚 体 到 单 体 和 片 段 都 获 得 了 更 好 的 分 离 度 出 现 了 五 聚 体 峰, 在 二 聚 体 之 前 和 之 后 也 分 别 分 离 出 小 峰 19
总 结 是 最 近 研 发 出 的 新 产 品, 是 一 款 既 可 以 使 用 在 UHPLC 系 统 上, 又 可 以 使 用 在 HPLC 系 统 上 均 可 实 现 高 分 辨 率 的 尺 寸 排 阻 色 谱 柱 我 们 将 UP-SW3000 色 谱 柱 与 相 同 尺 寸 的 Waters 公 司 的 ACQUITY UPLC BEH SEC, 00A, 1.7 um 色 谱 柱 进 行 了 对 比, 发 现 UP-SW3000 色 谱 柱 在 抗 体 三 聚 体 / 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 之 间 的 分 离 上, 显 示 了 更 高 的 分 离 度 此 外,UP-SW3000 色 谱 柱 对 于 蛋 白 样 品 具 有 更 高 的 排 阻 极 限 抗 体 的 单 体 和 片 段 通 过 1 支 30cm 的 UP-SW3000 色 谱 柱 就 可 以 完 全 分 开, 这 个 结 果 甚 至 比 支 G3000SWXL 串 联 的 效 果 都 更 好 UP-SW3000 色 谱 柱 可 以 在 抗 体 药 物 的 研 发 和 质 量 控 制 上 提 供 更 有 力 的 帮 助 0