采用自动制备测定橄榄油中的脂肪酸甲酯 (FAME) 应用简报 食品检测 作者 Ramon Hernandez & Pablo Castillo Lab de Microbiologia de Andaluza Instrumentatcion 西班牙 Enrique Longueira & Jose Pineda Laboratorio Químico Microbiológico, S.A. Murcia 西班牙 Rebecca Veeneman 安捷伦科技有限公司 2850 Centerville Road Wilmington,DE 19808 美国 摘要 测定橄榄油中的脂肪酸 (FA) 有多种不同的方法 本应用介绍了如何在碱性催化反应后进行分析以及使用安捷伦 7696A WorkBench 制备工作台制备的优势 前言 脂肪酸的分析在橄榄油工业中非常普遍且通常采用气相色谱分析 因为这类物质的强极性和高沸点, 通常会得到较差的峰形和糟糕的重现性 为了避免这些问题, 很多方法采用了衍生反应将脂肪酸变成脂肪酸甲酯 (FAME), 从而更容易实现色谱分离并得到更好的峰形 衍生反应种类众多, 其中最普遍的是使用正己烷和氢氧化钾 (KOH) 在甲醇中进行碱性催化反应 该方法快速 简单, 可以得到游离脂肪酸无法获得的优异结果
实验材料 所用试剂包括购自 Baker 公司的正庚烷 ( 也可以采用正己烷 ) 甲醇 ( 色谱纯 ) 和氢氧化钾 将 11.2 g KOH 溶解在 100 ml 甲醇中制备得到 2N 的 KOH 正庚烷和水用作 7696A 制备工作台的清洗溶剂 移取 KOH 溶液的注射器必须用两种溶剂进行清洗, 首先用水洗掉 KOH, 然后再用正庚烷清洗 移取正庚烷的注射器单独采用正庚烷进行清洗 仪器碱性衍生化分析橄榄油中脂肪酸的方法通常是在 20 ml 试管中加入 100 mg, 然后再加入 10 ml 正庚烷和 100 µl KOH 本研究对 WorkBench 制备工作台的应用进行了测试, 工作台使用的瓶为 2 ml, 因此, 所有试剂用量都缩小了 10 倍 碱性催化反应为单一步骤, 几分钟之内即可完成 制备工作台用于自动化制备所有进行 GC/MS 分析的 方法如下所示 : 软件提供的资源管理器界面可以显示所有瓶和试剂的布局 ( 见图 1) 图 1. 试剂资源布局 2
图 2 显示了制备所用的方法 图 2. 安捷伦 7696A 制备方法 在其中一个瓶盘上, 放置了三行 2 ml 瓶, 一行瓶装有正庚烷, 一行装有 KOH, 一行各装有一滴约 10 µl 橄榄油 ( 需分别称重示 ) 制备工作台使用两个注射器分别加入两种试剂 :1 ml 正庚烷和 10 µl KOH 都加入完成后, 将瓶振荡 10 min 瓶混合完成后, 取上层有机相进样到 GC, 配置 250 C 的分流 / 不分流进样口, 和 MSD 相连 色谱柱为 HP88 (60 m 250 µm, 0.2 µm), 柱流量 1 ml/min 柱箱的程序升温为 175 C 保持 5 min, 以 5 C/min 升到 250 C, 以获得最佳的脂肪酸分离效果 进样口采取 100:1 的分流模式, 所有分析均采用 SIM 和 SCAN 两种模式进行采集 结果和讨论 为评估使用工作台制备的重现性和准确度, 将 10 个工作台制备的注射进样到 GC/MS 表 1 列出了结果 此应用报告对橄榄油中四种主要组分的结果进行了对比 色谱图如图 3 所示, 各组分的峰面积见表 2 3
首先, 对装有橄榄油的 10 个瓶进行称重, 称重结果见表 1 表 1. 10 个的重量瓶橄榄油重 /mg 1 12.9 2 13.4 3 14.8 4 14.5 5 14.2 6 14.7 7 13.2 8 14.9 9 13.8 10 13.6 这些瓶随后被放置在工作台的盘上, 根据程序设定的加入量自动加入各试剂 一旦制备完毕, 即按上述仪器条件注射进样到 GC/MS 进行分析, 图 3 为分析结果 图 3. 表 2. SIM 模式下的色谱图 橄榄油中四个主要组分的峰面积 亚 1 317343837.0 63331226.0 569320584.0 80584679.0 2 373510457.0 74825501.0 660064790.0 94609910.0 3 389137859.0 74174710.0 683431450.0 98106712.0 4 350160186.0 69553324.0 621849766.0 88281829.0 5 350311578.0 69513586.0 622622625.0 88233984.0 6 363692227.0 71973045.0 643859326.0 91639831.0 7 298792007.0 58778562.0 534781631.0 74997383.0 8 376569059.0 74878674.0 666439996.0 95109185.0 9 352698458.0 68424565.0 654254324.0 82569566.0 10 351745852.0 70145747.0 602155656.0 86951448.0 均值 350409359.2 69188856.3 622601967.1 87561952.4 相对标准偏差 27119463.9 5161865.2 46358289.5 7182432.9 %RSD 7.7 7.5 7.4 8.2 4
中四个组分单位橄榄油质量的峰面积见表 3 表 3. 每毫克橄榄油中各组分的峰面积 亚 1 24600297.4 4909397.4 44133378.6 6246874.3 2 27873914.7 5583992.6 49258566.4 7060441.0 3 26293098.6 5011804.7 46177800.7 6628831.9 4 24155874.9 4796781.0 42886190.8 6088402.0 5 24669829.4 4895323.0 43846663.7 6213660.8 6 24740967.8 4896125.5 43799954.1 6234002.1 7 22635758.1 4452921.4 40513759.9 5681619.9 8 25273091.2 5025414.4 44727516.5 6383166.8 9 25557859.3 4958301.8 47409733.6 5983301.9 10 25863665.6 5157775.5 44276151.2 6393488.8 均值 25097420.2 4954369.4 44585290.7 6272059.8 相对标准偏差 1391411.9 284657.5 2430391.6 371694.7 %RSD 5.5 5.7 5.5 5.9 表 4 为 10 个中, 每种 FAME 的峰面积百分比 表 4. 每个组分所占的峰面积百分比 1 30.8 6.1 55.2 7.8 2 31.0 6.2 54.9 7.9 3 31.3 6.0 54.9 7.9 4 31.0 6.2 55.0 7.8 5 31.0 6.1 55.1 7.8 6 31.1 6.1 55.0 7.8 7 30.9 6.1 55.3 7.8 8 31.0 6.2 54.9 7.8 9 30.5 5.9 56.5 7.1 10 31.7 6.3 54.2 7.8 均值 31.0 6.1 55.1 7.7 相对标准偏差 0.3 0.1 0.6 0.2 %RSD 1.0 1.9 1.0 2.9 亚 5
本实验对两种剂量的试剂加入法 原剂量方法 (100 mg 橄榄油 ) 和 WorkBench 工作台剂量方法进行了对比 采用此两种试剂加入法人工制备得到的结果分别见表 5 和表 6 表 5. 使用原始试剂加入法得到的每毫克橄榄油中各组分的峰面积 亚 1 2674181.8 529275.8 4610749.8 674892.3 2 2562129.3 505970.3 4442449.3 648040.5 3 2596966.1 511187.6 4504510.0 655770.4 4 2388663.8 466760.2 4168008.4 601931.7 5 2721157.8 535230.9 4722598.6 688465.5 6 2789232.0 549999.6 4813189.6 704034.8 7 2330855.0 453164.1 4057061.6 589335.4 8 2645696.1 528725.3 4579552.0 669544.2 9 2650632.8 520264.3 4600138.2 668931.5 10 2660736.3 520639.8 4632201.2 671882.6 均值 2594658.8 510416.9 4501404.4 655410.2 相对标准偏差 142531.1 30276.4 236121.4 36110.5 %RSD 5.5 5.9 5.2 5.5 可以看到,%RSD 结果与工作台自动化制备所得结果相近 按与工作台制备相同的试剂量人工制备 : 将一滴橄榄油滴加到 2 ml 瓶中, 称重, 使用安捷伦注射器加入 1 ml 正庚烷和 10 µl KOH 的甲醇溶液, 人工轻微震荡混匀 分析结果见表 6 表 6. 使用工作台剂量方法人工操作得到的每毫克橄榄油中各组分的峰面积 亚 1 24414278.4 4280301.6 34483064.7 5405051.1 2 21953969.5 4385041.9 34340981.7 5496525.8 3 25176754.2 4987565.4 39311102.4 6258162.4 4 23806050.0 4723341.1 36249791.4 5917479.9 5 23413864.7 4659269.7 36103230.9 5862013.3 6 22388861.8 4441774.0 34988087.2 5625015.1 7 23345774.4 4655270.9 36540218.6 5654628.9 8 21758664.6 4326697.7 31010500.3 5465899.5 9 22268704.8 4448969.7 34833834.8 5598507.6 10 21726270.7 4324528.6 34099881.5 5188441.0 均值 22970768.0 4513461.5 35078976.3 5633014.3 相对标准偏差 1194355.0 226067.9 2129375.1 301856.8 %RSD 5.2 5.0 6.1 5.4 如上所示,%RSD 值与使用工作台自动化制备的值相似 6
结论 安捷伦 7696A 制备工作台是一款使用起来非常方便 简单 可靠的工具, 可以自动化完成类似制备这样的实验室典型操作 本应用报告中的结果详细论证了使用工作台操作进行分析的重现性 无论是原始剂量试剂加入法还是工作台剂量试剂加入法, 人工制备得到的结果与工作台自动化制备得到的结果非常相近 更多信息 本文中的数据仅代表测定的典型结果 有关产品和服务的更多信息, 请访问 www.agilent.com/chem/cn 7
www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本资料中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,2012 2012 年 7 月 19 日, 中国印刷 5991-0761CHCN