中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 National food safety standard Food microbiological examination:aerobic plate count 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中华人民共和国卫生部 发布
前 言 本标准代替 GB/T 4789.2-2008 食品卫生微生物学检验菌落总数测定 本标准与 GB/T 4789.2-2008 相比, 主要修改如下 : 修改了标准的中英文名称 ; 修改了菌落总数计算公式中的解释 ; 修改了培养基和试剂 ; 删除了第二法菌落总数 Petrifilm TM 测试片法 本标准的附录 A 是规范性附录 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 : GB 4789.2-1984 GB 4789.2-1994 GB/T 4789.2-2003 GB/T 4789.2-2008 I
食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定 1 范围 本标准规定了食品中菌落总数 (Aerobic plate count) 的测定方法 本标准适用于食品中菌落总数的测定 2 术语和定义 2.1 菌落总数 aerobic plate count 食品检样经过处理, 在一定条件下 ( 如培养基 培养温度和培养时间等 ) 培养后, 所得每 g(ml) 检样中形成的微生物菌落总数 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : 3.1 恒温培养箱 :36 ±1,30 ±1 3.2 冰箱 :2 ~5 3.3 恒温水浴箱 :46 ±1 3.4 天平 : 感量为 0.1 g 3.5 均质器 3.6 振荡器 3.7 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 3.8 无菌锥形瓶 : 容量 250 ml 500 ml 3.9 无菌培养皿 : 直径 90 mm 3.10 ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 3.11 放大镜或 / 和菌落计数器 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 : 见附录 A 中 A.1 4.2 磷酸盐缓冲液 : 见附录 A 中 A.2 1
4.3 无菌生理盐水 : 见附录 A 中 A.3 5 检验程序 菌落总数的检验程序见图 1 检样 25 g(ml) 样品 +225 ml 稀释液, 均质 10 倍系列稀释 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液, 各取 1 ml 分别加入无菌培养皿内 每皿中加入 15 ml~20 ml 平板计数琼脂培养基, 混匀 36 ±1 48 h±2 h 培养 计数各平板菌落数 计算菌落总数 报告图 1 菌落总数的检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品 : 称取 25 g 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min, 或放入盛有 225 ml 稀释液的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打 1 min~2 min, 制成 1:10 的样品匀液 6.1.2 液体样品 : 以无菌吸管吸取 25 ml 样品置盛有 225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 ( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 ) 中, 充分混匀, 制成 1:10 的样品匀液 2
6.1.3 用 1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 ml, 沿管壁缓慢注于盛有 9 ml 稀释液的 无菌试管中 ( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面 ), 振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混 合均匀, 制成 1:100 的样品匀液 6.1.4 按 6.1.3 操作程序, 制备 10 倍系列稀释样品匀液 每递增稀释一次, 换用 1 次 1 ml 无菌吸管 或吸头 6.1.5 根据对样品污染状况的估计, 选择 2 个 ~3 个适宜稀释度的样品匀液 ( 液体样品可包括原液 ), 在进行 10 倍递增稀释时, 吸取 1 ml 样品匀液于无菌平皿内, 每个稀释度做两个平皿 同时, 分别吸取 1 ml 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照 6.1.6 及时将 15 ml~20 ml 冷却至 46 的平板计数琼脂培养基 ( 可放置于 46 ±1 恒温水浴箱中保温 ) 倾注平皿, 并转动平皿使其混合均匀 6.2 培养 6.2.1 待琼脂凝固后, 将平板翻转,36 ±1 培养 48 h±2 h 水产品 30 ±1 培养 72 h±3 h 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时, 可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基 ( 约 4 ml), 凝固后翻转平板, 按 6.2.1 条件进行培养 6.3 菌落计数 可用肉眼观察, 必要时用放大镜或菌落计数器, 记录稀释倍数和相应的菌落数量 菌落计数以菌落形成单位 (colony-forming units,cfu) 表示 6.3.1 选取菌落数在 30 CFU~300 CFU 之间 无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数 低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数, 大于 300 CFU 的可记录为多不可计 每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时, 则不宜采用, 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数 ; 若片状菌落不到平板的一半, 而其余一半中菌落分布又很均匀, 即可计算半个平板后乘以 2, 代表一个平板菌落数 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时, 则将每条单链作为一个菌落计数 7 结果与报告 7.1 菌落总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内, 计算两个平板菌落数的平均值, 再将平均值乘以相应稀释倍数, 作为每 g(ml) 样品中菌落总数结果 7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时, 按公式 (1) 计算 : C (1) N = n 0.1n ) d 式中 : N 样品中菌落数 ; ( + 1 2 C 平板 ( 含适宜范围菌落数的平板 ) 菌落数之和 ; n 1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 平板个数 ; n 2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 平板个数 ; d 稀释因子 ( 第一稀释度 ) 3
示例 : 稀释度 1:100( 第一稀释度 ) 1:1000( 第二稀释度 ) 菌落数 (CFU) 232,244 33,35 C N = ( n + 1 0.1n 2 ) d 232 + 244 + 33 + 35 544 = [2 + (0.1 2)] 10 0.022 = = 2 上述数据按 7.2.2 数字修约后, 表示为 25000 或 2.5 10 4 24727 7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU, 则对稀释度最高的平板进行计数, 其他平板可记录为多不可计, 结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算 7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU, 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算 7.1.5 若所有稀释度 ( 包括液体样品原液 ) 平板均无菌落生长, 则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算 7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间, 其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时, 则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算 7.2 菌落总数的报告 7.2.1 菌落数小于 100 CFU 时, 按 四舍五入 原则修约, 以整数报告 7.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时, 第 3 位数字采用 四舍五入 原则修约后, 取前 2 位数字, 后面用 0 代替位数 ; 也可用 10 的指数形式来表示, 按 四舍五入 原则修约后, 采用两位有效数字 7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数, 则报告菌落蔓延 7.2.4 若空白对照上有菌落生长, 则此次检测结果无效 7.2.5 称重取样以 CFU/g 为单位报告, 体积取样以 CFU/mL 为单位报告 4
附录 A ( 规范性附录 ) 培养基和试剂 A.1 平板计数琼脂 (plate count agar,pca) 培养基 A.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 ml ph 7.0±0.2 A.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中, 煮沸溶解, 调节 ph 分装试管或锥形瓶,121 高压灭菌 15 min A.2 磷酸盐缓冲液 A.2.1 成分磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 34.0 g 蒸馏水 500 ml ph 7.2 A.2.2 制法贮存液 : 称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 ml 蒸馏水中, 用大约 175 ml 的 1 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml 后贮存于冰箱 稀释液 : 取贮存液 1.25 ml, 用蒸馏水稀释至 1 000 ml, 分装于适宜容器中,121 高压灭菌 15 min A.3 无菌生理盐水 A.3.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 ml A.3.2 制法称取 8.5g 氯化钠溶于 1 000 ml 蒸馏水中,121 高压灭菌 15 min 5