Q Exactive 参数优化对蛋白质鉴定结果的影响 李静赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司色谱质谱部 201206 Application Notes CM0084 关键词 Q Exactive;Orbitrap;Proteome Discoverer 1. 前言 Q Exactive 是赛默飞世尔科技在 2011 年 ASMS 上推出的新型四极杆和轨道阱杂交高分辨质谱仪, 它将高选择性四极杆的离子过滤与 Orbitrap 高分辨准确质量数 (HR/AM) 测量技术相结合, 在分辨率 扫描速度和灵敏度性能上进一步提升, 并提供各种高分辨扫描功能, 适应不同的应用需要 Q Exactive 作为蛋白组学研究的一个通用质谱平台, 可以同时涵盖蛋白质组学的定性和定量要求, 并能够在一台仪器上同时达到高灵敏度 高分辨率 高质量准确度和高质谱图采集速度 Q Exactive 的方法设置界面与以往 LTQ Orbitrap 方法设置界面略有不同, 最常用的为用于常规鉴定和相对定量的方法 ---Full Scan/dd-MS 2 (TopN)( 图 1), 其方法设置根据样品的复杂程度 液相色谱梯度条件 上样量略有不同 本文将以中等复杂样品酵母细胞蛋白质酶解物为研究对象, 探讨几个关键参数的设置对于鉴定结果的影响 2 实验部分 2.1 实验样品酵母细胞裂解液蛋白质样品使用 RapiGest 变性, 然后用三 (2- 羧乙基 ) 膦盐酸 Tris[2- carboxyethyl] phosphine (TCEP) 还原, 碘乙酰胺烷基化 胰蛋白酶 37 度酶解反应过夜, 然后加入 0.5% 三氟乙酸去除 RapiGest 后离心, 用 0.1% 甲酸稀释成 400ng/mL 2.2 HPLC 方法高效液相色谱仪 :Thermo Scientific EASY-nLC 1000 System (Nano HPLC) 预柱 :Acclaim PepMap100 column, 2cm x 75µm,C18,3µm 色谱柱 :EASY-Spray column, 15 cm x 75 µm, C18, 3µm 上样量 :5uL 图 1 Q Exactive 方法设置界面
2 流动相 A 是 5% 乙腈,0.1% 甲酸 ; 流动相 B 是 95% 乙腈,0.1% 甲酸实验所用梯度为 40min 内流动相 B 由 5% 升高至 35% 流速 :300 nl/min 2.3 质谱方法 质谱仪 :Q Exactive, 离子源采用 EASY-Spray source 参数如表 1 和表 2 所示 表 1 质谱参数 喷雾电压 1.8 kv Full Scan AGC target 3e6 毛细管温度 250 C Full Scan Max.IT 20ms 全扫描分辨率 70,000 FWHM 母离子扫描范围 350-1800 m/z MS/MS 分辨率 17,500 FWHM 碰撞模式 HCD Top N 20 碰撞能量 27% 表 2 主要考察的质谱参数 关键参数 初始设置 方法一 方法二 方法三 Intensity threshold 1.00E+04 1.00E+04 1.00E+04 5.00E+04 Danamic Exclusion 15s 15s 30s 15s MS2 Max. IT 50ms 100ms 100ms 100ms MS2 AGC 5.00E+04 1.00E+05 1.00E+05 1.00E+05 2.4 数据库检索 数据采用 Proteome Discoverer1.3 进行检索, 搜索使用的蛋白 质数据库 swissprot yeast 数据库 数据库搜索时的参数设置 : Precursor ion mass tolerance: ± 15 ppm; Fragment ion mass tolerance: ± 20 mmu Static Modification:C carboxyamidomethylation(57.021 Da) Dynamic Modification:M Oxidation(15.995Da);Missed cleavage site: 2. False discovery rate(fdr)of all peptide and protein identifications :<1%, 3 结果与讨论 3.1 典型 TIC 谱图和典型一级和二级质谱图 图 2 本实验典型的 TIC 谱图
3 图 3 特定保留时间 (RT23.22min) 全扫描质谱图 图 4 特定保留时间 (RT23.22min) 母离子 1088.46m/z 及其同位素峰质谱图
4 图 5 特定保留时间 (RT23.23min) 母离子 1088.46 的 MS/MS 质谱图 3.2 蛋白质鉴定结果表 3 不同方法下的蛋白质鉴定结果 关键参数 初始设置 方法一 方法二 方法三 Intensity threshold 1.00E+04 1.00E+04 1.00E+04 5.00E+04 Dynamic Exclusion 15s 15s 30s 15s MS2 Max. IT 50ms 100ms 100ms 100ms MS2 AGC 5.00E+04 1.00E+05 1.00E+05 1.00E+05 Protein Group 989 1114( 12.6% ) 1153( ) 1132( ) Peptides 3210 4017( 25.1%) 4080( ) 4020( ) Success Rate 26.45% 32.25%( ) 28.42%( ) 33.16%( )
3.2.1 初始设置初始设置 ( 如表 3 中所示 ) 为大规模蛋白质鉴定中常用的参数设置, 适用于中等到较复杂样品 高上样量时的蛋白质鉴定工作 按照该参数完成蛋白质鉴定工作后, 根据 Proteome Discoverer1.3 的搜库结果, 发现针对本样品, 近 70% 的肽段达到了设置的 MS2 Max. IT, 平均的色谱峰宽为 30s 左右, 且鉴定肽段的 Full Scan Intensity 最低值为 5.00E+04 左右, 故从以上三个角度来考察参数调整对鉴定结果的影响 3.2.2 方法一 (MS2 Max. IT 和 MS2 AGC) 鉴于近 70% 的肽段达到了设置的 MS2 Max. IT, 故调整参数为 MS2 Max. IT( 由初始参数 50ms 调整为 100ms) 和 MS2 AGC( 由初始参数 5.00E+04 调整为 1.00E+05), 其余参数保持不变 经调整后,Protein Group Peptides 和 Success Rate 都有了一定程度的提高, 由此可知, 根据鉴定的结果及时调整关键参数, 可有效改善鉴定结果 如提高 MS2 Max. IT 虽然会使数据的采集频率降低, 但可显著改善谱图质量, 从而使鉴定数目不降反升 同理, 提高 MS2 AGC 也可显著改善谱图质量, 从而提升鉴定数目 3.2.3 方法二 (Dynamic Exclusion) 鉴于平均的色谱峰宽为 30s 左右, 故调整参数为 ( 由方法一参数 15s 调整为 30s), 其余方法设置按照表 3 中方法二来设置 该调整对最终鉴定结果无显著影响 4 结论目前对生物来源复杂样品进行蛋白质组水平上的深入发掘是目前蛋白质组学研究中最常见的工作之一,Q Exactive 由于其高灵敏度 高分辨率 高质量准确度和高质谱图采集速度等特点, 是公认的进行该项研究最适宜的平台之一 Q Exactive 方法设置根据样品的复杂程度 液相色谱梯度条件 上样量略有不同, 需要通过参数的优化实现最理想的鉴定结果 本实验通过对 Q Exactive 关键质谱参数的调整并观察其规律, 可显著提升蛋白质的鉴定数目, 为读者进一步进行方法优化提供一定的参考 参考文献 1 Michalski A, Damoc E, Hauschild JP, Lange O, Wieghaus A, Makarov A, Nagaraj N, Cox J, Mann M, Horning S.,Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer,mol Cell Proteomics. 2011 Sep;10(9) 2 Nagaraj N, Kulak NA, Cox J, Neuhauser N, Mayr K, Hoerning O, Vorm O, Mann M,System-wide perturbation analysis with nearly complete coverage of the yeast proteome by single-shot ultra HPLC runs on a bench top Orbitrap,Mol Cell Proteomics. 2012 Mar;11(3) Application Notes CM0084 3.2.4 方法三 (Intensity threshold) 鉴于鉴定肽段的 Full Scan Intensity 最低值为 5.00E+04 左右, 调整参数为 ( 由方法一参数 1.00E+04 调整为 5.00E+04), 其余方法设置按照表 3 中方法三来设置 该调整对于 Protein Group Peptides 数目无显著影响, 但 Intensity threshold 的提高可减少无用谱图的产生, 提高鉴定的成功率