亿康基因科技有限公司 MALBAC 微量基因组快速扩增试剂盒 产品说明书 For Research Use Only. Not For Diagnostic and Therapeatic Procedures. 版本号 170525.1 识别码 PMC050
目录 产品编码... 2 产品名称... 2 包装规格... 2 预期用途... 2 检测原理... 3 主要组成成分... 3 储存条件及有效期... 3 适用仪器... 3 注意事项... 4 安全信息... 4 需要客户准备的仪器和耗材... 4 产品特点... 4 适用领域... 5 样品要求... 6 实验准备... 6 检测步骤...7 参考文献... 13 问题解决方案... 14 产品编码 KT110700324 / KT110700396 产品名称 通用名 :MALBAC 微量基因组快速扩增试剂盒 英文名 :MALBAC Single Cell DNA Quick-Amp Kit 包装规格 24 测试 / 盒,96 测试 / 盒 预期用途 本产品可用于单细胞或其他微量样本中全基因组 DNA 扩增, 扩增产物可用于实时定量 PCR 高通量测序等技术平台 也可用于多种下游实验 : 基因点突变分析检测单核苷酸多态性 (SNP) 基因分型基因拷贝数 (CNV) 分析微阵列比较基因组杂交 (Array CGH) SNP 芯片技术 1 2
检测原理 本产品采用 MALBAC 专利技术 [ 1 ( ] 即多次退火环状循环扩增技术 ) 对单细胞或稀有细胞样本进行全基因组高效 快速裂解和扩增 ; 该技术无需提取核酸, 利用独特的具有链置换活性的 DNA 聚合酶进行准线性的全基因组扩增和指数式扩增, 扩增均一性高, 脱扣率较低, 只需两步即可为下游分析提供充足的实验材料 主要组成成分 储存条件及有效期 序号 名称 规格及数量 24 测试 96 测试 储存条件 1 Rapid Solution 108 µl 1 432 µl 1-20 2 RAPE Mix 12 µl 1 48 µl 1-20 3 Rap-WGA Solution 1440 µl 1 1440 µl 4-20 4 RWGA Enzyme Mix 48 µl 1 192 µl 1-20 -20 保存, 避免反复冻融 有效期 :24 个月 适用仪器 MALBAC 基因扩增仪 ( 亿康基因生产 ) 或用户自备 PCR 仪 3 注意事项 本产品仅供科学研究使用, 不得用于临床医学诊断及其他非合理用途 安全信息 使用本试剂盒进行实验操作时, 请穿着实验防护服, 戴好一次性手套和防护眼镜, 务必做好生物安全防护措施 如需更多安全信息, 请查阅材料安全数据表 需要用户准备的仪器和耗材 产品特点 单细胞经扩增后可获得 2~5µg 的 DNA 产物 ; 单管操作 2 步完成 仅需 2 小时 ; 序号名称 序号 名称 1 无核酸酶水 6 微型离心机 2 1.5mL,200μL 离心管 7 漩涡混和仪 3 移液器 8 紫外分光光度计 4 移液器吸头 9 PCR 仪 5 1 PBS 缓冲液 4
可从流式分选出的细胞或 0.5pg 级 DNA 中扩增出全基因组 DNA, 且成功率达 95% 以上 ; 可在 AT-GC 富集区得到准确 高重复度的连续扩增结果 ; 全基因组覆盖度高, 仅存在 <10% 的基因座丢失及等位基因丢失 适用领域 MALBAC 单细胞全基因组扩增试剂盒的适用范围十分广泛, 基因组 DNA 新鲜或干燥的血液 新鲜或冷冻的组织 司法痕量物证等多种微量样本均可通过该试剂盒进行全基因组扩增, 本产品适用的其他领域如下 : 人和动物生物学研究生物标志物研究 (CNVs SNVs) 体外受精胚胎植入前基因筛查和诊断 (PGS/PGD) 转基因动物基因分型胚胎和干细胞单精子 卵细胞研究, 神经元细胞等研究肿瘤研究体细胞遗传变异分析肿瘤进化和发展肿瘤干细胞循环肿瘤细胞 (CTCs) 微生物研究宏基因组学研究微生物基因分型 5 样本要求 1. 样本起始量本试剂盒主要用途是针对单细胞的全基因组扩增, 同时适用于起始模板量为单染色体或范围在 0.5pg~1 ng 级的微量基因组 DNA 2. 样本收集方式通过流式细胞仪分选, 缓冲液稀释, 显微操作和激光显微切割等方式获得的单细胞均可利用本试剂盒进行全基因组扩增 此外, 本试剂盒也适用于经过多聚甲醛固定或激光显微切割的微量的组织细胞样本 3. 样本清洗为避免细胞准备过程中外源 DNA 的污染, 建议在实验前对细胞进行清洗, 清洗液为不含 Mg 2+ 和 Ca 2+ 的 1 PBS 溶液, 需注意, 确保后续实验中的 PBS 溶液的体积不超过 1 µl 实验准备 1. 预扩增样本准备区的隔离为避免样本受外界因素干扰或 DNA 扩增产物的污染, 在扩增前, 预扩增样本的准备过程需在单独隔离的实验室或专门工作区完成, 并预备专用的实验材料和仪器, 例如, 移液器 移液管 PCR 管 1.5mL 的离心管 离心管架 离心机 漩涡混和仪和实验服等 ; 请将 DNA 扩增产物与预扩增试剂分开储存 ; 所有的下游分析处理, 如 DNA 纯化 测序前的准备工作, 请在另一实验室中进行 6
2. 对照组 DNA 样本 (5 μl) 配置阳性对照配置 : 用无核酸酶水将 DNA 存储液稀释为 30pg/μL 的 DNA, 取 30 pg/μl DNA 溶液 1 μl, 加 入含 4 μl Rapid Solution 的 PCR 管中, 作为阳性对照 阴性对照配置 : 取 1μL 无核酸酶水, 加入到含 4μL Rapid Solution 的 PCR 管中, 作为阴性对照 1.6 ( 如果使用亿康基因的 MALBAC 基因扩增仪 ) 将 步骤 1.5 PCR 管放置在 MALBAC 基因扩增仪中, 逆时针旋转拧紧热盖, 按下图所示设定裂解程序 检测步骤 1. 样本预处理 1.1 从 -20 拿出 Rapid Solution, 室温解冻, 震荡混匀, 瞬时离心 ( 微型离心机,2000 转,3-5 秒 ), 备用 1.2 根据反应数目 (N, 建议设置阴性对照及阳性对照 ), 按照下表配制反应体系 组分体积 Rapid Solution RAPE Mix 反应总体积 4.5 µl N 0.5 µl N 5.0 µl N 图 1-1: 点击 Lysis 程序自动跳转到下一界面 图 1-2: 加液量 调到 10μL, 控温模式 勾选 Tube, 确认 热盖控制 图 1-3: 待 剩余时间 显示为 --:--:-- 表示程序已结束, 点击 停止 终 备注 : 如样本活检后不能立即进行预处理, 需将活检样本放入 4.5µL Rapid Solution 放于 -20 或 -80 保存, 待需要预处理时再加入 0.5µL RAPE Mix 1.3 涡旋震荡器充分混匀, 瞬时离心 ( 微型离心机,2000 转,3-5 秒 ), 用于样本裂解反应 1.4 将裂解混合液 5.0 µl 分装至 0.2mL PCR 管内, 瞬时离心 ( 微型离心机,2000 转,3-5 秒 ) 1.5 收集活检样本至上一步的 PCR 管内, 瞬时离心 ( 微型离心机,2000 转,3-5 秒 )( 注意 : 不要用力震荡, 以防活检样本丢失, 尽量避免产生气泡 ) 为 105, 勾选 On 选项, 首节暂停 勾选 否, 点击 确定 按钮, 自动跳转到工作界面 止程序 7 8
1.7 ( 可选 ) 使用自备 PCR 仪的用户, 按照下表设定反应程序 2.5 将步骤 2.4 中的 PCR 管放置在 MALBAC 基因扩增仪中, 逆时针旋转拧紧热盖, 按照下图设定扩增程序 温度时间循环 50 20 min. 1 80 10 min. 1 4 维持 * 热盖温度设置为 105 1.8 程序结束后样本可以留在 MALBAC 基因扩增仪中 (4 ), 或者取出放置与 2-8 冰箱暂存 2 样本扩增 2.1 从 -20 拿出 Rap-WGA Solution, 室温解冻, 震荡混匀, 瞬时离心 ( 微型离心机,2000 转,3-5 秒 ), 备用 2.2 根据反应数目 (N), 按照下表配制反应体系 图 2-1: 点击 MALBAC 程序自动跳 图 2-2: 加液量 调到 65μL, 控温模式 图 2-3: 待 剩余时间 显示为 --:--:-- 组分 体积 Rap-WGA Solution 60 µl N RWGA Enzyme Mix 2µL N 转到下一界面 勾选 Tube, 确认 热盖控制 为 105, 勾选 On 选项, 首节暂停 勾选 否, 点击 确定 按钮, 自动跳转到工作界面 表示程序已结束, 点击 停止 终止程序 反应总体积 62µL N 2.3 涡旋震荡, 充分混匀, 用于样本扩增反应 2.4 将配好的扩增反应液分装至步骤 1.8 的产物中, 涡旋震荡, 瞬时离心 ( 微型离心机,2000 转,3-5 秒 ) 9 10
2.6 ( 可选 ) 用户使用自备 PCR 仪, 按照下表设置反应程序 注 : 热盖温度设置为 105 温度时间循环 94 3 min. 1 10 20 sec. 30 30 sec. 50 40 sec. 70 2 min. 95 20 sec. 94 30 sec. 1 94 20 sec. 58 15 sec. 72 2 min. * 循环数可根据细胞类型不同而优化, 100pg gd N A 设置 17 个循环, 单染色体建议设置 19-21 个循环 72 5 min. 1 4 维持 1 8 17* 推荐循环数为 14, 流式细胞仪分选的哺乳动物细胞建议 2.7 程序结束后, 将样本取出进行纯化, 取适量纯化后的 MALBAC 产物进行 Nanodrop 定量,MALBAC 产物 终产量为 2-5μg 为合格 2.8 取 5uL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 ( 条件 :1% 琼脂糖凝胶,110V,25-35 分钟 ), 扩增产物大小为 300~2000bp, 产物电泳如图 2 所示 M:DM 2000 DNA ladder;1: 阴性对照 ;2: 阳性对照,30pg 的人类基因组 DNA;3: 单细胞扩增产物 ;4: 单细胞扩增产物 ( 重复 ) 2.9 纯化后的 MALBAC 产物保存于 -20 冰箱, 留待后续实验使用 11 12
参考文献 1. C. Zong*, S. Lu*, A.R. Chapman*, X.S. Xie. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy Number Variations of a Single Human Cell. Science, 2012, 338, 1622-1626. 2. Lu S, Zong C, Xie XS, et al. Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells by Whole Genome Sequencing using MALBAC. Science, 2012, 338(6114):1627-30. 3. Hou Y, Fan W, et al. Genome Analyses of Single Human Oocytes. Cell, 2013, 155(7):1492-506. 4. Ni X, Zhuo M, Xie XS, et al. Reproducible Copy Number Variation Patterns among Single Circulating Tumor Cells of Lung Cancer Patients. PNAS, 2013, 110(52):21083-8. 5. Yu Z, Lu S, Huang Y. Microfluidic Whole Genome Amplification Device for Single Cell Sequencing. Anal. Chem., 2014 Oct 7; 86(19):9386-90. 6. Huang J, Yan L, Xie XS, Qiao J, et al. Validation of Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycle Sequencing for 24-chromosome Aneuploidy Screening of Cleavage-stage Embryos. Fertil. Steril., 2014, Dec;102(6):1685-91. 7. Huang L, Ma F, Xie XS, et al. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applifications. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2015. 16: 16. 1-16. 24. 问题解决方案 问题原因措施 无扩增产物 扩增产物含量低 阴性对照产生了与单细胞全基因组扩增相似的产物 样本在收集过程中丢失 起始样本中含有的聚合酶抑制剂可能是导致全基因组扩增反应失败的原因 酶失活 样本中含有聚合酶抑制剂 基因组 DNA 降解 试剂被外源性 DNA 污染 操作台被外源性 DNA 污染 重新收集样本, 确保操作正确 建议实验前应使用不含 Ca2+ Mg2+ Mo2+ 或肝素等成分的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保样本中不含有聚合酶抑制剂 试剂盒中所有的组份都应该在 -20 的条件下保存 ; 试剂复融过程需在冰上进行, 避免反复冻融 建议实验前应使用不含 Ca2+ Mg2+ Mo2+ 或肝素等成分的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保样本中不含有聚合酶抑制剂 避免细胞因储存方法或准备方法不当造成 DNA 的降解, 影响扩增效率 避免试剂盒的组份与扩增产物接触, 并使用无核酸酶和无核酸污染的实验耗材进行单细胞全基因组扩增, 建议实验前应使用不含 Ca2+ Mg2+ Mo2+ 或肝素等成分的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保不含有外源 DNA 污染 使用防核酸污染试剂彻底清理操作台 阴性对照溶液被外源性 DNA 污染 使用新阴性对照 13 14