LTQ Orbitrap CID ETD 两种裂解模式在磷酸化翻译后修饰研究中的应用 李静赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司色谱质谱部 201206 Application Notes CM0085 关键词 LTQ Orbitrap Elite;CID; ETD; 磷酸化 1. 前言一般的蛋白质组学中要获得氨基酸序列信息所依赖的是在质谱中获得相关肽段的碎片信息, 然后使用一些算法 ( 如 SEQUEST 或 MASCOT 等 ) 将碎片离子的质谱图谱与数据库进行比对打分获得统计结果以确定肽段的序列, 而这些碎片信息的获得主要是用 CID(Collision Induced Dissociation) 或 HCD(Higher Energy Collision Dissociation) 得到的 但磷酸化的研究中又存在一定的特殊性, 磷酸基团的酯键的键能比肽键的要低, 因此在 CID 或 HCD 时磷酸酯键比肽键更容易断裂, 使得 CID 谱中发生磷酸化 80Da 或 98Da 对应磷酸基团的丢失, 这一点直接造成了磷酸化位点判断的困难 2004 年 Hunt 等发现, 通过携带一个电子的阴离子 (Anion) 与肽阳离子 (Cation) 相互作用, 也可以产生类似 ECD(Electron Capture Dissociation) 的碎裂行为, 称之为电子转运裂解 (Electron Transfer Dissociation, ETD) 与 CID 技术撞击肽段时产生的大量 b 和 y 族碎片不同,ETD 技术产生的多是 c 和 z 族碎片, 更加关键的是磷酸基团在 ETD 中保留在碎片分子中, 这就使得磷酸化位点的直接判断提供了极大的便利 在 ETD 技术发明后的第二年 (2005 年 ),Thermo 公司就首先推出了带有 ETD 功能的 LTQ 线性离子阱型质谱仪,2008 年继续推出可同时支持高分辨率和低分辨率测量 ETD 碎片质量的 LTQ Orbitrap 线性离子阱 - 静电场轨道阱组合型质谱仪 LTQ Orbitrap ETD 也是目前国内外进行磷酸化翻译后修饰研究的科学家首选的质谱平台 本实验通过在 CID 和 ETD 模式下, 比较不同方法设置下进行磷酸化翻译后修饰研究的结果, 寻找一种最适宜进行磷酸化翻译后修饰的方法 2 实验部分 2.1 实验样品小鼠睾丸蛋白质提取后采用胰蛋白酶 (Trypsin) 进行酶解, 经 SCX 分级收集馏分,IMAC 富集磷酸化肽段 本实验选择其中一个馏分为测试对象 2.2 HPLC 方法高效液相色谱仪 :Thermo Scientific EASY-nLC 1000 System (Nano HPLC) 预柱 :Acclaim PepMap100 column, 2cm x 75µm,C18,3µm 色谱柱 :EASY-Spray column, 15 cm x 75 µm, C18, 3µm 上样量 :2uL 流动相 A 是 0.1% 甲酸水, 流动相 B 是 0.1% 甲酸乙腈实验所用梯度为 90min 内流动相 B 由 5% 升高至 25%,15min 内由 25% 升高至 40% 流速 :300 nl/min 2.3 质谱方法质谱仪 :LTQ Orbitrap Elite ETD 离子源 :EASY-Spray source 喷雾电压 :1.8 kv 毛细管温度 :275 C 全扫描分辨率 :120,000 FWHM MS/MS 通过离子阱采集数据母离子扫描范围 :350-2000 m/z 表 1 三种不同的方法设置 方法方法设置 CID-ETD CID 和 ETD 交替进行, 依次对 Full Scan 中 Top10 double Play 的离子进行 CID 和 ETD MS/MS 数据采集 CID-NL-ETD CID 采集 MS/MS, 待发现有设置的中性丢失峰, 便进一步触发 ETD, 依次对 Full Scan 中 Top10 的离子进行 CID 和 ETD MS/MS 数据采集 CID-ETD DDDT 采用 DDDT(Data Dependent Decision), 根据母离子的 charge state 和 m/z 选择 CID 或 ETD 进行裂解, 依次对 Full Scan 中 Top10 的离子进行 CID 和 ETD MS/MS 数据采集
2 2.4 数据库检索数据采用 Proteome Discoverer1.3 进行检索, 检索使用的蛋白质数据库为 swissprot mouse 数据库, 采用如下图 1 模板 3 结果与讨论 3.1 典型 TIC 谱图和典型一级和二级质谱图图 2 到图 4 为三个 raw data 对应的 TIC 总离子流图, 图 5 为蛋白质 Isoform 2 of A-kinase anchor protein 4 鉴定到的肽段信息和磷酸化位点示意图, 图 6 为肽段 NTNNNQSPSN- PATKSPSNQR(+3) 不同裂解模式下 PhosphoRS 得分, 图 7 肽段 NTNNNQSPSNPATKSPSNQR(+3), S15-Phospho CID MS/MS 质谱图图 8 肽段 NTNNNQSPSNPATKSPSNQR(+3), S15-Phospho ETD MS/MS 质谱图图 9 为肽段 LSSLVIQMAR(+2) 不同裂解模式下 PhosphoRS 得分图 10 肽段 LSSLVIQMAR(+2), S3-Phospho CID MS/MS 质谱图图 11 肽段 LSSLVIQMAR(+2), S3-Phospho ETD MS/MS 质谱图 图 1 Proteome Discoverer1.3 搜库模板数据库搜索时的参数设置 : Precursor ion mass tolerance: ± 10 ppm; Fragment ion mass tolerance: ± 1.2Da(ETD);± 0.7Da(CID) Static Modification:C carboxyamidomethylation(57.021 Da) Dynamic Modification:S T Y phosphorylation(79.966 Da) ;Missed cleavage site: 2. False discovery rate(fdr)of all peptide and protein identifications :<1%, 如图 6 所示, 肽段 NTNNN QSPSN PATKS PSNQR, 有六个可能的磷酸化位点 (T2,S7,S9,T13,S15,S17), 在两种不同的裂解模式下,ETD 模式下对于磷酸化位点 (S15) 的可靠性可达 100%,CID 模式下对于磷酸化位点 (S15) 的可靠性也可达 81%; 如图 9 所示, 肽段 LSSLVIQMAR 有两个可能的磷酸化位点 (S2,S3), 在两种不同的裂解模式下,CID 模式下对于磷酸化位点 (S3) 的可靠性可达 100%,ETD 模式下的可靠性也可达 99.9% 两种模式对肽段有不同的偏好性, 如对于价态较高 (>=3) 且 m/z<1000da 的肽段, 采用 ETD 可获得较理想的裂解效果 而对于价态较低 (2-3 价 ) 的肽段, 采用 CID 可获得较理想的裂解效果 两种模式相互补充, 可极大地提高磷酸化肽段的鉴定数目, 并对于磷酸化位点有更可靠的确认 图 2 CID-ETD double Play Raw Data TIC
3 图 3 CID-NL-ETD Raw Data TIC 图 4 CID-ETD DDDT Raw Data TIC
4 图5 蛋白质Isoform 2 of A-kinase anchor protein 4鉴定到的肽段信息和磷酸化位点示意图 图6肽段NTNNNQSPSNPATKSPSNQR不同裂解模式下PhosphoRS得分 图7 肽段NTNNNQSPSNPATKSPSNQR, S15-Phospho CID MS/MS质谱图 图8 肽段NTNNNQSPSNPATKSPSNQR, S15-Phospho ETD MS/MS质谱图 图9 为肽段LSSLVIQMAR +2 不同裂解模式下PhosphoRS得分
5 图 10 肽段 LSSLVIQMAR(+2), S3-Phospho CID MS/MS 质谱图 图 11 肽段 LSSLVIQMAR(+2), S3-Phospho ETD MS/MS 质谱图 3.2 蛋白质鉴定结果及讨论 表 2 不同方法下的鉴定结果 CID-ETD double Play CID-NL-ETD CID-ETD DDDT Protein Group 1147 1322 1136 Peptides 3089 3308 2970 PhosphoPeptide 521 680 551 PSM 8325 7670 8297 3.2.1 方法一 方法一为 CID 和 ETD 交替进行, 依次对 Full Scan 中 Top10 的离子进行 CID 和 ETD MS/MS 数据采集 该方法是较常用的蛋白质鉴定方法, 可同时获取某特征肽段在 CID 和 ETD 两种模式下的 MS/MS 质谱图, 但需要较长的 cycle time 3.2.2 方法二方法二为 CID 采集 MS/MS, 待发现有设置的中性丢失峰, 便进一步触发 ETD, 依次对 Full Scan 中 Top10 的离子进行 CID 和 ETD MS/MS 数据采集 从实验结果可知, 该方法是较适合于分析磷酸化肽段的方法 因为 ETD 模式下的数据采集速度慢于 CID 模式下的数据采集速度, 只有在发现了特征的中性丢失峰后才触发 ETD, 对潜在的磷酸化肽段进行 ETD 碎裂, 这样可以大大减少 cycle time, 提升分析的效率 3.2.3 方法三采用 DDDT(Data Dependent Decision), 根据母离子的 charge state 和 m/z 选择 CID 或 ETD 进行裂解, 依次对 Full Scan 中 Top10 的离子进行 CID 和 ETD MS/MS 数据采集, 主要参数设置见下图 12, 该方法可保证 ETD 在最适宜的条件 ( 电荷数, 质荷比 ) 下触发, 但就本实验结果来看, 对于磷酸化肽段的鉴定与方法一的鉴定效果类似
Application Notes CM0085 图 12 DDDT Procedures 方法设置界面 3.3 实验拓展方向本实验中采用了 Trypsin 酶解, 如果选用 Lys-C 来进行酶解, 可以得到大片段且易形成高价态的肽段, 针对这种类型的肽段,ETD 可获得更理想的碎裂效果 ; 其次, 如果 CID 模式下采用 MSA 或 NL-triggered MS3 进行磷酸化肽段的鉴定, 可获得更优的鉴定结果 ; LTQ Orbitrap Elite 采用了高场 Orbitrap 质量分析器, 使得 HCD 裂解模式下 MS/MS 的采集速度有了极大的提升, 也非常适用于常规蛋白质鉴定和磷酸化翻译后修饰研究, 后续研究也可进一步比较 CID ETD HCD 不同裂解模式下进行磷酸化研究的优缺点 参考文献 1 Kerstin Strupat. et al. Data Dependent Analysis of Phosphopeptides upon Higher Energy Collision Induced Dissociation (HCD)Using a Hybrid Linear Ion Trap - Orbitrap MS; Thermo Fisher Scientific Application note AN 30138. 4 结论本实验比较了 CID-ETD double Play CID-NL-ETD CID-ETD DDDT 三种方法下进行磷酸化翻译后修饰研究的实验结果, 实验表明,CID-NL-ETD 是一种非常适宜进行磷酸化翻译后修饰研究的方法, 结合 Proteome Discoverer1.3 中的 PhosphoRS 可以对磷酸化肽段有更准确的识别并对磷酸化位点有更可靠的判断