1081 论著 中医 中西医结合研究 黄芪 丹参酮 ⅡA 和 5- 氟尿嘧啶单用及联合应用对人宫颈癌 HeLa 细胞的体外作用研究 田亚萍, 王园园, 迟宝荣 摘要 目的检测黄芪 丹参酮 ⅡA 5- 氟尿嘧啶 (5 FU) 单用及联合应用对人宫颈癌 HeLa 细胞的抑制作用及其抗肿瘤机制, 探讨黄芪 丹参酮 ⅡA 在宫颈癌治疗中的应用价值 方法 2014 年 3 12 月选取人宫颈癌 HeLa 细胞, 分为 6 组, 包括对照组 黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组, 每组分别加入不同浓度的药物进行处理 应用四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT 法 ) 和流式细胞术检测人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率及细胞凋亡率, 检测氧化应激因子丙二醛 (MDA) 水平及超氧化物歧化酶 (SOD) 谷胱甘肽 (GSH) 活力 结果 4 0g/ml 黄芪 8 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 50 0mg/L5 FU 4 0g/ml 黄芪 +8 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 4 0g/ml 黄芪 +8 0μg/ml 丹参酮 ⅡA+50 0mg/L5 FU 人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高, 同组培养 72h 后人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高 (P<0 05) 培养 72h 后, 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率较黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组升高 (P<0 05); 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率较黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组升高 (P<0 05) 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率较黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组升高 (P<0 05) 不同组 MDA 水平及 GSH 活力比较, 差异无统计学意义 (P>0 05); 不同组 SOD 活力比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组 SOD 活力较对照组降低 (P<0 05) 结论黄芪 丹参酮 ⅡA 5 FU 可诱导人宫颈癌 HeLa 细胞发生凋亡, 联用后可增加抗肿瘤活性, 具有临床应用价值 关键词 宫颈肿瘤 ; 黄芪 ; 丹参酮 ; 氟尿嘧啶 ;HeLa 细胞 ; 体外研究 中图分类号 R737 33 文献标识码 A doi:10 3969/j isn 1007-9572 2016 09 020 田亚萍, 王园园, 迟宝荣 黄芪 丹参酮 ⅡA 和 5- 氟尿嘧啶单用及联合应用对人宫颈癌 HeLa 细胞的体外作用研究 [J]. 中国全科医学,2016,19(9):1081-1085 [www chinagp net] TianYP,WangYY,ChiBR Invitroefectofastragalus,tanshinoneⅡA,5-fluorouracilaloneortheircombineduseon humancervicalcarcinomahelacels[j].chinesegeneralpractice,2016,19(9):1081-1085 InVitroEfectofAstragalus, TanshinoneⅡ A,5-fluorouracilAloneorTheirCombinedUseonHumanCervical CarcinomaHeLaCels TIANYa-ping,WANGYuan-yuan,CHIBao-rong DepartmentofDermatologyandVenereology, thefirsthospitalofjilinuniversity,changchun130021,china Abstract Objective Toinvestigatetheinhibitoryefectandanti-tumormechanismofastragalus,tanshinoneⅡ A, and5-fluorouracil(5 FU)usedaloneorincombinationonhumancervicalcarcinomacels,andtoexploretheapplication valueofastragalusinjectionandtanshinoneⅡaincervicalcancertreatment Methods HumancervicalcarcinomaHeLacels weresampledanddividedintosixgroups:controlgroup,astragalusgroup(group1),tanshinoneⅡagroup(group2),5 FU group(group3),astragalus+tanshinoneⅡagroup(group4),astragalus+tanshinoneⅡa+5 FUgroup(group5)from MarchtoDecemberin2014 Eachgroupwasadministratedwithdiferentconcentrationsofdrugs MTTmethodandFCM method wereusedtodetectthehelacelgrowthinhibitionrateandcelapoptosisrateofhumancervicalcarcinomaanddetectmdalevel andtheactivityofsodandgsh Results Group1,group2,group3,group4andgroup5hadthehighesthumancervical carcinomahelacelgrowthinhibitionrateswhendrugconcentrationwas4 0g/ml,8 0μg/ml,50 0mg/L,4 0g/ml+8 0 μg/ml,4 0g/ml+8 0μg/ml+50 0mg/L(P<0 05);the5groupshadhighestHeLacelgrowthinhibitionratesafter72h culture(p<0 05) After72hculture,group4washigherthangroup1,group2andgroup3inHeLacelgrowthinhibition 基金项目 : 吉林省中医药管理局中医药科技项目 (2012-130) 作者单位 :130021 吉林省长春市, 吉林大学第一医院皮肤性病科 ( 田亚萍, 王园园 ), 消化内科 ( 迟宝荣 ) 通信作者 : 迟宝荣,130021 吉林省长春市, 吉林大学第一医院消化内科 ;E-mail:chibr@jlu edu cn
1082 htp: //www chinagp net E mail:zgqkyx@chinagp net cn rate(p<0 05);group5washigherthangroup1,group2andgroup3andgroup4inHeLacelgrowthinhibitionrate(P< 0 05).Group5washigherthangroup1,group2andgroup3andgroup4inHeLacelapoptosisrate(P<0 05) No significantdiferencesexistedinmdalevelandgshactivityamongdiferentgroups(p>0 05);significantdiferencesexisted insodactivityamongdiferentgroups(p<0 05);group1,group2,group3,group4andgroup5werelowerthancontrol groupinsod activity(p<0 05) Conclusion Astragalusinjectionsolution,tanshinoneⅡ A and5 FU caninducethe apoptosisofhumancervicalcancerhelacels, andtheircombinedusecanincreaseantitumoractivity, andhaveclinical applicationvalue Keywords Uterinecervicalneoplasms;Astragalusmembranaceus;Tanshinone;Fluorouracil;HeLacels;Invitro 宫颈癌是引起妇女死亡的主要原因之一 中药联合化疗药物在一定程度上减少化疗药物毒副作用的产生, 提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性, 改善患者生活质量 [1] 临床用于各类中 晚期癌症患者的扶正固本方剂对提高患者近期 远期疗效均有益处 [2-3] 黄芪 (astragalus) 具有健脾补中 升阳举陷 益卫固表 利尿等功效, 在体内和体外均对各类癌症具有较好的抑制作用 [3] 从丹参中提取的脂溶性单体 丹参酮 ⅡA (tanshioneⅡa) 有抑制肿瘤细胞增殖 诱导其分化和凋亡的作用 [4-5] 黄芪和丹参酮 ⅡA 对人宫颈癌 HeLa 细胞的抑制作用已有研究报道 [6-7], 但二者联合应用对人宫颈癌 HeLa 细胞的作用及机制研究尚未见报道 另外, 黄芪丹参复方注射液具有清除氧自由基 减轻氧化应激对机体细胞损伤的作用 [8], 此种药物活性能否保护肿瘤细胞未见报道 因而, 本研究于 2014 年 3 12 月研究黄芪 丹参酮 ⅡA 5- 氟尿嘧啶 (5 FU) 单用及联合应用对人宫颈癌 HeLa 细胞的抑制作用及其抗肿瘤机制, 为其临床应用提供实验依据 1 材料与方法 1 1 主要试剂黄芪注射液为正大制药集团产品 ( 每毫升相当于生药黄芪 2g, 批号 1305051) 丹参酮 ⅡA 为中国药品生物制品检定所的标准品 ( 批号 1401026), 溶解于适量的二甲基亚砜 (DMSO), 终浓度为 0 1% 5 FU 购自上海旭东海普药业有限公司 ( 批号 130801) 胎牛血清 (GIBCO 公司 ),RPMI -1640 培养液 (GIBCO 公司 ), 胰蛋白酶 (AMRESCO 公司 ) 3- (4,5- 二甲基噻唑 -2) -2(MTT) 试剂盒 ( 武汉华美生物工程有限公司 ), 丙二醛 (MDA) 试剂盒 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ), 超氧化物歧化酶 (SOD) 谷胱甘肽 (GSH) 试剂盒 ( 南京建成生物科技有限公司 ) 1 2 仪器与器材荧光显微镜 流式细胞仪 (Olympus), 5% 二氧化碳 (CO 2 ) 培养箱 (ThermoElectronCorporation), 恒温培养箱 ( 诺基仪器 ), 生物安全柜 力新仪器 ( 上海 ) 有限公司, 倒置相差显微镜 (Olympus),Mode1680 型酶标仪 ( 美国 Bio-Rad) 1 3 研究方法 1 3 1 细胞培养人宫颈癌 HeLa 细胞购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心, 置于含 10% 胎牛血清及青霉素 链霉素各 100U/ml 的 DMEM 培养液中,37 5%CO 2 培养箱中培养 1 3 2 实验分组对照组不加入任何药物 ; 黄芪组 : 分别加入不同浓度黄芪注射液, 含生药 0 1 0 5 1 0 2 0 4 0 g/ml; 丹参酮 ⅡA 组 : 分别加入不同浓度丹参酮 ⅡA, 终浓度 0 5 1 0 2 0 4 0 8 0μg/ml;5 FU 组 : 分别加入不同浓度 5 FU, 终浓度 3 5 7 0 12 5 25 0 50 0mg/L; 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 : 分别加入不同浓度黄芪注射液和丹参酮 Ⅱ A,0 1g/ml+0 5μg/ml 0 5g/ml+1 0μg/ml 1 0g/ml +2 0μg/ml 2 0g/ml+4 0μg/ml 4 0g/ml+8 0μg/ml; 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组 : 分别加入不同浓度黄芪注射液 丹参酮 Ⅱ A 和 5 FU:0 1g/ml+0 5μg/ml+3 5mg/L 0 5 g/ml+1 0μg/ml+7 0mg/L 1 0g/ml+2 0μg/ml+12 5 mg/l 2 0g/ml+4 0μg/ml+25 0mg/L 4 0g/ml+8 0 μg/ml+50 0mg/L 1 3 3 生长抑制率检测采用四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT 法 ) 检测黄芪 丹参酮 ⅡA 5 FU 单用及联合应用对人宫颈癌 HeLa 细胞生长的抑制作用 取 1 10 8 个对数生长期宫颈癌 HeLa 细胞接种于 96 孔培养板中,200μl/ 孔, 培养 24h, 吸去培养液, 分别加入 200μl 不同浓度 不同组分药物, 每组设 3 个复孔 各用药组细胞培养 24 48 72h 后, 每孔加入 MTT (5g/L)20μl, 继续培养 6h, 弃上清液, 每孔加入 DMSO 150μl, 室温下振荡 10min 将结晶完全溶解 酶标仪 570nm 波长处测吸光度值 (OD 值 ) 生长抑制率 = (1- 实验组 OD 值 / 对照组 OD 值 ) 100% 1 3 4 细胞凋亡率检测各用药组细胞于培养 72h 后消化收集, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤后,70% 乙醇固定,4 过夜 PBS 洗涤 2 次 RNA 酶, 消化 30min 后, 采用流式细胞术检测 每组重复 3 次 采用 CelQuest 软件计算细胞凋亡率 1 3 5 MDA 水平及 SOD GSH 活力测定各组细胞于培养 72h 后消化收集,PBS 洗涤 2 次, 收集细胞于 1 5mlEP 管中, -80 超低温冰箱冻存待检 每份细胞样本加入 0 5ml0 9% 氯化钠溶液, 超声波破碎,3000r/min 离心 10min( 离心半径 10cm) 收集上清液 按照试剂盒说明书分别检测 MDA 水平及 SOD GSH 活力 1 4 统计学方法采用 SPSS13 0 统计学软件进行数据处理 计量资料以 (x±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用 q 检验 以 P<0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 不同浓度黄芪组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较培养 24 48 72h 后, 不同浓度黄芪组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中 4 0 g/ml 黄芪人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高, 同组培养 72h 后人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高 (P<0 05, 见表 1) 2 2 不同浓度丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比
1083 较培养 24 48 72h 后, 不同浓度丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中 8 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高, 同组培养 72h 后人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高 (P <0 05, 见表 2) 2 3 不同浓度 5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较培养 24 48 72h 后, 不同浓度 5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中 50 0 mg/l5 FU 人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高, 同组培养 72 h 后人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高 (P<0 05, 见表 3) 2 4 不同浓度黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较培养 24 48 72h 后, 不同浓度黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中 4 0g/ml 黄芪 +8 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高, 同组培养 72h 后人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高 (P<0 05, 见表 4) 2 5 不同浓度黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较培养 24 48 72h 后, 不同浓度黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中 4 0g/ml 黄芪 +8 0μg/ml 丹参酮 ⅡA+50 0mg/L5 FU 人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高, 同组培养 72h 后人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率最高 (P <0 05, 见表 5) 2 6 不同用药组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较培养 72h 后, 选取各用药组最高浓度组进行比较, 不同用药组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较, 差异有统计学意义 (P< 0 05); 其中黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率较黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组升高, 差异有统计学意义 (P<0 05); 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率较黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组升高, 差异有统计学意义 (P<0 05, 见表 6) 2 7 不同用药组人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率比较 培养 72h 后, 选取各用药组最高浓度组进行比较, 不同用药组人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率比较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率较黄芪 组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组升高, 差异 有统计学意义 (P<0 05, 见表 7) 2 8 不同组 MDA 水平及 SOD GSH 活力比较培养 72h 后, 选取各组最高浓度组进行比较, 不同组 MDA 水平及 GSH 活力 比较, 差异无统计学意义 (P>0 05); 不同组 SOD 活力比 较, 差异有统计学意义 (P<0 05); 其中黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组 SOD 活力较对照组降低, 差异有统计学意义 (P<0 05, 见 表 8) 表 2 不同浓度丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较 Table2 丹参酮 ⅡA (μg/ml) inhibition rate in tanshinone Ⅱ A group among diferent 0 5 4 59±0 52 12 85±1 87 e 17 23±2 22 ef 42 64 <0 001 1 0 7 92±0 64 a 25 28±3 11 ae 37 64±4 21 aef 72 15 <0 001 2 0 15 24±1 38 ab 31 04±3 69 abe 43 96±5 94 abef 36 65 <0 001 4 0 20 35±1 53 abc 46 66±5 82 abce 55 37±6 74 abcef 36 64 <0 001 8 0 30 04±3 00 abcd 56 42±5 81 abcde 59 53±6 88 abcdef 26 23 0 001 F 值 110 80 47 43 27 86 注 : 与 0 5μg/ml 丹参酮 ⅡA 比较, a P<0 05; 与 1 0μg/ml 丹参 酮 ⅡA 比较, b P<0 05; 与 2 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 比较, c P<0 05; 与 4 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 比较, d P<0 05; 与同组培养 24h 后比较, e P< 0 05; 与同组培养 48h 后比较, f P<0 05 表 1 不同浓度黄芪组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较 Table1 黄芪 (g/ml) inhibition rate in astragalus group among diferent 0 1 3 65±0 45 9 87±0 87 e 17 23±1 68 ef 110 00<0 001 0 5 5 34±0 42 a 15 64±1 44 ae 24 27±3 27 aef 62 46<0 001 1 0 17 69±2 05 ab 25 79±1 98 abe 31 75±5 22 abef 12 67 0 007 2 0 19 36±2 78 abc 31 42±4 03 abce 39 37±3 77 abcef 23 93 0 001 4 0 28 64±1 96 abcd 47 23±3 39 abcde 55 45±4 93 abcdef 42 83<0 001 F 值 100 90 92 18 41 11 注 : 与 0 1g/ml 黄芪比较, a P<0 05; 与 0 5g/ml 黄芪比较, b P< 0 05; 与 1 0g/ml 黄芪比较, c P<0 05; 与 2 0g/ml 黄芪比较, d P< 0 05; 与同组培养 24h 后比较, e P<0 05; 与同组培养 48h 后比较, f P <0 05 表 3 不同浓度 5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较 Table3 5 FU (mg/l) inhibition rate in 5 FU group among diferent 3 5 4 57±0 67 11 84±2 96 e 15 16±2 45 ef 17 36 0 003 7 0 7 41±0 65 a 18 64±2 33 ae 29 45±4 98 aef 35 66<0 001 12 5 16 09±2 11 ab 23 74±1 98 abe 30 98±4 51 abef 17 38 0 003 25 0 20 66±1 85 abc 25 49±3 65 abce 36 47±4 10 abcef 17 61 0 003 50 0 29 46±3 65 abcd 42 83±4 58 abcde 56 89±6 87 abcdef 20 78 0 002 F 值 69 10 38 08 29 79 注 :5 FU=5- 氟尿嘧啶 ; 与 3 5mg/L5 FU 比较, a P<0 05; 与 7 0mg/L5 FU 比较, b P<0 05; 与 12 5mg/L5 FU 比较, c P<0 05; 与 25 0mg/L5 FU 比较, d P<0 05; 与同组培养 24h 后比较, e P<0 05; 与同组培养 48h 后比较, f P<0 05
1084 htp: //www chinagp net E mail:zgqkyx@chinagp net cn 表 4 不同浓度黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较 Table4 ComparisonofhumancervicalcarcinomaHeLacelgrowthinhibitionrateinastragalus+tanshinoneⅡAgroupamongdiferent 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 0 1g/ml+0 5μg/ml 6 16±0 55 13 27±1 48 e 17 67±1 85 ef 51 32 <0 001 0 5g/ml+1 0μg/ml 7 29±0 85 a 23 74±2 63 a 40 36±4 58 aef 85 99 <0 001 1 0g/ml+2 0μg/ml 17 01±2 35 ab 32 53±3 39 abe 54 32±5 63 abef 64 90 <0 001 2 0g/ml+4 0μg/ml 25 58±3 65 abc 46 41±5 85 abce 61 35±7 23 abcef 29 10 <0 001 4 0g/ml+8 0μg/ml 39 38±4 21 abcd 59 27±5 47 abcde 66 47±6 66 abcdef 19 26 0 002 F 值 76 26 58 60 37 75 注 : 与 0 1g/ml 黄芪 +0 5μg/ml 丹参酮 ⅡA 比较, a P<0 05; 与 0 5g/ml 黄芪 +1 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 比较, b P<0 05; 与 1 0g/ml 黄芪 +2 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 组比较, c P<0 05; 与 2 0g/ml 黄芪 +4 0μg/ml 丹参酮 ⅡA 比较, d P<0 05; 与同组培养 24h 后比较, e P<0 05; 与同组 培养 48h 后比较, f P<0 05 Table5 表 5 不同浓度黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较 ComparisonofhumancervicalcarcinomaHeLacelgrowthinhibitionratein astragalus+tanshinoneⅡ A +5 FU group amongdiferent 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 0 1g/ml+0 5μg/ml+ 3 5mg/L 7 35±0 85 14 67±1 65 e 18 68± 2 25 ef 34 92 <0 001 0 5g/ml+1 0μg/ml+ 7 0mg/L 5 34±0 58 a 25 58±3 84 ae 46 29± 5 98 aef 74 21 <0 001 1 0g/ml+2 0μg/ml+12 5mg/L 17 69±4 21 ab 35 87±4 25 abe 57 35± 7 65 abef 37 61 <0 001 2 0g/ml+4 0μg/ml+25 0mg/L 28 36±3 65 abc 42 67±5 66 abce 65 58± 8 29 abcef 27 81 <0 001 4 0g/ml+8 0μg/ml+50 0mg/L 41 64±5 96 abcd 67 43±9 55 abcde 82 85±10 55 abcdef 16 39 0 004 F 值 50 93 37 51 30 66 注 : 与 0 1g/ml 黄芪 +0 5μg/ml 丹参酮 ⅡA+3 5mg/L5 FU 比较, a P<0 05; 与 0 5g/ml 黄芪 +1 0μg/ml 丹参酮 ⅡA+7 0mg/L5 FU 比 较, b P<0 05; 与 1 0g/ml 黄芪 +2 0μg/ml 丹参酮 ⅡA+12 5mg/L5 FU 比较, c P<0 05; 与 2 0g/ml 黄芪 +4 0μg/ml 丹参酮 ⅡA+25 0mg/L 5 FU 比较, d P<0 05; 与同组培养 24h 后比较, e P<0 05; 与同组培养 48h 后比较, f P<0 05 3 讨论临床上, 黄芪常被单独或组成方剂用于各种中 晚期肿瘤患者的治疗, 如十全大补汤 补中益气汤等 [6] 黄芪具有抗炎 免疫调节 抗氧化 抑制肿瘤生长 抗病毒等作用, 同时具有保护心肌 肝脏等重要脏器的作用, 是新药及食品保健研究的热点之一 [9-10] 丹参酮 ⅡA 是一种低毒 抗瘤谱广的表 6 不同用药组人宫颈癌 HeLa 细胞生长抑制率比较 (x±s,%, n=3) Table6 inhibitionrateamongdiferentdruggroups 组别生长抑制率黄芪组 55 45± 4 93 丹参酮 ⅡA 组 59 53± 6 88 5 FU 组 56 89± 6 87 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 66 47± 6 66 abc 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组 82 85±10 55 abcd F 值 6 90 P 值 0 006 注 : 与黄芪组比较, a P<0 05; 与丹参酮 ⅡA 组比较, b P<0 05; 与 5 FU 组比较, c P<0 05; 与黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组比较, d P<0 05 中药单体, 已证实其对多种肿瘤具有杀伤作用 [4] 黄芪与丹 参酮 ⅡA 联合应用治疗宫颈癌疗效是否优于单药以及其作用机 制的研究, 对治疗宫颈癌和黄芪与丹参酮 ⅡA 的进一步开发利 用具有十分重要的价值 本研究发现, 黄芪 丹参酮 ⅡA 对人宫颈癌 HeLa 细胞具 有明显的抑制作用, 且黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组人宫颈癌 HeLa 细 表 7 不同用药组人宫颈癌 HeLa 细胞凋亡率比较 Table7 ComparisonofhumancervicalcarcinomaHeLacelapoptosisrate amongdiferentdruggroups 组别 细胞凋亡率 黄芪组 46 74±3 34 丹参酮 ⅡA 组 54 59±6 65 5 FU 组 49 07±5 36 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 55 84±4 85 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组 65 92±8 88 abcd F 值 4 46 P 值 0 025 注 : 与黄芪组比较, a P<0 05; 与丹参酮 ⅡA 组比较, b P<0 05; 与 5 FU 组比较, c P<0 05; 与黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组比较, d P<0 05
1085 表 8 不同组 MDA 水平及 SOD GSH 活力比较 (x±s,n=3) Table8 ComparisonofMDAlevelandtheactivityofSODandGSHamong diferentgroups 组别 MDA(nmol/ml) SOD(nU/mg) GSH(nU/mg) 对照组 0 55±0 15 31 32±0 55 13 2±1 04 黄芪组 0 59±0 14 28 17±0 40 a 12 4±1 61 丹参酮 ⅡA 组 0 60±0 13 28 70±1 77 a 12 69±1 55 5 FU 组 0 67±0 09 27 16±0 58 a 11 89±1 27 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 0 69±0 15 26 51±0 75 a 10 44±1 61 黄芪 + 丹参酮 Ⅱ A+5 FU 组 0 74±0 11 25 63±1 11 a 10 01±0 17 F 值 0 91 12 60 2 85 P 值 0 508 <0 001 0 064 注 :MDA= 丙二醛,SOD= 超氧化物歧化酶,GSH= 谷胱甘肽 ; 与对照组比较, a P<0 05 胞抑制率高于黄芪组 丹参酮 ⅡA 5 FU 组, 同时本实验还证 实, 黄芪 + 丹参酮 ⅡA+5 FU 组人宫颈癌 HeLa 细胞抑制率高 于黄芪组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组及黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 表 明黄芪 丹参酮 ⅡA 联合应用在抑制人宫颈癌 HeLa 细胞增殖 方面效果优于两药单用, 除本身对肿瘤细胞的增殖有抑制作用 外, 还能对化疗药物有增敏作用 [11] 许多诱导剂能抑制肿瘤细胞生长 诱导其分化, 作用机制 主要是通过抑制细胞原癌基因表达 诱导抑癌基因表达, 抑制 细胞进入 S 期及 DNA 合成 [12] 本研究提示, 黄芪 丹参酮 Ⅱ A 5 FU 联合应用于人宫颈癌 HeLa 细胞后, 诱导细胞凋亡的 作用显著提高, 与前期研究结果一致 [13] SOD 在抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中发挥重要 的作用 [14],SOD 亦可通过多种途径激活自噬 [15] 生理情况 下,SOD 的产生和清除保持动态平衡, 如果 SOD 产生超过了 清除的能力, 就会破坏生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸产生过量 的 MDA, 损伤细胞的正常结构和功能 [16] 黄芪和丹参酮 ⅡA 能够保护机体细胞减轻氧化应激损伤, 本研究结果表明, 黄芪 组 丹参酮 ⅡA 组 5 FU 组 黄芪 + 丹参酮 ⅡA 组 黄芪 + 丹 参酮 ⅡA+5 FU 组 SOD 活力较对照组降低, 加剧活性氧对肿瘤 细胞的破坏, 但该作用与时间 药物浓度的关系仍需要深入 探索 黄芪和丹参是我国传统中药, 药理作用机制明确, 不良反 应小, 二者联合应用于宫颈癌的治疗和作为辅助化疗药物国内 外迄今还未见报道, 本研究为二者联合治疗肿瘤的临床应用提 供实验依据 作者贡献 : 田亚萍进行实验设计与实施 资料收集整理 撰写论文 成文并对文章负责 ; 田亚萍 王园园进行实验实 施 评估 资料收集 ; 迟宝荣进行质量控制及审校 参考文献 本文无利益冲突 [1]OwrangiAM,PrisciandaroJI,SolimanA,etal Magneticresonance imaging- guided brachytherapy forcervicalcancer: initiating a program [J]. J Contemp Brachytherapy, 2015, 7 (5): 417-422 [2] WangX,FengY,WangN,etal Chinesemedicinesinducecel death:themolecularandcelularmechanismsforcancertherapy[j]. BiomedResInt,2014,2014:530342 [3]HuB,WangSS,DuQ TraditionalChinesemedicineforprevention andtreatmentofhepatocarcinoma:frombenchtobedside[j].world JHepatol,2015,7(9):1209-1232 [4]ZhangY,JiangP,YeM,etal Tanshinones:sources,pharmacokinetics andanti-canceractivities[j].intjmolsci,2012,13(10):13621-13666 [5] 王茂林, 陈世益, 李云霞, 等 黄芪皂甙和丹参酮 ⅡA 注射液对大鼠骨骼肌钝挫伤后氧化应激的影响 [J]. 中国运动医学杂志, 2011,30(2):162-165 [6] 李敏州, 高彦彬 自拟黄芪生脉散治疗糖尿病冠心病 29 例临床观察 [J]. 疑难病杂志,2010,09(9):676-678 [7] 沈隽, 王照艳, 张晓, 等 丹参酮 ⅡA 对 HeLa 宫颈癌细胞凋亡的影响 [J]. 中国药房,2007,18(27):2012-2014 [8] GengLM,HanFQ,TianJB, etal Efectsofthecombinationof Dansheninjection and Huangqiinjection on the cardic patients hemorheologyandejectionfraction[j].chinesegeneralpractice, 2004,7(7):455,458 (inchinese) 耿立梅, 韩凤芹, 田金彪, 等 丹参液与黄芪液合用对冠心病患者血液流变学及射血分数的影响 [J]. 中国全科医学,2004,7 (7):455,458 [9] 王晓莉, 苏志红, 李妍芹, 等 黄芪对体外培养人宫颈癌 Hela 细胞的抑制作用 [J]. 西北国防医学杂志,2010,31(4):270-272 [10] ShanGZ,YeXT Clinicalobservationofastraglauspolysaccharide combinedwithchemotherapyin84casesofpatientswithadvanced cancer[j]. Chinese JournalofClinicalOncology, 2007, 34 (6):355-356 (inchinese) 山广志, 叶兴涛 注射用黄芪多糖联合化疗治疗 84 例晚期恶性肿瘤临床疗效观察 [J]. 中国肿瘤临床,2007,34(6):355-356 [11] 王冬, 田亚平, 姜英雁, 等 丹参酮 ⅡA 抑制 Hela 细胞生长及诱导凋亡的体外实验研究 [J]. 中国现代医学杂志,2007,17 (6):676-678 [12] FuhrmanCB,KilgoreJ,LaCoursiereYD,etal Radiosensitization ofcervicalcancercelsvia double- strand DNA break repair inhibition[j].gynecoloncol,2008,110(1):93-98 [13] 王冬, 田亚平, 姜英雁, 等 丹参酮 ⅡA 与 5 FU 抑制 HeLa 细胞生长及诱导细胞凋亡的研究 [J]. 中国现代医学杂志,2008, 18(22):3237-3240 [14]GuhaP,DeyA,SenR,etal IntracelularGSHdepletiontriggered mitochondrialbaxtranslocationtoaccomplishresveratrol-induced apoptosisintheu937celline[j].jpharmacolexpthen,2011, 336(1):206-214 [15] 纪元, 龙建纲, 刘健康 自噬发生中的 ROS 调节机制 [J]. 中国生物化学与分子生物学报,2014,30(4):321-327 [16] 李宏林, 王炜, 杜英 自拟活血通脉灵对心肌缺血大鼠 SOD 活性和 MDA 含量的影响 [J], 疑难病杂志, 2012, 11 (4):277 ( 收稿日期 :2015-05-24; 修回日期 :2016-01-10) ( 本文编辑 : 陈素芳 )