HPLC 测定二维芦丁片复方制剂中芦丁的溶出度和含量 文春梅 1, 郑舒娴 1, 王建 2* (1. 浙江工业大学, 杭州 310014;2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 310052) 摘要 : 目的建立 HPLC 测定二维芦丁片中芦丁溶出度和含量的方法 方法溶出度测定以水 ( 含 0.5 SDS) 为溶出介质, 浆法, 转速为 75 r min 1,45 min 取样, 取样后采用 HPLC 测定 ; 含量测定采用 Thermo C 18 柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm), 以磷酸盐缓冲液 (0.l mol L 1 磷酸二氢钠溶液, 用磷酸调节 ph 值至 4.4)- 乙腈 (80 20) 为流动相, 检测波长为 254 nm 结 果芦丁在 2.26~22.56 μg ml 1 内与峰面积线性关系良好 (r=1.000 0), 平均回收率为 98.2(RSD=0.4), 溶出液稳定 3 批样品在 45 min 时平均溶出度均 >75, 并且有较好的均一性 ; 含量测定线性关系良好, 芦丁回收率为 100.6(RSD=0.4, n=9) 结论该法简单 准确 重复性好, 可用于二维芦丁片中芦丁的溶出度及含量的测定 关键词 : 二维芦丁片 ; 芦丁 ; 溶出度 ; 含量 ; 高效液相色谱法 中图分类号 :R917.101 文献标志码 :B 文章编号 :1007-7693(2018)02-0188-05 DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.02.008 引用本文 : 文春梅, 郑舒娴, 王建. HPLC 测定二维芦丁片复方制剂中芦丁的溶出度和含量 [J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(2): 188-192. Determination of Dissolution and Content of Two-dimensional Rutin Tables by HPLC WEN Chunmei 1, ZHENG Shuxian 1, WANG Jian 2* (1.Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To determine dissolution and content of rutin in Two-dimensional Rutin tablets by HPLC. METHODS The dissolution medium of determination of dissolution was water (containing 0.5 SDS ). Apparatus 2 was used with 75 r min 1. The dissiution medium was taken and analyzed by HPLC at 45 min. Determination of content was measured using a Thermo C 18 column. The mobile phase was treated with phosphate buffer (0.l mol L 1 sodium dihydrogen phosphate solution and adjusted to ph 4.4 with phosphoric acid) - acetonitrile (80 20). The detection wavelength was 254 nm. RESULTS Dissolution determination: it showed that stardard curve was linear in the range of 2.26 22.56 μg ml 1 (r=1.000 0). The average recovery was 98.2 (RSD=0.4) for rutin. The disslution of Two-dimensional Rutin tablets from three batches were >75. Determination of content: the method for determination of rutin had a good linearity, and the recovery was 100.6(RSD=0.4, n=9). CONCLUSION The method is simple, sensitive and reproducible, and it can be used for the determination of dissolution and content of Two-dimensional Rutin tablets. KEY WORDS: Two-dimensional Rutin tablets; rutin; dissolution; content; HPLC 芦丁具有降低毛细血管异常通透性和脆性的作用, 临床主要用于高血压病的辅助治疗 二维芦丁片是由维生素 C 维生素 B6 芦丁制成的复方制剂, 用于高胆固醇血症及动脉粥样硬化治疗 亚油酸维生素 E 胶丸 / 二维芦丁片由杭州华东医药集团五丰制药厂生产 目前执行国家药品监督管理局国家药品标准试行 WS-10001-(HD-1263)- 2002, 国内外药典 ( 中国药典 USP BP EP 和 JP) 均未见收载 试行标准中采用 UV 法测定芦丁含量, 专属性差, 前处理过程产生的误差很大, 因此本实验将芦丁的含量测定方法由 UV 法改为 HPLC; 试行标准二维芦丁片中未设溶出度检查 项, 考虑到芦丁为水难溶性药物, 因此本实验研究了芦丁的溶出度检查方法 本实验参照中国药典 2015 年版曲克芦丁的液相色谱条件, 和相关的 [1-3] [4-5] 含量和溶出度文献, 研究建立了 HPLC 测定二维芦丁片中芦丁溶出度和含量的方法, 并在标准中增订了芦丁的溶出度检查, 将芦丁的含量测定方法由 UV 法改为了 HPLC, 经方法学试验, 方法简便 可行, 可用于本品的质量控制 1 仪器与试药 LC-20AD 液相色谱仪 ( 日本岛津, 包括在线真空脱气机, 二元泵, 自动进样系统等 );AT7 型溶出仪 ( 瑞士 SOTAX, 采用针式取样方式 );Hanson 基金项目 : 国家药品标准提高研究项目 ( 食药监药化管便函 [2015]1057 号 ) 作者简介 : 文春梅, 女, 硕士生 Tel: 13735458046 E-mail: 2529449568@qq.com (0571)87180340 E-mail: wangjianhw2000@aliyun.com * 通信作者 : 王建, 男, 博士, 主任药师, 博导 Tel: 188 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期
在线过滤器 ( 孔径 10 μm) 水为蒸馏水 ; 乙腈为色谱纯 ; 磷酸二氢钠 戊烷磺酸钠均为分析纯 ; 芦丁对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号 :10080-201409, 含量 :91.1); 二维芦丁片及空白辅料 ( 杭州华东医药集团五丰制药厂, 规格 :10, 批号 :16062001,16011901, 16062202) 槲皮素对照( 中国食品药品检定研究院, 批号 :10081-201509, 纯度为 98.6) 2 方法与结果 2.1 色谱条件二维芦丁片为复方制剂, 且芦丁规格小, 因此采用专属性强的 HPLC 测定本品中芦丁的溶出度和含量 2.1.1 含量测定色谱条件色谱柱 :Thermo C 18 柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm), 以磷酸盐缓冲液 (0.l mol L 1 磷酸二氢钠溶液, 用磷酸调节 ph 值至 4.4)- 乙腈 (80 20) 为流动相, 检测波长为 254 nm; 流速 :1.0 ml min 1, 柱温 :30, 进样量 :10 µl 2.1.2 溶出度色谱条件进样量 :20 µl, 其他条件同含量测定色谱条件 2.2 溶出度测定 2.2.1 二维芦丁片在 4 种溶出介质中的溶出曲线和溶出条件的选择取本品, 照溶出度与释放度测定法 ( 中国药典 2015 年版通则 0931 第二法 [6] ), 分别以 4 种溶剂 [ 分别为水 ph 1.2 的盐酸溶液 2 mol L 1 醋酸溶液 (ph 4.0) ph 6.8 磷酸盐缓冲液, 4 种溶出介质中均含 0.5SDS]900 ml 为溶出介质, 转速为 75 r min 1, 依法操作, 经 5,10,15, 30,45,60 min 时, 取溶出液 5 ml, 作为供试品溶液, 并及时补足溶出介质 另精密称取芦丁对照品 11, 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2 ml, 置 100 ml 量瓶中, 用溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液 按 2.1.1 项下色谱条件测定, 取供试品溶液和对照品溶液各 20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算每片芦丁的溶出量, 结果见图 1 通过上述研究, 确定溶出度检查的条件为 : 桨法, 以水 ( 含 0.5 SDS)900 ml 为溶出介质, 转速为 75 r min 1,45 min 取样 图 1 二维芦丁片在 4 种溶出介质中的溶出曲线图 A ph 1.2;B ph 4.0;C ph 6.8;D 水 Fig. 1 The dissolution profile of Two-dimensional Rutin tablets in four dissolution media A ph 1.2; B ph 4.0; C ph 6.8; D water. 2.2.2 溶出度测定方法取本品, 照溶出度与释放度测定法 ( 中国药典 2015 年版通则 0931 第二法 ), 以 0.5 SDS 900 ml 为溶出介质, 转速 75 r min 1, 依法操作, 经 45 min 时, 取溶液 10 ml, 滤过, 取续滤液作为供试品溶液 另取芦丁对照品约 11, 精密称定, 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2 ml, 置 100 ml 量瓶中, 用溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液 按 2.1.1 项下色谱条件, 取供试品溶液和对照品溶液各 20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算每片芦丁 (C 27 H 30 O 16 3H 2 O) 的溶出量 限度为标示量的 75, 应符合规定 2.2.3 方法学试验 2.2.3.1 线性关系精密称取芦丁对照品适量, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取适量, 加水 ( 含 0.5 SDS) 稀释制成系列浓度溶液, 按 2.1.2 项下色谱条件测定 结果回归方程 :A= 1 226.499 3+18 590.399 6C, 相关系数 r=1.000 0 结果表明, 对照品溶液浓度在 2.26~22.56 μg ml 1 内与峰面积有良好的线性关系 2.2.3.2 溶出度其他成分的干扰试验按处方比例, 制成不含芦丁的空白样品, 取适量, 加水 ( 含 0.5 SDS) 适量, 超声振荡, 并稀释至规定浓度, 摇匀 滤过, 取滤液照 2.1.2 项下色谱条件测定, 结果表明其他成分对芦丁的溶出度测定无干扰, 见图 3 2.2.3.3 回收率试验按处方比例, 分别精密称取相当于样品标示量的 50,70,100 的芦丁对照品及相应量的空白辅料, 加甲醇适量, 超声振 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 189
荡使芦丁溶解, 并加水 ( 含 0.5 SDS) 至规定浓度, 摇匀, 滤过, 按 2.1.2 项下色谱条件测定, 对本法的回收率进行考察 结果见表 1 可见本法的回收率较高, 可用于溶出度的测定 精密量取续滤液 5 ml, 置 25 ml 量瓶中, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 作为含量测定的供试品溶液 表 1 溶出度的回收率测定结果 (n=9) Tab. 1 The results of recovery for dissolution(n=9) 模拟浓度 / 加入量 / 测定量 / 回收率 / 50 6.05 5.94 98.24 平均值 / RSD/ 6.12 5.96 97.39 6.03 5.94 98.52 70 9.45 9.29 98.27 9.39 9.28 98.79 9.43 9.28 98.44 100 12.64 12.39 98.01 12.58 12.36 98.25 12.62 12.37 98.00 98.2 0.4 图 2 3 批二维芦丁片的溶出曲线 A 16062001;B 16011901;C 16062202 Fig. 2 Dissolution curves of two batchs of Two-dimensional Rutin tablets. A 16062001; B 16011901; C 16062202. 2.2.3.4 溶液的稳定性取供试品溶液, 按 2.1.2 项下色谱条件测定, 于 0,2,4,8 h 测定, 结果 RSD 为 1.3, 溶液在 8 h 内稳定 2.2.4 样品的溶出度测定结果取杭州华东医药集团五丰制药厂样品 3 批, 照溶出度测定法 ( 中国药典 2015 年版通则 0931 第二法 ), 以水 ( 含 0.5SDS) 为溶出介质, 转速为 75 r min 1, 依法操作, 在 5,10,15,30,45,60 min 时, 分别取溶液 10 ml, 滤过, 并及时在操作容器中补充上述溶剂 10 ml 另精密称取芦丁对照品 11, 置 20 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量取 2 ml, 置 100 ml 量瓶中, 用溶出介质稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液 按 2.1.1 项下色谱条件测定, 取供试品溶液和对照品溶液各 20 μl, 分别注入液相色谱仪, 记录色谱图, 按外标法以峰面积计算每片的溶出量 结果见图 2~3 根据溶出曲线试验结果, 将取样时间定为 45 min, 限度定为 75 2.3 含量测定 2.3.1 溶液的配制精密称取芦丁对照品约 10, 精密称定, 置 50 ml 量瓶中, 加甲醇约 10 ml, 超声使溶解, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 作为含量测定的对照品溶液 ; 取本品 20 片, 精密称定, 研细, 取细粉适量 ( 约相当于芦丁 50 ), 精密称定, 置 50 ml 量瓶中, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 图 3 溶出色谱图 A 对照品溶液 ;B 供试品溶液 ( 批号 :16011901);C 空白样品溶液 ; 1 芦丁 Fig. 3 Dissolution chromatogram A standard solution; B sample solution(batch 16011901); C blank; 1 rutin. 2.3.2 系统适用性试验取芦丁对照品和槲皮素对照品各适量, 加甲醇适量使溶解, 用流动相稀释制成每 l ml 中分别约含 0.2 和 2 µg 的溶液, 作为系统适用性溶液, 取 10 µl 按 2.1.1 项下的色谱条件进行分析, 记录色谱图, 结果见图 4, 芦丁峰与槲皮素峰的理论板数分别为 8 967,9 521, 芦丁峰与槲皮素峰之间的分离度为 35.75 图 4 系统适用性试验色谱图 1 芦丁 ;2 槲皮素 Fig. 4 Chromatogram of system suitability test 1 rutin; 2 quercetin. 190 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期
2.3.3 方法专属性试验 2.3.3.1 芦丁与槲皮素的分离取 2.3.1 项下 的系统适用性溶液 10 µl, 按 2.1.1 项下色谱条 件测定, 确定芦丁和槲皮素的保留时间, 考察两者之间的分离度, 结果见图 4 结果表明, 在上述色谱条件下, 芦丁与槲皮素完全分离 2.3.3.2 强力破坏试验分别取 5 份芦丁原料药和二维芦丁片细粉各适量, 其中 2 份分别加入 0.1 mol L 1 氢氧化钠溶液 0.5 ml 和 0.1 mol L 1 盐酸溶液 0.5 ml, 加入碱的那份放置 0.5 h 后中和, 加入酸的那份放置 1 h 后中和 ; 一份加 3 过氧化氢溶液 0.5 ml, 放置 2 h; 另外 2 份分别在 105 下放置 3 h 和于强光下 (4 500 lx) 照射 5 d, 分别加甲醇适量, 超声使芦丁溶解, 用流动相稀释制成每 1 ml 中约含 0.2 的溶液, 滤过, 取上述处理后的溶液各 10 μl 进样分析, 结果芦丁对强光 碱 氧化破坏基本稳定, 在酸 高温破坏下, 有降解产物产生, 产生的主要降解产物是槲皮素, 对主峰含量测定无干扰 2.3.3.3 其他峰干扰按二维芦丁片处方制备不含芦丁的缺味溶液, 进样, 记录色谱图 结果表明二维芦丁片中的辅料 维生素 C 和维生素 B6, 对芦丁的含量测定无干扰, 色谱图见图 5 2.3.4 方法学试验 2.3.4.1 线性关系精密称取芦丁对照品适量, 加甲醇适量, 超声使溶解, 用流动相定量稀释制成每 1 ml 中约含 0.04,0.10,0.20,0.30 和 0.40 的溶液 按 2.1.1 项下色谱条件测定 得线性方程为 A=1.96 10 7 C 1.7 10 3,r=1.000 0(n=5) 结果表明, 芦丁在 0.04~0.40 ml 1 内线性良好 2.3.4.2 回收率试验按处方比例, 分别精密称取相当于样品标示量的 80,100,120 的芦丁对照品及相应量的空白辅料, 加甲醇适量, 超声使芦丁溶解, 并加流动相稀释至规定浓度, 摇匀, 滤过, 按 2.1.2 项下色谱条件测定, 对本法的准确度进行考察 结果见表 2 2.3.4.3 仪器精密度试验取批号为 16062001 的样品 6 份, 照确定的含量测定方法测定, 结果 RSD 为 0.6 2.4 样品含量测定取 3 批样品, 照确定的方法, 进样测定, 结果批号为 16062001,16011901,16062202 的 4 批 样品, 含量分别为 99.5,99.5,99.1, 含量测定 HPLC 色谱图见图 5 表 2 芦丁测定回收率测定结果 (n=9) Tab. 2 The results of recovery for rutin(n=9) 模拟浓度 / 加入量 / 测定量 / 回收率 / 80 17.06 17.03 99.83 16.43 16.46 100.17 16.65 16.75 100.58 100 20.25 20.43 100.91 20.56 20.68 100.59 20.46 20.65 100.92 120 24.64 24.84 100.80 24.61 24.74 100.54 24.74 24.96 100.87 平均值 / RSD/ 100.6 0.4 图 5 含量测定典型色谱图 A 对照品溶液 ;B 供试品溶液 ( 批号 :16011901);C 空白样品溶液 ; 1 芦丁 Fig. 5 Typical chromatogram of content determination A standard solution; B sample solution(batch 16011901); C blank; 1 rutin. 3 讨论 3.1 芦丁在 4 种溶出介质中的溶解度和表面活性剂 SDS 浓度的选择取芦丁原料药 10, 置带塞三角瓶中, 分别加入 ph 1.2 盐酸缓冲液 ph 4.0 醋酸缓冲液 水和 ph6.8 磷酸缓冲液 4 种溶出介质 250 ml, 振摇, 在 37 水浴中放置 3 h, 其间每隔 0.5 h 取出振摇一次 结果芦丁在 4 种溶出介质均未完全溶解, 在水和 ph 4.0 醋酸缓冲液中的溶解度大于 ph 1.2 盐酸溶液中的溶解度, 在 ph 6.8 磷酸缓冲液中的溶解度最差 因此在溶出介质中需添加表面活性剂 SDS 试验了在 4 种溶出介质中分别添加 0.1,0.2, 0.3,0.4 和 0.5SDS, 结果添加 0.1,0.2, 0.3,0.4SDS, 芦丁在 4 种溶出介质均未完全 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 191
溶解 ; 添加 0.5SDS, 芦丁在水和 ph 4.0 醋酸缓冲液中溶解完全, 在 ph 1.2 盐酸溶液中未完全溶解, 在 ph 6.8 磷酸缓冲液中的溶解较差 因此在溶出介质中添加 0.5SDS 3.2 溶出介质的选择根据二维芦丁片在 4 种溶出介质中 (ph 1.2 盐酸缓冲液,pH 4.0 醋酸缓冲液, 水和 ph 6.8 磷酸缓冲液且均含 0.5SDS) 的溶出曲线, 确定水 ( 含 0.5 SDS)900 ml 为溶出介质最佳 3.3 转速的选择比较了浆法转速为 75 r min 1 和转速为 50 r min 1 的溶出度, 结果表明, 转速为 50 r min 1, 溶出度低 ; 转速为 75 r min 1,45 min 可基本完全溶出 因此转速选择 75 r min 1 3.4 滤膜的吸附作用考察水 ( 含 0.5 SDS) 为溶出介质的溶出液经滤膜过滤 ( 津隆 MICRO PES 聚醚砜, 水系,0.45 μm), 与离心过后的溶出液比较,HPLC 测定 经滤膜过 滤后峰面积为 139 117, 离心后峰面积为 139 931, 说明水 ( 含 0.5 SDS) 为溶出介质, 滤膜对芦丁无 吸附 REFERENCES [1] ATTIA T Z. Simultaneous determination of rutin and ascorbic acid mixture in their pure forms and combined dosage form [J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2016(169): 82-86. [2] MA J Y, ZHANG C X, ZHAO B T. Determination of Rutin tablets and Compound Rutin tablets from different manufacturers by RP-HPLC [J]. J Northwest Norm Univ(Nat Sci)( 西北师范大学学报 ), 2010, 46(5): 74-76. [3] SUN Y H. Determination of vitamin C and rutin in Compound Rutin tablets by HPLC with dual-wavelength [J]. Anhui Med Pharm J( 安徽医药 ), 2012, 16(1): 30-32. [4] ZHANG P, CHEN R, WANG Y, et al. Study on the dissolution determination of Compound Rutin tablets [J]. Pharm Care Res( 药学服务与研究 ), 2016, 16(3): 225-229. [5] SHI J M, LIN L. Study on dissolution method of Troxerutin tablets [J]. J Guangdong Pharm Univ( 广东药学院学报 ), 2012, 28(3): 251-254. [6] 中国药典. 四部 [S]. 2015: 121-123. 收稿日期 :2017-08-22 ( 本文责编 : 曹粤锋 ) 192 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 February, Vol.35 No.2 中国现代应用药学 2018 年 2 月第 35 卷第 2 期