中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013,29(1):165 168 173 165 [ 文章编号 ] 1000 4718(2013)01 0165 05 阻塞性黄疸术后胰岛素抵抗与 肠黏膜屏障破坏间的相关性 陈振勇, 代红梅, 涂志刚, 杨鹏, 蒋春舫, 冯贤松 ( 华中科技大学同济医学院附属协和医院综合外科, 湖北武汉 430022) [ 摘要 ] 目的 : 探讨阻塞性黄疸 ( 阻黄 ) 术后胰岛素抵抗与肠黏膜屏障破坏间的相关性 方法 : 建立阻黄大鼠模型, 术后给予胰高血糖素样肽 2(GLP 2) 和强化胰岛素治疗, 分别于手术前 1d 及手术后 2 24 48h 和 3 7d 采血, 计算胰岛素抵抗指数, 检测乳果糖 / 甘露醇 (L/M) 比值,ELISA 法检测血清抵抗素样分子 β(relmβ) 浓度, RT PCR 检测回肠组织内 RELMβmRNA 相对含量 结果 : 阻黄组术后 3d 的胰岛素抵抗指数 (10 1±1 8) 和 L/M 比值 (0 66±0 08) 远高于其它时点 ( 均 P<0 05), 两者呈明显正相关 (r=0 86,P<0 05) GLP 2 组术后 7d 的胰岛素抵抗指数降幅达 37 0%, 胰岛素组术后 3d 的 L/M 降幅最大达 46 7%(P<0 05) 阻黄组术后 3d 血清 RELMβ 含量 [(0.69±0.05)μg/L] 和末端回肠上皮细胞内 RELMβmRNA 相对水平达到最高 (1 40±0 06) GLP 2 组和胰岛素组的 RELMβ 浓度较阻黄组明显降低 (P<0 05) 结论: 阻黄术后胰岛素抵抗与肠黏膜屏障破坏间具有相关性, 改善肠黏膜屏障和术后强化胰岛素治疗可以提升血清和组织内 RELMβ 含量 [ 关键词 ] 阻塞性黄疸 ; 胰岛素抵抗 ; 肠黏膜屏障 ; 抵抗素样分子 β [ 中图分类号 ] R364.5 [ 文献标志码 ] A doi:10.3969/j.isn.1000 4718.2013.01.029 Correlationbetweenpost operationinsulinresistanceandintestinalbarri erdysfunctioninobstructivejaundicerats CHENZhen yong,daihong mei,tuzhi gang,yangpeng,jiangchun fang,feng Xian song (DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalColege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430022,China.E mail:xhczy@126.com) [ABSTRACT] AIM:Toinvestigatethecorelationbetweenpost operationinsulinresistance(ir)andintestinal barierdysfunctioninobstructivejaundice(oj)rats.methods:theratmodelofojwassetup.theratswererandoml dividedintocontrolgroup(shamoperation),ojgroup,glucagon likepeptide2(glp 2)group(chalengedwithGLP 2 byintraperitonealinjection)andinsulingroup(insulinsubcutaneousinjection).peripheralbloodwascolected1dbefore operationand2h,24h,48h,3dand7dafteroperation.theirindexandtheratiooflactulose/mannitol(l/m)were determined.theconcentrationofserumresistin likemolecule(relm)βwasdetectedbyelisa.therelativemrnalev elofrelmβinterminalileumenterocyteswasmeasuredbysemi quantitativert PCR.RESULTS:TheIRindexandthe ratioofl/m inojgroup3dafteroperationwere10 1±1 8and0 66±0 08,respectively,whichwerehigherthanthose atothertimepoints(alp<0 05).ThecorelationcoeficientbetweenthechangesofIRindexandratioofL/Mwas0 86 (P<0 05).TheIRindexinGLP 2groupdescendedby37.0% 7dafteroperation(7.33±1 07vs4 62±0 53,P< 0 05).ThehighestconcentrationofserumRELMβwasobservedinOJgroup3dafteroperation(0 69μg/L±0 05μg/ L).TherelativemRNAlevelofRELMβinterminalileum enterocyteswasalsoincreasedobviously.theexpresionof RELMβwasobviouslydecreasedinGLP 2groupandinsulingroup.CONCLUSION:Thereisclosedrelationshipbetween post operationinsulinresistanceandintestinalbarierdysfunction.therelmβisthepointofintersection.enterocytesare notonlythesourceofpost operationinsulinresistancebutalsothetargetorgan. [KEYWORDS] Obstructivejaundice;Insulinresistance;Intestinalmucosabarier;Resistin likemoleculebeta 尽管随着术前评估和术后护理的进展, 阻塞性黄疸 ( 阻黄 )(obstructivejaundice,oj) 仍保持较高的 发病率和死亡率, 其中关键性的病理生理因素是肠道屏障功能破坏 [1], 肠通透性增加 [2] 其中尚有许 [ 收稿日期 ]2012 05 17 [ 修回日期 ]2012 11 13 [ 基金项目 ] 湖北省自然科学基金资助项目 (No.2010CDB08005) 通讯作者 Tel:027 85351530;E mail:xhczy@126.com
166 多未解之处 术后胰岛素抵抗 (insulinresistance, IR) 是指继发于大手术后的机体对胰岛素敏感性下降, 组织利用葡萄糖障碍的现象, 主要表现在术后血糖升高, 糖耐量异常 严重的术后 IR 会产生多种负面影响, 影响机体代谢, 破坏内环境稳定, 加重组织蛋白分解 临床研究显示术后 IR 在择期腹部手术中普遍存在, 发生的机制并未完全阐明 [3] 而择期腹部大手术后均存在肠黏膜屏障的破坏 [4], 我们前期的实验研究亦发现阻黄能破坏肠紧密连接蛋白, 损伤肠黏膜屏障, 引起内毒素血症和肠细菌移位 既然这两者在术后均普遍存在, 那么两者间是否具有某种联系? 我们在前期实验的基础上, 以阻黄大鼠为模型, 研究两者间的相关性 材料和方法 1 动物与分组 50 只 5 周龄 Wistar 大鼠, 雌雄不限, 体重 (300± 20)g, 购自华中科技大学同济医学院实验动物学部, 单笼适应性喂养 1 周后按随机数字表法平均分为 5 组, 每组 10 只 采用 10% 水合氯醛 (0.3g/kg) 腹腔注射麻醉 手术过程中预防性给予 0.1mL/g 体重的生理盐水皮下注射 对照组 : 即假手术组, 麻醉后仅行开关腹手术 ; 阻黄组 (OJ 组 ): 取上腹正中切口, 显露肝十二指肠韧带, 于近肝门处游离并结扎胆总管 ; 胰高血糖素样肽 2(glucagon likepeptide2,glp 2) 组 : 阻黄动物腹腔注射 GLP 2( 美国多肽公司 )0.5 ml(250mg kg -1 d -1 ), 连续 7d; 胰岛素组 (insu lin 组 ): 阻黄动物颈背部皮下注射胰岛素 ( 安徽宏业药业有限公司 )0.45U/kg; 连续 7d 2 检测指标 2.1 术后 IR 的检测手术前 1d(1dbeforeopera tion,1dbo) 手术后 2 24 48h 和 3 7d 空腹大鼠尾静脉各采血 300μL 美国雅培公司血糖仪检测大鼠的空腹血糖 (fastingbloodglucose,fbg,mmol/l), 放射免疫法 ( 北方生物技术研究所 ) 测定空腹血清胰岛素 (fastingserum insulin,fins,mu/l) 使用稳态模式评估法 (homeostasismodelasesment,homa) 计算胰岛素抵抗指数 (HOMA IR)=FBG FINS/22.5 各时点相隔 5min 采血 3 次取平均值 2.2 乳果糖 / 甘露醇 (lactulose/mannitol,l/m) 比值检测实验动物分别于各时点采血后自由饮水, 经胃管每只喂服 2mL 检测溶液 ( 含 10% 乳果糖 100 mg 和 5% 甘露醇 50mg,Sigma) 随后连续收集 6h 尿液, 混匀后取 5mL, 加入 1mg 硫柳汞作防腐剂, 置于 -20 冰箱保存 利用色谱仪分析尿中 L/M 比值 每只大鼠尿标本分 3 次各取 5mL, 重复测量 3 次 2.3 血清类抵抗素分子 β(resistin likemoleculebeta, RELMβ) 浓度的测定采用 RELMβELISA 试剂盒 ( 上海天呈生物科技有限公司 ),100μL 血清标本加入 96 孔板, 按说明书操作, 通过多波段培养皿阅读器在 420 nm 处测量每孔吸光度 测量极限 75ng/L 2.4 回肠组织内 RELMβmRNA 的检测采取半定量逆转录 PCR( 武汉博士德公司 ) 检测组织细胞内 RELMβ 表达 各组动物分别于术后第 8d 拉脱法处死 无菌取原手术切口, 距回盲部 10cm 处环形切取回肠, 取 1mm 1mm 1mm 大小的组织块, 提取总 RNA, 逆转录合成 cdna, 以此为模版进行 PCR 扩增 扩增片段及引物 [5] : 上游引物 5 CCCTTCTCC AGCTGATCAAC 3, 下游引物 5 CCACGAACC ACAGCCATAG 3 ; 以 β actin 作为内参照, 上游引物 5 TTGCCTCTCAGACAATGCCTG 3, 下游引物 5 TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT 3 循环条件 :94 预变性 5min;94 30s,58 1min; 72 1min; 共 35 个循环, 最后 72 7min PCR 产物通过 12% 琼脂糖凝胶电泳, 并用密度扫描分析 PCR 产物带 3 统计学处理计量资料用均数 ± 标准差 (mean±sd) 表示, 采用 SPSS13.0 分析, 组间计量资料比较, 方差齐时采用单因素方差分析及配对资料 t 检验, 方差不齐时采用秩和检验 以 P<0.05 为差异有统计学意义 结果 1 阻黄术后 IR 指数的变化阻黄和对照组动物术后 IR 指数均明显升高, 与术前相比, 对照组术后 48hIR 指数达到最高 (8.8± 1.9), 阻黄组术后 3d 为最高 (10.1±1.8), 均明显高于其它时点 ( 均 P<0 05), 见图 1 Figure1.ThechangesofindexofIRafteroperation.BO:before operation.mean±sd.n=10. # P<0.05vsothertime pointsincontrolgroup; P<0.05vsothertimepoints inojgroup. 图 1 阻黄术后 IR 指数的变化
167 2 阻黄术后 L/M 的变化 L/M 比值是反映肠黏膜通透性的指标 对照组术后有所上升, 但各时点的上升幅度没有统计学意义 ( 均 P>0.05), 阻黄组术后明显上升, 其中 3d 组达到最高值 0.66±0.08(P<0.05),7d 组开始下降, 但仍高于其它时点, 见图 2 Figure4.ThechangesofratioofL/M ininsulinandojgroups. Mean±SD.n=10. # P<0.05vsothertimepointsin OJgroup. 图 4 胰岛素组和阻黄组术后 L/M 的变化 Figure2.ThechangesofratioofL/M afteroperation.mean± SD.n=10. # P<0.05vsothertimepointsinOJ group. 图 2 阻黄术后 L/M 的变化 3 IR 与 L/M 比值变化间的相关性将术后 IR 与 L/M 比值的变化进行相关性分析, 结果两者的相关系数 r=0.86(p<0.05), 呈明显正相关 4 GLP 2 组术后 IR 的变化 GLP 2 是一种肠黏膜保护剂 [6], 能恢复受损的肠黏膜 腹腔注射 GLP 2 后术后 IR 指数较阻黄组下降, 其中 7d 组从 7.33±1.07 降至 4.62±0.53, 降幅达 37.0%, 为各时点最大降幅 (P<0.05), 见图 3 6 术后 IR 与肠黏膜屏障间的联系 用 ELISA 检测阻黄组不同时点血清 RELMβ 的含量, 结果阻黄动物术后 3dRELMβ 血清含量达到最高 [(0.69±0.05)μg/L], 见图 5A, 分别与术后 IR 指数变化的相关度 r=0.955(p<0.05), 与 L/M 变化的相关系数 r=0.736(p<0.05) 由于 RELMβ 在肠道组织内特异性表达, 我们进一步研究末端回肠上皮细胞内 RELMβmRNA 的表达 半定量 PCR 显示各组相对 RELMβmRNA 水平均高于对照组, 与血清浓度不同的是 GLP 2 组上皮组织内 RELMβ mrna 相对含量高于胰岛素组, 见图 5B 7 各组血清 RELMβ 含量 由于 GLP 2 和胰岛素可以分别影响肠黏膜屏障和 IR, 我们研究两者对血清 RELMβ 含量的影响, 结果各组均高于对照组 (P<0.01), 其中阻黄组最高达 (0.41±0.04)μg/L,GLP 2 组与胰岛素组相比差异无统计学意义, 见图 6 讨 论 Figure3.ThechangesofindexofIRafteroperationinGLP-2 group.mean±sd.n=10. # P<0.05vsOJgroup. 图 3 GLP 2 组术后 IR 的变化 5 胰岛素组术后 L/M 的变化研究显示围手术期强化胰岛素治疗可以降低术后 IR [7] 使用胰岛素后 L/M 在 3d 和 7d 较阻黄组明显降低, 其中 3d 组从 0.66±0.08 降至阻黄组的 0.35±0.04, 降幅最大达 46.7%(P<0.05), 见图 4 术后 IR 在腹部手术后普遍存在 [2], 发生机制十分复杂, 一般认为与抗调节激素 ( 如生长激素 促肾上腺皮质激素 抗利尿激素 胰高血糖素 糖皮质激素和儿茶酚胺 ) 细胞因子 (IL 1 IL 6 和 TNF α) 的大量释放及外周组织胰岛素抵抗密切相关 而外周组织胰岛素抵抗又与胰岛素受体有关, 并可初步区分为受体前 受体和受体后机制 [8] 临床和实验均观察到腹部大手术后存在肠黏膜屏障的破坏 [4], 我们前期以阻黄动物模型为实验对象, 研究发现阻黄手术后肠紧密连接蛋白数量和分布受损, 紧密连接通道开放, 肠黏膜屏障通透性增加, 出现肠细菌移位和内毒素血症 既然这两者在术后均普遍存在, 那么两者间是否具有某种联系? 我们的研究发现阻黄术后 IR 和肠黏膜屏障的破坏间具有明显相关 阻黄术后 IR 指数增加, 阻黄
168 Figure5.Thechangesofserum RELMβconcentrationdetected byelisa(a)andtheexpresionofrelmβmrna detectedbyrt PCR(B).1:control;2:OJ;3:insu lin;4:glp-2.mean±sd.n=10. # P<0.05vsinsu lingroup; P<0.05vscontrolgroup. 图 5 血清 RELM β 的含量和组织内 RELMβmRNA 表达 Figure6.SerumRELMβconcentration.Mean±SD.n=10. # P< 0.05vscontrolgroup. 图 6 各组血清 RELMβ 含量组和假手术组术后 IR 指数均远高于术前, 说明手术后均存在 IR 阻黄组术后 3dIR 指数达到最高 (10. 1±1.8), 且反映肠黏膜通透性的指标 L/M 比值也在术后 3d 达到最高 (0.66±0.08), 两者的相关系数 r=0.86, 说明两者间的变化具有同步性 既然两者有相关性, 那么改变其中一个因素是否也能影响另外一个因素?GLP 2 能保护并恢复受损的肠黏膜屏障 结果阻黄动物使用 GLP 2 后术后 IR 指数较未用者下降 同样, 注射胰岛素后, 阻黄动 物 3d 组的 L/M 降幅最大 46.7% 说明两者间可以互相影响 由于肠黏膜屏障的产生基础是肠黏膜上皮细胞及其相互间的紧密连接, 因此我们的研究显示肠道上皮细胞既是术后 IR 产生的来源, 也是 IR 作用的靶器官 在应激状态下, 肠上皮细胞分泌抗调节激素, 参与术后 IR 形成, 同时增高的激素水平反过来也损伤肠上皮细胞, 破坏肠黏膜屏障 因此使用肠黏膜屏障保护剂 GLP 2, 减少了肠上皮分泌抗调节激素和细胞因子, 达到降低 IR 的作用 而术后强化胰岛素治疗, 可以降低术后 IR, 也间接保护了肠黏膜屏障 那两者间有什么内在联系? 或者说其交汇点是 [9] 什么?Steppan 等于 2001 年首次提出抵抗素 (re sistin) 为肥胖与糖尿病的联系所在, 出现 IR 的小鼠抵抗素显著增高 抵抗素参与 2 型糖尿病的发病机制, 并且 2 型糖尿病患者中,IR 组的抵抗素水平要明显高于胰岛素敏感组 [10] 随后一系列的研究发现该家族的其它成员, 包括类抵抗素分子 RELMα β γ 和 resistin [11] 这些家族成员由 105~114 个氨基酸组成, 有 3 个结构区域 :N 端信号肽 中间可变区和相对保守的富含 11 个半胱氨酸的 C 端序列 [12] 其中 RELMβ 也称作肠道特异性抵抗素, 高度局限于肠杯状细胞 [13], 参与维持胃肠道屏障功能 [14], 与肠道上皮细胞分化 细胞增殖 免疫反应和炎症反应密切相关 [15] 用 ELISA 检测阻黄组不同时段血清 RELMβ 的含量, 结果阻黄动物术后 3d 组 RELMβ 血清含量达到最高 (0.69±0.05)μg/L, 分别与术后 IR 指数变化呈正相关, 说明血清 RELMβ 含量与术后 IR 的变化有关 通过 RT PCR 研究末端回肠上皮细胞内 RELMβ 的表达, 显示各时点组织细胞内相对 RELMβ mrna 水平均高于对照组, 说明阻黄术后短期内血液和组织细胞内 RELMβ 水平上升, 与术后 IR 有一致性 同时阻黄术后使用 GLP 2 和强化胰岛素治疗,RELMβ 相对含量均上升较多, 从另一个角度更加反映 RELMβ 与术后肠黏膜屏障和 IR 有关 说明改善肠黏膜屏障和术后强化胰岛素治疗可以提升血清和组织内 RELMβ 含量, 其变化与术后肠黏膜屏障和 IR 具有一致性 [ 参考文献 ] [1] WangN,YuH,MaJ,etal.Evidencefortightjunction proteindisruptioninintestinalmucosaofmalignantob structivejaundicepatients[j].scandjgastroenterol, 2010,45(2):191 199. ( 下转第 173 页 )
173 matrixcompositionandstructural,functional,andclinical manifestationsofhypertensiveheartdisease[j].circula tion,2006,113(17):2089 2096. [3] BrionesaAM,AribasbSM,SalaicesM.Roleofextracel lularmatrixinvascularremodelingofhypertension[j]. CurOpinNephrolHypertens,2010,19(2):187 194. [4] LemarieCA,TharauxPL,LehouxS.Extracelularmatrix alterationsinhypertensivevascularremodeling[j].jmol CelCardiol,2010,48(3):433 439. [5] SaglamM,KarakayaO,EsenAM,etal.Contributionof plasmamatrixmetaloproteinasestodevelopmentofleft ventricularhypertrophyanddiastolicdysfunctioninhyper tensivesubjects[j].tohokujexpmed,2006,208(2): 117 122 [6] SchubertA,WaltherT,FalkV,etal.Extracelularma trixgeneexpresioncorelatestoleftventricularmasin dexaftersurgicalinductionofleftventricularhypertrophy [J].BasicResCardiol,2001,96(4):381 387. [7] SpinaleFG,CokerML,BondBR,etal.Myocardialmatrix degradationandmetaloproteinaseactivationinthefailing heart:apotentialtherapeutictarget[j].cardiovascres, 2000,46(2):225 238. [8] HayashidaniS,TsutsuiH,IkeuchiM,etal.Targetedde letionofmmp 2attenuatesearlyLVruptureandlatere modelingafterexperimentalmyocardialinfarction[j].am JPhysiolHeartCircPhysiol,2003,285(3):H1229 H1235. [9] 徐磊, 卢兴国, 陈怀红, 等. 基质金属蛋白酶 3 和尿激酶型纤溶酶原激活物受体在 2 型糖尿病大血管病变中的变化 [J]. 中国病理生理杂志,2007,23(5):897 899. [10] McFarlandKL,GlaserK,HahnJM,etal.Culturemedi umandceldensityimpactgeneexpresioninnormalskin andabnormalscar derivedfibroblasts[j].jburncare Res,2011,32(4):498 508. [11] MedleyTL,KingwelBA,GatzkaCD,etal.Matrixme taloproteinase 3genotypecontributestoage relatedaortic stifeningthroughmodulationofgeneandproteinexpres sion[j].circres,2003,92(11):1254 1261. [12] KochW,deWahaA,HoppmannP,etal.Haplotypes and5a/6apolymorphismofthematrixmetaloproteinase 3 geneincoronarydisease:case controlstudyandameta a nalysis[j].atherosclerosis,2010,208(1): 171 176. 櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆 ( 上接第 168 页 ) [2] 陈振勇, 代红梅, 杨鹏, 等. 阻塞性黄疸对肠上皮细胞氯离子分泌影响的实验研究 [J]. 中国病理生理杂志,2011,27(11):2194 2198. [3] 陈宏, 李非, 贾建国, 等. 择期腹部手术后胰岛素抵抗相关因素研究 [J]. 中国实用外科杂志,2009,29 (5):428 430. [4] 陈振勇, 冯贤松, 杨鹏, 等. 梗阻性黄疸时脾切除对肠黏膜屏障影响的实验研究 [J]. 中华肝胆外科杂志, 2011,17(4):309 312. [5] FangC,MengQ,WuH,etal.Resistin likemolecule β isahumanairwayremodelingmediator[j].eurrespir J,2012,39(2):458 466. [6] GiovanniM,RobertoG,MaurizioC.Obesity,diabetes, and gutmicrobiota:the hygiene hypothesisexpanded? [J].DiabetesCare,2010,33(10):2277 2284. [7] AwadS,LoboDN.Metabolicconditioningtoatenuatethe adverseefectsofperioperativefastingandimprovepatient outcomes[j].curopinclinnutrmetabcare,2012,15 (2):194 200. [8] 秦环龙, 杨俊. 胰岛素抵抗与创伤性高血糖 [J]. 中国实用外科杂志,2006,26(2):96 97. [9] SteppanC,YamazawaT,BrownEJ,etal.Antagonismof insulinactionbyresistin[j].diabetes,2001,50(suppl 2):A70. [10] TokuyamaY,OsawaH,IshizukaT,etal.Serumresistin levelisasociatedwithinsulinsensitivityinjapanesepa tientswithtype2 diabetesmelitus[j].metabolism, 2007,56(5):693 698. [11] NairMG,GuildKJ,DuY,etal.Gobletcel derivedre sistin likemoleculeβaugmentscd4 + Tcelproductionof IFN γandinfection inducedintestinalinflammation[j].j Immunol,2008,181(7):4709 4715. [12] 叶红, 马万里, 张少华, 等. 慢性吸烟大鼠肺组织 FIZZ1/RELMα 表达的变化 [J]. 中国病理生理杂志, 2006,22(5):938 942. [13] HeW,WangML,JiangHQ,etal.Bacterialcolonization leadstothecolonicsecretionofrelmβ/fizz2,anovel gobletcel specificprotein[j].gastroenterology,2003, 125(5):1388 1397. [14] HerbertDR,YangJQ,HoganSP,etal.Intestinalepithe lialcelsecretionofrelm βprotectsagainstgastrointesti nalworm infection[j].jexpmed,2009,206(13): 2947 2957. [15] RimBK,LarisaK,LaurentD,etal.Resistin likemol eculeβregulatesintestinalmucoussecretionandcurtails TNBS inducedcolitisinmice[j].inflamm BowelDis, 2008,14(7):931 941.