儀器分析 ~ 講義 1. 層析分析法 層析分析法為一種有效的物理分離分析方法, 根據混合物中各成分在不互溶的兩相 ( 固定相與流動相 ) 中的吸附能力 分配係數 或其他親和作用之性能的差異, 使其流速不同, 作為分離的依據 使用高靈敏度的偵測器, 將被分離之成分的濃度變化轉換成電子信號, 由信號處理器產生輸出信號, 由記錄器繪製成層析圖 (chromatogram, 又稱色譜圖 ) 層析分析法的分類 1 依流動相鼎文公職 ( 動相 ) 及固定相 ( 靜相 ) 的狀態來分類固定相可為固體或液體, 流動相可為氣體 液體或超臨界流體 (supercritical fluid), 因此有三類層析法 : 氣相層分析法 (gas chromatography,gc): 流動相為氣體時, 稱為氣相層析法, 依固定相不同可分為三種 : 氣 - 固層析法 (gas chromatography,gc): 流動相為氣體 ; 固定相為固體之層析法, 試閱講義其固體通常為吸附劑, 其平衡類型為試料成分在固體上之吸附 (adsorption) 氣 - 液層析法 (gas-liquid chromatography,glc): 係流動相為氣體 ; 固定相為液體之層析法, 其液體通常為吸附在管壁上, 其平衡類型為試料成分在氣體和液體間之分配 (partition) 氣 - 鍵結相層析法 (gas-bonded phase chromatography,gbc): 係流動相為氣體 ; 固定相為鍵結在固體表面上的有機物種, 其平衡型式為試料成分在氣體與鍵結相表面之間的分配 液相層析法 (liquid chromatography,lc): 流動相為液體時, 稱為液相層析法, 依固定相不同可分為三種 : 液 - 固層析法 (liquid-solid chromatography,lsc): 流動相為液體 ; 固定相為固體之層析法, 固體通常為吸附劑, 平衡類型為試料成分在固體上之吸附 (adsorption) 液 - 液層析法 ( liquid-liquid chromatography,llc): 又稱為分配層析法 (partition chromatography), 流動相為液體 ; 固定相為液體之層析法, 固定相通常為吸附在固體上之液體, 其平衡類型為試料成分在二不互溶液體間的分配 (partition) 液 - 鍵結相層析法 (liquid-bonded phase chromatography,lbc): 流動相為液體 ; 固定相為鍵結在固體表面上之有機物種, 其平衡類型為試料成分在液體與鍵結相表面間 鼎文文理補習班 1 版權所有翻印必究
的分配 超臨界流體層析法 (supercritical-fluid chromatography,sfc): 流動相為超臨界流體, 而固定相為鍵結在固體表面上的有機物種 (organic species), 其平衡類型為試料成分在超臨界流體與鍵結表面間之分配 (partition) 2 依分離過程的原理來分類 吸附層析法 (adsorption chromatography): 利用試料成分在固體吸附劑表面吸附性能的差異, 來進行分離的層析法 分配層析法 (partition chromatography): 利用試料成分在二不互溶液體間之分配係數的差異, 以萃取法來進行分離的層析法 離子交換層析法 (ion-exchange chromatography,iec): 利用試料成分在離子交換樹脂表面上之親和力的差異來進行分離的層析法 凝膠滲透層析法 (gel-permeation chromatography,gpc): 利用試料成分的分子大小及鼎文公職形狀不同, 通過含有特定大小多孔性之凝膠之固定相, 小分子可滲透入凝膠之孔隙而較慢流出, 但大分子因不能滲透入孔隙而經過凝膠間較大的空隙很快流出而與小分子分離 此層析法, 又稱尺寸大小排除層析法 (size exclusion chromatography,sec): 因係利用分子大小不同來分離, 又稱為分子篩層析法, 因係利用分子篩孔隙大小不同來分離 3 依固定相的形式來分類試閱講義 管柱層析法 (column chromatography): 係將固定相裝入玻璃管或金屬管內, 其流動相依本身的重力或外加壓力而通過管柱內的固定相而分離 氣相層析法及超臨界流體層析法均屬於管柱層析法 平面層析法 (planar chromatography): 係固定相附著在一平板上或多孔濾紙上, 其流動相則利用毛細現象或重力作用而流經固定相而分離 固定相在平板上又稱為薄層層析法 (thin-layer chromatography, TLC): 固定相在濾紙上又稱為紙層析法 (paper chromatography,pc) 鼎文文理補習班 2 版權所有翻印必究
管柱層析法之分類 流動相分類 特性方法 靜相 平衡類型 氣相層析法 氣 - 液相氣 - 固相 液體吸附在固體上固體 在氣體與液體之間的分配行為吸附行為 液相層析法 液 - 液相或分配行為 液體吸附或者鍵結在固 不互溶液體之間的分配行為 體表面上 液 - 固相或吸附行為 固體 吸附行為 離子交換 離子交換樹脂 離子交換行為 凝膠滲透 在聚合物固體縫隙中的液體 分配 / 過篩行為 鼎文公職吸引官能基特異性液體鍵結在表面液體與移動性液體之間在固體表面上的分配行為超臨界流體有機物種鍵結在固體表在超臨界流體與鍵結表面之間層析法面上的分配行為 1-1 層析分析法的基本理論試閱講義 1-1-1 管柱層析分析法 層析分析法是將樣品混合物經由流動相 ( 氣體或液體 ) 的攜帶而流經固定相 ( 固體或固定在 固體表面上的液體 ), 由於混合物中的各成分有不同的移動速率, 而將樣品中的成分分離 方法 A. 選擇了適合於待分離物質的固定相和流動相 固定相常常需要水合 (hydrated) 或預先浸泡在流動相中, 製備好的固定相充填至管柱 ( 通常為玻璃柱 ), 管柱的長度和直徑取決於樣品添加量 採用的分離模式和要求達到的分離度 B. 吸附層管柱析可以用乾法或濕法充填 最普通的濕法充填技術是先用溶劑將吸附劑調成漿狀, 然後倒入管柱, 當吸附劑沉降時, 排除多餘的溶劑, 再加入另外的漿狀吸附劑, 此過程重複進行到達所需的管柱高度 C. 將待分離的樣品溶於最小體積的流動相中, 滴加於管柱上部形成一薄層, 低壓層析只採用重力或蠕動泵來維持通過管牲的洗脫溶劑的流速 洗脫可以採用恆量或梯度洗脫 梯度洗脫是指在洗脫過程中, 為了提高分離和減少分析時間而改變流動相 ( 如增加溶劑強度或 ph 等 ) 鼎文文理補習班 3 版權所有翻印必究
D. 管柱洗脫液直接通過檢測後進入部分收集器中按定時間間隔收集的試管中, 檢測需以電訊號的形式感應並記錄下來 ( 層析圖譜 ) E. 部分收集器可設置成特定的時間間隔或在流出一定體積的洗脫液以後收集組成分 經此層析分離得到的樣品的成分還需要進行進一步的分析 層析圖譜 鼎文公職 層析圖譜之意義 分離和解析度層析的目的是當組成分通過在柱中遷移後, 使樣品混合物分離出區帶或成分峰 兩個峰之間的解析度 ( resolution) 可定義為 : 2Δt Rs = ( w2 + w1) 試閱講義 Rs: 解析度 t: 峰 1 和峰 2 滯留值之差 w2: 峰 2 的峰基寬 w1: 峰 1 的峰基寬層析解析度是管柱效率 選擇性和容量因子三者的綜合, 其關係可用下列計算式表示 : a: 管柱效率因子 b: 管柱選擇性因子 c: 容量因子 A. 管柱效率 (column efficiency) 檢查管柱效率為改善解析度的主要解決方法, 一根高效的管柱保持區帶較窄或得到較銳的峰形 管柱效率可以下式定量計算 : 鼎文文理補習班 4 版權所有翻印必究
tr N = σ N: 理論板數 t R : 滯留時間 2 tr tr = 16 = 5.5 w w1 / 2 σ: 高斯峰的標準偏差 w: 峰基寬 (w=4σ) w 1/2 : 峰半高寬度 2 管柱情況的惡化引起的區帶增寬將導致管柱效率的下降 理論板數通常與管柱長度成正比, 於使用的管柱長度不一, 因此, 不依賴於柱長的管柱效率的測定就非常有用, 其表示式如下 : L HETP = N HETP: 理論板高鼎文公職 L: 管柱長度 N: 理論塔板數理論板高 (HETP) 有時簡稱為板高 (H) 假如說柱長是由不連續的片段組成,HETP 就是每個虛擬的片段的高度 板高值小 ( 塔板數大 ) 表示管柱的分離效率高 層析峰形依賴於洗脫速度, 並受溶質擴散的影響 任何造成溶質擴散的因素都會增加 HETP, 隨之使管柱效率下降 試閱講義根據研究層析峰帶加寬的因素是由下列三個程序所造成 : 渦流擴散 (eddy diffusion), 縱向擴散 (longitudinal diffusion), 非平衡質量傳遞 (nonequilibrium mass transfer) 這三個程序的效應由下列控制變數來決定 : 流動速率 填充物粒子大小 擴散速率要及固定相厚度 1950 年由荷蘭化學工程師凡迪姆特 (van Deemter) 導出這三個程序造成峰帶加寬對平板高度 H 的影響, 將流動相的流動速率 u 對 H 的關係式稱為凡迪姆特方程式 (van Deemter equation): 鼎文文理補習班 5 版權所有翻印必究
b HETP = A + + Cu u HETP: 理論板高 A B C: 常數 u: 流動相的線速 常數 A B C 對於確定的管柱 流動相和溫度是不變的 A 項是因為渦流擴散 (eddy diffusion) 或多通路擴散造成 渦流擴散可認為是流動相在管柱的固定相顆粒之間存在著不同的且急性微小的流動通路 Van Deemter 方程式的 B 項, 有時稱為縱向擴散相 (longilu dinal diffusion), 是由於溶質從高濃度區域向低濃度區域擴散造成的 在液相層析中, 此項對 HETP 的影響很小, 除非是在很低的流速下進行 ( 溶質在管柱上運行的時間越長, 其擴散的程度就越大 ) C 項是由於溶質在流動相和固定相之間達到平衡需要一定的時間而產生的 按照 Van Deemter 方程式, 流動相流速 u 對板高有兩個完全不同的影響 - 增加流速, 一方面會增加渦流擴散和質傳阻力 (A 和 C 項 ), 同時又降低了縱向擴散 (B 項 ) 鼎文公職 Van Deemter 曲線可用於確定使板高最小 管柱效率最高時流動相的流速 B. 選擇性 (selectivity) 層析的解析度與選擇性及管柱效率有關, 選擇性是指兩個峰之間的距離或相對分離程度, 可用下式表示 : ( tr 2 t 0) tr 2' K 2 α = = = 試閱講義 ( tr1 t 0) tr1' K 1 α: 分離因子 t R1 和 t R2 : 組成份 1 和 2 的滯留時間 t 0 ( 或 t m ): 未滯留成分的滯留時間 t R1 和 t R2 : 組成份 1 和 2 的調整滯留時間 K 1 和 K 2 : 組成 1 和組成 2 的分配平衡常數 C. 容量因子 (capacity factor) 容量因子或滯留因子 k 是層析分離組成分 ( 溶質 ) 滯留在固定相與流動相中時間之比 容量因子和層析保留值之間的關係見下式所示 : KV k' = Vm S ( VR Vm) ( t = = Vm k : 容量因子 K: 溶質的分配平衡常數 V S : 管柱固定體積 V m : 流動相體積 R t 0) t 0 鼎文文理補習班 6 版權所有翻印必究