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- 卵箕 函
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1 细胞治疗揽要 ( 一 ) 上海市血液中心 钱开诚
2 如果 20 世纪是药物治疗时代, 那么 21 世纪就是细胞治疗时代 美国生物学家 George Daley
3 细胞治疗相关的诺贝尔奖 马里奥 卡佩奇, 奥利弗 史密斯 ( 美国 ) 马丁 埃文斯 ( 英国 ) 发现在利用胚胎干细胞引入特异性基因修饰的原理 获 2007 年诺贝尔生理或医学奖 拉尔夫 斯坦曼 ( 美国 ) 发现树突细胞和其在获得性免疫中的作用 获 2011 年诺贝尔生理或医学奖 约翰 格登 ( 英国 ) 山中伸弥 ( 日本 ) 发现成熟细胞可被诱导生成多能干细胞 ( induced pluripotent stem cells ips) 获 2012 年诺贝尔生理或医学奖
4 细胞治疗 利用具有特定功能的细胞的特性, 达 到预期的治疗效果 特定功能的细胞 直接获取的成熟细胞 通过特殊方法诱导培养 扩增, 形成具有特定免疫功效或再生能力的细胞群落 用分子生物学方法改造天然细胞, 使之增强精确免疫攻击能力 或分化再生能力的细胞群落
5 细胞治疗 第一代细胞治疗 全血输注 成分输血 红细胞输注血小板输注 粒细胞输注 第二代细胞治疗 自体免疫细胞输注 造血干细胞移植 免疫激活 ( NK LAK CIK TIL DC ) 免疫抑制 (MSC Treg tdc) 恶性血液系统疾病实体瘤遗传性疾病 实体瘤 移植耐受 自身免疫性疾病 第三代细胞治疗 同种异基因免疫细胞输注 免疫抑制 (MSC Treg tdc) 移植耐受 自身免疫性疾病 干细胞治疗 (MSC ES ips) 组织修复 器官再造
6 细胞治疗 免疫细胞治疗 干细胞治疗
7 免疫细胞治疗治疗 免疫细胞攻击治疗 淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) 肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK) 树突状细胞 (DC) 树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞 (DC-CIK) 自然杀伤细胞 (NK) 嵌合抗原受体 T 细胞 (CAR-T) 免疫调节细胞治疗 调节性 T 细胞 ( Regulatory T Cells,Tregs ) 耐受型树突状细胞 ( Tolerogenic dendritic cell,tdc ) 间充质干细胞 ( MSC )
8 免疫细胞攻击治疗
9 免疫细胞治疗的基础 Chester Southam: 在五十年代首次给志愿者注射活的癌细胞 结果 : 注射的癌细胞在健康人体内不生长. 注射的癌细胞在癌症病人体内可长成大肿瘤 结论 : 正常人体内具有抵抗癌细胞的免疫能力, 癌症病人体内失去健康人所具有的抗癌免疫活性 该项研究显然与医学伦理学的基本原则相违悖, 但对癌症及其治疗的机理研究提供了实证提示, 1968 年被推选成全美抗癌学会主席 首次证明人体内天然抗癌活性的存在 Science,1957 年一月 125:
10 淋巴因子激活的杀伤细胞 lymphokine-activated killer cell LAK 1982 年 Grimm 等首先报道 PBMC 中加入 IL-2 体外培养 4-6 天, 能诱导出一种非特异性的杀伤细胞, 可以杀伤多种肿瘤细胞 目前尚未发现 LAK 细胞特有的表面标志, 有研究表明, LAK 细胞的前体细胞是 NK 细胞和 T 细胞 1984 年 11 月 Rosenberg 等经 FDA 批准, 应用 IL-2 与 LAK 协同治疗肿瘤患者 报道 222 例, 其中 16 例患者肿瘤转移灶完全消退,26 例患者肿瘤消退 50% 以上, 证明该疗法对转移性肾细胞癌 黑素瘤 结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著 同时发现, 该方法治疗过程中可出现较严重的毒副反应, 最常见是出现毛细血管渗漏综合征 CLS, 表现为全身性水肿和多器官功能失调, 可引起胸腹腔积液 肺间质水肿和充血性心力衰竭
11 肿瘤浸润淋巴细胞 (Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL) 1986 年 Rosenberg 研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞 TIL,TIL 是通过采集患者肿瘤组织或腹水中的淋巴细胞, 经过体外 IL-2 等等激活和扩增培养, 得到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细胞的细胞群, 一般以 CD3+CD8+T 细胞为主 疗效优于 LAK, 毒副作用则明显低于 LAK 作用机制 通过释放细胞毒素直接杀伤肿瘤细胞 调节机体免疫功能, 提高机体对肿瘤细胞的杀伤能力 其后的研究提示,TIL 可提高 NK CIK 等细胞作用 临床应用已在临床应用多年, 证明对皮肤 肾 肺 肝 卵巢部位的原发或继发肿瘤
12 TIL 细胞治疗流程
13 细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokine-Induced Killer,CIK) 1991 年斯坦福大学 Wolf 等首先报道单个核细胞在多种细胞因子如 IL-2 IFN-γ 及某些单克隆抗体 (anti-cd3mcab) 刺激下于体外培养扩增出的以 D3+CD56+ CD3+CD8+ 为主的一个细胞群, 称之为 CIK CIK 的扩增效率是 LAK 的 50 倍以上, 具有广泛的非 MHC 限制的极强的溶瘤活性 识别能力强, 能点射肿瘤细胞 作用机制 : 通过释放穿孔素及颗粒酶而直接杀伤 通过分泌多种细胞因子而间接杀伤 通过激活凋亡基因诱导肿瘤细胞凋亡 促进 T 细胞增殖分化 临床应用 : 清除残余癌细胞, 预防复发和转移 降低放化疗的毒副作用, 提高放化疗的疗效 用于放 化疗无效及耐药性的患者的治疗 用于失去手术指征或已复发转移的晚期患者, 缓解症状 延长生存期
14 树突状细胞 (Dendriticcell DC) 细胞特点 : 抗原呈递活性最强的细胞 能有效激活初始 T 细胞 作用机制 : 重建免疫监视功能 诱导产生大量效应 T 细胞 趋化效应 T 细胞迁移至肿瘤部位 可致敏辅助 T 细胞分泌多种细胞因子 临床应用 : 对血液 消化 呼吸 泌尿及生殖系统等多个系统肿瘤细胞均有杀伤作用 14
15 树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞 (DC-CIK 细胞 ) 通过负载肿瘤抗原的 DC 与 CIK 的有机结合 ( 即 DC-CIK 细胞 ) 能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应, 二者具有一定的互补作用 DC- CIK 细胞不仅能激发 增强肿瘤患者特异性抗肿瘤免疫应答, 有效清除体内残留病灶, 且在患者体内诱发免疫记忆, 从而获得长期的抗瘤效应
16 自然杀伤细胞 (Natural killer cell,nk) NK 细胞来源于骨髓, 主要存在于外周血 数量约占 PMBC5~10% 在 IL-2 IL-12 IFN-α TNF-α 等因子的刺激下,PBMC 可被诱导生成 扩增 NK 细胞 作用机理 NK 细胞对靶细胞杀伤时既不需特异性抗体参加, 也不需抗原预先致敏 NK 细胞可在接触病原体或肿瘤细胞后, 立即释放穿孔素 细胞因子等杀伤靶细胞的作用, 尤其是对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用, 抑制肿瘤的生长及扩散, 被认为是人体内的第一道抗癌防线 NK 细胞会抑制肿瘤附近新血管的增生, 限制肿瘤获取养份, 从而限制肿瘤生长 ; NK 细胞可直接改善并调节患者的免疫力及神经系统, 间接提高患者之生活品质 ; 应用前景 : 非特异性抗肿瘤和抗病毒感染 非特异性清除体内坏死细胞及脂肪等垃圾
17 嵌合抗原受体 T 细胞 Chimeric Antigen Receptor- Tcell CAR-T CAR-T: 利用基因工程修饰外周血 T 细胞, 使其表达嵌合抗原受体 ( Chimeric Antigen Receptor) 来特异性的识别肿瘤相关性抗原的方法 上世纪 90 年代,Rosenberg( 美国 ) 和 Eshhar( 以色列 ) 在 NIH 合作研究靶向人体黑素瘤的嵌合抗原受体, 设计初步并构建了 CAR-T 细胞, 包括一种细胞外的特异性靶向癌细胞的抗体 历经不断完善优化, 于近年成为体外过继免疫治疗的热点
18
19 CAR 的优化 CAR 的基本结构中包括一个肿瘤相关抗原 ( TAA) 结合区 (scfv 段 ), 一个胞外铰链区, 一个跨膜区和一个胞内信号区 第一代 CAR 介导的 T 细胞激活是通过 CD3ζ 链上的酪氨酸激活基序完成的, 即只有 信号 1 只有 信号 1 的 T 细胞细胞因子分泌少, 抗肿瘤活性及增殖能力有限, 且易凋亡 早期利用第一代 CAR-T 开展的临床试验没有表现出显着的有效性
20 CAR 的优化 研究者致力于加强 CAR 激活信号, 突破第一代 CAR 的限制, 设计并构建结合共刺激结构的第二代 CAR 第二代的 CAR 设计中同时包括了 CD3ζ 链的 信号 1 和 CD28 或 CD137(4-1BB) 的 信号 2 研究表明, 搭载了 信号 2 的第二代 CAR 与第一代 CAR 相比, 抗原特异性不变,T 细胞增殖 细胞因子分泌增加, 抗细胞凋亡蛋白分泌增加, 细胞死亡延迟
21 CAR 的优化 进一步的优化研究着眼于发展第三代 CAR, 不仅包括 信号 1 信号 2, 还包括了额外的共刺激信号, 但迄今尚无证据表明 G3 优于 G2
22 CAR-T 细胞治疗示意图 Annu.Rev.Med,2014
23 CAR-T 细胞治疗的优势 靶点更广 CAR-T 细胞既可以靶向蛋白质抗原, 又可以靶向糖脂类抗原, 扩大了肿瘤抗原的靶点范围 ; 治疗更精准 CAR-T 细胞疗法利用抗原抗体结合机制, 能有效克服肿瘤细胞 MHC 分子表达下调以及抗原递呈降低等问题造成的免疫逃逸 ; 杀瘤谱更宽由于多种肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原, 针对某一种肿瘤抗原的 CAR 基因一旦构建完成, 便可被广泛利用 ; 效果更持久新一代 CAR 结构中增加了促进 T 细胞增殖与活化的基因序列, 保证了 T 细胞进入人体后还能增殖, 同时 CAR-T 细胞具有免疫记忆功能, 可以长时间在体内存活
24 CAT-T 细胞治疗的毒性 是靶标 / 非癌细胞正常细胞被 连坐 杀伤, 导致多器官损伤, 甚至死亡 细胞因子风暴 TNF-α IL-1 IL-6 IL-12 IFN-α IFN-β IFN-γ 和 IL-8 等细胞因子短时间内大量释放, 引起急性呼吸窘迫综合症, 肝肾功能衰竭等
25 免疫调节细胞治疗 调节性 T 细胞 ( Regulatory T Cells,Tregs ) 耐受型树突状细胞 ( Tolerogenic dendritic cell,tdc ) 间充质干细胞 ( MSC )
26 国外已开展的 Treg 细胞临床治疗结果 研究小组 病人数 治疗类型 Tregs 种类 输注剂量 Tregs 扩增方 法 Blazar (Minnesota) Martelli (Perugia) 23 无关供者双份脐带血移植 28 HLA 半相合造血干细胞移植 第三方脐带血 Tregs 供者 Tregs 至 per kg per kg 体外扩增 200 倍 新鲜分离 临床结果 II-IV 级急性 GVHD 反应减少 急性和慢性 GVHD 非常低 Edinger (Regensburg ) 9 白血病复发率高的病人造血干细胞移植 Tregs(>50%) 和效应 T 细胞共同输注 per kg 新鲜分离 能安全有效地抑制 GVHD Trzonkowski (Gdarisk, Poland) 10 儿童 I 型糖尿病 自身 Tregs per kg, 体外扩增 安全, 其中有两个病人不需要打胰岛素 Colombel (Paris) 20 Crohn 氏病 自身抗原特异 性 Tregs 体外抗原特异性扩增 有一些副作用, 但都能恢复, 疾病临床指数下降
27 Immunity. 2009; 30:
28 PBMC 来源 人源性 CD4 + Treg - 细胞来源 :PBMC 分选 CD4 + CD25 + T 细胞 - 扩增方法 1: 雷帕霉素 TGF-β anti-cd3/28 IL-2 共扩增 12 天 - 扩增效率 :30-35 倍 - 扩增方法 2: 雷帕霉素 人 B 细胞 anti-cd3/28 IL-2 扩增 - 扩增效率 : 约 80 倍 12 天, anti-cd3/28 IL-2 再扩增 6 天
29 人源性 CD4 + Treg PBMC 经分选后可获得 CD4 + CD25 + T 细胞, 经 12 天扩增后扩增方法 1 可获得 CD4 + Treg; 扩增方法 2 可获得 CD4 + Treg 实验证明 :CD4 + Treg 经过冻存和复苏后仍然能发挥其有效的抑制功能
30 治疗效果 - GVHD CB Treg 细胞能有效的抑制 20±2g 小鼠的 GVHD 发病
31 人源性 CD4 + Treg 脐血来源 - 细胞来源 : 脐血单个核细胞分选 CD4 + CD25 + T 细胞 - 扩增方法 :anti-cd3/28 IL-2 扩增两轮 - 扩增效率 : 倍 1unit CB 经分选后可获得 CD4 + CD25 + T 细胞, 经两轮扩增后可获得 CB Treg
32 治疗效果 - GVHD CB Treg 细胞能有效的抑制 25±2g 小鼠的 GVHD 发病
33 治疗效果 - CIA Treg 细胞能有效的抑制 25±2g 小鼠的 CIA 发病
34 PBMC 来源 人源性 CD8 + Treg - 细胞来源 :PBMC 分选 CD8 + T 细胞 - 扩增方法 : 雷帕霉素 TGF-β anti-cd3/28 IL-2 扩增 4 轮, 一共 27 天 - 扩增效率 : 约 倍, 每轮约 10 倍 PBMC 经分选后可获得 CD8 + T 细胞, 经 27 天扩增后可获得 CD8 + Treg
35 治疗效果 CD8Treg 细胞能有效的抑制 20±2g 小鼠的 EAE 发病 CD8Treg 细胞能有效的抑制 20±2g 小鼠的 CIA 发病
36 治疗效果 自身免疫性结肠炎 CD8Treg 能有效的减轻 25±2g 小鼠的自身免疫性结肠炎的发病
37 耐受型树突状细胞 ( Tolerogenic dendritic cell,tdc )
38 研究背景 耐受型树突状细胞 (Tolerogenic dendritic cell, tdc) - 低表达 MHC 和共刺激分子 - 大量分泌 IL-10 和 TGF-β 等 - 不能有效的刺激效应性 T 细胞 - 能在体内外产生或扩增 ntreg 或 itreg Nat Rev Immunol Aug;7(8):610-21
39 人源性 tdc tdc - 细胞来源 :PBMC 中的单核细胞 - 诱导方法 :GM-CSF IL-4 IL-10 TGF-β 诱导 - 诱导效率 : 倍 免疫抑制联合诱导的 tdc - 细胞来源 :PBMC 中的单核细胞 - 诱导方法 :GM-CSF IL-10 TGF-β 联合他克莫司诱导 - 诱导效率 : 倍
40 治疗效果 自身免疫性结肠炎 tdc 细胞能有效的减轻 25±2g 小鼠的自身免疫性结肠炎的发病
41 免疫细胞治疗展望 被寄予厚望 路曼曼其修远 还须上下而求索
42 谢谢!
43 实验流程 白膜层 PBMC CD14 + 单核细胞 tdc 剩余细胞 CD19 + B 细胞 Breg 剩余细胞 CD8 + T 细胞 CD8 + Treg 剩余细胞 CD4 + CD25 + T 细胞 CD4 + ntreg CD4 + CD25 - T 细胞 CD4 + itreg
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肿瘤学领域 (H16) 申请代码和研究方向一览表 (2014 年试用版 ) 申请代码领域内容研究方向 H1601 H1602 H1603 H1604 H1605 H1606 H1607 H1608 肿瘤病因 肿瘤发生 肿瘤遗传与表观遗传 肿瘤免疫 肿瘤预防 肿瘤复发与转移 肿瘤干细胞 肿瘤诊断 病毒与肿瘤发生化学因素与肿瘤发生物理因素 ( 含辐射 ) 与肿瘤发生细菌等微生物感染与肿瘤发生生活方式 (
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免疫细胞治疗研究指导手册_0512
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儿科学 儿科学 儿科学 儿科学 儿科学 儿科学 ( 专业学位 ) 儿科学 ( 专业学位 ) 儿科学 ( 专业学位 ) 儿科学 ( 专业学位 ) 儿科学 ( 专业学位 ) 耳鼻咽喉科学 ( 专业学位 ) 非定向 全国统考
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新生儿护理（下）.doc
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閱 立 法 會 CB(2)1907/14-15(01) 號 文 件 ) 為 確 保 督 導 委 員 會 的 建 議 得 以 及 時 推 行, 醫 管 局 承 諾 在 三 個 月 內 制 定 一 份 行 動 計 劃, 以 期 在 三 年 內 推 行 各 項 建 議 5. 醫 管 局 成 立 了 專 責
立 法 會 CB(2)97/15-16(01) 號 文 件 二 零 一 五 年 十 月 二 十 二 日 資 料 文 件 立 法 會 衞 生 事 務 委 員 會 為 推 行 醫 院 管 理 局 檢 討 督 導 委 員 會 所 提 建 議 而 制 定 的 行 動 計 劃 目 的 本 文 件 旨 在 告 知 委 員 醫 院 管 理 局 ( 醫 管 局 ) 就 推 行 醫 管 局 檢 討 督 導 委 員 會
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合一康生物学术内刊第三期
HYK 学术内刊 第03期 ACADEMIC JOURNAL 中国生物治疗网 www.chinaswzl.com 本期推荐文献 传真 0755-21672020 * * Email [email protected] * Transferred melanoma-specific CD8+T cells persist, mediate tumor regression, 电话 0755-21672023-617
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中华临床医师杂志 ( 电子版 )2014 年 8 月第 8 卷第 15 期 Chin J Clinicians(Electronic Edition),August 1,2014,Vol.8,No.15 2889 综述 细胞因子诱导的杀伤细胞治疗肿瘤的研究进展 庞佳楠崔久嵬 摘要 肿瘤的过继细胞治疗是肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域之一, 细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK) 在肿瘤的治疗中逐渐成为焦点
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