苏燕南, 等 : 分光光度计法测定磷脂酶 A1 酶活条件优化 23 脂肪酸的生成速度, 有滴定法比色法和气相色谱称取一定量的卵磷脂, 溶于相应的缓冲液中, 加入法滴定法是通过滴定消耗的碱量来计算脂肪酸终浓度为 25mM 的 CaCl 2 和 0.02% 脱氧胆酸钠, 的产量比色法则是将特定的底

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1 第 27 卷第 3 期重庆理工大学学报 ( 自然科学 ) 2013 年 3 月 Vol.27 No.3 JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience) Mar.2013 doi: /j.isn (z) 分光光度计法测定磷脂酶 A1 酶活条件优化苏燕南, 薛正莲, 马琦亚, 王洲, 赵世光 ( 安徽工程大学生物与化学工程学院, 安徽芜湖 ) 摘要 : 优化了分光光度计法测定 LecitaseUltra 的磷脂酶 A1 活力的相关参数根据单因素实验结果选择底物浓度酶稀释倍数 ph 值 3 个因素进行正交实验, 经分析得到酶活测定的最佳条件为 : 酶稀释倍数为 1250 倍, 缓冲体系 ph 值为 6.5, 离子强度为 50mM, 底物浓度为 6%, 终止酶反应方式为加入 0.4MTCA 溶液优化后酶活最高值为 U/mL, 较原工艺提高了 18.42% 关键词 : 磷脂酶 A1;LecitaseUltra; 分光光度计法 ; 正交实验中图分类号 :TS 文献标识码 :A 文章编号 : (2013) OptimizationofColorimetricMethodforPhospholipase A1ActivityAsay SUYan nan,xuezheng lian,maqi ya,wangzhou,zhaoshi guang (InstituteofBiologic&ChemicalEngineering,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu241000,China) Abstract:TherelevantparametersofcolorimetricmethodforphospholipaseA1activityasaywasop timized.threefactors,substrateconcentration,enzymedilutionfactorandph,werechosefororthog onalexperimentbasedonsinglefactorexperiment.theoptimalconditionsforenzymeasaywereas folows:enzymesolutiondilutedfor1250 fold,ph6.5,ionicstrengthof50mm,substrateconcen trationof6%,adding0.4m TCAforenzymereactiontermination.Theactivityreachedamaximum valueof4876.9u/ml,whichwasincreased18.42% comparedtotheoriginalproces. Keywords:phospholipaseA1;LecitaseUltra;colorimetricmethod;orthogonalexperiment 磷脂酶 A1 是一类专一性水解卵磷脂 sn-1 位酰基的酶类, 属于脂肪酶的一种 [1] 磷脂酶 A1 可用于植物油脱胶相对于传统的物理和化学脱胶方法, 酶法脱胶可以大大降低能耗和污染, 且效率高, 是一种绿色环保高效的脱胶方法 [2] 目前, 用于油脂脱胶的磷脂酶 A1 为诺维信公司生产的 LecitaseUltra(E.C ) [3] 磷脂酶 A1 酶活检测主要是检测磷脂酶 A1 水解卵磷脂过程中收稿日期 : 基金项目 : 安徽省自然科学基金资助项目 ( M81); 安徽省高校自然科学基金资助项目 (KJ2009A168) 作者简介 : 苏燕南 (1985 ), 女, 安徽池州人, 硕士研究生, 主要从事微生物学研究 ; 通讯作者薛正莲 (1967 ), 女, 安徽巢湖人, 硕士, 教授, 主要从事酶工程研究

2 苏燕南, 等 : 分光光度计法测定磷脂酶 A1 酶活条件优化 23 脂肪酸的生成速度, 有滴定法比色法和气相色谱称取一定量的卵磷脂, 溶于相应的缓冲液中, 加入法滴定法是通过滴定消耗的碱量来计算脂肪酸终浓度为 25mM 的 CaCl 2 和 0.02% 脱氧胆酸钠, 的产量比色法则是将特定的底物与脂肪酸结合高速均质机 10000r/min 处理 15min 后, 通过测定吸光度值来测量其含量 [4] 气相色 2) 酶溶液的配制取一定量原酶, 用相应缓谱法则是通过将酶反应生成的脂肪酸甲酯化后测冲液稀释至所需倍数定脂肪酸甲酯的含量 [5] 滴定法是现在通用的脂 3) 吡啶 - 铜盐显色剂的配制 5.0% 醋酸铜肪酶的测定方法, 但是酶反应需要在一定的缓冲水溶液, 用吡啶调节 ph 值至 6.1 体系中进行, 而脂肪酸是弱酸, 会影响滴定结果的 4) 棕榈酸异辛烷溶液的配制精确称取准确度, 而且碱滴定终点的控制要非常精确, 否则 g 棕榈酸溶于 100mL 异辛烷中, 配制对于酶活高的样品会产生较大的误差虽然酸碱 10μmol/mL 的母液, 用此母液分别配制自动滴定仪也可以避免实验误差的产生, 但是一 μmol/mL 的棕榈酸异次只能测定一个样品, 耗时长气相色谱法是相辛烷溶液对比较精确的方法, 但是样品处理繁复, 耗时长, 5) 终止酶反应溶液配制 6mol/LHCl: 取一般用于定性实验采用醋酸铜络合法可以避免 12MHCl50mL 加入 50mL 蒸馏水即得 0.4M 三碱滴定过程中缓冲液的影响, 并且不存在滴定终氯乙酸 (TCA): 称取 6.54gTCA 溶于 100mL 蒸馏点的问题铜皂 - 分光光度计法用于脂肪酶酶活水中即得的测定已经比较成熟 [6] 笔者在前期的实验中比 1.3 酶活测定较了滴定法双层平板法和分光光度计法 3 种测 1) 棕榈酸铜皂标准曲线取 5.00mL 棕榈定方法, 发现分光光度计测定磷脂酶 A1 用时短, 酸异辛烷加入 1.00mL 铜盐显色剂溶液, 充分混精确度高, 而且底物消耗量小 [7], 因此采用分光光匀 90s, 常温静置 5min 至上层清澈, 取 3mL 上层度计法测定磷脂酶 A1 酶活具有很大的优势但清液 714nm 测定吸光度值, 空白组为相同处理的目前还没有关于分光光度计法测定磷脂酶 A1 酶异辛烷溶液活条件优化的相关报道本文对影响分光光度计 2) 酶活测定步骤 25mL 具塞试管中加入法测定磷脂酶 A1 酶活过程中的主要因素进行了 2 00mL 一定浓度的卵磷脂底物和 2.5mL 的缓冲单因素和正交实验, 并找出测定条件的最佳组合, 液,40 预热 5min, 加入 0.5mL 酶液, 混匀后以期提供一种快速精确检测磷脂酶 A1 酶活的 40 恒温振反应 15min, 快速加入终止反应溶液方法终止反应, 混匀后加入 3mL 异辛烷, 充分震荡混匀 90s,65 静置分层, 常温冷却 5min, 取上层 1 材料与方法清液 1.00mL 加 4mL 异辛烷和 1mL 吡啶 - 铜盐显色剂, 振荡混匀 90s, 静置澄清后, 取上层有机 1.1 实验材料与仪器相 714nm 检测吸光度空白组为先加入酶反应 LecitaseUltra, 购自 Novozymes 公司 ; 卵磷脂, 终止反应液再加入酶液, 其他操作相同在用 0.4 购自生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司 ; 棕榈酸, 购自 M TCA 和 6M 的 HCl 终止反应时, 将 65 静置 Sigma 公司 ; 其他化学试剂购自国药集团化学试剂分层步骤改为 12000r/min 离心 5min, 其他操作有限公司仪器包括 FJ-200 高速均质机 SK-1 相同快速混匀器 723 分光光度计 ph 计等 3) 磷脂酶 A1 酶活力单位定义及计算公式 1.2 主要溶液的配制在一定条件下,1min 内生成 1μmol 棕榈酸所需 1) 底物的配制根据所需配制的底物浓度, 的磷脂酶 A1 的量定义为 1 个酶活单位计算公

3 4 2 重庆理工大学学报式为 U =C 15 n/(t m) 式中 :U 为磷脂酶 A1 酶活 (U/mL);15 为脂肪酸稀释倍数 ;C 为棕榈酸浓度 (μmol/ml);n 为酶液稀释倍数 ;t 为酶反应时间 (min);m 为酶用量 (ml) 2 实验结果与分析 2.1 标准曲线的绘制脂肪酸会与铜盐形成铜皂, 而且在 ph 值为 6.0~6.2 时, 铜皂在 710±10nm 处吸收峰最强, 因此, 需要用吡啶调节醋酸铜溶液的 ph 值为 6 1 [6,8] 由于磷脂酶 A1 水解磷脂的主要脂肪酸产物为棕榈酸 [9], 因此, 选用棕榈酸异辛烷溶液制作标准曲线如图 1 所示, 标准曲线方程为 y= x , 相关系数为 , 线性关系良好, 可以用于计算溶液中脂肪酸的含量由图 1 可看出, 在棕榈酸浓度增大过程中, 数据的误差明显增大, 而且在棕榈酸浓度超过 3.6μmol/mL 时, 测得的吸光度数值偏差很大, 且不在线性范围内, 因此在测定磷脂酶 A1 酶活时, 酶反应液中的脂肪酸浓度不宜超过 3.6μmol/mL, 可以推算该标准曲线适应的酶活范围为 : 稀释后酶活小于等于 7.2 U/mL 图 1 棕榈酸铜皂标准曲线 2.2 底物浓度对酶活的影响卵磷脂本身在水中的溶解度较小, 常规方法只能配置 5% 浓度的乳液 [3], 但是在高速均质机的作用下, 同时加入乳化剂脱氧胆酸钠, 卵磷脂溶液的浓度可以达到 10% 分别取 2% 4% 6% 8% 和 10% 的卵磷脂作为底物测定稀释至 1000 倍的 LecitaseUltra 的磷脂酶 A1 酶活力, 缓冲液 ph 值为 7.0, 离子强度为 0.05M, 酶失活方式为加入 6mL95% 乙醇如图 2 所示, 当底物浓度在 2% ~6% 时, 测得的酶活数据随着底物浓度的上升而上升, 而当浓度高于 6% 时, 酶活力值的增幅减小, 应该是由于底物在此时已经达到饱和综合考虑节约材料和酶活较高, 后续单因素实验的最佳底物浓度选择 8% 图 2 底物浓度对酶活的影响 2.3 酶液稀释倍数对酶活测定的影响根据本文 2.1 节中的标准曲线预测标准曲线适用范围为 : 稀释后酶活小于等于 7.2U/mL, 因此选择酶液的稀释倍数分别为为 200 倍 500 倍倍 1500 倍和 2000 倍, 底物浓度为 8%, 缓冲液 ph 值为 7.0, 离子强度为 0.05M, 酶失活方式为加入 6mL95% 乙醇如图 3 所示, 在稀释倍数为 1000 倍时, 测定的酶活力最高, 在稀释 200 倍和 500 倍时, 由于酶反应液中的棕榈酸浓度过高, 测得的 OD 值较高偏差很大, 而在稀释倍数上升时, 尤其在达到 2000 倍时, 测得的 OD 值数值低于 0.1, 因此误差也较大所以最终选择 1000 倍作为最佳稀释倍数 2.4 ph 值对酶活的影响为了考察 ph 值对酶活的影响, 分别配制了一系列 ph 值的缓冲液, 用于稀释酶液和进行酶反应 ph 值梯度设定为和 8 底物浓度为 8%, 酶液稀释 1000 倍, 缓冲液离子强度为 0.05M, 加入 6mL95% 乙醇终止酶反应如图 4 所示,pH 值对酶活的影响比较大在

4 苏燕南, 等 : 分光光度计法测定磷脂酶 A1 酶活条件优化 25 ph 值较低时, 酶活明显受抑制, 在 ph 值为 6.0 时达到最高值, 之后随着 ph 值的上升, 酶活略有下降因此, 用于稀释酶液和进行酶反应的 ph 值设定为 6.0 图 5 离子强度对酶活的影响图 3 稀释倍数对酶活测定的影响图 4 ph 值对酶活的影响 2.5 缓冲液离子强度对酶活的影响由本文 2.4 节的实验结果可知,LecitaseUltra 磷脂酶 A1 对酸的耐受力较差, 而磷脂酶 A1 水解卵磷脂会产生脂肪酸, 使反应体系的 ph 值下降, 因此反应体系系中的 ph 缓冲能力不能太弱, 而缓冲能力太强势必会引入大量的离子, 也可能会影响酶, 因此需要考察缓冲液的离子强度对酶活力的影响分别配制离子强度为和 5mM 的 ph 值为 6.0 的缓冲液稀释酶液和用于酶反应, 底物浓度为 8%, 酶稀释倍数为 1000 倍, 终止反应采用加入 6mL95% 乙醇的方法如图 5 所示, 离子强度为 50mM 时酶活力最高, 离子强度为 100mM 时测得的酶活较低, 可见较强的离子强度对酶存在一定的影响, 而离子强度较低时酶活也会变低, 可能与反应体系的 ph 值下降有关 2.6 酶失活方式对酶活的影响实验过程中还发现反应终止时酶失活的方式对测得的 OD 值存在一定影响在使用乙醇失活时, 某些反应液会出现乳浊现象,OD 异常, 因此尝试了几种常用的酶失活的办法 : 加入 6mL95% 乙醇 1mL6M HCl 1mL0.4M TCA 以及 100 加热 20min, 分别评估最后的酶活, 希望可以得到相对稳定的且较高的值每组设置空白组, 为先加失活剂再加入酶液, 其他条件相同在使用 HCl 和 TCA 使酶失活时, 会产生大量絮状物, 加入异辛烷,65 静置需要 1~2h 才能分层, 因此实验过程中采用离心的办法使其快速分层 4 组对照组酶活均为 0, 实验组结果如图 6 所示几种失活方式对比表明, 使用乙醇失活的相对误差较大,HCl 其次, 使用 TCA 失活各组测量值偏差较小, 酶活稍微高一些, 而使用加热的方式, 虽然相对偏差最小, 但是酶活出现大幅下降, 可能是由于加热时自由脂肪酸有部分挥发造成的因此, 使用加入 TCA 失活的方法相对最佳图 6 酶失活方式对酶活的影响

5 6 2 重庆理工大学学报 2.7 酶反应条件的正交实验在单因素实验的基础上, 选择了对酶活影响较大的几个因素 :ph 值酶液稀释倍数和底物浓度进行正交实验, 如表 1 所示表 2 为正交实验的结果实验结果表明, 对酶活影响最大的因素为底物的浓度, 其次为 ph 值和酶液稀释倍数表 3 的方差分析结果显示 :3 个因素对酶活的影响都显著, 其中酶液稀释倍数的显著性稍差预测的最佳酶反应组合为 A4B4C2, 此时酶活最高值为 U/mL 由于在实验过程中, 发现有其他组合的酶活也较高, 因此一起做了验证实验, 如表 4 所示结果表明 : 验证组合为 A4B4C2 时酶活最高达到 U/mL, 即最佳的酶反应条件为 :ph 值为 6.5, 酶稀释倍数为 1000 倍, 底物浓度为 6% 水平 ph 值 (A) 表 1 正交实验因素水平因酶液稀释倍数 (B) 素底物浓度 (C)/% 表 2 正交实验数据及结果分析编号 A B C 实验结果均值 k k k k A4B4C2 预测值

6 苏燕南, 等 : 分光光度计法测定磷脂酶 A1 酶活条件优化 27 表 3 正交实验方差分析因素偏差平方和自由度 F P 显著性 A B C 误差表 4 实验结果验证酶活 /(U ml -1 ) 项目均值 ±SD 原工艺 ±28.9 优化后 A4B4C ±19.8 优化后 A4B3C ±31.2 优化后 A4B4C ± 结束语综合单因素和正交实验的结果, 优化后 Leci taseultra 磷脂酶 A1 的酶活测定最佳条件为 : 酶稀释倍数为 1250 倍, 缓冲体系 ph 值为 6.5, 离子强度为 50mM, 底物浓度为 6%, 终止酶反应时加入 1mL0.4M TCA 溶液酶活达到最高值为 U/mL, 较原工艺得到的酶活 (3978.5U/mL) 提高了 18.42%, 且平行组得到的数值稳定, 相对误差较小, 为今后磷脂酶 A1 酶活的测定提供了一种高效稳定快速的方法参考文献 : [1] GregoryS,Richmond,TeryK.Smith.PhospholipasesA1 [J].IntJMolSci,2011,12: [2] 杨继国, 杨博, 孟炯, 等. 新型磷脂酶 LecitaseUltra 用于大豆油脱胶的研究 [J]. 中国油脂,2003,28(10): [3] 占剑峰, 姜绍通, 潘丽军. 磷脂酶酶活力测定条件的优化 [J]. 食品科学,2012,33(17): [4] 李脉, 杨继国, 杨博. 磷脂酶 A1 酶活测定方法的研究 [J]. 现代食品科技,2007,23(8): [5] 李谭瑶, 邓克国, 陈波, 等. 气相色谱法测定脂肪酶的活力 [J]. 药学学报,2009,44(6): [6] 侯爱军, 徐冰斌, 梁亮, 等. 改进铜皂 - 分光光度法测定脂肪酶活力 [J]. 皮革科学与工程,2011,21(1): [7] 赵梦梦, 薛正莲, 黄祖耀, 等. 三种磷脂酶 A1 活力测定方法的比较 [J]. 食品与发酵科技,2012,48(3): [8] 纪建业. 脂肪酶活力测定方法的改进 [J]. 通化师范学院学报,2005,26(6): [9] 汪勇, 谢林云, 欧仕益. 磷脂酶 A1 催化水解大豆油制备甘油二酯研究 (Ⅲ) 产品分析与检测 [J]. 中国油脂,2008,33(9): ( 责任编辑刘舸 )

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