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1 第 31 卷第 2 期大连海洋大学学报 Vol. 31 No 年 4 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr DOI: / j. cnki. dlhyxb 文章编号 : (216) 从珍珠龙趸体内分离的 1 株创伤弧菌的 鉴定及耐药性分析 1 辜良斌 2, 徐力文 1, 王雨 3, 苏友禄 1, 刘广锋 1, 郭志勋 1 1, 冯娟 (1 郾中国水产科学研究院南海水产研究所农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东广州 513; 2 郾上海海洋大学水产 与生命学院, 上海 2136; 3 郾中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心, 海南三亚 57218) 摘要 : 为研究创伤弧菌 Vibrio vulnificus 对药物的敏感性, 减少珍珠龙趸养殖业中的病害影响, 从患病珍珠龙趸 (pearl gentian) ( 棕点石斑鱼 Epinephelus fuscoguttatus 意伊鞍带石斑鱼 E 郾 lanceolatus 裔 ) 肝肾中分离出一株病原菌, 编号为 X11XC26, 并对其进行了鉴定及耐药性分析 经攻毒试验证明, 该菌对斜带石斑鱼 E 郾 coioides 有较强的致病性, 半数致死浓度 (LD 5 ) 为 1 郾 7 伊 1 5 CFU / g, 呈急性感染型 ; 对该菌株进行常规生理生化试验 API (32E) 系统鉴定和 16S rdna rctb topa mreb rpod 等 5 种管家基因序列分析, 可将该菌株鉴定为创伤弧菌 ; 通过纸片扩散 K-B 法测试了该菌株对 16 种药物的敏感性, 结果显示, 该菌株对氧氟沙星 诺氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星和阿莫西林 5 种药物敏感, 对多粘菌素 B 等 11 种药物不敏感 本研究中从患病珍珠龙趸体内分离出创伤弧菌在国内属首次报道, 而该菌株较强的耐药性应引起人们的关注 关键词 : 珍珠龙趸 ; 创伤弧菌 ; 药物敏感 ; 管家基因中图分类号 : S941 郾 4 摇摇摇摇文献标志码 : A 摇摇创伤弧菌 Vibrio vulnificus 是一种革兰氏阴性嗜盐菌, 隶属于弧菌科 Vibrio 弧菌属 Vibrio, 生活在温带和热带生态系统中, 是水域常见的一类细菌 [1-2] 1976 年, Holli 从血液中分离出该菌, 鉴定为乳酸阴性嗜盐弧菌, 1979 年, Farmer 正式将其命名为创伤弧菌 [3] 创伤弧菌是一类重要的病原菌, 已报道的感染对象有鳗鲡 Anguilla anguilla 大菱鲆 Scophthalmus maximus 黄姑鱼 Nibea albiflo 鄄 ra 矛尾复虾虎鱼 Synechogobius hasta 等, 该菌均能引起这些鱼类严重的出血和溃烂症状 [4-7] 创伤弧菌同时还是人鱼共患菌, 能引起创口感染及原发性败血症, 死亡率超过了 5% [8] 石斑鱼是海水养殖中重要的养殖种类 珍珠龙趸 (pearl gentian) 又称珍珠斑或龙虎斑, 是由棕点石斑鱼 Epinephelus fuscoguttatus 意与鞍带石斑鱼 Epinephelus lanceolatus 裔杂交培育出来的新品种 育苗成功后, 在天津 山东 海南 福建 广东等地得到广泛推广 [9] 珍珠龙趸结合了父本生长快 速和母本肉质细腻的特点, 又具有虎斑头 龙胆尾的外形, 可作为观赏鱼养殖, 被称为 石斑鱼的后起之秀冶 [1-11] 珍珠龙趸适应能力强, 适合网箱 池塘多种养殖模式, 特别是高密度养殖 [12] 然而随着养殖规模的不断扩大, 病害问题接连发生, 尤其是细菌性疾病 ( 弧菌病 ) 的影响最为广泛 [13-14], 制约了水产养殖业的发展 目前, 关于珍珠龙趸的研究多集中在育种 养殖方面, 未见有关珍珠龙趸弧菌病的报道 [15-16] 211 年, 海南新村养殖的珍珠龙趸突发大量死亡, 笔者从病鱼体内分离出一株细菌, 采用生理生化方法和分子生物学方法对致病菌进行鉴定, 同时研究了该株菌对 16 种药物的敏感性, 以期为该病毒的防治研究提供参考依据 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料患病珍珠龙趸于 211 年取自发生严重疾病的 摇收稿日期 : 摇基金项目 : 国家自然基金青年基金资助项目 (3122); 中国水产科学研究院院级基本科研业务费 (214KX64); 海南省科技兴海项目 (215XH3); 海南省自然科学基金资助项目 (314179) 摇作者简介 : 辜良斌 (1989 ), 女, 硕士研究生 guliangbin212@ 163 郾 com 摇通信作者 : 冯娟 (1973 ), 女, 研究员 jannyfeng@ 163 郾 com

2 第 2 期 辜良斌, 等 : 从珍珠龙趸体内分离的 1 株创伤弧菌的鉴定及耐药性分析 163 海南新村珍珠龙趸养殖场, 病鱼体表观察无明显症状 健康斜带石斑鱼 Epinephelus coioides 体质量为 其中 : Xg 为死亡率为 1% 组剂量的对数 ; d 为相邻两组剂量对数之差 ; 移 P 为各组死亡率之和 (31 郾 7 依 5 郾 4) g, 体长为 (11 郾 4 依 郾 6) cm, 取自深 1 郾 2 郾 3 摇 菌株形态及生理生化特性分析摇 将菌株 圳某养殖场 X11XC26 用革兰氏染色后镜检观察染色情况 取 1 郾 2 摇 方法 纯培养的细菌, 接种于 2216E 斜面培养基中, 按常规生理生化鉴定步骤进行试验 [17], 同时做 API 1 郾 2 郾 1 摇 组织样品的制备摇 将患病的珍珠龙趸解剖 (32E) 系统鉴定 后观察到病鱼肝脏 肾脏肿大, 随机选取 2 尾濒死 1 郾 2 郾 4 摇 16S rdna mreb rctb rpod topa 序列的 病鱼的肝 肾组织, 分别划线于 TCBS 和营养琼脂 测定和分析摇 采用煮沸法提取分离菌 DNA 用作 平板, 28 益下培养过夜, 将得到的优势细菌 ( 编号为 X11XC26) 纯化培养, 同时取肾脏组织固定, 做组织病理切片以观察组织结构 PCR 模板 PCR 反应程序 : 94 益下预变性 5 min; 94 益下变性 1 min, 48 ~ 63 益下退火 2 min, 72 益下延伸 1 min, 共进行 35 个循环 PCR 反应体系 1 郾 2 郾 2 摇 菌株致病性检测摇 将健康斜带石斑鱼在实 ( 共 5 滋 L): Premix rtaq 25 滋 L, 上 下游引物各 验室暂养 7 d 后随机分为 E1 E2 E3 E4 对照组, 每组设 3 个平行, 试验组 对照组每个平行分别放 1 7 尾鱼 将供试菌 X11XC26 接种到 2216E 斜面上培养 12 ~ 16 h, 用无菌生理盐水制备 1 郾 5 滋 L, DNA 2 滋 L, ddh 2 O 2 滋 L PCR 引物见表 1 [18-19] 取 5 滋 L PCR 产物在 1 g / L 琼脂糖凝胶中电泳, 在 13 V 25 min 条件下检测结果 将扩增所得阳性产物送英潍捷基 ( 广州 ) 公司进行测序 4 个浓度梯度的菌悬液, 分别对试验组鱼进行腹腔 1 郾 2 郾 5 摇 菌株对药物的敏感试验摇 按照 NCCL 试验 注射, 剂量为 郾 2 ml / 尾, 对照组注射等量生理盐 操作标准 [2], 采用纸片扩散 K -B 法, 取 1 滋 L 水 注射菌液后正常饲养, 观察并记录 7 d 内的情 菌悬液 ( 浓度约为 1 8 CFU / ml) 涂布于 MHA 培 况, 在试验组濒死鱼肝 肾中划线分离细菌, 利用寇式法计算半数致死浓度 (LD 5, CUF / g): lg(ld 5 ) = Xg - d( 移 P - 郾 5) 养基上, 1 min 后贴药敏纸片, 于 28 益下培养 24 h 后, 观察并测量抑菌圈直径 根据抑菌圈直径的大小判断菌株对药物的敏感性 表 1 摇 引物信息 Tab 郾 1 摇 The primers used in the experiment 基因位点 蛋白产物 引物名称 引物序列 PCR 产物长度 / bp 退火温度 / 益 location protein product primer primer sequence(5 忆 -3 忆 ) PCR product annealing temperature 16S rdna rctb topa mreb rpod 2 摇结果与分析 2 郾 1 摇病原菌的分离 复制起点结合蛋白 replication origin-binding protein 拓扑异构酶 topoisomerase I 细胞骨架蛋白 actin-like cytoskeleton protein RNA 聚合酶 s7 因素 RNA polymerase s7 factor 8-F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492-R GGTTACCTTGTTACGACTT rctb-f rctb-r topa-f topa-r mreb-f mreb-r rpod-f rpod-r ATGCCNGARGGYTTYAARAG GTWGGMGCCATRTTRCGYTT GAGATCATCGGTGGTGATG GAAGGACGAACGCTTCGTG ACTTCGTGGCATGTTTTC CCGTGCATATCGATCATTTC ACGACTGACCCGGTACGCATGT- AYATGMGNGARATGGGNACNGT ATAGAAATAACCAGACGTAAGT- TNGCYTCNACCATYTCYTTYT 该种细菌存在 将平板上的细菌纯化分离后得到一 菌株, 将其命名为 X11XC26 2 郾 2 摇患病珍珠龙趸肾组织的病理观察 将患病的珍珠龙趸肝 肾组织划线于 TCBS 平 板及营养琼脂平板培养 12 ~ 18 h 后, 观察到两种 平板上均有优势细菌存在, 且 TCBS 平板中上只有 通过对患病珍珠龙趸肾组织的病理学观察, 发 现患病鱼肾脏组织已纤维化, 且可见大量细菌聚集 ( 图 1)

3 164 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 数致死浓度 LD 5 为 1 郾 7 伊 1 5 CFU / g 取感染后斜 带石斑鱼的肝 肾组织, 进行细菌分离 纯化, 得 到的菌株命名为 X 郾 4 摇 菌株形态及生理生化特征 图 1 摇 肾脏组织病理学切片 经革兰氏染色发现, 菌株 X11XC26 和 X11-1 均为革兰氏阴性细菌, 呈短杆状 ; TCBS 生长呈绿色, O / 129 (15 滋 g / 片 ) 敏感 ; 该菌在 3% NaCl Fig 郾 1 摇 Histopathological section of the kidney 胨水 6% NaCl 胨水中均能生长, 在无盐胨水 2 郾 3 摇 菌株 X11XC26 的致病性人工感染试验结果表明, 菌株 X11XC26 对健 8% NaCl 胨水 1% NaCl 胨水中不生长 ; 该菌在 益下均能生长, 在 益下均不生长 ; 氧化酶 过氧化氢酶为阳性, VP 反应为阴性, 康斜带石斑鱼有强致病性 ( 表 2), 计算得出其半 能利用葡萄糖 麦芽糖 ( 表 3) 表 2 摇 菌株 X11XC26 对斜带石斑鱼人工感染结果 Tab 郾 2 摇 Pathogenicity of X11XC26 strain to orange-spotted grouper Epinephelus coioides 组别 group 菌液浓度 / (CFU ml -1 ) bacterial concentration 剂量 / (ml 尾 -1 ) dose 试验鱼数量 / ind 郾 individual number 死亡数 / ind 郾 death number 死亡率 / % mortality E1 5 郾 5 伊 1 7 郾 2 1 E2 5 郾 5 伊 1 6 郾 E3 E4 对照 control 5 郾 5 伊 郾 5 伊 1 4 郾 9% NS 郾 2 郾 2 郾 2 21 表 3 摇 菌株 X11XC26 和 X11-1 的主要生理生化指标检测结果 Tab 郾 3 摇 Main phenotypic traits of strains X11XC26 and X11-1 检测项目 detection item X11XC26 X11-1 V 郾 vulnificus 检测项目 detection item X11XC26 X11-1 V 郾 vulnificus 革兰氏染色 Gram staining 精氨酸双水解酶 Arginine hydrolase TCBS 生长 TCBS growth G G G 精氨酸脱羧酶 Arginine decarboxylase O / 129(15 滋 g / 片 ) 赖氨酸脱羧酶 Iysine decarboxylase + + ND O / 129(1 滋 g / 片 ) 鸟氨酸脱羧酶 Ornithine decarboxylase - - ND 无盐胨水 not NaCl tryptone broth 葡萄糖产气 Glucose aerosis % NaCl 生长 3% NaCl tryptone broth 阿拉伯糖 Arabinose % NaCl 生长 6% NaCl tryptone broth 肌醇 Inositol % NaCl 生长 8% NaCl tryptone broth 甘露醇 Mannitol % NaCl 生长 1% NaCl tryptone broth 棉子糖 Raffinose 益生长 growth at 4 益 鼠李糖 Rhamnose 益生长 growth at 15 益 蔗糖 Sucrose 益生长 growth at 28 益 乳糖 Lactose 益生长 growth at 35 益 水杨素 Salicin 益生长 growth at 42 益 山梨醇 Sorbitol ONPG 反应 ONPG reaction + + ND 蜜二糖 Melibiose 过氧化氢酶 Catalase 尿素 Carbamide - - ND 氧化酶 Oxidase 葡萄糖 Glucose 硝酸盐还原 Nitrate reduction 麦芽糖 Maltose VP 反应 VP reaction 明胶 Gelatin 甲基红反应 Methyl red 吲哚乙酸 Heteroauxing - - ND 硫化氢产生 Hydrogen sulfide - - ND 淀粉 Starch 注 : + 表示阳性 ; - 表示阴性 ; G 表示绿色 ; ND 表示没有可提供的数据 Note: +, represents positive; -, represents negative; G, represents green; ND, no data

4 第 2 期 辜良斌, 等 : 从珍珠龙趸体内分离的 1 株创伤弧菌的鉴定及耐药性分析 郾 5 摇 16S rdna mreb rctb topa rpod 序列和系统发育学分析双向测序得到菌株 X11XC26 的上述 5 个基因片段, 将基因按照 mreb-rctb-rpod-topa 的顺序串联起来, 与创伤弧菌菌株进行比对, 利用 MEGA 6 郾 软件构建 NJ 系统树, 进行系统进化分析 ( 图 2 和图 3) 结果发现, 该株病原菌与创伤弧菌能自然聚类, 结合形态学及生理生化特征确定 X11XC26 菌株为创伤弧菌 Vibrio vulnificus 2 郾 6 摇菌株的药敏试验利用纸片法测定 16 种抗菌药物对菌株 X11XC26 与 X11-1 的作用效果, 两株菌株对氧氟沙星 诺氟沙星 环丙沙星 恩诺沙星 阿莫西林等 5 种药物均敏感, 对多粘菌素 B 卡那霉素 青霉素 G 庆大霉素 四环素 呋喃唑酮 利福平 复方新诺明 红霉素 氯霉素 头孢克肟等 11 种抗生素均不敏感 ( 表 4) Fig 郾 2 摇 图 2 摇 菌株 X11XC26 的 16S rdna 序列分析聚类结果 Dendrogram of 16S rdna sequence analysis of strain X11XC26 Fig 郾 3 摇 图 3 摇 菌株 X11XC26 4 个基因串联序列的系统进化树 Phylogenetic constructions of four concatenated genes in strain X11XC26 表 4 摇 致病菌 X11XC26 与 X11-1 对不同抗菌药物的敏感性 Tab 郾 4 摇 Antibacterial activities of different antimicrobial agents to the pathogens X11XC26 and X11-1 抗菌药物 antibacterial agent 含药量 / ( 滋 g disc -1 ) dose 抑菌圈直径 / mm inhibition zone diameter X11XC26 X11-1 药物敏感度 susceptibility 抑菌圈直径 / mm inhibition zone diameter 多粘菌素 B Polymyxin B 25 R R 卡那霉素 Kanamycin 3 13 R 13 R 氧氟沙星 Ofloxacin 5 22 S 3 S 青霉素 G Penicillin G 1 U R 21 R 庆大霉素 Gentamicin 1 12 R 13 R 四环素 Tetracycline 3 12 R 13 R 呋喃唑酮 Furazolidone 3 14 R 15 R 诺氟沙星 Norfloxacin 1 3 S 31 S 阿莫西林 Amoxicillin 1 17 I 23 S 利福平 Rifampicin 5 R R 复方新诺明 Cotrimoxazole 1 郾 25 R R 红霉素 Erythrocin R 25 R 环丙沙星 Ciprofloxacin 5 3 S 32 S 氯霉素 Chloramphenicol 3 1 R 9 R 头孢克肟 Cefixime 5 17 R 11 R 恩诺沙星 Enrofloxacin 5 3 S S 注 : R 为不敏感 ; I 为中度敏感 ; S 为高度敏感 Note: R, resistance; I, medium sensitivity; S, high sensitivity 药物敏感度 susceptibility

5 166 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 31 卷 3 摇讨论 创伤弧菌是一类 机会性冶人类病原菌, 能 引起肠胃炎 败血症等症状, 致死率较高 若将携 带创伤弧菌的水产品流通, 很容易引发大面积的感 染 1992 年, 中国报道了首例由创伤弧菌引起的 疾病, 创伤弧菌主要通过伤口感染或食用未煮熟的 贝类传播, 其中食用生海鲜为主要的人类感染途 径, 如牡蛎 Ostrea plicatula 文蛤 Meretrix meretrix 贻贝 Mytilus edulis [21] [22] 等 曹敏华等的研究显示, 仅珠海地区 89 种海产品中, 创伤弧菌的总阳性检 出率就达 43 郾 82%, 其中牡蛎的检出率达到了 [23] 6 郾 87% 石亚素等从舟山市区 114 份海虾样品 中检出了 23 份创伤弧菌样品, 检出率为 2 郾 18% 以上两位研究者均发现创伤弧菌的检出率呈季节性 变化, 在 4 9 月污染率较高, 此结果与 Cantet [24] 等的研究结果吻合 根据基因型和表型的不同, 创伤弧菌可被分为 3 个生物型 : 生物性玉型, 为人 类病原菌, 分布在世界各地 ; 生物性域型, 能感染 鱼和人类, 全世界均有分布 ; 生物性芋型, 主要在 以色列地区有报道, 能引发人类弧菌病 [2,25] 由于 创伤弧菌的严重危害, 该菌在 26 年被 Emer 鄄 ging Infectious Diseases 杂志列入最危险的细菌之 列 [26] 本试验中, 人工感染试验确认菌株 X11XC26 有强致病性, LD 5 为 1 郾 7 伊 1 5 CFU / g 感染后的 斜带石斑鱼游动缓慢, 取濒死鱼解剖观察到肝 肾 组织充血肿大 从人工感染发病死亡的石斑鱼体内 分离到菌株 X11-1, 该菌株与 X11XC26 菌株生理 生化特性表现一致, 由此可确定菌株 X11XC26 的 致病性 试验中, 选取健康斜带石斑鱼验证该菌株 的病原性, 且能复制出患病珍珠龙趸的典型症状, 该试验有效地证实了此次分离到的创伤弧菌的致病 性 创伤弧菌具有 人鱼共患性冶, 本试验中首次 从珍珠龙趸中分离到创伤弧菌, 创伤弧菌宿主范围 的增大应该得到重视 本试验中, 将 mreb-rctb-rpod-topa 基因串联 后, 与 NCBI 中登录的创伤弧菌的基因比对, 结果 显示, 菌株 X11XC26 与菌株 Vvyb1 的一致性达 1% 菌株 Vvyb1 为生物性芋型菌株, 但菌株 X11XC26 的生物性型尚需通过测定生物型相关基 因才能确定 对 16 种抗菌药物的敏感性试验结果 表明, 菌株 X11XC26 对氧氟沙星 诺氟沙星 环 丙沙星 恩诺沙星等 4 种喹诺酮类药物及阿莫西林 敏感, 对其余的 11 种药物不敏感, 耐药性强 珍 珠龙趸为中国新兴的水产养殖鱼类, 但其耐药性极 强 抗菌药物在中国水产动物疾病防治中占主要地 位, 但药物的过度使用易造成细菌的耐药性, 同时 细菌间相互获得耐药基因也是耐药性产生的重要原 因 [-28] 因此, 合理且有效使用抗菌药物迫在眉 睫, 同时, 应该找寻其他的途径进行疾病的预防, [29-3] 如中草药的应用等 此外, 还应研究疾病发 生的流行病学和病原菌的耐药机制, 寻找其他合理 有效的方法预防疾病的发生 [31-32] 参考文献 : [1] 摇 Ca 觡 igral I,Moreno Y,Alonso J L,et al 郾 Detection of Vibrio vulnifi 鄄 cus in seafood,seawater and wastewater samples from a Mediterra 鄄 nean coastal area [ J] 郾 Microbiological Research,21,165 ( 8 ): [2] 摇 Sanju 佗 n E,Gonz 佗 lez-candelas F,Amaro C. Polyphyletic origin of Vibrio vulnificus biotype 2 as revealed by sequence-based analysis [ J]. Applied and Environmental Microbiology,211,77(2): [3] 摇邢丽萍, 周虓. 创伤弧菌生物学研究进展 [ J]. 中国卫生检验杂 志,211,21(7): [4] 摇许斌福, 林天龙, 董传甫, 等. 鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定 [ J]. 中 国人兽共患病杂志,25,21(11): [5] 摇于兰萍, 王斌, 李艳, 等. 大菱鲆出血性败血症病原菌的分离与 鉴定 [J]. 大连水产学院学报,28,23(5): [6] 摇马爱敏, 闫茂仓, 常维山, 等. 黄姑鱼创伤弧菌的分离和鉴定 [J]. 中国人兽共患病学报,28,24(1): [7] 摇毕可然, 张晓君, 梁利国, 等. 矛尾复虾虎鱼溃疡病病原创伤弧 菌的鉴定 [J]. 海洋科学,211,35(7):2-25. [8] 摇姬华, 陈艳, 刘秀梅, 等. 创伤弧菌控制措施与风险评估的研究 进展 [J]. 食品与发酵工业,213,39(2): [9] 摇郑石勤. 珍珠龙胆石斑鱼明日之星 [ J]. 海洋与渔业,211 (3):47. [1] 摇孟振, 刘新富, 雷霁霖. 略论我国海水鱼类苗种繁育和种质改 良的研究 [J]. 渔业信息与战略,212,(3): [11] 摇梁华芳, 黄东科, 吴耀华, 等. 温度和盐度对龙虎斑存活与摄 食的影响 [J]. 广东海洋大学学报,213,33(4): [12] 摇李样红, 韩巍, 彭树锋, 等. 珍珠龙趸高位池养殖技术研究 [J]. 科学养鱼,213(2): [13] 摇杨少丽, 王印庚, 董树刚. 海水养殖鱼类弧菌病的研究进展 [J]. 海洋水产研究,25,26(4): [14] 摇吴后波, 潘金培. 弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病 [J]. 中国水产科学,21,8(1): [15] 摇郭泽雄, 郑冠雄, 沈铭辉, 等. 珍珠龙胆石斑鱼高位池无公害 养殖技术研究 [J]. 科学养鱼,214(7): [16] 摇陈超, 孔祥迪, 李炎璐, 等. 棕点石斑鱼 ( 意 ) 伊鞍带石斑鱼 ( 裔 ) 杂交子代胚胎及仔稚幼鱼发育的跟踪观察 [ J]. 渔业科 学进展,214,35(5): [17] 摇东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册 [ M]. 北京 : 科学出 版社,21.

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