1

Transcription

1 脊 髓 灰 质 炎 实 验 室 手 册 2004 年 第 四 版 世 界 卫 生 组 织

2 多 亏 了 那 些 无 私 的 经 济 援 助, 使 这 本 手 册 最 终 得 以 完 成, 世 界 卫 生 组 织 免 疫 疫 苗 及 生 物 制 品 部 对 此 表 示 真 诚 的 谢 意 本 手 册 订 购 代 码 :WHO/IVB/04.10 印 刷 日 期 :2004 年 9 月 按 如 下 联 系 方 式, 可 申 请 得 到 本 手 册 : World Health Organization Department of Immunization,Vaccines and Biologicals CH-1211 Geneva 27,Switzerland 传 真 : ; vaccines@who.int 本 手 册 是 在 以 前 的 脊 灰 病 毒 学 监 测 手 册 WHO/EPI/GEN/97.01 基 础 上 加 以 修 订 的, 并 取 而 代 之 世 界 卫 生 组 织 保 留 对 于 本 手 册 的 一 切 权 利 世 界 卫 生 组 织 的 出 版 物 可 按 如 下 联 系 方 式 得 到 :Marketing and Dissemination, World Health Organization, 20 Avenue Appia,1211 Geneva 27,Switzerland( 电 话 : ; 传 真 : ; bookorders@who.int) 要 申 请 得 到 复 制 或 翻 译 WHO 出 版 物 的 授 权 不 论 是 基 于 商 业 或 非 商 业 目 的, 也 应 该 与 以 上 地 址 联 系 ( 传 真 : ; permissions@who.int) 作 为 世 界 卫 生 组 织, 本 手 册 中 所 使 用 的 名 称 及 素 材 的 表 达, 包 括 表 格 和 地 图, 不 暗 示 任 何 涉 及 任 一 国 家 领 土 地 区 和 城 市 合 法 地 位 或 其 权 力 的 观 点, 也 与 上 述 地 理 区 域 的 边 界 指 定 无 关 对 那 些 可 能 还 未 完 全 达 成 一 致 协 议 的 边 界, 我 们 在 地 图 上 用 虚 线 代 表 近 似 的 边 界 手 册 中 提 及 的 某 些 公 司 或 某 些 公 司 的 产 品 并 不 暗 示 它 们 被 WHO 所 认 可 和 推 荐, 也 不 暗 示 它 们 比 未 被 提 及 的 其 它 同 类 性 质 的 产 品 更 优 越 世 界 卫 生 组 织 不 能 保 证 本 手 册 所 包 含 的 内 容 完 整 无 误 对 由 于 使 用 本 手 册 所 造 成 的 损 失 将 不 承 担 责 任

3 本 手 册 是 WHO 脊 髓 灰 质 炎 实 验 室 手 册 2004 年 8 月 出 版 的 最 新 版 本 的 中 文 版 由 国 家 脊 髓 灰 质 炎 组 织 实 验 室 科 技 人 员 翻 译 和 校 对, 是 全 球 脊 髓 灰 质 炎 实 验 室 网 络 的 权 威 操 作 手 册, 对 其 他 网 络 实 验 室 或 病 毒 学 实 验 室 也 有 重 要 的 参 考 价 值 翻 译 : 张 勇 刘 桂 艳 严 冬 梅 候 晓 辉 祝 双 俐 陈 立 赵 蓉 王 冬 艳 李 杰 朱 辉 校 对 : 许 文 波 需 此 手 册 请 与 下 列 地 址 联 系 : 李 杰

4 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 目 录 目 录 图 形 一 览 表 V 表 格 一 览 表 VI 缩 略 语 1 第 1 部 分 导 言 脊 灰 消 灭 计 划 脊 灰 的 历 史 和 脊 灰 疫 苗 脊 灰 病 原 学 特 征 脊 灰 病 毒 的 传 播 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒,VDPVs 10 第 2 部 分 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 正 确 的 检 测 WHO 脊 灰 实 验 室 网 络 的 结 构 和 工 作 网 络 内 部 的 协 调 合 作 网 络 实 验 室 的 认 证 17 第 3 部 分 实 验 室 质 量 保 证 实 验 室 质 量 保 证 的 基 础 标 准 操 作 规 程 文 件 仪 器 和 设 备 备 品 实 验 室 安 全 36 I

5 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 目 录 3.7 考 核 38 第 4 部 分 细 胞 培 养 技 术 细 胞 培 养 实 验 室 的 工 作 细 胞 培 养 操 作 规 程 培 养 病 毒 和 细 胞 的 培 养 液 及 有 关 试 剂 细 胞 培 养 中 的 问 题 : 鉴 定 和 淘 汰 61 Hoechst 直 接 DNA 染 色 法 检 测 支 原 体 污 染 64 MYCO 免 疫 法 检 测 支 原 体 污 染 65 PCR 法 检 测 支 原 体 污 染 67 第 5 部 分 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 细 胞 系 质 量 控 制 参 考 毒 株 的 选 择 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 制 备 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 测 定 用 Kärber 公 式 计 算 病 毒 滴 度 细 胞 系 敏 感 性 试 验 的 结 果 解 释 及 解 决 办 法 如 何 获 得 脊 灰 病 毒 参 考 毒 株 77 第 6 部 分 标 本 的 接 收 和 处 理 标 本 的 接 收 标 本 的 处 理 处 理 标 本 的 试 剂 81 第 7 部 分 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 推 荐 用 于 分 离 脊 灰 病 毒 的 细 胞 系 分 离 脊 灰 病 毒 及 其 它 肠 道 病 毒 84 II

6 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 目 录 7.3 脊 灰 病 毒 分 离 物 的 鉴 定 鉴 定 非 脊 灰 肠 道 病 毒 94 第 8 部 分 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 型 内 鉴 别 方 法 ELISA 法 型 内 鉴 别 方 法 核 酸 探 针 杂 交 型 内 鉴 别 方 法 PCR 法 使 用 两 种 方 法 进 行 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 115 第 9 部 分 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 什 么 时 候 怀 疑 有 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 调 查 可 能 的 脊 灰 野 病 毒 污 染 源 检 查 在 实 验 室 操 作 中 有 无 失 误 确 定 标 本 结 果 是 否 可 以 追 踪 在 调 查 时 加 强 与 脊 灰 项 目 组 的 联 系 123 第 10 部 分 标 本 和 分 离 物 的 运 输 运 输 计 划 运 输 材 料 的 包 装 准 备 相 关 文 件 和 运 输 包 裹 通 知 收 件 人 通 知 发 件 人 136 第 11 部 分 数 据 管 理 收 样 记 录 实 验 室 结 果 记 录 实 验 室 工 作 和 实 验 室 结 果 的 报 告 144 III

7 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 目 录 11.4 认 证 所 需 要 的 实 验 室 数 据 146 参 考 文 献 148 IV

8 世 界 卫 生 组 织 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 图 形 一 览 表 图 ~2002 年 消 灭 脊 灰 进 展... 5 图 1.2 脊 灰 病 毒 基 因 组... 9 图 2.1 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 结 构 示 意 图 图 2.2 标 本 采 集 和 运 输 流 程 图 图 3.1 SOP 的 书 写 图 3.2 SOP 书 写 范 例 图 3.3 SOP 流 程 图 范 例 图 3.4 微 生 物 学 操 作 技 术 规 范 图 3.5 基 本 的 二 级 生 物 安 全 装 备 图 4.1 生 物 安 全 柜 (Ⅱ 级 ) 图 4.2. 使 用 血 细 胞 计 数 板 进 行 细 胞 计 数 ( 以 Freshney 计 数 板 为 例 ) 图 4.3 控 制 细 胞 冷 却 的 装 置 ( 以 Freshney 为 例 ) 图 4.4 液 态 及 气 态 氮 贮 存 罐 ( 以 Freshney 为 例 ) 图 4.5 细 胞 库 的 建 立 图 5.1 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 毒 株 的 稀 释 图 5.2 实 验 室 质 量 控 制 标 准 品 滴 定 的 板 面 设 计 图 5.3 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 标 准 毒 株 滴 定 结 果 示 例 图 7.1 在 RD 和 L20B 细 胞 上 分 离 脊 灰 病 毒 流 程 图 图 7.2 脊 灰 病 毒 定 型 实 验 的 板 面 设 计 图 7.3 病 毒 的 稀 释 图 7.4 中 和 实 验 鉴 定 脊 灰 型 别 示 意 图 图 7.5 用 微 孔 板 鉴 定 肠 道 病 毒 的 型 别 图 8.1 ELISA 法 用 于 脊 灰 病 毒 型 内 鉴 别 时 的 平 板 设 计 图 8.2 杂 交 点 样 的 一 个 例 子 图 8.3 加 样 示 意 图 图 8.4 阳 性 对 照 扩 增 产 物 电 泳 结 果 示 意 图 图 10.1 三 层 包 装 系 统 图 10.2 用 冻 存 管 包 装 病 毒 分 离 物 图 10.3 包 装 标 记 规 范 图 10.4 感 染 性 材 料 运 输 的 外 包 装 和 标 签 示 意 图 图 10.6 运 输 标 本 的 准 备 工 作 图 10.7 运 输 多 个 标 本 的 准 备 工 作 图 10.8 诊 断 标 本 运 输 的 标 记 和 外 层 包 装 图 10.9 例 : 海 关 声 明 图 11.1 实 验 室 结 果 和 实 验 室 工 作 监 测 数 据 流 程 图 图 11.2 实 验 室 数 据 反 馈 流 程 图 V

9 世 界 卫 生 组 织 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 表 格 一 览 表 表 3.1 基 本 的 实 验 室 设 备 表 3.2 对 100 份 标 本 进 行 脊 灰 病 毒 分 离 所 需 的 试 剂 和 材 料 表 4.1 细 胞 培 养 必 备 器 材 表 4.2 不 同 培 养 瓶 中 L20B 和 RD 细 胞 近 似 的 接 种 体 积 及 接 种 细 胞 量 表 4.3 检 测 支 原 体 的 方 法 表 7.1 准 备 RIVM 定 型 试 剂 表 7.2 病 毒 中 和 实 验 鉴 定 脊 灰 病 毒 型 别 的 结 果 解 释 表 8.1 PCR 实 验 结 果 解 释 表 表 8.2 PCR 引 物 列 表 表 8.3 使 用 ELISA 法 和 核 酸 探 针 杂 交 法 / 诊 断 性 PCR 法 进 行 型 内 鉴 别 的 方 案 VI

10 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 缩 略 语 缩 略 语 μg 微 克 μl 微 升 AFP 急 性 弛 缓 性 麻 痹 ART 防 气 溶 胶 的 吸 尖 ( 用 于 加 样 器 ) BCIP 5- 溴 4- 氯 3- 吲 哚 磷 酸 BSC 生 物 安 全 柜 BSL 生 物 安 全 水 平 CCID 细 胞 感 染 剂 量 CO2 二 氧 化 碳 cdna 互 补 DNA CPE 致 细 胞 病 变 效 应 DNA 脱 氧 核 糖 核 酸 DMF 二 甲 基 甲 酰 胺 DMSO 二 甲 基 亚 砜 DTT 二 硫 苏 糖 醇 eipv 增 强 型 灭 活 脊 灰 疫 苗 ELISA 酶 联 免 疫 吸 咐 试 验 EPI 扩 大 免 疫 规 划 EPID number AFP 病 例 的 通 用 标 识 码 FITC 异 硫 氰 酸 荧 光 素 GAP 全 球 封 存 脊 灰 野 毒 株 行 动 计 划 GM 生 长 液 GSL 全 球 专 项 实 验 室 HEPA 高 效 空 气 过 滤 器 IATA 国 际 航 空 运 输 协 会 IPV 灭 活 脊 灰 疫 苗 ( 由 Salk 等 发 明 ) 1

11 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 缩 略 语 ITD 型 内 鉴 别 IU 国 际 单 位 IVB 免 疫 疫 苗 及 生 物 制 品 部 KPa 千 帕 L 升 L20B 表 达 了 人 类 脊 灰 病 毒 受 体 的 小 鼠 细 胞 系 LQA 实 验 室 质 量 保 证 MCB 主 细 胞 库 mg 毫 克 min 分 钟 ml 毫 升 MM 维 持 液 MW 分 子 量 NBT 四 唑 氮 蓝 ( 染 料 ) NIDs 全 国 免 疫 日 NL 国 家 实 验 室 nm 纳 米 NPEV 非 脊 灰 肠 道 病 毒 NSL 非 Sabin 类 似 株 OD 光 密 度 OPV 口 服 脊 灰 活 疫 苗 (sabin) PBS 磷 酸 盐 缓 冲 液 PCR 聚 合 酶 链 式 反 应 PSI 磅 / 平 方 英 尺 PT 职 能 考 核 PVR 脊 灰 病 毒 受 体 QC 质 量 控 制 RD 来 源 于 人 横 纹 肌 肉 瘤 的 一 种 细 胞 系 2

12 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 缩 略 语 RFLP 限 制 性 片 断 长 度 多 态 性 RNA 核 糖 核 酸 RPM 每 分 钟 转 数 RRL 地 区 参 比 实 验 室 RT 反 转 录 SDS 十 二 烷 基 磺 酸 钠 SL Sabin 类 似 株 SOP 标 准 操 作 规 程 SSC 氯 化 钠 和 柠 檬 酸 钠 TMB 四 甲 基 对 二 氨 基 联 苯 U 单 位 UP 过 氧 化 脲 VAPP 疫 苗 相 关 麻 痹 型 脊 髓 灰 质 炎 病 例 V&B 疫 苗 及 生 物 制 品 部 ( 现 为 IVB, 请 看 前 面 ) VDPV 疫 苗 衍 生 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 WCB 工 作 细 胞 库 WHA 世 界 卫 生 大 会 WHO 世 界 卫 生 组 织 3

13 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 1.1 脊 灰 消 灭 计 划 第 1 部 分 导 言 1988 年 5 月, 第 41 届 世 界 卫 生 大 会 通 过 了 WHO 成 员 国 要 力 争 到 2000 年 底 全 球 消 灭 脊 髓 灰 质 炎 ( 以 下 简 称 脊 灰 ) 的 决 议 (WHA41.28 号 决 议 ) 这 项 决 议 指 明 消 灭 脊 灰 应 该 通 过 加 强 扩 大 免 疫 来 实 现 1989 年 第 42 届 世 界 卫 生 大 会 通 过 了 全 球 消 灭 脊 灰 的 总 体 行 动 计 划 消 灭 脊 灰 全 球 行 动 计 划 是 历 史 上 最 大 的 公 共 卫 生 行 动 计 划 自 从 1988 年 这 一 计 划 提 出 后, 在 阻 断 野 病 毒 传 播 及 达 到 2005 年 完 成 全 球 消 灭 脊 灰 的 认 证 方 面 已 经 取 得 非 凡 的 成 就 在 1988 年 的 时 候, 五 大 洲 还 有 超 过 125 个 国 家 有 脊 灰 流 行, 导 致 超 过 35 万 名 儿 童 瘫 痪 到 了 2002 年 底, 有 脊 灰 感 染 的 国 家 已 减 少 到 7 个 ( 图 1.1), 并 且 有 三 个 洲 消 除 了 脊 灰, 报 告 的 脊 灰 病 例 数 减 少 到 约 1900 例 在 美 洲 欧 洲 和 西 太 区 已 经 阻 断 了 脊 灰 的 传 播,2002 年 底 有 超 过 180 个 国 家 和 地 区 进 入 无 脊 灰 状 态 随 着 脊 灰 的 消 灭 和 脊 灰 免 疫 的 最 终 停 止, 全 球 每 年 将 节 约 15 亿 美 元 的 开 支 现 行 的 由 WHO 提 出 的 消 灭 脊 灰 策 略 经 过 实 践 证 明 是 成 功 的, 这 四 个 策 略 是 : 高 覆 盖 率 的 儿 童 常 规 免 疫 脊 灰 疫 苗 的 常 规 免 疫 程 序 是 口 服 脊 灰 活 疫 苗 (OPV) 至 少 3 剂 次, 在 脊 灰 流 行 国 家 出 生 时 再 多 服 一 次 全 国 计 划 免 疫 日 的 目 标 人 群 规 定 为 所 有 小 于 5 岁 的 儿 童 急 性 弛 缓 性 麻 痹 的 监 测 和 实 验 室 检 测 扫 荡 式 免 疫 以 阻 断 脊 灰 的 最 后 传 播 链 实 验 室 在 确 保 达 到 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 是 至 关 重 要 的 除 了 脊 灰 病 毒 以 外, 还 有 其 它 因 素 也 能 引 起 急 性 弛 缓 性 麻 痹, 因 此 所 有 疑 似 病 例 的 标 本 都 必 须 经 过 病 毒 学 检 测 大 部 分 脊 灰 病 毒 感 染 者 无 症 状, 只 有 0.1%~1% 的 感 染 者 会 出 现 临 床 症 状, 所 以 从 每 例 确 诊 的 AFP 病 例 中 采 集 到 的 粪 便 标 本 都 必 须 按 规 定 的 程 序 进 行 认 真 检 测, 以 防 漏 检 脊 灰 野 病 毒, 漏 掉 1 例 就 意 味 着 漏 掉 1000 例 脊 灰 病 毒 感 染 者 消 灭 脊 灰 行 动 计 划 要 想 行 之 有 效, 就 必 须 把 疾 病 监 测 和 实 验 室 工 作 紧 密 结 合 起 来, 以 保 证 计 免 管 理 人 员 和 其 他 实 施 消 灭 脊 灰 策 略 的 人 员 能 根 据 所 获 得 的 流 行 病 学 数 据 和 实 验 室 病 毒 学 资 料 开 展 工 作 EPI 人 员 临 床 医 生 流 行 病 学 家 和 病 毒 学 家 必 须 互 相 配 合, 形 成 一 个 团 队 团 队 的 建 立 及 良 好 地 发 挥 其 作 用 是 整 个 消 灭 脊 灰 行 动 中 不 可 缺 少 的 环 节, 也 为 加 强 EPI 工 作 和 相 关 卫 生 机 构 中 需 要 实 验 室 支 持 的 其 它 疾 病 工 作 打 下 了 基 础 4

14 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 图 ~2002 年 消 灭 脊 灰 进 展 1988 年 例 125 个 国 家 2002 年 1918 例 7 个 国 家 1989 年 通 过 的 行 动 计 划 中 具 体 规 定 了 实 验 室 在 全 球 消 灭 脊 灰 中 的 职 能 该 计 划 阐 述 了 如 何 建 立 一 个 各 级 职 责 明 确 的 三 级 全 球 实 验 室 网 络 这 项 工 作 现 在 已 经 取 得 了 巨 大 的 进 展 网 络 中 的 各 级 实 验 室, 即 WHO 6 个 地 区 的 全 球 专 项 实 验 室 地 区 参 比 实 验 室 和 国 家 实 验 室 正 在 一 个 有 史 以 来 最 大 的 以 及 协 调 合 作 的 公 共 卫 生 实 验 室 网 络 中 共 同 工 作 着 在 实 验 室 网 络 建 立 的 初 期, 分 发 给 各 网 络 实 验 室 的 操 作 手 册 中 规 定 了 脊 灰 病 毒 学 检 测 的 标 准 方 法 (WHO/EPI CDS/POLIO/90.1) 该 手 册 是 WHO 及 各 参 比 实 验 室 主 办 的 培 训 中 必 不 可 少 的 资 料 随 着 时 间 的 推 移 和 工 作 的 进 展, 其 中 有 些 要 求 已 发 生 了 变 化, 而 且 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 在 建 立 和 发 展 过 程 中 又 积 累 了 一 些 新 的 经 验, 所 以 这 本 手 册 分 别 于 1997 年 (WHO/EPI/GEN/97.01) 和 2001 年 ( 只 有 电 子 版 ) 进 行 了 修 订 5

15 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 1999 年 5 月, 世 界 卫 生 大 会 重 申 了 WHO 关 于 消 灭 脊 灰 的 提 议, 并 要 求 所 有 成 员 国 开 始 封 存 脊 灰 野 病 毒 封 存 的 目 的 是 为 了 防 止 野 病 毒 从 实 验 室 传 播 给 日 益 增 多 的 无 脊 灰 国 家 1999 年 12 月,WHO 颁 布 了 实 验 室 脊 灰 野 病 毒 封 存 的 全 球 行 动 计 划 (GAP), GAP(WHO/\/&B/99.32) 的 制 定 是 为 2005 年 完 成 全 球 消 灭 脊 灰 的 认 证 和 此 后 5-10 年 最 终 减 少 或 停 止 脊 灰 疫 苗 使 用 所 做 的 一 项 准 备 工 作 该 计 划 现 正 在 修 订 中, 第 二 版 (WHO/V&B/99.32) 将 于 2004 年 出 版, 其 中 总 结 了 对 6 个 WHO 地 区 中 的 5 个 地 区 共 一 百 多 国 家 生 物 医 学 实 验 室 进 行 调 查 所 取 得 的 经 验 GAP 第 二 版 根 据 消 灭 脊 灰 的 两 个 阶 段 阐 明 了 相 关 工 作 任 务 : 实 验 室 调 查 阶 段 是 指 整 个 脊 灰 野 病 毒 持 续 流 行 的 时 期 在 这 一 阶 段, 国 家 应 调 查 所 有 生 物 医 学 实 验 室, 明 确 哪 些 实 验 室 有 脊 灰 野 病 毒 感 染 材 料 或 潜 在 的 感 染 材 料, 并 鼓 励 销 毁 所 有 不 需 要 的 材 料 所 有 保 存 脊 灰 野 病 毒 和 潜 在 感 染 性 材 料 的 实 验 室, 国 家 应 该 有 备 案 记 录, 并 且 指 导 这 些 实 验 室 加 强 二 级 生 物 安 全 措 施, 以 安 全 操 作 这 些 材 料 国 家 也 要 开 始 为 全 球 消 灭 脊 灰 的 认 证 制 定 自 己 的 工 作 计 划 全 球 认 证 阶 段 这 一 阶 段 从 检 测 到 世 界 上 最 后 一 株 脊 灰 野 病 毒 一 年 后 开 始, 那 时 很 可 能 脊 灰 在 人 类 中 的 传 播 已 经 停 止 这 时 候 国 家 将 通 告 生 物 医 学 实 验 室 脊 灰 野 病 毒 传 播 已 经 阻 断 另 外 还 应 联 系 到 所 有 上 述 的 在 国 家 备 案 的 实 验 室, 并 指 导 这 些 实 验 室 选 择 以 下 的 一 种 或 几 种 方 式 来 封 存 毒 株 : 在 适 当 的 条 件 下, 消 除 材 料 中 脊 灰 病 毒 的 感 染 性, 或 销 毁 这 些 材 料 ; 实 验 室 的 工 作 要 符 合 生 物 安 全 需 要, 根 据 是 否 要 扩 增 病 毒 来 选 择 二 级 生 物 安 全 水 平 或 三 级 生 物 安 全 水 平 ; 或 将 脊 灰 野 病 毒 感 染 材 料 或 潜 在 感 染 材 料 送 至 符 合 相 应 的 生 物 安 全 标 准 的 实 验 室 中 继 续 完 成 必 要 的 工 作 脊 灰 病 毒 消 灭 的 通 告 发 出 一 年 后, 国 家 必 须 完 成 所 要 求 的 封 存 工 作 及 相 关 的 书 面 文 件, 以 便 于 全 球 消 灭 脊 灰 的 认 证 GAP 第 二 版 中 声 明, 是 否 在 全 球 停 止 使 用 脊 灰 疫 苗 将 决 定 认 证 后 再 操 作 脊 灰 病 毒 的 生 物 安 全 要 求 如 果 停 止 了 脊 灰 免 疫 接 种, 则 对 于 OPV 病 毒 也 要 和 野 病 毒 一 样, 控 制 要 求 就 会 比 上 述 的 要 求 更 为 严 格 1.2 脊 灰 的 历 史 和 脊 灰 疫 苗 脊 灰 是 一 种 古 老 的 疾 病 最 早 的 关 于 脊 灰 的 描 述 大 概 要 追 溯 到 公 元 前 1350 年 左 右, 在 埃 及 的 石 碑 上, 描 画 了 一 个 年 轻 人, 他 的 腿 表 现 为 典 型 的 不 对 称 迟 缓 性 麻 痹 并 已 经 萎 缩 在 17 世 纪 和 18 世 纪 的 著 作 中 也 出 现 过 散 在 的 关 于 此 病 的 描 述 到 了 19 世 纪 中 期, 工 业 革 命 推 进 了 欧 洲 和 北 美 的 城 市 化, 居 民 生 活 条 件 大 为 改 善, 但 随 之 而 来 的 是 大 规 模 6

16 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 高 频 率 的 脊 灰 爆 发 从 19 世 纪 后 期 开 始, 在 美 国 和 欧 洲 的 一 些 国 家, 脊 灰 不 断 爆 发 脊 灰 成 为 20 世 纪 前 50 年 发 达 国 家 最 大 的 公 共 卫 生 问 题 1909 年,Landsteiner 和 Popper 在 非 人 的 灵 长 类 动 物 身 上 成 功 地 进 行 了 病 毒 的 传 代, 这 在 脊 灰 的 研 究 中 是 一 个 里 程 碑 事 件 动 物 模 型 的 建 立 第 一 次 使 该 疾 病 能 在 人 体 外 进 行 研 究, 并 获 得 了 关 于 疾 病 的 感 染 过 程 和 病 理 生 理 方 面 的 重 要 信 息 直 到 1949 年, Enders,Weller 和 Robbins 取 得 了 用 组 织 培 养 扩 增 病 毒 这 一 重 大 成 就, 脊 灰 病 原 体 方 面 才 有 了 进 一 步 研 究 这 一 进 展 以 及 对 脊 灰 三 种 不 同 血 清 型 的 认 识 为 后 来 疫 苗 的 发 明 及 脊 灰 病 毒 生 物 医 学 和 生 物 物 理 特 性 的 研 究 铺 平 了 道 路 到 了 20 世 纪 50 年 代, 用 疫 苗 来 预 防 脊 灰 的 两 种 不 同 方 法 都 发 展 起 来 1954 年,Salk 和 Younger 采 用 甲 醛 化 学 灭 活 法 灭 活 组 织 培 养 的 病 毒, 成 功 发 明 了 第 一 种 脊 灰 疫 苗 这 种 疫 苗 完 全 没 有 感 染 性, 但 通 过 注 射 能 引 起 免 疫 反 应 预 防 瘫 痪 的 发 生 同 时, 许 多 实 验 室 也 在 寻 求 生 产 减 毒 脊 灰 活 疫 苗 的 方 法 到 了 1961 年, 口 服 脊 灰 疫 苗 (OPV)Sabin 株 经 过 在 前 苏 联 东 欧 和 拉 丁 美 洲 的 大 量 现 场 试 验 后 得 到 生 产 许 可 1962 年 和 1963 年, 许 多 国 家 开 始 了 脊 灰 疫 苗 的 大 规 模 免 疫 接 种 脊 灰 灭 活 疫 苗 (IPV) 和 OPV 都 包 含 三 种 组 分, 不 同 组 分 针 对 不 同 血 清 型 提 供 免 疫 一 些 国 家 使 用 加 强 型 IPV(eIPV), eipv 中 的 Ⅱ Ⅲ 型 含 有 比 标 准 IPV 更 高 的 D 抗 原 单 位 IPV 和 OPV( 从 1963 年 开 始 使 用 ) 的 广 泛 应 用 事 实 上 已 经 使 大 多 数 发 达 国 家 都 消 除 了 脊 灰 1.3 病 原 学 特 征 脊 灰 病 毒 属 于 小 核 糖 核 酸 病 毒 科 肠 道 病 毒 属 病 毒 为 直 径 30nm 的 小 圆 球 型 颗 粒, 呈 二 十 面 体 对 称 结 构, 无 包 膜 脊 灰 病 毒 的 生 化 和 生 物 物 理 特 征 与 其 它 肠 道 病 毒 有 许 多 相 似 之 处, 但 与 其 它 一 些 小 核 糖 核 酸 病 毒 不 同 病 毒 颗 粒 在 氯 化 铯 中 的 浮 力 密 度 是 1.34g/ml, 沉 降 系 数 大 约 为 156S 有 感 染 性 的 颗 粒 相 对 耐 热 ( 有 镁 离 子 存 在 时 更 为 稳 定 ) 耐 酸 (PH 3~5 的 条 件 下 能 存 活 1~3 小 时 ), 也 能 抵 抗 许 多 普 通 的 清 洁 剂 和 消 毒 剂, 包 括 普 通 的 肥 皂 非 离 子 清 洁 剂 醚 类 氯 仿 和 其 它 脂 溶 剂 病 毒 在 4 下 能 存 活 数 周, 常 温 下 能 存 活 几 天, 但 是 在 干 燥 紫 外 线 高 热 甲 醛 和 游 离 氯 作 用 下 都 很 易 灭 活 脊 灰 病 毒 和 肠 道 病 毒 在 基 本 的 物 理 特 征 上 与 其 它 小 核 糖 核 酸 病 毒 不 同, 例 如 在 氯 化 铯 中 的 浮 力 密 度 和 弱 酸 中 的 稳 定 性 三 种 血 清 型 的 脊 灰 病 毒 都 可 以 通 过 型 特 异 性 的 抗 血 清 中 和 实 验 以 及 在 临 床 上 容 易 导 致 瘫 痪 来 与 其 它 肠 道 病 毒 相 鉴 别 Ⅰ 型 病 毒 Mahoney 株 是 小 核 糖 核 酸 肠 道 病 毒 属 脊 灰 病 毒 的 原 型 株, 它 是 人 类 病 原 体 中 研 究 最 多 性 质 最 为 了 解 的 病 原 体 之 一 7

17 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 脊 灰 病 毒 的 衣 壳 由 60 个 亚 单 位 构 成, 每 个 亚 单 位 又 由 4 种 蛋 白 质 组 成,60 个 亚 单 位 形 成 一 个 高 度 有 序 的 病 毒 外 壳 壳 的 内 部, 一 条 约 7500 个 碱 基 的 单 股 RNA 构 成 病 毒 基 因 组 4 种 蛋 白 质 分 子 是 由 一 多 聚 蛋 白 前 体 被 蛋 白 水 解 酶 切 割 而 成, 命 名 为 VP1-VP4 在 VP4 蛋 白 的 氨 基 酸 末 端 共 价 连 接 着 一 个 十 四 碳 脂 肪 酸 此 外 还 一 个 小 蛋 白 VPg 共 价 连 接 在 病 毒 RNA 的 5' 末 端 随 着 观 察 晶 体 结 构 的 分 辨 率 可 达 到 0.29nm 这 一 难 关 的 突 破, 脊 灰 病 毒 结 构 方 面 的 研 究 也 取 得 了 重 大 进 展 从 脊 灰 病 毒 的 三 维 结 构 来 看, 病 毒 表 面 的 氨 基 酸 残 基 大 部 分 是 VP1 蛋 白 的,VP2 和 VP3 部 分 暴 露 于 病 毒 表 面, 而 VP4 蛋 白 则 全 部 位 于 毒 粒 内 部 了 解 病 毒 表 面 的 结 构 对 于 理 解 脊 灰 病 毒 中 和 抗 体 的 作 用 机 制 非 常 有 用 通 过 单 克 隆 中 和 抗 体 以 及 不 能 被 该 抗 体 完 全 中 和 的 病 毒 变 异 株 的 研 究 已 经 揭 示 了 病 毒 上 的 四 个 主 要 抗 原 位 点 每 个 位 点 的 重 要 性 对 于 脊 灰 病 毒 三 个 血 清 型 来 说 是 不 同 的 X 射 线 晶 体 结 构 已 经 证 实 抗 原 决 定 位 点 由 位 于 病 毒 表 面 的 氨 基 酸 残 基 和 暴 露 的 壳 蛋 白 环 组 成 由 相 同 或 不 同 衣 壳 蛋 白 构 成 的 相 邻 结 构 域 影 响 蛋 白 环 的 构 象 这 就 解 释 了 为 什 么 破 坏 病 毒 的 结 构 就 破 坏 了 病 毒 的 抗 原 性 此 外 还 有 其 它 的 抗 原 位 点, 它 们 能 引 起 免 疫 反 应 但 不 能 产 生 中 和 抗 体 脊 灰 病 毒 中 和 抗 体 反 应 是 血 清 型 特 异 性 的, 不 过 在 Ⅰ 和 Ⅱ 型 脊 灰 病 毒 之 间 有 一 点 儿 交 叉 加 热 破 坏 的 病 毒 尤 其 在 去 垢 剂 存 在 的 情 况 下 加 热 破 坏 的 病 毒, 它 们 诱 导 产 生 的 抗 体 能 和 许 多 肠 道 病 毒 发 生 反 应, 一 般 这 种 能 引 起 广 谱 反 应 的 抗 体 并 不 是 中 和 抗 体 由 动 物 体 内 获 得 的 抗 血 清 多 数 是 型 特 异 性 的, 在 中 和 实 验 中 用 于 病 毒 血 清 型 的 鉴 定 尽 管 在 病 毒 的 结 构 蛋 白 和 非 结 构 蛋 白 上 存 在 不 只 一 个 T 细 胞 抗 原 决 定 基, 但 细 胞 介 导 的 免 疫 在 感 染 的 控 制 方 面 起 到 的 作 用 还 不 确 定 脊 灰 病 毒 就 基 因 的 复 杂 性 和 大 小 而 言, 是 属 于 最 简 单 的 病 毒 之 一 脊 灰 病 毒 三 个 血 清 型 的 RNA 基 因 组 都 已 被 克 隆 和 测 序 基 因 组 RNA 具 有 感 染 性 并 作 为 病 毒 蛋 白 翻 译 的 模 板 RNA 以 单 一 开 放 读 码 框 被 翻 译 成 一 个 大 的 前 体 蛋 白 质, 然 后 被 病 毒 编 码 的 两 种 不 同 的 蛋 白 水 解 酶 切 割 成 有 功 能 的 蛋 白 关 于 脊 灰 病 毒, 尽 管 已 做 了 大 量 的 研 究 而 且 病 毒 本 身 很 简 单, 但 病 毒 生 长 周 期 的 几 个 步 骤 还 不 清 楚, 包 括 病 毒 的 进 入 位 点 和 方 式, 以 及 基 因 组 如 何 释 放 到 细 胞 质 中 脊 灰 病 毒 首 先 结 合 到 一 个 特 殊 的 膜 蛋 白 即 脊 灰 病 毒 受 体 (PVR;CD155) 上, 它 是 免 疫 球 蛋 白 基 因 超 家 族 中 的 一 员 与 受 体 的 结 合 导 致 衣 壳 构 象 发 生 变 化, 这 种 变 化 是 基 因 组 释 放 到 胞 质 中 所 必 需 的 其 它 的 小 核 糖 核 酸 病 毒 都 不 能 和 脊 灰 病 毒 受 体 相 结 合 通 过 表 达 了 人 类 脊 灰 病 毒 受 体 的 重 组 鼠 细 胞 系 可 以 选 择 性 地 分 离 脊 灰 病 毒, 该 受 体 已 经 被 应 用 到 脊 8

18 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 灰 消 除 的 工 作 中 一 旦 病 毒 基 因 组 进 入 到 细 胞, 复 制 周 期 就 开 始 了, 这 时 病 毒 RNA 由 3' 末 端 开 始, 在 聚 合 酶 作 用 下 转 录 成 互 补 的 RNA(cRNA), 然 后 依 靠 宿 主 细 胞 中 的 某 种 物 质, 再 以 crna 为 模 板 合 成 子 代 病 毒 RNA 新 合 成 的 病 毒 RNA 在 5' 末 端 共 价 连 接 上 一 个 VPg 蛋 白 分 子 而 后 只 有 正 链 RNA 包 装 上 病 毒 结 构 蛋 白 形 成 具 有 感 染 性 的 病 毒 颗 粒 在 对 病 毒 复 制 和 装 配 大 量 研 究 的 基 础 上, 一 项 仅 从 病 毒 RNA 开 始, 完 全 不 依 赖 于 细 胞 的 病 毒 复 制 实 验 取 得 了 惊 人 的 成 功 图 1.2 脊 灰 病 毒 基 因 组 所 有 肠 道 病 毒 的 保 守 区 ; 探 针 杂 交 和 PCR 结 合 位 点 所 有 脊 灰 病 毒 血 清 型 特 异 性 脊 灰 病 毒 Sabin 特 异 性 脊 灰 病 毒 PCR 和 探 针 杂 交 结 合 位 点 ; 测 序 首 选 区 1.4 脊 灰 病 毒 的 传 播 脊 灰 病 毒 的 传 播 有 几 种 途 径 在 大 多 数 发 展 中 国 家, 最 主 要 的 途 径 是 粪 - 口 传 播 病 毒 在 肠 道 中 复 制 效 率 很 高, 通 常 粪 便 中 排 毒 2~4 周, 有 时 长 达 几 周 排 毒 可 能 是 间 歇 性 的, 并 且 受 宿 主 免 疫 状 态 和 免 疫 力 的 影 响 既 往 发 生 过 脊 灰 野 病 毒 的 自 然 感 染 或 服 过 OPV 的 人 群, 脊 灰 病 毒 排 放 量 会 降 低, 排 毒 时 间 会 缩 短 增 强 型 IPV 和 竞 争 性 的 肠 道 感 染 也 可 能 使 粪 便 中 病 毒 的 排 放 量 和 排 毒 时 间 减 少 到 一 定 程 度 影 响 脊 灰 病 毒 传 播 的 因 素 包 括 人 口 密 度 卫 生 水 平 水 质 和 污 水 处 理 设 备 在 具 有 良 好 的 卫 生 条 件 饮 用 水 没 被 污 染 的 地 区, 其 它 传 播 途 径 可 能 更 重 要 因 为 病 毒 也 在 上 呼 吸 道 复 制, 因 此 脊 灰 病 毒 同 样 也 通 过 上 呼 吸 道 分 泌 物 传 播 在 早 期 急 性 感 染 期 能 从 咽 拭 子 和 洗 漱 液 中 检 测 到 病 毒 关 于 非 脊 灰 肠 道 病 毒 的 研 究 表 明 患 者 呼 吸 道 的 分 泌 物 也 具 有 感 染 性, 可 以 通 过 人 与 人 之 间 的 直 接 密 切 接 触 大 的 气 溶 胶 颗 粒 或 其 它 媒 介 引 起 疾 病 的 传 播 通 常, 脊 灰 野 病 毒 ( 与 来 源 于 OPV 的 疫 苗 相 似 株 脊 灰 病 毒 比 ) 的 流 行 根 据 地 理 位 9

19 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 置 的 不 同 有 明 显 的 季 节 性 变 化 在 热 带 和 亚 热 带 地 区 流 行 可 能 是 全 年 性 的 或 者 跟 雨 季 有 关 在 实 行 脊 灰 疫 苗 免 疫 前, 温 带 地 区 脊 灰 的 流 行 多 在 夏 季 和 秋 季, 但 是 爆 发 可 能 发 生 在 冬 季 在 实 行 OPV 常 规 免 疫 的 国 家, 总 能 发 现 脊 灰 病 毒 疫 苗 相 似 株 病 例, 疫 苗 相 似 株 病 例 也 可 在 全 国 免 疫 日 期 间 聚 集 发 生 追 踪 脊 灰 野 毒 株 流 行 的 一 个 非 常 有 力 的 工 具 就 是 临 床 分 离 物 病 毒 基 因 组 的 分 子 生 物 学 特 征 脊 灰 病 毒 在 人 类 肠 道 中 进 行 复 制 时 会 发 生 变 异 鉴 于 脊 灰 病 毒 复 制 酶 的 特 性, 病 毒 基 因 组 在 复 制 时 易 于 发 生 错 误, 这 种 错 误 以 相 对 稳 定 的 频 率 发 生, 导 致 了 脊 灰 病 毒 基 因 组 的 快 速 进 化 ( 每 年 1% 到 2% 的 核 苷 酸 发 生 变 异 ) 通 过 比 较 病 毒 株 之 间 基 因 变 异 的 程 度, 可 以 追 溯 病 毒 的 地 理 来 源 和 时 间 来 源 建 立 世 界 范 围 的 脊 灰 病 毒 基 因 序 列 数 据 库 使 快 速 追 踪 脊 灰 野 毒 株 的 来 源 成 为 可 能 1.5 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒,VDPVs OPV 病 毒 和 它 们 的 原 始 株 ( 野 毒 株 ) 基 因 序 列 不 同, 某 些 位 点 的 变 异 导 致 神 经 毒 力 的 减 弱 OPV 株 在 人 类 肠 道 中 复 制 时 能 发 生 变 异, 一 些 变 异 可 以 导 致 强 神 经 毒 力 的 回 复, 引 起 疫 苗 相 关 的 脊 髓 灰 质 炎 (VAPP) VAPP 较 少 发 生, 大 约 每 250 万 服 苗 者 中 出 现 一 例 从 OPV 服 苗 者 和 其 接 触 者 中 可 以 分 离 到 多 种 OPV 衍 生 病 毒, 通 常 这 些 人 并 不 发 生 瘫 痪 与 Sabin 株 比, 病 毒 VP1 区 基 因 序 列 的 变 化 可 以 作 为 分 子 钟 用 来 估 算 病 毒 已 持 续 复 制 了 多 长 时 间 原 则 上, 所 有 从 临 床 和 环 境 中 获 得 的 与 OPV 株 有 关 的 脊 灰 病 毒 分 离 物 都 是 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 (VDPVs) 但 是,Sabin OPV 的 衍 生 株 根 据 项 目 要 求 还 是 被 分 成 两 大 类 : OPV 相 似 株 病 毒 大 部 分 疫 苗 相 关 株 病 毒 都 属 于 疫 苗 相 似 株, 它 们 与 原 始 的 OPV 株 相 比, 有 非 常 相 似 的 基 因 序 列 (VP1 区 序 列 同 源 性 大 于 99%) 正 常 的 OPV 服 苗 者 通 常 排 毒 3-4 周, 短 暂 的 排 毒 期 和 高 覆 盖 率 的 人 群 免 疫 限 制 了 这 些 OPV 相 似 株 在 人 群 中 的 传 播 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 VDPV 株 很 少, 它 们 与 原 始 Sabin 株 比,VP1 区 序 列 同 源 性 小 于 99%, 这 种 基 因 突 变 表 明 它 们 经 过 了 长 期 的 复 制 现 已 证 实 有 两 种 VDPV 分 离 株 : 免 疫 缺 陷 VDPVs (ivdpvs) 和 循 环 VDPVs (cvdpvs) IVDPVs 许 多 年 前 人 们 就 认 识 到 疫 苗 株 能 在 B 细 胞 免 疫 缺 陷 的 病 人 体 内 长 期 复 制 10

20 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 导 言 经 现 代 分 子 生 物 技 术 鉴 定 的 第 一 例 ivdpv 分 离 株 来 自 普 通 的 免 疫 缺 陷 或 X 染 色 体 连 锁 遗 传 的 的 丙 种 球 蛋 白 缺 乏 的 患 者 一 些 ivdpv 分 离 株 与 原 始 OPV 株 相 比,VP1 区 序 列 同 源 性 为 90% 左 右, 这 表 明 慢 性 脊 灰 病 毒 感 染 已 持 续 了 10 年 或 更 久 到 2002 年 底, 全 世 界 共 发 现 了 18 名 慢 性 ivdpv 携 带 者, 但 因 为 缺 乏 对 免 疫 缺 陷 病 人 的 系 统 监 测, 这 个 数 字 可 能 是 低 估 了 现 在 还 没 有 证 据 表 明 ivdpv 能 够 从 慢 性 感 染 者 传 播 到 更 广 泛 的 人 群 中 cvdpvs cvdpvs 在 公 共 卫 生 中 的 重 要 性 第 一 次 被 认 识 到 是 在 2000~2001 年 海 地 加 勒 比 岛 发 生 Ⅰ 型 cvdpvs 爆 发 时, 一 共 确 诊 了 21 例 脊 灰 病 例 ( 其 中 2 例 死 亡 ) 当 发 现 最 初 的 两 个 分 离 株 彼 此 不 同, 但 有 相 关 性, 且 它 们 与 原 始 的 SabinⅠOPV 相 比,VP1 区 的 序 列 有 2%-3% 的 不 同 时, 怀 疑 VDPV 可 以 在 人 与 人 之 间 传 播 还 有 更 多 小 规 模 的 cvdpv 爆 发, 2001 年 在 菲 律 宾 发 生 了 Ⅰ 型 cvdpv 爆 发,2002 年 在 马 达 加 斯 加 发 生 了 Ⅱ 型 cvdpv 爆 发 还 有 一 次 爆 发 是 在 回 顾 性 调 查 中 发 现 的, 即 从 80 年 代 一 直 持 续 到 90 年 代 初 在 埃 及 发 生 的 Ⅱ 型 cvdpv 的 广 泛 流 行 引 起 cvdpv 爆 发 的 一 个 共 同 因 素 是 人 群 免 疫 力 低 下 OPV 免 疫 覆 盖 率 低 以 及 明 显 缺 乏 本 土 同 型 野 病 毒 的 流 行 其 它 的 危 险 因 素 与 典 型 的 野 病 毒 流 行 相 同, 包 括 人 口 密 集 出 生 率 高 卫 生 条 件 和 卫 生 设 施 差 及 热 带 气 候 所 有 与 爆 发 相 关 的 cvdpv 分 离 株 都 是 与 C 型 肠 道 病 毒 发 生 了 重 组 但 这 并 不 表 明 重 组 是 OPV 表 型 发 生 返 祖 的 机 制 脊 灰 病 毒 和 其 它 肠 道 病 毒 的 重 组 是 混 合 感 染 的 结 果, 重 组 的 频 率 与 肠 道 病 毒 的 携 带 率 和 混 合 感 染 的 总 次 数 有 关 有 一 点 现 在 越 来 越 清 楚, 那 就 是 任 何 正 在 循 环 的 脊 灰 病 毒 最 终 都 将 和 同 种 的 相 关 肠 道 病 毒 重 组 这 种 重 组 只 表 明 脊 灰 病 毒 发 生 了 循 环, 但 它 并 不 表 示 这 种 重 组 是 病 毒 在 人 和 人 之 间 传 染 力 增 强 所 必 需 的 因 此 考 虑 到 这 些 相 关 性 和 不 确 定 性, 如 果 一 个 疫 苗 相 关 分 离 株 核 酸 序 列 与 原 始 的 OPV 株 有 很 大 差 异 ( 大 于 1%) 并 且 有 证 据 表 明 与 C 组 的 非 脊 灰 肠 道 病 毒 发 生 重 组, 则 它 很 可 能 是 一 株 cvdpv, 该 病 例 要 进 一 步 研 究 11

21 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 第 2 部 分 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 脊 灰 实 验 室 网 络 的 主 要 职 能 是 提 供 病 毒 学 信 息, 用 于 集 中 力 量 消 灭 脊 灰, 以 及 在 发 生 输 入 病 例 的 情 况 下, 阻 断 野 毒 株 的 传 播 在 有 本 土 脊 灰 流 行 的 国 家, 实 验 室 的 任 务 是 及 时 提 供 关 于 野 毒 株 传 播 的 准 确 信 息, 用 于 指 导 免 疫 活 动, 以 消 除 脊 灰 在 已 经 阻 断 了 本 土 脊 灰 野 病 毒 传 播 的 国 家, 实 验 室 的 任 务 是 及 时 提 供 关 于 野 病 毒 从 脊 灰 流 行 国 输 入 的 准 确 信 息, 证 实 本 国 已 经 消 除 了 脊 灰 所 有 国 家 的 脊 灰 实 验 室 都 必 须 与 国 家 消 灭 脊 灰 项 目 组 密 切 配 合, 按 照 他 们 的 要 求 对 疑 似 脊 灰 病 例 做 出 快 速 准 确 的 实 验 室 诊 断 2.1 正 确 的 检 测 1989 年 世 界 卫 生 大 会 正 式 通 过 了 全 球 消 灭 脊 灰 行 动 计 划, 并 且 在 1996 年 进 行 了 修 订 (WHO/EPI/GEN/96.03) 该 计 划 阐 述 了 处 于 消 灭 脊 灰 各 个 阶 段 的 国 家 在 免 疫 监 测 实 验 室 检 测 方 面 的 首 要 任 务 实 验 室 的 首 要 任 务 就 是 从 粪 便 标 本 中 分 离 病 毒 要 尽 可 能 正 确 地 采 集 所 有 AFP 病 例 的 标 本 并 运 送 至 实 验 室 所 有 分 离 到 的 脊 灰 病 毒 应 该 由 国 家 脊 灰 实 验 室 定 型 ( 血 清 型 ), 并 尽 快 送 至 WHO 参 比 实 验 室 进 行 型 内 鉴 别 至 少 一 年 内 未 发 现 过 脊 灰 病 例 的 国 家, 出 现 任 何 野 毒 株 病 例 都 必 须 视 为 国 家 突 发 公 共 卫 生 紧 急 事 件, 要 立 即 进 行 详 细 而 专 业 的 调 查, 还 要 迅 速 地 对 所 有 脊 灰 病 毒 分 离 物 进 行 型 内 鉴 别, 并 将 结 果 上 报 到 国 家 脊 灰 项 目 组 如 果 分 离 到 脊 灰 野 毒 株, 必 须 立 即 上 报 国 家 脊 灰 项 目 组 和 世 界 卫 生 组 织 地 区 办 公 室, 并 安 排 将 分 离 物 送 至 全 球 专 项 实 验 室 (GSL) 作 基 因 序 列 分 析 要 证 实 一 个 国 家 已 经 消 除 了 脊 灰 野 毒 株, 必 须 符 合 病 例 发 现 和 调 查 的 严 格 标 准 要 12

22 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 求 至 少 三 年 内 没 有 从 瘫 痪 儿 健 康 儿 童 或 环 境 中 检 测 到 脊 灰 野 毒 株 实 验 室 应 该 提 供 详 细 的 检 测 记 录 和 书 面 证 据 以 证 明 其 严 格 遵 守 了 相 关 的 工 作 标 准, 这 样 才 能 通 年 度 认 证 所 有 的 脊 灰 病 毒 分 离 物, 不 论 来 源 如 何, 都 应 该 由 WHO 授 权 的 实 验 室 用 WHO 认 可 的 方 法 进 行 型 内 鉴 别, 以 证 明 其 不 是 野 毒 株 在 脊 灰 的 常 规 诊 断 中 不 推 荐 检 测 中 和 抗 体 因 为 该 实 验 对 可 疑 病 毒 诊 断 结 果 的 判 断 没 有 用 处, 而 且 占 用 额 外 的 时 间 及 实 验 室 场 地 在 人 群 普 及 免 疫 的 情 况 下, 血 清 抗 体 水 平 难 以 说 明 问 题, 而 且 这 种 方 法 检 测 不 出 是 野 毒 株 还 是 疫 苗 株 产 生 的 抗 体 2.2 WHO 脊 灰 实 验 室 网 络 的 结 构 和 工 作 WHO 实 验 室 行 动 计 划 概 述 了 如 何 使 所 有 国 家 的 实 验 室 工 作 都 达 到 要 求 的 策 略 和 措 施, 而 且 阐 明 了 三 级 实 验 室 网 络 的 结 构 及 职 责 : 国 家 实 验 室 (NL) 地 区 参 比 实 验 室 (RRL) 和 全 球 专 项 实 验 室 (GSL)( 如 图 2.1) 一 些 国 家 还 建 立 了 亚 国 家 实 验 室, 这 些 实 验 室 承 担 着 国 家 实 验 室 的 部 分 或 全 部 工 作, 应 视 如 国 家 实 验 室 同 等 要 求 图 2.1 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 结 构 示 意 图 全 球 专 项 实 验 室 地 区 参 比 实 验 室 国 家 和 亚 国 家 实 验 室 所 有 实 验 室 都 要 进 行 年 度 认 证, 以 证 明 其 有 能 力 完 成 在 消 灭 脊 灰 中 承 担 的 任 务 13

23 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 国 家 实 验 室 的 职 责 国 家 实 验 室 的 主 要 职 责 如 下 : 使 用 标 准 化 程 序 和 试 剂, 分 离 粪 便 标 本 中 的 脊 灰 病 毒 并 进 行 定 型 向 地 区 参 比 实 验 室 送 交 脊 灰 病 毒 分 离 物 报 告 实 验 结 果 与 EPI 病 例 调 查 人 员 合 作 配 合 和 进 行 脊 灰 野 毒 株 封 存 工 作 地 区 参 比 实 验 室 的 职 责 地 区 参 比 实 验 室 的 主 要 职 责 如 下 : 作 为 本 国 或 者 没 有 国 家 实 验 室 的 其 它 指 定 国 家 的 国 家 实 验 室 完 成 本 地 区 脊 灰 病 毒 分 离 株 的 型 内 鉴 别 工 作 下 发 参 考 物 质, 如 优 质 的 细 胞 系 和 抗 血 清 作 为 本 地 区 各 国 家 的 课 程 培 训 中 心 和 实 验 室 工 作 人 员 的 个 人 培 训 中 心 通 过 实 施 职 能 考 核 (PT), 以 及 必 要 时 如 工 作 出 现 问 题 时 亲 临 指 导 来 协 助 完 成 本 地 区 国 家 实 验 室 的 质 量 控 制 和 认 证 工 作 挑 选 一 些 脊 灰 病 毒 分 离 株 送 至 全 球 专 项 实 验 室 进 行 基 因 序 列 分 析 及 时 报 告 实 验 结 果 配 合 和 进 行 野 毒 株 封 存 工 作 与 EPI 病 例 调 查 人 员 合 作 全 球 专 项 实 验 室 的 职 责 实 验 室 网 络 中 仅 有 有 限 的 几 个 实 验 室 作 为 全 球 专 项 实 验 室 其 职 责 包 括 : 利 用 所 有 可 能 的 技 术 对 脊 灰 病 毒 分 离 株 进 行 终 末 鉴 定, 包 括 遗 传 特 征 的 鉴 定, 以 揭 示 该 毒 株 的 来 源 14

24 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 准 备 和 下 发 相 关 标 准 参 考 试 剂 和 培 训 材 料 制 备 和 下 发 职 能 考 核 标 本 派 遣 专 家 对 实 验 室 工 作 进 行 评 审 和 提 出 建 议, 并 提 供 专 业 培 训 参 与 评 估 有 关 草 案 和 参 考 物 质 的 合 作 研 究 进 行 旨 在 提 高 脊 灰 病 毒 感 染 的 诊 断 临 床 和 环 境 样 品 中 野 毒 株 的 检 测 等 实 验 方 法 的 速 度 敏 感 性 特 异 性 和 适 用 性 的 研 究 及 时 报 告 实 验 结 果 配 合 和 进 行 野 毒 株 封 存 工 作 与 EPI 病 例 调 查 人 员 合 作 2.3 网 络 内 部 的 协 调 合 作 WHO 要 求 脊 灰 实 验 室 网 络 内 部 要 协 调 合 作 WHO 的 每 个 地 区 都 有 一 个 地 区 实 验 室 协 调 员 对 本 地 区 的 实 验 室 负 责 每 个 地 区 协 调 员 负 责 向 WHO 总 部 ( 位 于 日 内 瓦 ) 的 全 球 实 验 室 协 调 员 报 告 定 期 前 馈 实 验 结 果 要 求 和 质 疑, 以 及 反 馈 分 析 结 果 释 疑 和 技 术 性 建 议, 这 两 者 达 到 了 相 互 协 调 此 外,WHO 还 协 调 着 筹 集 和 分 发 实 验 室 基 本 设 备 和 试 剂 这 样, 脊 灰 实 验 室 网 络 已 成 为 有 史 以 来 最 大 的 公 共 卫 生 实 验 室 网 络 标 本 的 采 集 和 运 输 有 效 的 病 毒 学 诊 断 有 赖 于 适 时 正 确 地 采 取 临 床 标 本 并 在 理 想 条 件 下 运 送 至 实 验 室 这 就 要 求 病 毒 学 家 流 行 病 学 家 和 临 床 医 生 密 切 合 作 周 密 计 划 明 确 责 任 以 及 进 行 专 业 培 训 一 个 典 型 的 从 现 场 采 集 和 运 输 标 本 直 至 进 入 实 验 室 网 络 系 统 的 程 序 如 图 2.2 所 示 15

25 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 图 2.2 标 本 采 集 和 运 输 流 程 图 当 地 卫 生 机 构 确 定 疑 似 病 例 (AFP) 报 告 给 国 家 监 测 中 心 国 家 脊 灰 项 目 组 安 排 采 集 粪 便 标 本 及 病 例 调 查 事 宜 病 例 分 类 或 排 除 分 配 EPID 编 码 准 备 病 例 调 查 表 准 备 实 验 室 申 请 单 安 排 麻 痹 14 天 内 采 集 双 份 粪 便 标 本 事 宜, 两 份 粪 便 标 本 的 采 集 时 间 要 间 隔 24~48 小 时 标 本 采 集 后 3 天 内 冷 藏 (4~8 ) 运 送 到 国 家 实 验 室 地 区 参 比 实 验 室 接 收 标 本, 打 开 外 包 装, 登 记 以 及 告 知 收 到 标 本 核 实 病 毒 分 离 以 及 分 离 物 定 型 ( 血 清 型 ) 结 果 完 成 型 内 鉴 别 速 将 所 有 的 野 毒 株 送 往 全 球 专 项 实 验 室 进 行 序 列 分 析 向 国 家 实 验 室 及 WHO 地 区 办 公 室 报 告 型 内 鉴 别 结 果 每 周 或 每 月 一 次 向 WHO 地 区 办 公 室 报 告 实 验 室 工 作 进 展 及 实 验 结 果 国 家 实 验 室 接 收 粪 便 标 本 打 开 外 包 装 标 本 登 记 处 理 粪 便 标 本 进 行 病 毒 分 离 和 定 型 实 验 向 国 家 监 测 中 心 报 告 病 毒 分 离 结 果 速 将 脊 灰 病 毒 分 离 株 送 往 地 区 参 比 实 验 室, 如 果 有 要 求 的 话, 送 粪 便 标 本 未 能 鉴 定 的 L20B 分 离 物 报 告 并 送 往 地 区 参 比 实 验 室 每 月 或 每 周 一 次 向 WHO 地 区 办 公 室 报 告 实 验 结 果 及 工 作 进 展 全 球 专 项 实 验 室 接 收 登 记 和 告 知 收 到 标 本 核 实 病 毒 分 离 及 定 型 结 果 完 成 基 因 序 列 分 析 向 参 比 实 验 室 WHO 地 区 办 公 室 和 WHO 总 部 报 告 实 验 结 果 16

26 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 2.4 网 络 实 验 室 的 认 证 认 证 合 格 的 实 验 室 说 明 其 有 能 力 对 临 床 和 环 境 样 本 中 可 能 存 在 的 脊 灰 野 毒 株 进 行 检 测 分 离 和 迅 速 报 告 认 证 过 程 更 是 一 个 学 习 的 过 程, 可 了 解 现 有 资 源 和 培 训 需 求, 而 且 通 过 认 证 也 可 获 得 进 步, 同 时 建 立 与 WHO 全 球 实 验 室 网 络 的 联 系 WHO 地 区 办 公 室 依 据 国 家 脊 灰 实 验 室 提 供 的 最 近 12 个 月 内 的 全 部 资 料 ( 通 常 是 从 认 证 前 13 个 月 到 认 证 前 1 个 月 ), 评 估 实 验 室 工 作 完 成 情 况, 从 而 对 之 进 行 年 度 认 证, 认 证 结 果 在 未 来 的 1 年 内 有 效 国 家 和 亚 国 家 实 验 室 的 认 证 标 准 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 中 的 国 家 和 亚 国 家 实 验 室 的 认 证 需 符 合 以 下 7 条 标 准 : 1) 收 到 AFP 标 本 后 28 天 内 报 告 实 验 结 果 及 时 率 80% 所 有 病 毒 分 离 阴 性 的 标 本 要 经 过 盲 传 两 代 共 培 养 14 天 培 养 第 一 代 就 引 起 细 胞 病 变 的 标 本 能 在 28 天 内 完 成 定 型, 而 病 变 较 晚 的 病 毒 病 毒 混 合 物 或 定 型 困 难 的 病 毒 可 能 要 超 过 28 天 才 能 报 告 实 验 结 果 2) 每 年 至 少 要 检 测 150 份 粪 便 标 本 实 验 室 每 周 都 处 理 细 胞, 以 维 持 良 好 的 细 胞 状 态, 每 年 至 少 检 测 150 份 任 何 来 源 的 粪 便 标 本 以 分 离 肠 道 病 毒, 这 种 积 极 工 作 的 实 验 室 才 符 合 此 标 准 标 本 不 足 的 实 验 室 可 以 和 EPI 人 员 合 作, 从 无 菌 性 脑 膜 炎 患 儿 高 危 地 区 健 康 儿 童 或 其 它 适 当 的 流 行 病 学 监 测 中 采 样 3) 脊 灰 病 毒 检 测 的 准 确 率 及 所 有 病 毒 分 离 物 定 型 的 准 确 率 均 90% 准 确 率 取 决 于 过 去 的 最 近 12 个 月 内 国 家 实 验 室 送 到 地 区 参 比 实 验 室 的 所 有 脊 灰 病 毒 分 离 株 检 测 结 果 的 一 致 性 4) 来 源 于 AFP 病 例 的 脊 灰 病 毒 分 离 株 定 型 后 7 天 内 送 往 地 区 参 比 实 验 室 及 时 率 80% 脊 灰 项 目 组 尽 快 获 悉 关 于 野 毒 株 或 疑 似 疫 苗 衍 生 株 的 信 息 是 非 常 重 要 的 因 此 所 有 来 源 于 AFP 病 例 及 其 接 触 者 和 其 他 疑 似 脊 灰 病 例 的 脊 灰 病 毒 分 离 株, 应 该 立 即 送 往 地 区 17

27 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 参 比 实 验 室 进 行 型 内 鉴 别 来 自 非 AFP 患 者 或 其 它 监 测 工 作 中 ( 如 环 境 样 本 ) 的 脊 灰 病 毒 也 应 该 尽 快 送 往 地 区 参 比 实 验 室 进 行 型 内 鉴 别 ( 最 好 在 定 型 后 7 天 内 送 出 ) 5) 按 照 WHO 手 册 中 规 定 的 程 序, 至 少 每 季 度 进 行 一 次 内 部 质 量 控 制, 包 括 细 胞 敏 感 性 的 评 价 最 好 能 了 解 实 验 室 中 所 有 冻 存 细 胞 的 敏 感 性, 新 复 苏 的 或 者 新 收 到 的 细 胞 也 要 对 其 敏 感 性 进 行 评 价 推 荐 至 少 在 细 胞 传 到 15 代 中 途 时 测 其 敏 感 性 已 满 15 代 的 细 胞 在 丢 弃 之 前 评 价 其 敏 感 性 能 确 保 细 胞 在 整 个 使 用 过 程 中 都 是 敏 感 的, 但 实 验 室 资 格 认 证 不 做 此 项 要 求 质 量 控 制 原 始 数 据 和 纠 正 工 作 的 概 要 应 存 档, 以 备 将 来 在 评 审 时 讨 论 6) 最 近 一 次 的 WHO 职 能 考 核 成 绩 (PT) 不 低 于 80 分 要 想 达 到 完 全 合 格, 考 核 标 本 的 检 测 结 果 必 须 在 收 到 标 本 之 日 起 28 天 内 递 交 7) 实 验 室 规 程 和 实 际 操 作 年 度 现 场 评 审 成 绩 不 低 于 80 分 对 于 连 年 获 得 高 分 的 实 验 室, 若 地 区 实 验 室 协 调 员 对 该 实 验 室 所 汇 报 的 年 度 工 作 满 意, 可 以 不 进 行 现 场 评 审 每 年 所 有 粪 便 标 本 中 非 脊 灰 肠 道 病 毒 分 离 率 : 该 率 并 不 在 认 证 标 准 之 列, 因 为 它 受 很 多 因 素 包 括 季 节 当 地 的 海 拔 高 度 和 人 群 卫 生 水 平 的 影 响 但 是 它 可 以 做 为 评 价 实 验 室 工 作 的 一 个 有 用 的 指 标, 所 以 在 评 审 时 应 该 加 以 讨 论 在 大 多 数 热 带 国 家, 每 年 非 脊 灰 肠 道 病 毒 分 离 率 一 般 都 会 在 10% 以 上 地 区 参 比 实 验 室 的 认 证 标 准 地 区 参 比 实 验 室 的 认 证 需 符 合 以 下 5 条 标 准 : 1) 收 到 来 源 于 AFP 病 例 的 脊 灰 病 毒 分 离 株 后 14 天 内 将 型 内 鉴 别 结 果 报 告 给 脊 灰 项 目 组 和 地 区 实 验 室 协 调 员 的 及 时 率 80% 如 果 定 型 是 在 该 实 验 室 中 进 行, 则 时 间 期 限 为 定 型 后 的 14 天 内 此 条 标 准 适 用 于 所 有 来 自 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 脊 灰 病 毒 分 离 株 任 何 来 源 的 脊 灰 病 毒 分 离 株 都 必 须 进 行 型 内 鉴 别, 但 是 来 源 于 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 标 本 要 优 先 处 理 2) AFP 病 例 及 其 接 触 者 中 检 测 到 野 毒 株 和 疑 似 疫 苗 衍 生 株 7 天 内 将 脊 灰 病 毒 分 离 物 送 出 测 序 的 及 时 率 80% 18

28 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 此 标 准 适 用 于 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 脊 灰 病 毒 分 离 物 消 灭 脊 灰 项 目 组 尽 快 获 知 有 关 野 毒 株 和 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 的 信 息 是 非 常 重 要 的 野 毒 株 和 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 分 离 物 必 须 立 即 送 往 全 球 专 项 脊 灰 实 验 室 进 行 序 列 分 析 3) 最 近 一 次 的 WHO 脊 灰 病 毒 型 内 鉴 别 职 能 考 核 成 绩 (PT) 不 少 于 90 分 要 想 达 到 完 全 合 格, 考 核 标 本 检 测 结 果 需 在 收 到 标 本 后 14 天 内 递 交 4) 最 近 一 次 的 WHO 脊 灰 病 毒 分 离 / 定 型 职 能 考 核 成 绩 (PT) 不 少 于 90 分 要 想 达 到 完 全 合 格, 考 核 标 本 检 测 结 果 需 在 收 到 标 本 后 28 天 内 递 交 5) 实 验 室 规 程 和 实 际 操 作 年 度 现 场 评 审 分 数 不 少 于 90 分 以 下 标 准 同 样 适 用 于 国 家 实 验 室 : 6) 收 到 AFP 标 本 后 28 天 内 报 告 实 验 结 果 及 时 率 80% 病 变 较 晚 的 病 毒 病 毒 混 合 物 或 定 型 困 难 的 病 毒 可 能 要 超 过 28 天 才 能 报 告 结 果 7) 按 照 WHO 规 定 的 程 序, 至 少 每 季 度 进 行 一 次 L20B 和 RD 细 胞 敏 感 性 的 内 部 质 量 控 制 最 好 能 了 解 实 验 室 所 有 冻 存 细 胞 的 敏 感 性, 新 复 苏 的 或 者 新 收 到 的 细 胞 也 要 对 其 敏 感 性 进 行 评 价 推 荐 至 少 在 细 胞 传 到 15 代 中 途 时 测 其 敏 感 性 已 满 15 代 的 细 胞 在 丢 弃 之 前 测 其 敏 感 性 能 确 保 细 胞 在 整 个 使 用 过 程 中 都 是 敏 感 的, 但 实 验 室 资 格 认 证 不 做 此 项 要 求 质 量 控 制 原 始 数 据 和 纠 正 工 作 的 概 要 应 存 档, 以 备 将 来 在 评 审 时 讨 论 选 择 国 家 实 验 室 进 行 型 内 鉴 别 的 认 证 标 准 按 照 WHO 的 要 求, 需 要 检 测 大 量 采 自 本 地 或 者 近 期 居 住 在 本 地 的 AFP 病 例 粪 便 标 本 的 一 些 实 验 室 要 对 实 验 室 分 离 到 的 脊 灰 病 毒 株 进 行 型 内 鉴 别, 这 些 实 验 室 既 做 病 毒 分 离 / 定 型 又 做 型 内 鉴 别, 这 将 使 野 毒 株 和 疑 似 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 的 报 告 时 间 缩 短 好 几 周 如 果 能 通 过 补 充 的 资 格 认 证, 则 证 明 从 事 型 内 鉴 别 的 国 家 脊 灰 实 验 室 有 能 力 检 测 鉴 定 和 迅 速 报 告 任 何 样 本 中 发 现 的 野 毒 株 满 足 国 家 实 验 室 认 证 的 全 部 要 求 是 型 内 鉴 别 19

29 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 实 验 室 认 证 的 前 提 条 件 认 证 过 程 更 是 一 个 学 习 的 过 程, 可 了 解 现 有 资 源 和 培 训 需 求, 而 且 通 过 认 证 也 可 获 得 进 步, 同 时 建 立 与 WHO 全 球 实 验 室 网 络 的 联 系 补 充 认 证 的 4 条 标 准 : 1) 脊 灰 病 毒 分 离 株 定 型 ( 血 清 型 ) 后 14 天 内 将 型 内 鉴 别 结 果 报 告 给 脊 灰 项 目 组 和 地 区 实 验 室 协 调 员 的 及 时 率 80% 本 条 标 准 适 用 于 所 有 来 自 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 标 本 分 离 物 对 任 何 来 源 的 脊 灰 病 毒 分 离 株 都 应 进 行 型 内 鉴 别, 但 是 来 自 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 标 本 要 优 先 处 理 2) 最 近 一 次 的 WHO 脊 灰 病 毒 型 内 鉴 别 职 能 考 核 成 绩 (PT) 不 低 于 90 分 考 核 标 本 检 测 结 果 必 须 在 收 到 标 本 后 14 天 内 递 交 3) 来 自 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 野 毒 株 和 疑 似 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 的 分 离 物 7 天 内 送 出 测 序 的 及 时 率 80% 此 标 准 适 用 于 AFP 病 例 及 其 接 触 者 的 脊 灰 阳 性 分 离 物 让 消 灭 脊 灰 项 目 组 尽 快 获 悉 有 关 野 毒 株 和 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 的 信 息 是 非 常 重 要 的 野 毒 株 和 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒 分 离 物 必 须 立 即 送 往 全 球 专 项 脊 灰 实 验 室 进 行 测 序 4) 实 验 室 操 作 规 程 和 实 际 操 作 年 度 现 场 评 审 分 数 不 少 于 90 分 全 球 专 项 实 验 室 的 认 证 各 个 全 球 专 项 实 验 室 的 专 业 职 能 并 不 相 同 一 些 实 验 室 独 立 负 责 特 定 任 务 但 是 所 有 的 全 球 专 项 实 验 室 都 同 时 担 负 着 地 区 参 比 实 验 室 的 职 能, 其 中 有 几 个 还 是 国 家 实 验 室 因 此, 以 地 区 参 比 实 验 室 的 标 准 来 认 证 全 球 专 项 实 验 室 最 恰 当 不 过 了, 但 是 它 们 应 该 做 得 更 好 这 些 实 验 室 里 精 英 汇 集, 我 们 有 理 由 相 信 他 们 不 会 辜 负 大 家 的 期 望 暂 时 合 格 的 界 定 暂 时 合 格 适 用 于 那 些 通 过 了 职 能 考 核 (PT) 但 是 不 符 合 其 余 某 条 标 准 的 实 验 室 是 否 给 予 暂 时 合 格 由 地 区 实 验 室 网 络 协 调 员 决 定 该 实 验 室 应 该 与 认 证 委 员 和 WHO 地 区 办 公 室 一 起 制 定 详 细 的 行 动 计 划, 一 年 内 解 决 问 题 一 年 后 实 验 室 必 须 接 受 再 次 认 证 20

30 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 如 果 仍 然 不 合 格, 接 下 来 的 一 年 不 能 再 评 为 暂 时 合 格, 而 只 能 定 为 不 合 格 对 于 不 合 格 的 实 验 室 报 告 的 采 自 AFP 病 例 的 所 有 标 本 检 测 结 果, 必 须 由 合 格 实 验 室 加 以 复 核 不 合 格 的 实 验 室 不 合 格 的 实 验 室 将 与 地 区 实 验 室 协 调 员 一 起 开 展 如 下 工 作 : 确 定 需 要 改 进 的 地 方 制 定 并 执 行 工 作 方 案 监 督 改 进 工 作 的 进 展 需 要 时 进 行 重 复 实 验 继 续 努 力 达 到 完 全 合 格 每 个 实 验 室 的 目 标 都 是 达 到 完 全 合 格, 但 是, 如 果 一 个 实 验 室 通 过 了 最 近 一 次 职 能 考 核 (PT), 而 未 通 过 其 余 某 条 工 作 标 准 ( 如 报 告 及 时 性 检 测 标 本 份 数 分 离 物 的 鉴 定 内 部 质 量 控 制 操 作 规 程 和 实 际 操 作 现 场 评 审 ), 这 种 情 况 下 有 可 能 被 评 为 暂 时 合 格 但 到 底 是 否 评 为 暂 时 合 格 要 由 地 区 实 验 室 协 调 员 决 定 年 度 认 证 后 6 个 月 内 仍 未 通 过 职 能 考 核 (PT) 的 实 验 室 定 为 不 合 格, 必 须 安 排 一 个 合 格 实 验 室 对 其 所 有 标 本 的 检 测 结 果 进 行 复 核 不 合 格 实 验 室 将 为 项 目 组 的 工 作 增 加 难 度 有 些 情 况 下, 经 本 国 政 府 和 WHO 地 区 主 管 的 同 意, 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 可 以 排 除 掉 这 些 实 验 室 但 有 时 是 没 有 办 法 排 除 这 些 实 验 室 的, 这 时 必 须 通 过 派 遣 专 家 亲 临 指 导 以 及 培 训 实 验 室 人 员 的 方 式, 继 续 对 这 些 实 验 室 给 予 支 持, 努 力 提 高 其 业 务 水 平 遇 到 这 种 情 况, 必 须 安 排 一 个 合 格 实 验 室 对 不 合 格 实 验 室 报 告 的 采 自 AFP 病 例 的 标 本 检 测 结 果 进 行 复 核 要 做 长 期 安 排 的 打 算, 并 且 做 好 支 持 实 验 室 工 作 及 标 本 运 输 的 准 备 实 验 室 认 证 的 责 任 分 工 国 家 和 亚 国 家 实 验 室 : 国 家 和 认 可 的 亚 国 家 实 验 室 的 认 证 工 作 由 WHO 地 区 办 公 室 负 责 脊 灰 实 验 室 网 络 地 区 协 调 员 最 好 每 年 对 所 有 的 国 家 实 验 室 和 认 可 的 亚 国 家 实 验 室 进 行 一 次 视 察 如 果 达 不 到, 应 由 实 验 室 顾 问 或 其 它 专 家 代 表 WHO 视 察 实 验 室 该 视 察 21

31 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 应 该 与 年 度 认 证 现 场 评 审 一 起 进 行 WHO 地 区 办 公 室 完 成 认 证 评 审 后 应 该 通 报 认 证 结 果 地 区 办 公 室 有 责 任 公 开 发 布 并 向 下 列 单 位 或 个 人 报 告 认 证 结 果 : 通 过 WHO 驻 本 国 办 事 处 向 国 家 政 府 报 告 国 家 监 测 部 门 或 EPI 项 目 组 的 领 导 实 验 室 所 在 单 位 的 领 导 实 验 室 主 任 WHO 全 球 网 络 实 验 室 协 调 员 地 区 参 比 实 验 室 : 地 区 参 比 实 验 室 的 认 证 工 作 由 WHO 总 部 负 责 最 好 是 WHO 全 球 实 验 室 网 络 协 调 员 由 地 区 实 验 室 网 络 协 调 员 陪 同, 对 所 有 地 区 参 比 实 验 室 进 行 现 场 评 审 如 果 达 不 到, 由 WHO/ 总 部 的 代 表 陪 同 地 区 实 验 室 网 络 协 调 员 一 起 进 行 认 证 评 审 完 成 后 WHO 总 部 应 该 通 报 认 证 结 果 WHO/ 总 部 有 责 任 公 开 发 布 并 向 下 列 单 位 或 个 人 报 告 认 证 结 果 : WHO 地 区 办 公 室 实 验 室 所 在 单 位 的 领 导 实 验 室 主 任 全 球 专 项 实 验 室 : 全 球 专 项 实 验 室 的 认 证 由 WHO 总 部 负 责 认 证 评 审 完 成 后 WHO 总 部 应 该 向 下 列 单 位 或 个 人 公 开 发 布 认 证 结 果 : WHO 地 区 办 公 室 实 验 室 所 在 单 位 的 领 导 实 验 室 主 任 现 场 认 证 评 审 的 要 求 : 国 家 实 验 室 和 认 可 的 亚 国 家 实 验 室 经 过 认 证 如 果 达 到 完 全 合 格, 并 且 连 年 符 合 WHO 实 验 室 工 作 标 准, 就 不 需 要 每 年 都 接 受 现 场 认 证 评 审 这 种 情 况 下, 如 符 合 下 列 要 求, 该 实 验 室 可 以 由 地 区 实 验 室 网 络 协 调 员 认 证 为 合 格 : 实 验 结 果 28 天 内 报 告 及 时 率 80% 22

32 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 在 消 灭 脊 灰 中 的 作 用 和 职 能 每 年 至 少 检 测 150 份 标 本 脊 灰 病 毒 分 离 株 与 地 区 参 比 实 验 室 检 测 结 果 一 致 率 90% AFP 脊 灰 病 毒 分 离 株 7 天 内 送 出 进 行 型 内 鉴 别 及 时 率 80% 最 近 一 次 WHO 认 可 的 职 能 考 核 (PT) 成 绩 不 低 于 80 分 至 少 每 季 度 进 行 一 次 内 部 质 量 控 制 在 符 合 这 些 条 件 的 情 况 下,WHO 地 区 办 公 室 应 该 向 下 列 单 位 或 个 人 通 报 认 证 结 果, 即 该 实 验 室 在 未 来 的 一 年 内 完 全 合 格, 并 且 因 其 持 续 的 良 好 表 现, 不 需 接 受 现 场 认 证 评 审 通 过 WHO 驻 本 国 办 事 处 通 报 给 国 家 政 府 国 家 监 测 部 门 或 EPI 项 目 组 的 领 导 实 验 室 所 在 单 位 的 领 导 实 验 室 主 任 WHO 全 球 实 验 室 网 络 协 调 员 是 否 进 行 现 场 认 证 评 审 由 地 区 实 验 室 网 络 协 调 员 决 定 但 即 使 是 业 务 水 平 高 超 的 国 家 实 验 室 和 认 可 的 亚 国 家 实 验 室, 也 最 好 每 三 年 至 少 接 受 一 次 现 场 认 证 评 审 23

33 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 第 3 部 分 实 验 室 质 量 保 证 3.1 实 验 室 质 量 保 证 的 基 础 实 验 室 质 量 保 证 (LQA) 指 的 是 实 验 室 工 作 的 计 划 开 展 监 督 备 案 和 汇 报 得 以 顺 利 进 行 所 需 的 的 组 织 过 程 和 条 件 实 验 室 坚 持 LQA 的 原 则 能 够 确 保 制 定 出 合 理 的 工 作 计 划, 并 为 执 行 这 些 计 划 做 好 充 分 的 准 备 LQA 提 高 了 报 告 的 完 整 性 和 准 确 性, 并 且 规 定 了 通 过 何 种 方 式, 可 以 证 明 实 验 室 工 作 是 完 善 的 在 一 个 实 验 室 中 建 立 一 套 LQA 系 统 意 味 着 要 确 定 组 织 结 构 职 责 分 工 工 作 程 序 实 施 步 骤 及 所 需 的 资 源 以 达 到 如 下 目 的 : 防 止 危 险 发 现 偏 差 纠 正 错 误 提 高 效 率 保 证 数 据 的 质 量 和 完 整 性 职 责 实 验 室 主 任 有 责 任 制 定 执 行 和 确 保 遵 守 LQA 不 过,LQA 更 是 实 验 室 全 体 人 员 的 LQA 过 程 由 如 下 要 素 构 成 : 人 员 脊 灰 实 验 室 的 工 作 人 员 必 须 具 备 相 应 的 素 质 和 经 验, 能 安 全 无 误 地 完 成 脊 灰 实 验 室 的 工 作 及 职 责 脊 灰 实 验 室 应 建 立 一 套 能 反 映 上 下 级 分 工 权 责 明 确 的 组 织 结 构 人 员 应 该 包 括 : 实 验 室 主 任 可 能 的 情 况 下, 每 个 小 组 可 任 命 一 名 组 长, 例 如 负 责 细 胞 培 养 的 组 长, 负 责 型 内 鉴 别 的 组 长 等 实 验 室 科 研 技 术 及 辅 助 人 员 行 政 支 持, 维 护, 清 洁 和 服 务 人 员 求 每 个 岗 位 应 该 有 一 份 工 作 责 任 书, 内 容 包 括 : 岗 位 职 责 学 历 要 求 和 工 作 经 验 要 24

34 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 人 员 的 分 工 人 员 的 分 工 要 无 损 于 安 全 圆 满 地 完 成 脊 灰 实 验 室 的 所 有 工 作 实 验 室 中 专 业 性 的 工 作, 如 细 胞 培 养 观 察 病 毒 培 养 中 的 致 细 胞 病 变 效 应 (CPE) 进 行 型 内 鉴 别 和 测 序, 要 求 操 作 人 员 有 一 定 的 经 验 上 述 各 项 专 业 性 工 作 至 少 需 一 名 具 有 一 年 以 上 相 关 专 业 工 作 经 验 的 人 员, 还 需 要 至 少 一 人 与 其 一 起 工 作 并 了 解 整 个 操 作, 以 便 在 缺 人 时 补 充 上 去 人 力 资 源 人 力 资 源 策 略 的 基 本 目 的 就 是 按 劳 务 市 场 的 工 资 行 情 聘 用 受 过 科 研 和 / 或 技 术 方 面 培 训 的 可 靠 人 员, 这 些 人 员 能 按 照 实 验 室 规 程 的 要 求 圆 满 完 成 本 职 工 作 实 验 室 要 根 据 需 要 及 各 组 长 的 建 议, 定 期 安 排 和 调 整 培 训 内 容, 以 扩 展 和 更 新 技 术 员 及 科 研 人 员 的 知 识 和 技 能 这 种 培 训 有 助 于 LQA 过 程 的 顺 利 进 行 所 制 定 的 继 续 教 育 方 案 既 要 包 括 实 验 室 现 场 培 训, 也 要 有 外 部 培 训 人 员 培 训 过 程 要 记 录 在 案 并 存 档 人 力 资 源 规 划 应 包 括 人 员 技 术 水 平 的 评 估 以 及 根 据 当 初 设 定 的 个 人 的 工 作 责 任 全 程 监 督 他 们 的 工 作 完 成 情 况 这 个 体 系 既 有 利 于 纠 正 工 作 人 员 的 错 误 或 缺 点, 也 可 作 为 他 们 晋 升 的 依 据 ( 如 果 他 们 的 晋 升 是 当 之 无 愧 的 ) 实 验 室 布 局 脊 灰 实 验 室 应 该 足 够 宽 敞 以 便 安 全 地 进 行 实 验 室 工 作 和 放 置 所 有 必 要 的 仪 器, 并 且 要 易 于 清 扫 和 维 护 应 该 有 足 够 多 的 房 间 以 便 将 污 染 区 和 非 污 染 区 分 开 细 胞 培 养 和 配 液 应 该 尽 可 能 的 与 其 它 实 验 室 工 作 分 开, 最 好 在 一 个 与 操 作 病 毒 和 其 它 微 生 物 的 房 间 彻 底 分 开 的 完 全 独 立 的 房 间 进 行 不 同 的 工 作 区 之 间 要 有 一 个 清 楚 的 界 限, 以 减 少 清 洁 区 被 污 染 的 机 会 如 果 可 能, 要 对 实 验 室 内 部 或 多 个 实 验 室 之 间 的 工 作 有 一 个 合 理 的 安 排, 以 最 大 限 度 地 减 少 感 染 性 材 料 运 输 的 距 离, 并 保 证 污 染 物 运 送 时 不 要 跨 越 清 洁 区 如 果 地 方 够 大, 应 该 安 排 专 门 的 区 域, 最 好 是 专 门 的 房 间 用 于 以 下 用 途 : 储 存 试 剂 和 耗 材 放 置 仪 器 和 设 备 洗 刷 准 备 和 灭 菌 ( 分 为 干 净 的 物 品 和 脏 的 物 品 ) 细 胞 培 养 标 本 的 接 收 和 登 记 处 理 标 本 标 本 的 接 种 病 毒 培 养 物 的 收 集 和 定 型 25

35 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 特 殊 操 作 档 案 的 建 立 和 管 理 行 政 管 理 区 处 理 污 染 物 和 医 疗 废 弃 物 下 面 是 实 验 区 的 基 本 要 求 : 照 明 和 通 风 系 统 应 该 根 据 操 作 的 专 门 要 求, 按 照 每 个 工 作 区 的 需 要 来 设 计 实 验 台 表 面 要 光 滑 容 易 清 洁 且 耐 腐 蚀 安 全 系 统 应 包 括 火 电 灾 害 的 应 急 设 备, 应 急 淋 浴 和 洗 眼 装 置 冷 热 水 处 理 水 真 空 气 体 蒸 汽 和 电 的 供 应 设 备 应 合 理 布 局, 即 要 保 证 工 作 中 充 足 的 供 应, 也 要 便 于 保 养 与 维 修 电 力 系 统 的 安 装 不 能 给 工 作 人 员 带 来 任 何 危 险, 电 线 不 能 跨 越 过 道 要 有 一 台 备 用 的 发 电 机 用 来 保 证 基 本 设 备 如 孵 箱 生 物 安 全 柜 和 冰 箱 等 的 正 常 运 行, 尤 其 在 供 电 不 稳 定 的 情 况 下 存 放 备 用 品 的 地 方 应 足 够 大, 能 放 下 近 期 要 用 的 物 品, 以 避 免 工 作 台 面 和 过 道 混 乱 实 验 室 工 作 区 外 应 有 一 个 方 便 的 长 期 储 物 间 可 能 的 话, 每 个 实 验 室 都 应 该 安 装 有 自 来 水 的 洗 手 池, 最 好 安 在 靠 门 的 位 置 实 验 室 中 要 有 高 压 灭 菌 器 工 作 区 外 应 该 有 存 放 日 常 服 装 个 人 物 品 及 进 食 饮 水 的 地 方 设 备 的 摆 放 及 实 验 室 的 布 局 应 该 考 虑 到 生 物 安 全 及 其 它 安 全 要 求 3.2 标 准 操 作 规 程 标 准 操 作 规 程 要 详 细 规 定 实 验 室 中 的 各 项 操 作, 以 便 : 确 保 实 验 室 各 项 工 作 的 统 一 协 调 和 可 靠 减 少 系 统 误 差 为 新 手 提 供 培 训 和 指 导 行 标 准 操 作 规 程 应 该 由 实 验 室 专 业 技 术 人 员 编 写, 直 接 主 管 修 改, 实 验 室 主 任 批 准 执 实 验 室 的 各 项 工 作 都 应 该 制 订 一 个 标 准 操 作 规 程, 例 如 : 一 般 性 的 工 作 :SOPs 的 制 订 记 录 的 修 改 制 订 操 作 手 册 汇 报 试 验 系 统 : 工 作 区 的 设 立 和 维 护 实 验 室 操 作 : 标 本 的 接 收 记 录 和 贴 标 签, 可 重 复 利 用 物 品 的 洗 刷 材 料 的 灭 菌 标 本 的 保 存 材 料 和 试 剂 贴 标 签 基 质 和 溶 液 的 配 制 26

36 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 与 人 员 相 关 的 事 宜 : 培 训 操 作 危 险 材 料 实 验 室 安 全 每 个 实 验 小 组 的 人 员 安 排 参 考 品 : 鉴 定 特 征 处 理 接 收 储 存 使 用 档 案 : 保 存 分 类 和 更 新 设 备 : 常 规 校 正 清 洁 定 期 检 修 检 测 方 法 : 实 验 室 标 本 的 处 理 和 检 测 方 法 要 严 格 遵 循 WHO 推 荐 的 实 验 方 法, 根 据 图 3.1 所 示 的 形 式 来 制 订 图 3.1 为 SOP 书 写 范 例, 图 3.2 为 SOP 流 程 图 范 例 图 3.1 SOP 的 书 写 标 题 : 说 明 性 的 文 字 代 码 : 这 个 代 码 要 表 明 如 下 各 项 - 实 验 室 名 称 - 操 作 规 程 的 编 号 - 操 作 规 程 的 版 本 号, 最 初 版 用 00 表 示 目 的 : 要 简 单 明 了 地 说 明 使 用 上 述 规 程 的 目 的 范 围 : 执 行 该 规 程 的 单 位 名 称 及 应 用 领 域 定 义 : 表 明 该 规 程 中 所 用 的 主 要 术 语 的 含 义 主 要 内 容 : 每 个 标 准 操 作 规 程 都 要 清 楚 明 了, 不 能 模 棱 两 可, 要 让 无 论 有 无 经 验 的 人 都 能 看 懂 程 序 上 的 每 一 步 都 要 详 细 说 明 可 以 借 助 流 程 图 作 为 补 充 说 明 安 全 条 件 : 这 项 内 容 应 反 映 出 保 证 SOP 正 确 执 行 的 安 全 措 施 和 条 件 使 用 危 险 化 学 试 剂 时 还 应 包 括 材 料 安 全 数 据 单 操 作 记 录 : 用 来 记 录 规 程 中 涉 及 到 的 数 据 及 测 量 值 的 表 格 或 文 档 参 考 文 献 : 用 于 制 定 SOP 的 参 考 文 献 27

37 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 图 3.2 SOP 书 写 范 例 标 题 : 细 胞 培 养 液 的 配 制 代 码 : 实 验 室 : 实 验 室 名 称 操 作 规 程 的 编 号 :3 版 本 号 :3.00( 最 初 版 ),3.01 为 第 一 次 修 订 版,3.02 为 第 二 次 修 订 版 日 期 : 版 本 发 行 日 期 作 者 :xx 先 生 目 的 : 说 明 细 胞 室 中 两 种 细 胞 系 的 培 养 液 及 其 配 制 方 法 范 围 : 该 程 序 用 于 xxx 研 究 所 脊 灰 实 验 室 细 胞 培 养 定 义 : RD 是 一 种 来 源 于 人 横 纹 肌 肉 瘤 的 细 胞 系, 对 脊 灰 和 多 种 其 它 肠 道 病 毒 敏 感 L20B 来 源 于 表 达 了 人 类 脊 灰 病 毒 受 体 的 转 基 因 小 鼠 肺 细 胞, 它 支 持 脊 灰 病 毒 的 生 长, 不 支 持 其 它 肠 道 病 毒 生 长, 具 有 选 择 性 MEM:Eagles 基 础 液 (Eagle 的 基 本 盐 溶 液 ) PBS: 磷 酸 盐 缓 冲 液 主 要 内 容 : SOP 的 详 细 说 明 安 全 条 件 : 列 出 所 有 安 全 指 导 方 针, 包 括 生 物 安 全, 化 学 品 安 全 和 废 弃 物 处 理 的 指 导 方 针 需 要 记 录 的 事 项 : 培 养 基 种 类 制 造 商 目 录 编 号 批 号 有 效 期 收 到 日 期 配 制 日 期 配 制 量 配 液 者 质 量 控 制 结 果 配 好 的 培 养 液 的 有 效 期 储 存 方 法 使 用 日 期 其 它 说 明 参 考 文 献 :WHO 脊 灰 实 验 室 手 册 28

38 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 图 3.3 SOP 流 程 图 范 例 配 液 前 准 备 新 制 的 双 蒸 水 将 粉 末 状 基 质 及 其 它 成 分 加 入 到 蒸 馏 水 中 充 分 溶 解 带 有 低 蛋 白 结 合 滤 膜, 孔 径 0.22 μ m 的 无 菌 滤 器 将 培 养 液 过 滤 到 无 菌 的 带 有 标 签 的 瓶 子 中 分 装,4 保 存, 抽 出 一 份 检 查 是 否 无 菌 有 效 的 再 次 灭 菌 ( 只 一 次 ) 无 菌 的 培 养 液 污 染 的 培 养 液 使 用 每 个 SOP 在 每 页 都 要 有 如 下 内 容 : 工 作 单 位 的 标 识 和 名 称 签 发 SOP 的 部 门 或 单 位 SOP 的 名 称 29

39 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 编 写 SOP 的 人 员 签 名 和 日 期 ( 年 月 和 日 ) 评 阅 人 的 签 名 和 日 期 ( 年 月 和 日 ) 批 准 人 的 签 名 和 日 期 ( 年 月 和 日 ) 有 效 期 评 阅 的 日 期 代 码 页 码 和 总 页 数 SOP 的 更 改 应 该 由 实 验 室 的 专 业 人 员 完 成, 直 系 主 管 修 改, 实 验 室 主 任 批 准 标 准 方 法 和 权 威 方 法 的 任 何 改 动, 在 使 用 前 都 要 通 过 以 下 几 方 面 与 更 改 前 的 方 法 进 行 比 较, 以 验 证 其 有 效 性 : 准 确 度 : 方 法 在 修 改 前 后 所 得 结 果 的 一 致 性 精 密 度 : 用 标 准 差 和 变 异 系 数 表 示 结 果 的 变 异 程 度 灵 敏 度 : 检 出 不 同 浓 度 之 间 最 小 差 异 的 能 力 重 复 性 : 在 不 同 条 件 下 所 得 结 果 的 一 致 性 和 准 确 性 特 异 性 : 方 法 在 修 改 前 后 对 结 果 可 疑 的 样 品 检 验 结 果 的 一 致 性 稳 健 性 : 在 不 同 条 件 下 都 能 得 到 准 确 和 精 密 结 果 的 能 力 3.3 文 件 文 件 是 指 质 量 手 册 标 准 操 作 规 程 指 南 表 格 报 告 分 析 手 册 和 数 据 记 录, 使 LQA 有 据 可 查 并 用 于 资 料 的 查 阅 制 定 和 修 改 文 件 应 该 由 实 验 室 质 量 保 证 或 质 保 部 门 或 指 定 人 员 来 完 成, 这 要 根 据 实 验 室 工 作 的 情 况 来 定 3.4 仪 器 和 设 备 为 了 准 确 完 成 所 有 操 作, 实 验 室 应 该 有 必 要 的 仪 器 和 设 备 表 3.1 列 出 了 WHO 脊 灰 实 验 室 所 需 设 备 新 的 仪 器 和 设 备 要 尽 可 能 让 供 应 商 或 专 业 人 员 来 安 装 和 校 准 所 有 的 手 册 和 操 作 说 明 都 应 该 放 在 操 作 者 能 拿 到 的 地 方, 并 且 应 建 立 常 规 维 修 和 校 正 的 记 录 表 所 有 使 用 者 都 要 非 常 熟 悉 操 作 维 护 和 证 明 仪 器 有 效 性 的 程 序, 以 保 证 能 正 确 的 使 用 所 有 故 障 维 护 和 有 效 性 证 实 的 情 况 都 应 该 记 录 在 案 实 验 室 应 该 有 一 份 仪 器 和 设 备 的 清 单, 内 容 如 下 : 30

40 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 名 称 品 牌 捐 赠 者 或 供 应 商 维 修 厂 家 维 修 日 期 货 号 序 列 号 型 号 和 年 份 摆 放 位 置 购 买 日 期 首 次 使 用 日 期 厂 家 手 册 备 份 表 3.1 基 本 的 实 验 室 设 备 设 备 建 议 数 量 价 格 ( 美 元 ) 大 型 高 压 灭 菌 器 ( 小 实 验 室 用 台 式 的 ) (1000) 带 变 压 器 的 天 平 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 和 备 用 滤 板 低 速 冷 冻 离 心 机 配 有 软 件 的 计 算 机 计 数 板 ~1000µl 移 液 枪 ~200µl 移 液 枪 可 重 复 使 用 的 分 装 器 传 真 机 家 用 -20 无 霜 冰 柜 标 准 孵 箱 升 液 氮 罐 低 挥 发 的 液 氮 储 存 装 置 过 滤 装 置 及 配 件 带 有 备 用 电 极 的 手 握 式 PH 计 倒 置 显 微 镜 标 准 显 微 镜

41 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 涡 旋 式 混 匀 器 灭 菌 用 的 干 烤 箱 家 用 4 冰 箱 可 加 热 的 磁 力 搅 拌 器 冷 藏 柜 的 储 存 装 置 放 16mm 管 子 的 试 管 架 温 度 计 ~100 温 度 计 玻 璃 的 双 蒸 或 三 蒸 水 装 置 去 离 子 水 装 置 ( 筒 式 ) 水 浴 箱 备 用 品 参 考 品 ( 标 准 品 ) 这 些 材 料 用 于 标 化 检 测 程 序, 保 证 重 要 操 作 的 统 一 性 例 如 用 于 细 胞 敏 感 性 试 验 或 标 化 抗 血 清 的 Sabin 参 考 株 实 验 室 里 应 该 有 一 个 登 记 册 记 录 以 下 内 容 : 参 考 品 的 名 称 供 应 者 来 源 批 号 通 过 分 析 以 确 定 该 参 考 品 符 合 规 定 的 日 期 存 放 地 点 和 条 件 使 用 的 有 效 期 保 存 形 式 ( 参 照 SOP) 登 记 册 中 应 包 括 所 有 与 参 考 品 性 质 有 关 的 信 息 常 规 每 年 一 次 要 证 实 参 考 品 的 质 量, 如 果 条 件 改 变 也 要 验 证 参 考 样 品 的 质 量 试 剂 试 剂 是 指 用 于 实 验 室 检 测 的 化 学 或 生 物 制 品 表 3.2 列 出 了 WHO 脊 灰 实 验 室 每 100 份 标 本 进 行 病 毒 分 离 所 需 的 试 剂 和 材 料 实 验 室 总 要 保 证 可 供 至 少 6 个 月 使 用 的 试 剂 储 32

42 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 备 由 于 试 剂 运 送 的 时 间 长, 一 些 地 区 运 送 困 难, 应 该 提 前 6-12 个 月 定 购 试 剂 细 胞 培 养 液 应 该 当 作 一 种 试 剂 应 该 有 一 个 登 记 册 记 录 以 下 内 容 : 参 考 品 的 名 称 供 应 者 来 源 批 号 通 过 分 析 以 确 定 该 参 考 品 符 合 规 定 的 日 期 存 放 地 点 和 条 件 使 用 的 有 效 期 保 存 方 式 ( 参 照 SOP) 登 记 册 中 应 包 括 所 有 与 参 考 品 性 质 有 关 的 信 息 常 规 每 年 一 次 要 证 实 参 考 品 的 质 量, 如 果 条 件 改 变 也 要 验 证 参 考 品 的 质 量 试 剂 的 特 征 : 试 剂 质 量 要 合 格 试 剂 应 该 是 来 自 被 推 荐 供 应 商 的 原 装 产 品 要 有 一 个 购 买 接 收 和 分 装 情 况 的 记 录, 以 保 证 前 后 批 次 试 剂 的 连 续 性 尤 其 是 那 些 需 要 提 前 准 备 的 物 质 从 库 房 领 取 试 剂 时 或 接 收 送 到 实 验 室 的 试 剂 时 要 检 查 封 口 是 否 完 整 要 记 录 检 查 人 员 的 姓 名 和 标 签 上 的 日 期 制 定 专 门 的 SOP 用 于 试 剂 的 运 输 储 存 使 用 及 操 作 试 剂 或 基 质 的 成 分 生 物 制 品 ( 血 清, 酶 标 记 物 等 ) 批 号 的 改 变 都 要 详 细 记 录 在 案 水 被 认 为 是 一 种 试 剂, 应 该 达 到 一 定 的 纯 度 或 满 足 实 验 室 的 其 它 技 术 要 求 实 验 室 要 按 照 书 面 的 操 作 规 程 或 WHO 标 准 中 所 推 荐 的 方 法 来 配 制 试 剂, 并 标 明 如 下 内 容 : 试 剂 的 名 称 浓 度 配 制 日 期 和 有 效 期 储 存 条 件 试 剂 配 制 人 员 的 名 字 33

43 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 表 3.2 对 100 份 标 本 进 行 脊 灰 病 毒 分 离 所 需 的 试 剂 和 材 料 所 需 物 品 建 议 数 量 大 概 的 价 格 ( 美 元 ) 瓶 子 60ml ml ml ml L 吸 球 ( 吸 管 过 滤 器 ) 1 个 包 装 /12 个 50 冻 存 管 (2ml) (4ml) ml 量 筒 ml 量 筒 血 清 吸 管 1ml ml ml ml ml 玻 璃 吸 管 巴 斯 德 吸 管 1 个 包 装 /1000 支 30 玻 璃 珠 1 公 斤 80 氯 仿 2 升 75 DMSO 5x5 ml ampoules 3 包 65 75cm 2 培 养 瓶 1 箱 /500 个 cm 2 培 养 瓶 1 箱 /500 个 340 两 性 霉 素 B 30 个 包 装 220 中 号 一 次 性 乳 胶 手 套 100 付 270 谷 氨 酰 胺 200g 100 Hanks BSS 10 升 60 MEM/HEPES 10 升 100 平 底 无 菌 微 量 板 50 块 150 微 量 板 封 条 PBS 1 升 30 34

44 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 青 链 霉 素 40PK 190 酚 红 25g 40 防 气 溶 胶 的 2~20ul 一 次 性 吸 尖 1000 防 气 溶 胶 的 10ul 一 次 性 吸 尖 防 气 溶 胶 的 200ul 一 次 性 吸 尖 ~20ul 单 道 可 调 移 液 器 多 道 可 调 移 液 器 ~200ul 可 调 移 液 器 ~1000ul 可 调 移 液 器 胎 牛 血 清 3 升 900 碳 酸 氢 钠 1 千 克 20 台 盼 蓝 1 个 包 装 10 冻 干 的 胰 酶 30PK x125mm 的 细 胞 培 养 管 2 箱 / 细 胞 培 养 管 帽 x85 无 菌 带 帽 的 管 子 耐 氯 仿 的 15ml 离 心 管 Versene (EDTA) 100ml 50 木 质 的 便 签 细 胞 培 养 细 胞 传 代 或 培 养 应 该 符 合 专 门 的 要 求, 包 括 传 代 次 数 孵 箱 温 度 建 议 用 的 培 养 基 和 消 化 过 程 细 胞 应 该 避 免 污 染 实 验 室 中 细 胞 培 养 应 该 按 照 书 面 的 操 作 规 程 进 行 操 作, 并 记 录 如 下 项 目 : 细 胞 名 称 来 源 和 接 收 日 期 细 胞 的 代 数 生 长 液 维 持 液 接 种 密 度 细 胞 的 冻 存 毒 株 这 些 毒 株 是 指 由 WHO 指 定 的 供 应 商 提 供 的 用 来 评 价 病 毒 学 方 法 的 标 准 毒 株, 要 由 有 经 验 的 人 员 负 责 它 们 是 纯 净 稳 定 的 病 毒 培 养 物 必 须 要 有 良 好 的 技 术 来 保 证 它 们 的 35

45 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 活 性 纯 度 稳 定 性 和 基 因 特 征, 并 且 要 保 存 在 适 当 的 温 度 感 染 性 的 野 毒 株 不 能 用 作 实 验 中 的 病 毒 对 照 3.6 实 验 室 安 全 每 个 实 验 室 都 要 有 WHO 实 验 室 生 物 安 全 手 册 (WHO/CDS/CSR/LYO/2003.4, 英 文 版 可 从 下 载 ) 该 手 册 讲 述 了 基 本 的 生 物 安 全 及 化 学 品 火 电 安 全 的 要 求, 以 保 护 人 员 社 区 和 环 境 所 有 人 员 都 应 该 熟 悉 这 本 手 册 的 内 容 并 按 照 上 面 的 要 求 去 做 所 有 新 手 在 开 始 工 作 前 都 要 被 告 知 脊 灰 实 验 室 工 作 中 存 在 的 危 险 并 确 保 这 些 人 已 阅 读 过 实 验 室 生 物 安 全 手 册 实 验 室 主 任 要 负 责 贯 彻 执 行 手 册 中 的 条 款 脊 灰 消 灭 后, 实 验 室 将 是 病 毒 的 唯 一 来 源 安 全 的 保 管 好 剩 余 的 脊 灰 病 毒 和 潜 在 的 感 染 性 材 料 是 至 关 重 要 的 实 验 室 的 野 病 毒 对 已 经 免 疫 过 的 工 作 人 员 没 有 危 险, 但 如 果 在 人 群 中 传 播 则 对 脊 灰 的 成 功 消 灭 就 是 一 个 潜 在 的 威 胁 在 脊 灰 即 将 消 灭 阶 段, 为 了 保 证 野 毒 株 和 潜 在 感 染 性 材 料 的 安 全, 脊 灰 实 验 室 应 该 按 照 全 球 行 动 计 划 中 实 验 室 野 毒 株 封 存 的 建 议, 建 立 脊 灰 二 级 生 物 安 全 水 平 脊 灰 二 级 生 物 安 全 水 平 应 该 达 到 如 下 标 准 : 规 范 的 微 生 物 学 操 作 技 术 ( 图 3.4) 设 备 达 到 基 本 的 二 级 生 物 安 全 实 验 室 标 准 ( 图 3.5) 准 入 制 度 进 入 实 验 室 的 人 员 要 完 成 脊 灰 疫 苗 的 全 程 免 疫 减 少 或 消 除 野 病 毒 的 来 源 以 降 低 它 们 潜 在 传 播 的 危 险 - 当 用 减 毒 活 疫 苗 灭 活 的 抗 原 或 非 脊 灰 肠 道 病 毒 可 以 代 替 野 毒 株, 达 到 同 样 的 目 的 时, 就 不 要 使 用 野 毒 株, 如 中 和 试 验 - 已 没 有 项 目 或 研 究 需 要 时 要 处 理 掉 所 有 的 脊 灰 病 毒 库 和 潜 在 的 感 染 性 材 料 - 不 再 保 留 脊 灰 野 毒 株 的 实 验 室 要 通 过 高 压 或 焚 烧 销 毁 所 有 感 染 物 和 潜 在 感 染 性 材 料 对 于 保 存 野 毒 株 的 实 验 室 还 要 求 : - 要 达 到 工 作 所 需 的 生 物 安 全 水 平 ( 二 级 / 三 级 生 物 安 全 脊 灰 实 验 室 ), 或 者 把 材 料 送 到 符 合 要 求 的 实 验 室, 以 使 工 作 能 安 全 地 完 成 - 用 于 实 验 的 参 考 野 毒 株 或 工 作 株 只 能 使 用 分 子 生 物 学 方 法 易 于 鉴 别 的 毒 株 - 所 有 使 用 野 毒 株 感 染 性 材 料 或 潜 在 感 染 性 材 料 的 开 放 性 操 作 都 要 在 合 格 的 Ⅰ 级 36

46 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 或 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 里 进 行 - 野 毒 株 要 单 独 储 存 在 安 全 的 限 制 出 入 的 地 方 - 存 放 野 毒 株 的 冰 箱 要 上 锁, 钥 匙 的 使 用 要 有 限 制 性 规 定 冰 箱 上 要 清 楚 标 明 内 含 野 病 毒 材 料 - 冰 箱 存 放 目 录 中 的 信 息 应 该 是 最 新 的 完 整 的 要 包 括 所 放 标 本 的 属 性 体 积 或 数 量 及 在 冰 箱 中 的 位 置 - 要 记 录 所 有 储 存 标 本 的 地 理 来 源 和 采 样 日 期 - 所 有 材 料 都 要 放 到 防 渗 漏 防 破 裂 的 二 级 容 器 中 再 放 入 冰 箱 或 从 冰 箱 中 拿 出 - 要 建 立 SOP 和 日 常 的 培 训 以 应 对 可 能 出 现 的 野 毒 株 溢 出 存 放 野 毒 株 容 器 的 泄 漏 及 一 切 可 能 造 成 野 毒 株 释 放 的 意 外 事 件 图 3.4 微 生 物 学 操 作 技 术 规 范 安 全 地 操 作 标 本 禁 止 用 嘴 吸 液 安 全 地 使 用 吸 管 和 电 动 移 液 器 避 免 感 染 性 材 料 的 扩 散 避 免 皮 肤 和 眼 睛 接 触 感 染 性 材 料 避 免 食 入 感 染 性 材 料 安 全 地 分 离 血 清 安 全 地 使 用 匀 浆 器 振 荡 器 和 超 声 波 裂 解 器 安 全 地 使 用 组 织 研 磨 器 安 全 地 维 修 和 使 用 冰 箱 安 全 地 开 启 装 有 感 染 性 材 料 的 eppendoff 管 在 操 作 中 可 能 会 与 血 液 或 感 染 性 材 料 直 接 接 触 时 要 戴 手 套 操 作 后 离 开 实 验 室 之 前 要 洗 手 在 实 验 室 内 工 作 要 穿 实 验 服 在 实 验 室 内 工 作 不 要 穿 露 脚 趾 的 鞋 食 物 和 饮 料 禁 止 放 入 实 验 室 禁 止 在 实 验 室 内 进 食 饮 水 和 吸 烟 37

47 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 图 3.5 基 本 的 二 级 生 物 安 全 装 备 要 有 足 够 的 空 间 进 行 实 验 室 操 作 清 洁 和 维 护 墙 壁 天 花 板 和 地 板 要 易 于 清 洁 照 明 要 充 足 要 有 足 够 地 方 存 放 实 验 室 常 用 的 物 品 如 果 可 能, 在 每 个 实 验 室 里 都 要 安 装 有 自 来 水 的 洗 手 池, 最 好 在 门 旁 实 验 室 所 在 的 建 筑 物 里 要 有 高 压 灭 菌 器 ( 或 合 适 的 高 压 锅 ) 工 作 区 外 要 有 存 放 日 常 服 装 和 个 人 饮 食 用 具 的 设 施 要 有 质 量 合 格 的 可 靠 的 供 水 设 备 实 验 室 用 水 和 饮 用 水 源 之 间 不 要 有 交 叉 连 接 最 好 有 一 台 备 用 发 电 机 以 备 支 持 如 孵 箱 生 物 安 全 柜 和 冰 箱 之 类 的 重 要 设 备 用 移 液 器 而 不 要 用 嘴 吸 液 进 行 下 列 操 作 时 要 使 用 生 物 安 全 柜 - 容 易 产 生 气 溶 胶 的 操 作 包 括 离 心 研 磨 搅 拌 强 烈 振 荡 和 混 合 超 声 波 裂 解 以 及 开 启 装 有 感 染 性 材 料 的 容 器 ( 这 些 容 器 的 内 部 压 力 与 外 界 不 同 ) - 处 理 高 浓 度 或 大 量 的 感 染 性 材 料 在 开 放 的 实 验 室, 高 浓 度 或 大 量 的 感 染 性 材 料 离 心 时 要 盖 上 密 封 的 安 全 盖, 开 启 盖 子 要 在 生 物 安 全 柜 中 进 行 要 用 有 螺 旋 盖 的 管 子 和 瓶 子 盛 装 阳 性 标 本 及 培 养 物 要 有 灭 菌 污 染 物 的 高 压 灭 菌 器 3.7 考 核 考 核 的 目 的 就 是 要 通 过 一 个 系 统 的 独 立 的 检 查 以 评 价 质 量 控 制 工 作 的 进 展 和 取 得 的 成 效 是 否 符 合 当 初 设 定 的 目 标, 并 确 定 这 些 工 作 是 否 适 于 达 到 预 期 的 目 标, 以 及 是 否 有 效 开 展 了 这 些 工 作 考 核 可 以 是 内 部 的, 考 核 组 成 员 可 以 是 被 考 核 地 非 直 接 责 任 人, 也 可 来 自 实 验 室 质 量 控 制 部 门 外 部 的 考 核 由 WHO 每 年 的 脊 灰 实 验 室 认 证 小 组 或 国 际 组 织 来 执 行 38

48 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 实 验 室 质 量 保 证 考 核 对 象 如 下 : 整 个 质 量 系 统 系 统 的 一 些 方 面 ( 规 程, 人 员, 设 备, 工 作 区 ) 过 程 成 果 服 务 考 核 不 应 该 和 质 量 控 制 工 作 混 淆 实 验 室 应 该 有 定 期 的 内 部 考 核 考 核 步 骤 : 1) 查 阅 资 料 2) 起 草 考 核 计 划 3) 召 开 考 核 员 与 被 考 核 地 区 的 首 次 会 议 4) 预 考 核 5) 执 行 考 核 : 面 对 面 的 考 核 按 考 核 表 进 行 考 核 现 场 考 核 6) 闭 会 7) 考 核 报 告 考 核 报 告 考 核 结 果 拟 成 报 告, 包 括 考 核 日 期 考 核 过 程 不 符 合 要 求 之 处 及 提 出 的 建 议 或 改 正 措 施 报 告 交 给 被 考 核 地 的 领 导 及 负 责 执 行 建 议 的 领 导 追 踪 检 查 如 果 考 核 不 合 格, 要 进 行 追 踪 检 查 以 保 证 改 正 措 施 的 落 实 39

49 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 第 4 部 分 细 胞 培 养 技 术 脊 灰 病 毒 学 监 测 中 所 用 的 细 胞, 其 质 量 对 于 标 准 化 脊 灰 病 毒 的 分 离 和 毒 株 性 质 的 了 解 至 关 重 要 本 章 针 对 病 毒 诊 断 中 细 胞 培 养 的 正 确 操 作 提 出 了 一 些 指 导 性 建 议 4.1 细 胞 培 养 实 验 室 的 工 作 保 持 细 胞 培 养 的 顺 利 进 行 有 赖 于 对 培 养 条 件 和 传 代 过 程 的 认 真 负 责 此 外, 对 于 细 胞 质 量 的 三 个 最 基 本 特 性 : 纯 度 真 实 性 和 稳 定 性, 也 需 严 加 注 意 纯 度 : 微 生 物 如 细 菌 和 真 菌 的 污 染 将 杀 死 细 胞 并 且 给 实 验 室 的 其 它 培 养 带 来 危 险 支 原 体 污 染 会 严 重 影 响 细 胞 的 培 养 ( 见 后 ), 因 为 这 种 污 染 不 抑 制 细 胞 生 长, 即 使 在 显 微 镜 下 观 察 也 很 难 察 觉 这 是 由 于 支 原 体 本 身 极 其 微 小, 能 够 通 过 次 微 米 过 滤 器 与 细 菌 和 真 菌 相 比, 支 原 体 污 染 比 较 容 易 蔓 延 到 其 他 培 养 中, 而 且 很 多 对 细 菌 污 染 有 效 的 抗 生 素, 支 原 体 却 并 不 敏 感 另 外, 病 毒 的 污 染 会 出 现 特 有 的 细 胞 病 变, 但 持 续 性 感 染 也 可 能 不 出 现 细 胞 病 变, 这 将 影 响 病 毒 学 监 测 的 结 果, 同 时 也 会 给 操 作 人 员 带 来 危 险 ( 例 如, 由 B95-8 和 B95a 细 胞 表 达 的 Epstein Barr 病 毒 ) 病 毒 污 染 的 检 测 花 费 昂 贵 且 耗 费 时 间, 但 是, 对 细 菌 真 菌 和 支 原 体 的 日 常 检 查 相 对 而 言 就 比 较 容 易, 并 且 会 对 细 胞 培 养 的 质 量 更 有 把 握 真 实 性 : 很 多 情 况 下, 细 胞 系 无 意 中 的 调 换 或 者 细 胞 间 的 交 叉 污 染 会 导 致 错 误 的 或 另 人 费 解 的 实 验 结 果 因 此 对 于 一 种 新 的 细 胞 系, 既 要 有 书 面 证 明, 也 要 做 证 实 实 验 证 明 其 真 实 性, 这 一 点 非 常 重 要, 以 免 日 后 枉 费 时 间 和 精 力 用 于 消 灭 脊 灰 行 动 的 所 有 细 胞 系 应 从 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 获 得 为 避 免 交 叉 污 染, 同 一 时 间 在 一 个 超 净 台 内 只 能 处 理 一 种 细 胞 ; 工 作 区 要 严 格 清 洁 并 消 毒 后 才 能 处 理 其 它 细 胞 稳 定 性 : 细 胞 连 续 传 代 超 过 一 定 的 周 期, 总 是 会 在 基 因 或 表 型 特 征 上 出 现 一 些 变 异 的 迹 象 不 同 细 胞 系 对 这 种 变 异 的 易 感 性 也 不 相 同 为 将 细 胞 老 化 的 影 响 降 到 最 低 程 度, 强 烈 建 议 所 有 用 于 脊 灰 病 毒 分 离 的 细 胞 系 最 多 连 续 传 代 15 代 后 均 需 更 换 细 胞 培 养 的 基 本 条 件 40

50 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 虽 然 病 毒 诊 断 实 验 室 的 占 地 面 积 和 细 胞 培 养 所 需 仪 器 设 备 的 花 费 应 力 求 节 省, 但 表 4.1 所 列 的 器 材 是 必 需 的 由 于 玻 璃 器 皿 的 清 洁 和 回 收 要 达 到 细 胞 培 养 的 要 求 存 在 困 难, 所 以 许 多 实 验 室 在 细 胞 培 养 中 已 经 采 用 一 次 性 塑 料 器 皿,WHO 建 议 所 有 实 验 室 在 操 作 中 应 尽 量 使 用 塑 料 器 皿 表 4.1 细 胞 培 养 必 备 器 材 器 材 数 量 蒸 气 高 压 灭 菌 器 1 带 有 变 压 器 的 电 子 天 平 1 II 级 生 物 安 全 柜 1 低 速 冷 冻 离 心 机 1 细 胞 计 数 板 2 无 菌 吸 管,1ml 1000 无 菌 吸 管,10ml 1000 无 菌 吸 管,25 ml 500 电 动 移 液 器 1 细 胞 培 养 细 颈 瓶,25 cm 细 胞 培 养 细 颈 瓶,75cm 细 胞 培 养 管,16 x 125 mm 10,000 细 胞 冻 存 管,2 ml 和 4 ml 1,000 无 菌 平 底 聚 苯 乙 烯 微 量 板 家 用 无 霜 冰 柜 1 标 准 孵 箱 1 液 氮 罐,25~30l 1 液 氮 贮 存 装 置 1 耐 高 压 的 液 体 过 滤 系 统, 以 及 配 件 2 带 有 备 用 电 极 的 手 握 式 PH 计 1 倒 置 显 微 镜 1 标 准 显 微 镜 1 旋 涡 式 搅 拌 器 1 用 于 干 热 灭 菌 的 烤 箱 1 家 用 4 冰 箱 1 41

51 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 电 磁 加 热 搅 拌 器 1 冰 柜 的 贮 物 装 置 1 16mm 试 管 的 管 架 6 玻 璃 蒸 馏 装 置 ( 双 蒸 或 三 蒸 ) 1 筒 式 去 离 子 水 装 置 实 验 室 的 布 局 和 运 转 细 胞 培 养 的 环 境 应 整 洁, 不 应 拥 挤 和 杂 乱 要 通 过 制 定 和 实 行 完 善 的 内 务 和 清 扫 制 度, 将 环 境 污 染 控 制 在 最 低 限 度 并 且 要 对 未 经 检 测 的 和 污 染 的 细 胞 进 行 单 独 处 理 ( 这 是 一 项 预 防 性 措 施 ) 可 以 采 用 下 列 重 要 原 则 和 方 法, 确 保 细 胞 培 养 实 验 室 的 良 好 运 转 : 只 有 必 要 的 人 员 才 可 进 入 细 胞 培 养 区 细 胞 培 养 区 的 一 切 都 要 以 它 的 良 好 运 转 为 目 的, 必 须 和 其 他 房 间 和 工 作 区 分 开 每 个 细 胞 培 养 区 应 布 局 合 理, 保 证 所 需 物 品 伸 手 可 得, 避 免 在 处 理 细 胞 时 离 开 生 物 安 全 柜 实 验 室 布 局 应 保 证 生 物 安 全 柜 冰 箱 孵 箱 和 离 心 机 等 之 间 要 留 出 足 够 空 隙, 以 方 便 工 作 人 员 走 动 因 为 水 池 是 微 生 物 污 染 的 一 个 来 源, 所 以 细 胞 培 养 区 应 避 免 使 用 水 池 出 于 安 全 考 虑, 液 氮 装 置 应 放 在 通 风 处 要 为 下 列 工 作 制 定 标 准 操 作 规 程 : - 废 弃 物 的 消 毒 和 处 理 ; - 仪 器 如 离 心 机 和 生 物 安 全 柜 的 消 毒 程 序 ; - 水 浴 箱 的 清 洁 和 消 毒 ; - 工 作 台 和 地 面 的 清 洁 ; - 定 期 彻 底 地 清 扫, 防 止 污 染 和 灰 尘 ( 包 括 高 处 的 台 面, 生 物 安 全 柜 外 面 仪 器 下 面 和 后 面 及 冰 箱 和 冰 柜 的 里 面 等 ); 做 好 仪 器 的 认 证 安 装 和 维 修 记 录 ; 每 个 实 验 室 应 指 定 一 名 主 要 负 责 人, 做 好 仪 器 的 维 修 和 安 全 记 录 仪 器 的 使 用 为 保 证 利 用 细 胞 能 成 功 可 信 地 分 离 病 毒, 对 于 细 胞 操 作 和 培 养 中 使 用 的 仪 器 进 行 适 当 的 校 准 和 测 试 至 关 重 要 每 个 实 验 室 都 应 为 每 个 仪 器 建 立 档 案, 包 括 该 仪 器 的 校 准 和 维 修 以 及 使 用 记 录 小 型 器 材 ( 如 吸 管 移 液 器 等 ) 应 当 专 用, 不 可 与 操 作 微 生 物 的 实 验 室 共 享 42

52 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 生 物 安 全 柜 目 前, 大 多 数 细 胞 培 养 操 作 都 在 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 中 进 行 这 种 安 全 柜 可 为 细 胞 培 养 提 供 一 个 洁 净 的 空 间, 并 且 有 助 于 保 护 操 作 者 和 环 境 水 平 层 流 柜 可 用 于 液 体 的 制 备, 但 用 于 细 胞 培 养 并 不 可 取, 因 为 会 有 细 胞 培 养 中 的 潜 在 污 染 物 吹 到 操 作 者 面 部 的 危 险 一 个 安 全 柜 的 有 效 性 取 决 于 摆 放 的 位 置 正 确 的 使 用 和 定 期 的 维 护 英 国 BS5726 标 准 中 的 规 定 在 上 述 各 方 面 都 是 一 个 良 好 的 范 例, 相 关 信 息 可 进 入 下 面 的 收 费 网 站 查 询 : 图 4.1 生 物 安 全 柜 (Ⅱ 级 ) 前 面 的 开 口 工 作 窗 排 风 HEPA 过 滤 装 置 供 风 HEPA 过 滤 装 置 后 面 的 压 力 通 风 系 统 风 机 室 内 空 气 污 染 的 空 气 HEPA 滤 过 的 空 气 侧 面 安 全 柜 应 放 置 在 远 离 房 门 和 人 员 通 过 处 在 生 物 安 全 柜 区 走 动 会 干 扰 气 流, 所 以 进 入 该 区 要 严 格 限 制, 只 有 必 需 的 人 员 才 可 进 入 当 在 安 全 柜 内 操 作 时, 要 把 对 环 境 的 污 染 和 细 胞 间 交 叉 污 染 的 可 能 性 降 到 最 低 限 度, 下 面 这 些 要 求 有 助 于 达 到 上 述 目 的 : 43

53 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 安 全 柜 在 使 用 前 和 使 用 后 均 需 运 转 10~20 分 钟 ; 在 安 全 柜 内 不 要 快 速 移 动 以 免 破 坏 气 流 ; 处 理 液 体 时 动 作 要 轻 柔, 避 免 产 生 气 溶 胶 ; 绝 不 要 同 时 处 理 一 种 以 上 细 胞 ; 安 全 柜 里 不 要 过 于 拥 挤, 且 绝 不 要 阻 塞 前 面 的 开 口 ; 工 作 区 的 布 置 要 避 免 无 菌 试 剂 和 培 养 物 相 接 触 ( 如 : 可 以 把 废 液 缸 放 在 左 边, 无 菌 的 液 体 放 在 右 边, 在 中 央 处 理 细 胞 等 ); 不 要 将 记 录 纸 记 录 薄 或 其 他 文 件 放 在 安 全 柜 内, 因 为 他 们 会 干 扰 气 流, 而 且 可 能 会 被 感 染 性 微 生 物 所 污 染 却 没 有 适 当 地 进 行 消 毒 安 全 柜 应 当 定 期 做 如 下 测 试 : 滤 板 的 完 整 性 ( 如 油 雾 试 验 ) 和 对 操 作 者 的 保 护 性 能 ( 如 碘 化 钾 释 放 试 验 ); 气 流 ; 屏 障 作 用 ( 防 护 作 用 )( 这 些 测 试 BS2756 标 准 中 有 说 明 当 安 全 柜 移 动 后 或 实 验 室 布 局 改 动 时, 应 该 由 有 经 验 的 工 作 人 员 重 新 进 行 测 试 ); 每 次 使 用 后 应 清 洁 和 消 毒 安 全 柜 的 内 表 面 ( 包 括 水 平 面 和 垂 直 面 ), 定 期 消 毒 工 作 台 下 面 的 托 盘 ( 如 每 月 一 次 ); 在 安 全 柜 不 用 时 应 关 闭 前 面 的 工 作 窗, 防 止 灰 尘 和 气 溶 胶 进 入 注 意 : 在 安 全 柜 里 面 不 要 使 用 酒 精 灯 或 类 似 的 明 火, 因 为 它 们 会 破 坏 气 流 模 式 损 坏 HEPA 过 滤 器 并 且 有 火 灾 的 危 险 ( 除 非 有 特 殊 的 要 求 ) 孵 箱 孵 箱 分 为 两 类 : 标 准 孵 箱 和 二 氧 化 碳 孵 箱 实 验 室 应 按 下 列 原 则 正 确 使 用 孵 箱 : 新 购 置 的 孵 箱 的 安 装 校 准 和 维 护 应 按 照 厂 家 的 说 明 书 进 行 ( 参 照 脊 灰 实 验 室 手 册 关 于 实 验 室 仪 器 的 3.4 部 分 ); 参 考 脊 灰 实 验 室 手 册 4.5 中 关 于 使 用 不 同 类 型 的 孵 箱 培 养 细 胞 时, 推 荐 使 用 的 培 养 基 种 类 的 内 容 ; 细 胞 培 养 用 的 孵 箱 不 准 培 养 微 生 物 或 者 用 于 操 作 生 化 标 本 ; 孵 箱 温 度 设 置 应 为 36 ; 孵 箱 内 应 放 置 温 度 计, 每 天 应 由 第 一 个 打 开 孵 箱 的 人 察 看 并 记 录 温 度, 温 度 记 录 应 存 档 ; 44

54 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 每 2~3 个 月 孵 箱 应 彻 底 清 空, 取 出 架 子, 所 有 的 一 切, 包 括 架 子 内 壁 上 面 和 下 面 都 应 彻 底 用 消 毒 剂 或 10% 漂 白 剂 清 洗, 然 后 用 干 净 的 蒸 馏 水 彻 底 清 洗 干 净, 以 防 残 存 物 腐 蚀 孵 箱 内 层 或 引 起 细 胞 毒 性, 待 所 有 物 品 干 燥 后 放 回 原 位 ; 所 有 溢 出 物 应 立 即 盖 上 并 消 毒 ; 除 上 述 的 彻 底 清 洁 外, 建 议 每 周 一 次 用 70% 酒 精 擦 拭 架 子 标 准 孵 箱 ( 无 CO 2 ): 这 种 孵 箱 简 单 有 效 可 靠, 但 要 求 放 置 于 孵 箱 的 所 有 细 胞 培 养 容 器 必 须 密 封 好, 以 确 保 细 胞 培 养 所 需 的 适 宜 的 PH 环 境, 并 防 止 培 养 液 的 蒸 发 放 在 无 CO 2 的 孵 箱 中 的 所 有 细 胞 培 养 瓶 ( 或 培 养 管 或 培 养 板 ) 必 须 密 封 好, 培 养 瓶 或 培 养 管 的 瓶 盖 必 须 拧 紧, 密 封 微 量 板 时 需 用 无 毒 性 的 密 封 带 或 把 微 量 板 放 置 于 底 部 装 有 湿 纸 的 塑 料 盒 内, 这 有 助 于 减 少 和 其 它 培 养 物 交 叉 污 染 的 危 险 二 氧 化 碳 孵 箱 这 种 孵 箱 可 为 细 胞 培 养 提 供 一 个 含 有 CO 2 (5%) 且 有 一 定 湿 度 的 细 胞 培 养 环 境 除 上 述 的 常 规 要 求 外, 还 要 考 虑 以 下 注 意 事 项 : 应 保 证 清 洁 高 品 质 CO 2 气 体 的 持 续 可 靠 的 供 应 为 了 使 湿 润 的 CO 2 气 体 和 培 养 液 之 间 能 够 有 适 度 的 气 体 流 通, 细 胞 培 养 瓶 培 养 管 或 培 养 板 不 应 密 封, 使 用 透 气 的 瓶 盖 就 更 好 了 CO 2 的 浓 度 应 该 用 富 赖 特 二 氧 化 碳 测 定 仪 ( 或 类 似 的 仪 器 ) 每 年 测 定 3-4 次, 因 为 内 设 的 浓 度 随 着 时 间 会 有 所 波 动 ; 置 于 二 氧 化 碳 孵 箱 内 的 水 盘 可 为 孵 箱 提 供 一 个 湿 润 的 环 境, 每 周 水 盘 需 彻 底 倒 空 一 次, 并 用 70% 酒 精 擦 洗 后 倒 入 无 菌 蒸 馏 水 放 回 原 位, 以 防 细 菌 和 真 菌 污 染 或 者, 也 可 以 把 厂 家 推 荐 的 抗 菌 / 抗 真 菌 剂 加 到 水 里, 但 是 许 多 化 学 品 对 细 胞 有 毒 性 腐 蚀 性 并 对 人 体 有 害 ; 除 上 述 的 清 洁 步 骤 外, 还 必 须 对 于 孵 箱 内 的 湿 度 特 别 注 意, 要 每 天 检 查 水 盘 状 况 和 箱 内 湿 度, 并 擦 掉 架 子 箱 底 和 密 封 衬 垫 上 的 水 珠, 防 止 真 菌 及 霉 菌 的 污 染 ; 孵 箱 的 温 度 二 氧 化 碳 的 浓 度 和 相 对 湿 度 需 每 日 记 录 并 存 档 纯 水 仪 高 纯 度 无 毒 的 水 对 于 细 胞 培 养 是 必 需 的 蒸 馏 法 或 其 他 纯 水 法 ( 如 去 离 子 法 ) 都 可 使 用, 但 用 于 细 胞 培 养 的 水 在 使 用 前 必 须 要 高 压 注 射 的 制 药 级 水 是 制 备 培 养 液 最 理 45

55 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 想 的 水 之 一 所 有 用 于 细 胞 培 养 的 水 最 好 是 制 好 后 立 即 使 用, 因 为 水 贮 存 在 任 何 容 器 里 纯 净 度 都 会 下 降, 除 非 水 和 容 器 都 是 无 菌 的 玻 璃 双 蒸 法 : 这 是 细 胞 培 养 中 第 一 个 被 广 泛 使 用 的 纯 水 方 法, 而 且 目 前 来 讲, 仍 然 是 一 种 有 效 的 方 法 蒸 馏 器 应 该 是 电 动 的, 第 一 次 蒸 馏 过 的 水 将 自 动 进 行 二 次 蒸 馏 蒸 馏 法 的 优 点 是 水 经 加 热 灭 菌, 纯 度 高 ; 缺 点 是 蒸 馏 过 程 中 水 量 需 求 大 产 出 慢 运 转 费 用 高 以 及 需 要 经 常 性 的 维 护 去 离 子 法 : 去 离 子 法 是 一 个 多 阶 段 的 过 程 流 入 的 水 需 经 几 歩 法 纯 化 第 一 步 通 常 是 逆 渗 透, 下 一 步 是 去 除 有 机 物 或 无 机 物 ( 活 性 碳 ), 然 后 依 据 流 入 水 的 水 质 进 行 更 进 一 步 的 纯 化, 包 括 滤 膜 过 滤 ( 去 离 子 ), 最 后 成 品 水 的 质 量 需 用 电 导 仪 来 检 查, 理 想 的 导 电 系 数 为 18 兆 欧 姆 / 厘 米 左 右 去 离 子 系 统 的 优 点 是 纯 水 产 量 高, 水 的 消 耗 低, 而 且 系 统 可 依 据 流 入 水 的 水 质 进 行 调 整 无 菌 培 养 液 和 试 剂 的 制 备 为 确 保 器 材 和 试 剂 的 无 菌 状 态, 建 议 对 所 有 热 稳 定 的 试 剂 和 器 材 组 件 进 行 高 压 灭 菌 对 于 液 体 试 剂 的 灭 菌,121 至 少 15 分 钟 压 力 15 psi 磅 (100 千 帕 ) 就 已 足 够 达 到 灭 菌 的 要 求 ; 在 高 压 袋 内 的 密 封 器 材, 温 度 要 达 到 126 才 比 较 理 想, 或 121 需 20 分 钟 高 压 灭 菌 器 应 在 温 度 降 到 80 后 再 开 启, 无 菌 的 液 体 取 出 后, 要 马 上 放 到 一 个 干 净 安 全 的 地 方 使 其 自 然 冷 却 高 压 灭 菌 器 最 好 进 行 年 度 校 准, 以 确 保 其 在 高 压 时 能 达 到 正 确 的 温 度 和 压 力 水 平 许 多 品 牌 的 高 压 条 在 100 时 即 可 激 活, 所 以 121 高 压 灭 菌 的 效 果 不 应 该 用 这 种 条 带 来 作 为 指 示 物, 但 可 选 用 孢 子 条, 孢 子 条 从 高 压 灭 菌 器 中 拿 出 后 和 未 经 处 理 的 ( 有 活 性 的 ) 条 带 平 行 接 种 于 细 菌 学 的 肉 汤 培 养 基 中 进 行 培 养, 以 鉴 定 灭 菌 的 效 果 和 所 有 关 键 设 备 一 样, 对 高 压 灭 菌 器 也 需 要 系 统 地 验 证 其 有 效 性 热 不 稳 定 性 的 试 剂 一 般 通 过 过 滤 除 菌 ( 滤 膜 孔 径 为 0.22µm), 这 个 过 程 需 无 菌 操 作, 可 以 在 层 流 柜 或 消 过 毒 的 生 物 安 全 柜 中 进 行, 以 使 滤 过 的 液 体 在 无 菌 条 件 下 进 入 无 菌 的 贮 存 容 器 中 一 些 试 剂 如 葡 萄 糖 溶 液, 有 一 定 的 耐 热 性, 也 可 采 用 高 压 灭 菌 psi 磅 (70kPa 千 帕 ) 15 分 钟 灭 菌 每 批 试 剂 的 制 备 细 节 都 应 有 记 录 ( 包 括 所 用 的 原 材 料 的 详 细 信 息 ), 并 指 明 有 效 期 在 每 批 试 剂 的 分 包 装 上, 试 剂 的 名 称 批 号 和 有 效 期 都 要 标 记 清 楚 配 制 好 的 液 体 应 避 46

56 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 光 保 存, 以 免 产 生 细 胞 毒 性 成 分 无 菌 性 的 检 验 过 滤 : 当 过 滤 结 束 时, 过 滤 器 应 进 行 气 泡 点 测 试 过 滤 结 束 时 过 滤 器 内 泵 的 压 力 增 加, 如 果 过 滤 膜 是 完 好 的, 则 在 低 于 75psi ( 500kPa ) 时 气 体 不 应 通 过 滤 膜 ( 孔 径 为 0.22µm) 如 果 滤 膜 通 过 了 气 泡 测 试, 则 需 取 过 滤 开 始 中 间 和 结 束 时 的 分 装 液 体 样 品 置 于 36 孵 育 72 小 时, 任 何 孵 育 后 呈 现 混 浊 的 液 体 样 品 都 应 丢 弃, 并 且 整 批 液 体 要 重 新 除 菌 如 果 在 贮 存 容 器 内 任 何 液 体 呈 现 混 浊, 则 整 批 液 体 都 应 弃 掉 若 需 做 更 加 彻 底 的 检 查, 需 取 有 代 表 性 的 过 滤 样 品 并 1:3 稀 释 于 有 营 养 成 分 的 肉 汤 ( 如 牛 心 浸 液 ) 和 巯 基 乙 酸 盐 溶 液 中, 然 后 每 份 一 分 为 二, 取 一 份 置 20, 另 一 份 置 36.5 孵 育 10 天, 以 未 接 种 样 品 的 培 养 基 作 平 行 对 照 例 如 吸 出 10 ml 过 滤 后 的 液 体, 其 中 5 ml 加 到 10 ml 营 养 肉 汤 内, 剩 下 的 5 ml 加 到 10 ml 的 巯 基 乙 酸 盐 溶 液 中, 将 上 述 两 种 接 种 了 样 品 的 培 养 基 再 各 分 成 两 份, 并 分 别 在 上 述 的 两 种 温 度 下 孵 育 如 果 有 任 何 呈 现 混 浊 的 迹 象, 处 理 方 法 同 上 若 在 高 压 时 对 温 度 和 灭 菌 的 时 间 加 以 监 控, 则 可 不 进 行 高 压 物 品 的 无 菌 检 查 所 有 液 体 无 论 其 以 何 种 方 法 灭 菌, 均 应 在 使 用 前 查 看 一 下 其 PH 值 颜 色 是 否 正 常, 以 及 是 否 有 污 染 的 迹 象 如 果 一 瓶 液 体 已 保 存 了 很 长 时 间, 轻 微 的 污 染 会 在 瓶 底 形 成 细 小 的 沉 淀 物 若 轻 摇 后 瓶 底 产 生 螺 旋 状 的 沉 淀, 则 表 明 瓶 内 的 液 体 已 被 污 染 并 应 丢 弃 4.2 细 胞 培 养 操 作 规 程 必 须 满 足 下 列 重 要 条 件, 以 使 细 胞 培 养 获 得 成 功 : 孵 箱 温 度 为 36 ; 细 胞 生 长 所 需 PH 范 围 为 7.2~7.4; 葡 萄 糖 和 L- 谷 氨 酰 胺 的 浓 度 对 细 胞 生 长 有 较 大 影 响, 每 种 细 胞 在 培 养 之 前 需 找 到 这 两 种 物 质 的 最 适 浓 度 ( 葡 萄 糖 和 L- 谷 氨 酰 胺 的 标 准 浓 度 分 别 为 1~4mM 和 2mM) 细 胞 生 存 所 必 需 的 某 些 无 机 离 子 氨 基 酸 和 维 生 素 来 自 基 础 生 长 液 氧 和 二 氧 化 碳 也 是 必 需 的, 其 来 源 是 向 细 胞 培 养 皿 供 应 二 氧 化 碳 和 空 气 的 混 合 气 体 ( 即 培 养 于 二 氧 化 碳 孵 箱 中 ), 或 是 细 胞 培 养 瓶 加 盖 密 封 后, 由 细 胞 代 谢 产 生 二 氧 化 碳 47

57 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 无 菌 操 作 熟 练 掌 握 无 菌 操 作 技 术 对 在 液 体 配 制 和 细 胞 培 养 中 保 持 无 菌 状 态 是 非 常 重 要 的 而 且, 针 对 培 养 材 料 中 可 能 存 在 的 感 染 性 微 生 物, 它 也 是 为 操 作 者 提 供 保 护 的 一 个 重 要 环 节 无 菌 操 作 的 要 素 如 下 : 所 有 用 于 处 理 细 胞 的 玻 璃 器 皿 及 培 养 液 都 应 灭 菌 ( 请 看 下 面 ); 避 免 溢 出 溅 出 和 产 生 气 溶 胶 ; 移 液 时 避 免 倾 倒 ; 加 液 或 换 液 时, 绝 不 要 使 细 胞 培 养 瓶 与 盛 装 培 养 液 的 容 器 口 对 口 接 触, 也 绝 不 要 用 一 支 吸 管 往 超 过 一 个 培 养 瓶 中 加 液 操 作 时 从 总 培 养 液 中 分 出 可 供 一 次 细 胞 培 养 的 用 量, 其 余 放 到 4-8 保 存 ; 各 种 细 胞 的 培 养 液 都 要 专 用 ; 在 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 中, 清 洁 的 材 料 和 污 染 的 材 料 应 分 开 放 置 ; 尽 量 减 少 培 养 液 和 细 胞 暴 露 在 空 气 中 的 机 会 ( 即 使 在 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 里 操 作 也 是 如 此 ); 操 作 时 要 先 配 制 无 菌 培 养 液 ( 比 如 先 往 基 质 液 中 加 牛 血 清 和 其 它 补 充 试 剂 ) 再 处 理 细 胞 ; 由 于 存 在 着 污 染 和 交 叉 污 染 的 危 险, 病 毒 诊 断 实 验 室 的 细 胞 最 好 在 密 封 的 容 器 中 培 养, 通 常 用 带 有 螺 旋 盖 的 管 子 或 扁 平 瓶 世 界 卫 生 组 织 建 议 全 球 网 络 实 验 室 在 从 粪 便 标 本 中 分 离 脊 灰 病 毒 时 不 要 使 用 24 孔 培 养 板 细 胞 先 用 含 10% 血 清 的 生 长 液 培 养, 形 成 完 好 的 单 层 后 需 换 成 维 持 液, 目 的 是 在 不 刺 激 细 胞 生 长 的 情 况 下 尽 量 延 长 细 胞 保 持 健 康 状 态 的 时 间 通 过 降 低 血 清 含 量 可 达 到 这 个 目 的, 通 常 血 清 浓 度 降 低 到 2% 玻 璃 器 皿 的 准 备 由 于 玻 璃 器 皿 的 清 洁 和 回 收 要 达 到 细 胞 培 养 的 要 求 存 在 困 难, 现 在 许 多 实 验 室 已 经 使 用 一 次 性 培 养 用 塑 料 制 品 如 果 实 验 室 选 择 使 用 玻 璃 器 皿, 则 必 须 确 保 所 有 玻 璃 器 皿 都 要 经 过 细 心 的 清 洗 和 灭 菌, 从 而 确 保 细 胞 免 受 瓶 壁 上 残 留 的 蛋 白 质 消 毒 剂 热 原 质 水 垢 和 其 它 物 质 的 影 响 根 据 下 面 的 原 则, 制 定 一 个 玻 璃 器 皿 的 清 洗 程 序 : 清 洗 玻 璃 器 皿 时 应 小 心 谨 慎, 以 防 破 碎 ; 在 清 洗 之 前, 应 先 高 压 净 化 或 用 0.5% 的 含 氯 消 毒 液 浸 泡 过 夜 吸 管 应 浸 在 含 氯 的 消 毒 液 中 净 化 ; 48

58 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 玻 璃 器 皿 使 用 后 要 尽 快 清 洗 ; 污 染 的 物 品 要 浸 在 含 有 消 毒 剂 或 清 洁 剂 的 容 器 里, 避 免 干 燥 及 难 于 清 洗 ; 使 用 7-X DECON 或 类 似 的 清 洁 剂 彻 底 清 洗 所 有 的 玻 璃 器 皿 这 些 清 洁 剂 易 于 冲 洗 且 没 有 残 留 ( 在 任 何 情 况 下 都 不 要 使 用 家 庭 洗 碗 盘 用 的 洗 洁 精 ); 使 用 刷 子 清 洗 玻 璃 器 皿 时, 需 定 期 检 查 刷 子 的 磨 损, 避 免 对 玻 璃 器 皿 造 成 划 痕 ; 使 用 自 来 水 冲 洗 所 有 物 品, 再 用 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 冲 洗 5-7 次 任 何 清 洁 剂 消 毒 剂 或 酸 的 残 留, 都 会 影 响 细 胞 的 生 长 ; 将 清 洗 后 的 玻 璃 器 皿 放 在 架 子 或 固 定 的 板 子 上 晾 干, 干 燥 后 需 检 查 若 在 使 用 前 发 现 瓶 壁 模 糊 或 有 明 显 的 污 点, 需 重 新 清 洗 ; 细 胞 培 养 所 用 的 玻 璃 器 皿 需 用 干 烤 箱 灭 菌, 用 小 时 来 破 坏 热 原 质, 不 能 耐 180 的 非 玻 璃 组 件 应 该 用 其 它 方 法 灭 菌, 比 如 高 压 灭 菌 灭 菌 后 的 组 件 要 在 无 菌 的 条 件 下 组 装 铬 酸 洗 液 : 一 些 污 染 严 重 的 玻 璃 器 皿 需 要 更 有 力 的 清 洗 方 法, 传 统 的 方 法 是 采 用 铬 酸 洗 液 ( 即 将 10% 重 铬 酸 钾 溶 于 25% 硫 酸 中 ) 但 铬 酸 是 一 种 不 安 全 的 对 环 境 有 害 的 物 质, 从 市 场 上 可 以 买 到 它 的 替 代 品, 如 Fisher 产 品, Contrad 70 或 VWR 产 品 Chem Solv 不 含 磷 酸 盐 的 RBS-35 PCC-54 和 N hromix ( 也 由 Fisher 代 理 ); 如 果 必 须 使 用 铬 酸 洗 液, 必 须 遵 守 有 关 使 用 浓 酸 或 酸 溶 液 的 标 准 安 全 防 范 措 施 ; 使 用 任 何 清 洁 剂 清 洗 玻 璃 器 皿, 最 后 都 应 用 自 来 水 多 次 冲 洗, 再 用 蒸 馏 水 冲 洗 几 次 以 彻 底 除 去 残 留 的 清 洁 剂 细 胞 系 的 选 择 许 多 细 胞 系 可 支 持 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 和 其 他 肠 道 病 毒 生 长 世 界 卫 生 组 织 (WHO) 建 议 所 有 怀 疑 含 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 的 标 本 均 需 接 种 到 以 下 两 种 细 胞 系 : 1.L20B 细 胞, 来 源 于 转 基 因 小 鼠 细 胞 系, 表 达 了 人 类 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 受 体 ; 2.RD 细 胞, 来 源 于 人 横 纹 肌 肉 瘤 鉴 于 它 们 对 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 的 检 测 具 有 较 高 的 敏 感 性, 仅 选 择 这 两 种 细 胞 用 于 脊 髓 灰 质 炎 的 实 验 室 内 诊 断, 可 以 使 技 术 标 准 化, 同 时 可 比 较 不 同 病 毒 实 验 室 的 实 验 结 果 建 议 地 区 参 比 实 验 室 应 从 官 方 保 存 机 构 引 进 细 胞 这 些 细 胞 应 向 日 内 瓦 WHO 49

59 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 V&B/VAM 部 申 请 国 家 脊 灰 实 验 室 可 以 向 指 定 的 地 区 参 比 实 验 室 申 请 这 些 细 胞 系 收 到 这 些 细 胞 系 后, 国 家 实 验 室 应 尽 快 在 液 氮 中 建 立 自 己 的 细 胞 库, 如 果 没 有 条 件, 可 以 用 -70 或 更 低 温 度 的 冰 柜, 但 保 存 在 -70 的 细 胞 活 性 不 会 维 持 很 长 时 间, 需 每 4~6 个 月 复 苏 一 次, 传 代 扩 大 数 量 后 再 贮 存 于 细 胞 培 养 的 准 备 工 作 收 到 的 细 胞 应 附 有 前 面 讲 过 的 能 证 明 细 胞 质 量 的 书 面 证 明 材 料 进 行 细 胞 培 养 时, 实 验 室 人 员 不 仅 要 预 防 微 生 物 污 染 细 胞, 还 必 须 避 免 细 胞 培 养 材 料 对 工 作 环 境 的 污 染 不 管 是 否 接 种 标 本, 所 有 细 胞 培 养 物 都 应 视 为 有 潜 在 危 险 性 所 有 细 胞 及 其 液 体 最 后 都 应 高 压 净 化 不 同 种 类 细 胞 间, 特 别 是 传 代 细 胞 间 交 叉 污 染 的 危 险 是 经 常 发 生 的 为 预 防 这 种 情 况, 绝 不 要 同 时 进 行 不 同 种 类 的 细 胞 培 养 若 要 操 作 不 同 种 类 的 细 胞, 应 对 工 作 区 先 进 行 彻 底 清 洁 用 于 病 毒 学 的 细 胞 培 养 液 分 为 两 种, 即 生 长 液 和 维 持 液 生 长 液 (GM) 血 清 含 量 高 ( 通 常 为 10%), 可 促 进 细 胞 迅 速 生 长 细 胞 形 成 单 层 后, 接 种 病 毒 前 应 倒 掉 生 长 液, 换 上 维 持 液 维 持 液 (MM) 血 清 含 量 低 ( 通 常 为 2%), 在 病 毒 复 制 期 间, 使 细 胞 处 于 缓 慢 生 长 同 时 维 持 代 谢 的 稳 定 状 态 胎 牛 血 清 是 首 选, 因 为 胎 牛 血 清 能 很 好 地 促 进 细 胞 生 长 且 不 含 病 毒 抑 制 物 若 用 其 它 血 清, 就 必 须 先 检 测 是 否 存 在 所 研 究 病 毒 的 抑 制 物 所 有 用 于 细 胞 培 养 的 血 清 均 需 分 钟 灭 活 细 胞 传 代 (i) L20B 细 胞 和 RD 细 胞 的 维 持 一 些 重 要 试 剂 的 制 备 细 节 请 参 阅 4.5 部 分 细 胞 培 养 中 下 列 物 品 是 必 需 的 : 细 胞 培 养 瓶 中 有 长 满 单 层 的 L20B 细 胞 或 RD 细 胞 ( 不 可 使 用 已 长 满 超 过 两 周 的 细 胞 ); 不 含 镁 离 子 和 钙 离 子 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS); 胰 蛋 白 酶 ( 胰 蛋 白 酶 / 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 ); 生 长 液 ; 50

60 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 台 盼 蓝 ( 细 胞 计 数 时 用 ); 细 胞 计 数 板 ; 细 胞 培 养 管 和 培 养 瓶 ; 无 菌 吸 管 实 验 室 操 作 技 术 规 范 同 一 时 间 只 能 操 作 一 种 细 胞 (ii) 操 作 步 骤 : 1) 检 查 细 胞 的 质 量 ( 如 是 否 为 长 满 单 层 的 健 康 细 胞 ), 并 观 察 一 下 是 否 有 污 染 2) 轻 轻 倒 掉 细 胞 培 养 瓶 内 的 生 长 液, 用 PBS 轻 洗 完 好 的 细 胞 层 两 次 3) 将 PBS 配 制 的 0.25% 的 胰 蛋 白 酶 ( 或 等 量 的 0.25% 胰 蛋 白 酶 和 1:5000 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 溶 液 ) 加 入 细 胞 单 层, 使 消 化 液 均 匀 地 分 布 在 细 胞 层 上 ( 一 个 25 cm 2 培 养 瓶 用 0.5 ml 消 化 液 即 足 够 ) 4) 把 培 养 瓶 放 到 36 孵 箱, 直 至 细 胞 从 瓶 上 脱 离 轻 拍 培 养 瓶 几 次 也 有 助 于 细 胞 的 分 离, 在 倒 置 显 微 镜 下 检 查 细 胞 是 否 已 全 部 脱 落 5) 用 生 长 液 重 悬 细 胞 ( 一 个 25 cm 2 培 养 瓶 加 入 4.5 ml 生 长 液 即 可 ), 生 长 液 中 的 血 清 可 终 止 胰 蛋 白 酶 的 作 用 用 无 菌 吸 管 轻 吹 细 胞 悬 液 数 次, 直 至 细 胞 团 被 吹 散 6) 用 生 长 液 稀 释 至 所 需 的 细 胞 浓 度, 可 用 细 胞 计 数 法 决 定, 或 按 事 先 定 好 的 分 瓶 比 例, 通 常 是 将 1 瓶 细 胞 分 成 3 瓶 (1:3) 或 更 多 瓶 当 实 验 室 引 进 一 批 新 细 胞 时, 或 培 养 液 的 主 要 成 分 ( 如 胎 牛 血 清 或 MEM) 发 生 任 何 变 化 时, 必 须 要 确 定 细 胞 在 适 当 的 时 间 内 长 满 单 层 所 需 要 的 最 适 宜 的 分 瓶 比 例 ( 由 细 胞 计 数 决 定 ) 随 着 操 作 每 种 细 胞 时 经 验 的 积 累, 分 瓶 比 例 会 变 得 显 而 易 见 7) 种 上 细 胞 后, 盖 紧 细 胞 培 养 瓶 或 培 养 管 的 盖 子, 置 于 36 孵 箱 培 养 8) 当 细 胞 接 近 长 满 单 层 时 (2~3 天 ) 改 换 成 维 持 液, 通 常 每 5~7 天 传 代 一 次, 可 按 经 验 决 定 分 瓶 比 例 表 4.2 不 同 培 养 瓶 中 L20B 和 RD 细 胞 近 似 的 接 种 体 积 及 接 种 细 胞 量 细 胞 培 养 器 皿 近 似 的 接 种 体 积 接 种 细 胞 量 ( 细 胞 总 数 ) 125 x 16 mm 培 养 管 1 ml 1 x cm 2 培 养 瓶 10 ml 1 x cm 2 培 养 瓶 25 ml 2.5 x cm 2 培 养 瓶 150ml 5 x

61 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 实 验 室 操 作 技 术 规 范 上 表 中 给 出 的 不 同 大 小 的 培 养 瓶 中 需 接 种 细 胞 悬 液 的 体 积 和 细 胞 总 数 是 一 个 指 导 但 不 同 种 类 不 同 批 次 细 胞 或 培 养 液 成 分 改 变 都 可 能 导 致 最 适 的 接 种 量 有 所 不 同, 因 而 当 引 入 新 的 细 胞 或 培 养 液 的 主 要 成 分 有 任 何 变 化 时 应 使 用 细 胞 计 数 法 来 决 定 接 种 密 度 或 分 瓶 比 例 为 病 毒 分 离 制 备 细 胞 培 养 管 时 应 该 使 用 细 胞 计 数 法, 以 确 保 单 层 细 胞 可 维 持 5-7 天, 并 且 制 备 的 不 同 批 次 的 细 胞 性 状 相 似 ( 具 有 再 现 性 ) (iii) 细 胞 传 代 也 可 采 用 以 下 操 作 步 骤 : 1) 轻 轻 倒 去 细 胞 培 养 瓶 中 的 生 长 液, 用 PBS( 不 含 钙 镁 成 分 ) 轻 洗 长 好 的 细 胞 层 2) 将 PBS 配 制 的 0.25% 的 胰 蛋 白 酶 ( 或 等 量 的 0.25% 胰 蛋 白 酶 和 1:5000 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 溶 液 ) 加 入 细 胞, 其 量 要 足 以 覆 盖 细 胞 单 层 3) 置 36 孵 箱 孵 育 至 全 部 细 胞 从 瓶 上 脱 落 ( 用 倒 置 显 微 镜 观 察 ) 4) 将 细 胞 悬 液 离 心,100g(g 不 代 表 转 数 / 分 钟, 离 心 机 转 数 的 换 算 公 式 请 查 阅 本 手 册 第 72 页 页 脚 ) 10 分 钟, 去 上 清 5) 用 生 长 液 重 悬 沉 淀 的 细 胞 至 所 需 浓 度, 可 根 据 细 胞 计 数 ( 用 台 盼 蓝 染 色 的 方 法 确 定 活 细 胞 和 死 细 胞 的 比 例 ) 或 直 接 以 1:2 至 1:8 分 瓶 培 养 孵 育 新 制 备 的 细 胞 至 形 成 细 胞 单 层 时 ( 约 2-3 天 ) 改 换 维 持 液 通 常 每 4-7 天 传 代 一 次, 一 般 以 1:6 到 1:8 的 比 例 分 瓶 培 养 实 验 室 操 作 技 术 规 范 每 次 收 到 RD 或 L20B 种 子 细 胞 后, 应 注 意 记 录 传 代 过 程 在 每 个 细 胞 瓶 上 标 明 细 胞 种 类 传 代 数 传 代 日 期 和 换 液 情 况 若 同 种 细 胞 来 源 不 同 或 接 收 时 间 不 同, 应 当 准 确 标 明 其 来 源 和 时 间, 以 备 万 一 日 后 证 明 某 种 细 胞 不 宜 使 用 时, 可 采 取 措 施 (iv) 细 胞 计 数 可 用 血 细 胞 计 数 板 ( 如 改 进 的 Neubauer 氏 板 ) 来 精 确 计 算 细 胞 悬 液 中 的 细 胞 数, 最 重 要 的 是 用 吸 管 多 次 吹 吸 以 分 散 细 胞 下 面 是 用 改 进 的 Neubauer 氏 板 计 数 细 胞 的 方 法 : 1) 在 0.2ml 台 盼 蓝 ( 含 0.1%Trypan blue 的 PBS ) 中 加 0.2ml 细 胞 悬 液, 没 有 活 性 的 细 胞 被 染 成 蓝 色 52

62 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 2) 立 即 用 微 量 巴 斯 德 (Pasteur) 吸 管 混 匀 后, 吸 足 量 细 胞 悬 液 从 血 细 胞 计 数 室 的 两 边 加 样 ; 3) 计 算 一 侧 计 数 室 四 个 角 上 每 个 三 线 包 围 的 正 方 形 中 的 活 细 胞 数, 压 线 的 细 胞 不 计 数 ( 见 图 4.2); 计 数 室 的 另 一 侧 也 按 这 个 规 则 计 算 细 胞 数 注 意 : 若 细 胞 计 数 少 于 50 则 是 不 可 靠 的 4) 如 观 察 到 明 显 的 成 片 ( 成 团 ) 细 胞, 应 重 新 悬 浮 细 胞 原 液, 重 新 计 数 ; 5) 计 算 计 数 室 4 个 角 上 正 方 形 内 活 细 胞 的 总 数 ( 注 意 : 活 细 胞 不 会 被 台 盼 蓝 染 成 蓝 色 ); 6) 计 算 另 一 半 计 数 室 4 个 角 上 正 方 形 内 活 细 胞 总 数 ; 7) 用 下 列 公 式 计 算 每 ml 悬 液 中 活 细 胞 的 数 量 : C1 =t x tb x 1/4x10 4 t = 4 个 角 上 正 方 形 内 的 活 细 胞 总 数 tb = 台 盼 蓝 的 稀 释 度 校 正 值 ( 稀 释 度 计 算 为 1/tb) 1/4 = 每 个 角 正 方 形 内 活 细 胞 平 均 值 校 正 值 10 4 = 计 量 板 转 换 系 数 C1 = 每 毫 升 内 细 胞 原 始 浓 度 例 如 : t = 480;tb = 2; C1 = 480 x 2 X 1/4 x 10 4 = 2.4 x 10 6 细 胞 / 毫 升 8) 计 算 稀 释 系 数 (d) 得 出 每 毫 升 内 细 胞 工 作 浓 度 (C2). d= C2( 工 作 细 胞 浓 度 ) C1( 原 始 细 胞 浓 度 ) 例 如 : C1 = C2 = 则 : d= C1 5 C = = = 注 :1 份 原 细 胞 悬 液 加 11 份 生 长 液 即 可 达 到 所 需 的 工 作 浓 度 ; 9) 用 生 长 液 重 悬 细 胞, 接 种 到 细 胞 瓶 或 细 胞 管 后 放 36 孵 育 大 多 数 传 代 细 胞 在 两 三 天 内 就 能 长 满 单 层 53

63 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 图 4.2. 使 用 血 细 胞 计 数 板 进 行 细 胞 计 数 ( 以 Freshney 计 数 板 为 例 ) 细 胞 悬 液 计 数 四 角 面 积 内 的 所 有 细 胞 重 要 的 注 意 事 项 : 上 述 例 子 仅 针 对 改 进 的 Neubauer 氏 板, 其 他 类 型 计 数 板 如 Bürker-Türk 会 有 自 己 相 应 的 使 用 说 明 54

64 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 这 些 计 数 板 的 重 要 不 同 之 处 在 于 : a) 板 的 深 度 : 上 述 例 子 中 为 0.1 mm, 而 一 些 其 他 类 型 则 为 0.2mm b) 每 平 方 毫 米 最 小 正 方 形 的 数 目 : 上 述 例 子 为 25 个, 每 个 正 方 形 的 边 长 为 0.2mm 但 另 外 一 些 计 数 板, 每 平 方 毫 米 有 16 个 正 方 形, 每 个 正 方 形 的 边 长 为 0.25mm 要 点 : 当 使 用 不 同 规 格 的 计 数 板 时, 每 毫 升 细 胞 悬 液 中 细 胞 数 的 计 算 需 遵 循 不 同 的 计 算 方 法 必 须 指 出 在 使 用 不 同 的 计 数 板 时, 要 查 阅 它 的 使 用 说 明 并 按 其 中 的 要 求 进 行 计 算 (v) 细 胞 的 贮 存 在 生 长 液 中 加 入 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 等 防 冻 剂, 可 使 细 胞 在 低 温 下 保 持 存 活 状 态 其 方 法 的 关 键 是 缓 慢 地 使 细 胞 降 温 至 冰 冻 状 态 ( 约 -1 / 分 ), 再 保 存 在 -70 以 下 复 苏 细 胞 时 应 迅 速 化 冻 只 有 在 -135 以 下 时 细 胞 才 可 长 期 保 存 DMSO 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 是 一 种 较 强 的 溶 剂, 它 能 促 进 吸 收, 从 而 可 把 和 它 接 触 的 任 何 有 毒 或 无 毒 的 化 合 物 或 物 质 通 过 皮 肤 带 入 体 内, 因 此 在 使 用 时 应 始 终 注 意 避 免 与 皮 肤 接 触 冻 存 细 胞 1) 取 一 瓶 生 长 良 好 的 细 胞 ( 生 长 迅 速 但 未 完 全 长 满 ); 2) 用 前 述 的 胰 蛋 白 酶 / 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 溶 液 消 化 细 胞 ( 见 部 分 ), 所 处 理 的 细 胞 量 要 足 以 使 细 胞 最 终 经 冻 存 液 稀 释 后, 密 度 可 达 到 4 x 10 6 个 细 胞 / 毫 升 ; 3) 将 细 胞 重 悬 于 生 长 液,100g( 离 心 机 转 数 的 换 算 公 式 请 查 阅 本 手 册 第 72 页 页 脚 ) 离 心 10 分 钟 ; 4) 弃 去 上 清 液, 用 预 冷 的 含 20% 胎 牛 血 清 和 10%(V/V) 二 甲 基 亚 砜 的 细 胞 生 长 液 重 悬 沉 淀 细 胞 ; 5) 取 出 0.1ml 细 胞 悬 液 以 台 盼 蓝 染 色, 用 细 胞 计 数 板 计 数 细 胞 ( 见 章 节 ); 6) 用 含 二 甲 基 亚 砜 的 细 胞 生 长 液 将 细 胞 浓 度 稀 释 成 4~8 x 10 6 / 毫 升 ( 大 长 颈 瓶 ) 或 2x 10 6 / 毫 升 ( 小 长 颈 瓶 ); 7) 分 装 细 胞 可 用 1 或 2 毫 升 的 有 外 螺 旋 盖 的 小 瓶 ( 标 明 细 胞 种 类 实 验 室 来 源 55

65 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 传 代 数 和 冻 存 时 间 ), 并 且 拧 紧 盖 子, 或 者 用 可 封 口 的 聚 丙 烯 或 玻 璃 安 瓿, 前 者 适 于 保 存 在 气 态 氮 中, 后 者 适 于 在 液 氮 内 保 存 ; 8) 缓 慢 地 使 细 胞 降 温, 以 每 分 钟 降 1 最 为 理 想 小 瓶 / 安 瓶 应 放 在 特 殊 的 液 氮 罐 里, 使 之 保 持 在 气 相 层 该 种 液 氮 罐 可 以 从 市 场 上 买 到, 而 且 它 的 说 明 书 中 应 该 指 出 实 现 这 种 降 温 方 式 需 将 小 瓶 放 置 的 高 度 容 纳 小 瓶 / 安 瓶 的 数 量 和 所 需 时 间 ( 见 4.3) 也 可 将 小 瓶 / 安 瓶 用 纸 或 棉 花 包 裹 好, 放 入 壁 厚 25mm 的 聚 丙 烯 容 器 内, 然 后 于 -70 冰 柜 过 夜 9) 将 保 存 细 胞 的 小 瓶 转 入 液 氮 气 相 层 内 (-150 ~180 ), 而 聚 丙 烯 或 玻 璃 的 封 口 安 瓿 可 置 入 液 氮 (-196 ) 贮 存 罐 内 长 期 保 存 ( 如 数 年 ) 的 细 胞 应 贮 存 在 液 氮 内 实 验 室 技 术 操 作 规 范 使 用 液 态 及 气 态 氮 贮 存 罐 时, 应 穿 能 包 住 脚 趾 的 鞋 子, 戴 上 面 罩 和 厚 手 套, 以 避 免 未 封 好 的 安 瓿 炸 裂 和 液 氮 溅 出 发 生 灼 伤 图 4.3 控 制 细 胞 冷 却 的 装 置 ( 以 Freshney 为 例 ) 隔 离 定 位 环 隔 离 层 安 瓿 冷 冻 器 颈 部 液 氮 面 注 : 定 位 环 是 用 来 调 节 安 瓿 在 液 氮 罐 颈 部 位 置 高 低 的, 这 关 系 到 冻 结 的 速 度 56

66 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 复 苏 细 胞 1) 从 液 氮 或 气 态 氮 中 取 出 小 瓶 / 安 瓶 后, 立 即 放 入 36 水 浴, 或 最 好 放 到 盛 有 36 无 菌 水 的 烧 杯 中 ; 2) 当 完 全 化 冻 后, 用 酒 精 擦 拭 小 瓶 / 安 瓶 的 表 面, 以 减 少 细 菌 污 染 将 细 胞 悬 液 转 入 细 胞 培 养 瓶 中, 缓 慢 地 逐 滴 加 入 足 量 生 长 液 供 形 成 细 胞 单 层 ( 如 果 冻 存 的 细 胞 浓 度 为 4x10 6 / 毫 升, 则 1 毫 升 悬 液 中 所 含 的 细 胞 量 就 足 以 在 一 个 或 两 个 75cm 2 的 长 颈 瓶 中 培 养 ), 若 生 长 液 加 得 太 快 将 严 重 影 响 化 冻 细 胞 的 生 存 能 力 ; 3) 孵 育 至 细 胞 贴 壁 (6-8 小 时 ), 或 36 过 夜 ; 4) 小 心 地 倾 去 培 养 液 ( 以 除 去 剩 余 的 二 甲 基 亚 砜 ) 并 加 入 新 鲜 的 生 长 液 ; 也 可 将 化 冻 的 细 胞 悬 液 缓 慢 地 加 入 生 长 液 至 10ml,80g 离 心 10 分 钟 倾 去 上 清, 加 入 足 量 生 长 液 供 形 成 细 胞 单 层, 放 入 36 孵 箱 培 养 图 4.4 液 态 及 气 态 氮 贮 存 罐 ( 以 Freshney 为 例 ) 液 相 保 存 气 相 保 存 中 度 容 量 中 度 容 量 低 挥 发 性 高 挥 发 性 将 安 瓿 放 在 架 上 贮 存 于 罐 中 将 安 瓿 放 在 架 上 贮 存 于 罐 中 ( 或 将 安 瓿 放 入 抽 屉 装 置 ) 细 胞 库 的 建 立 病 毒 实 验 室 研 究 脊 灰 病 毒 推 荐 使 用 RD 和 L20B 传 代 细 胞 系, 这 两 种 细 胞 已 经 过 生 物 57

67 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 性 状 鉴 定 并 证 明 为 无 细 菌 支 原 体 和 感 染 性 病 毒 污 染 地 区 参 比 实 验 室 (RRL) 应 从 官 方 保 存 机 构 引 进 细 胞, 索 取 这 些 细 胞 系 应 向 日 内 瓦 的 WHO V&B/VAM 提 出 申 请 现 已 要 求 很 多 RRL 建 立 每 种 细 胞 的 主 细 胞 库 (WCB), 通 过 规 范 的 实 验 技 术 对 细 胞 进 行 传 代 和 贮 存, 这 样 就 可 直 接 向 其 管 辖 范 围 内 的 国 家 实 验 室 提 供 细 胞 如 有 条 件, 强 烈 鼓 励 国 家 实 验 室 在 液 氮 和 气 态 氮 中 保 存 细 胞 作 为 自 己 的 工 作 细 胞 库 (WCB) 表 4.2 概 述 了 如 何 建 立 主 细 胞 库 和 工 作 细 胞 库 建 立 细 胞 库 的 优 点 为 : 尽 量 减 少 了 从 主 管 单 位 获 得 细 胞 的 运 输 费 ; 参 比 实 验 室 作 为 主 细 胞 库 能 贮 存 受 到 严 格 控 制 的 细 胞 株 ; 国 家 实 验 室 可 就 近 从 主 细 胞 库 获 得 优 质 细 胞 若 条 件 具 备 还 应 鼓 励 国 家 实 验 室 也 贮 存 细 胞, 建 立 自 己 的 细 胞 库 ( 工 作 细 胞 库 ) 供 自 身 使 用 图 4.5 细 胞 库 的 建 立 从 WHO 的 官 方 保 存 机 构 获 得 细 胞 建 库 第 一 代 1 瓶 细 胞 (75 平 方 厘 米 ) 第 二 代 2 瓶 细 胞 (150 平 方 厘 米 ) 第 三 代 8 瓶 细 胞 (150 平 方 厘 米 ) 液 氮 冻 存 15 小 瓶 细 胞, 每 瓶 含 4 ~ 8 x 10 6 个 细 胞 参 比 实 验 室 的 主 细 胞 库 从 主 细 胞 库 获 得 细 胞 第 四 代 1 瓶 细 胞 (75 平 方 厘 米 ) 第 五 代 2 瓶 细 胞 (150 平 方 厘 米 ) 第 六 代 8 瓶 细 胞 (150 平 方 厘 米 ) 液 氮 冻 存 15 小 瓶 细 胞, 每 瓶 含 4 ~ 8 x 10 6 个 细 胞 国 家 实 验 室 的 工 作 细 胞 库 1 小 瓶 细 胞 培 养 后 用 于 常 规 实 验 1 小 瓶 细 胞 培 养 后 用 于 常 规 实 验 58

68 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 4.3 培 养 病 毒 和 细 胞 的 培 养 液 及 有 关 试 剂 注 意 : 必 须 全 部 使 用 分 析 纯 级 试 剂 1) 磷 酸 盐 缓 冲 液,PH7.2~7.4 (PBS) 这 是 细 胞 分 散 前 冲 洗 细 胞 最 简 单 的 基 础 盐 溶 液, 完 全 或 不 完 全 PBS 都 有 商 品 供 应 不 完 全 PBS 不 含 Ca 2 + Mg 2+ 离 子 ; 完 全 PBS 主 要 用 于 标 本 制 备 及 病 毒 的 稀 释,Ca 2 + Mg 2+ 离 子 的 存 在 有 助 于 病 毒 的 稳 定, 尤 其 是 对 脊 灰 及 其 他 肠 道 病 毒 A 液 氯 化 钠 NaCl 8.00 g 氯 化 钾 KCl 0.20 g 磷 酸 氢 二 钠 ( 无 水 的 ) Na 2 HPO g 磷 酸 二 氢 钾 KH 2 PO g 将 上 述 药 品 溶 于 600~800 ml 蒸 馏 水 中, 加 入 2 ml 0.4% 的 酚 红 作 为 指 示 剂, 加 蒸 馏 水 补 至 1000ml,10 磅 高 压 灭 菌 15 分 钟, 此 为 不 完 全 PBS B 液 氯 化 镁 MgCl 2.6H2O 0.10 g 溶 于 100 ml 蒸 馏 水 中,10 磅 15 分 钟 高 压 灭 菌 C 液 氯 化 钙 CaCl g 溶 于 100 ml 蒸 馏 水 中,10 磅 15 分 钟 高 压 灭 菌 完 全 PBS 的 工 作 溶 液 8 份 A 液 +1 份 B 液 +1 份 C 液 若 使 用 商 品 化 片 剂 或 粉 末 状 成 品, 则 依 据 厂 家 的 说 明 配 制 和 灭 菌 2) (NaHCO 3 ) 溶 液 碳 酸 氢 钠 溶 液 在 许 多 种 细 胞 培 养 液 中 与 气 态 CO 2 组 成 了 一 个 缓 冲 系 统, 它 本 身 也 是 代 谢 所 需 的 成 分 碳 酸 氢 钠 NaHCO g 溶 于 50 ml 蒸 馏 水 中, 加 0.4% 酚 红 0.2 ml, 加 蒸 馏 水 补 至 100 ml, 再 加 入 CO 2 至 颜 色 变 成 橙 色, 分 装 成 大 约 5ml 一 小 瓶, 盖 紧 瓶 盖,10 磅 15 分 钟 高 压 灭 菌 59

69 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 3) Eagle s 生 长 液 (GM) 和 Eagle s 维 持 液 (MM) 在 CO 2 存 在 的 情 况 下, 用 于 培 养 RD 及 L20B 细 胞 生 长 液 维 持 液 Eagle s 液 (MEM) 83.3 ml 90.3 ml L- 谷 氨 酰 胺 200 mm 1.0 ml 1.0 ml 胎 牛 血 清 10.0 ml 2.0 ml 7.5%NaHCO 3 溶 液 3.5 ml 4.5 m HEPES 1M 1.0 ml 1.0 ml P.S 溶 液 *( 青 霉 素 及 链 霉 素 ) 1.0 ml 1.0 ml 0.4% 酚 红 0.2 ml 0.2 ml * 将 1X10 6 个 单 位 的 结 晶 青 霉 素 G 和 1 g 链 霉 素 硫 酸 盐 溶 于 100 ml 无 菌 PBS 中, 过 滤 除 菌, 分 装 成 每 5 ml 一 小 瓶, 贮 存 在 -20 C 用 时 在 100ml 培 养 液 中 加 入 1ml 母 液, 使 终 浓 度 每 毫 升 含 青 霉 素 100 单 位 链 霉 素 100ug 即 可 实 验 室 操 作 技 术 规 范 一 些 厂 家 的 基 础 培 养 基 中 已 添 加 了 补 充 试 剂 ( 如 HEPES 和 L- 谷 氨 酰 胺 ), 所 以 再 往 其 中 添 加 补 充 试 剂 之 前, 应 查 阅 厂 家 的 说 明 书 L- 谷 氨 酰 胺 不 稳 定, 它 在 培 养 液 中 的 半 衰 期 4 时 约 为 3 周,36 约 为 1 周, 灭 菌 的 L- 谷 氨 酰 胺 分 装 后 应 置 于 -20 冻 存 备 用 4) Hanks s 生 长 液 和 维 持 液 用 于 RD 和 L20B 细 胞 系 培 养, 系 统 为 密 闭 的 ( 拧 紧 盖 子 的 管 或 瓶 ), 不 需 CO 2, 故 标 准 孵 箱 即 可 GM MM 最 低 量 基 础 液 85.3 ml 92.3 ml ( 不 加 碳 酸 氢 钠 的 Hank's 基 础 盐 溶 液 ) L- 谷 氨 酰 胺 200 mm 1.0 ml 1.0 ml 胎 牛 血 清 10.0 ml 2.0 ml NaHCO3 溶 液 7.5% 1.5 ml 2.5 ml HEPES 1M 1.0 ml 1.0 ml P.S 溶 液 1.0 ml 1.0 ml 0.4% 酚 红 0.2 ml 0.2 ml 60

70 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 5) 其 他 抗 生 素 青 霉 素 和 链 霉 素 是 细 胞 和 病 毒 培 养 中 最 常 用 的 抗 菌 素, 价 格 也 最 便 宜 庆 大 霉 素 较 贵, 但 抗 菌 谱 很 广, 而 且 可 以 高 压 灭 菌 庆 大 霉 素 应 以 终 浓 度 50ug/ml 使 用 25 单 位 /ml 的 制 霉 菌 素 对 霉 菌 和 酵 母 菌 污 染 有 作 用, 但 它 只 是 抑 菌 剂 而 非 杀 菌 剂, 在 36 ( 细 胞 培 养 的 温 度 ) 迅 速 失 去 活 力, 而 且 有 些 批 号 的 产 品 对 细 胞 有 轻 微 的 毒 性 作 用 两 性 霉 素 B 也 经 常 会 产 生 细 胞 毒 性 效 应 6) 细 胞 消 化 剂 胰 酶 和 Versene (EDTA) 常 单 独 或 一 起 使 用 胰 酶 尤 其 适 于 从 器 官 组 织 中 消 化 细 胞, 它 也 用 于 从 玻 璃 和 塑 料 瓶 壁 上 消 化 细 胞 Versene (EDTA) 也 同 样 可 以 应 用 胰 酶 或 Versene (EDTA) 应 该 在 没 有 钙 和 镁 离 子 存 在 的 PBS 中 制 备 因 为 这 些 离 子 的 存 在 可 以 增 加 细 胞 间 质 的 稳 固 性, 使 细 胞 难 以 从 玻 璃 / 塑 料 瓶 壁 上 消 化 下 来 胰 蛋 白 酶 溶 解 1 g Difco 1:250 胰 蛋 白 酶 于 400 ml 无 钙 镁 离 子 的 PBS 中,36 电 磁 搅 拌 30 分 钟, 通 过 滤 膜 过 滤 ( 孔 径 0.22 µm), 分 装 成 每 瓶 大 约 5 ml, 密 封 瓶 口,-20 保 存 Versene: (EDTA = 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 ) 溶 解 0.1 g Versene 于 10 ml 蒸 馏 水 中, 以 每 小 瓶 0.5 ml 的 容 量 分 装 于 密 封 瓶 中,10 磅 高 压 15 分 钟 灭 菌, 室 温 保 存 用 时 加 0.4 ml 这 种 溶 液 于 20 ml 没 有 钙 镁 离 子 的 PBS, 配 成 终 浓 度 为 0.02% 的 溶 液 7) 酚 红 指 示 剂 是 细 胞 培 养 中 的 PH 指 示 剂, 用 蒸 馏 水 制 备 成 0.4%(W/V) 的 母 液, 分 装 于 小 瓶 后 10 磅 15 分 钟 灭 菌, 室 温 保 存 制 备 培 养 液 通 常 是 1000ml 中 加 入 1~2 ml 酚 红 指 示 剂 4.4 细 胞 培 养 中 的 问 题 : 鉴 定 和 淘 汰 细 胞 过 早 老 化 细 胞 过 早 老 化 的 问 题, 在 使 用 细 胞 培 养 管 时 比 用 细 胞 培 养 瓶 时 更 为 常 见 细 胞 老 化 会 导 致 细 胞 变 圆 并 从 培 养 容 器 壁 上 脱 落 细 胞 老 化 最 常 见 的 原 因 为 : 接 种 的 细 胞 密 度 过 大 ; 没 有 在 适 宜 的 时 间 将 生 长 液 换 成 维 持 液 ; 或 者 是 使 用 的 胎 牛 血 清 质 量 不 好 或 浓 度 太 高 由 于 细 胞 迅 速 分 裂 繁 殖, 耗 尽 了 生 长 液 中 的 营 养 成 分, 并 造 成 酸 性 生 长 条 件, 引 起 细 胞 过 早 死 亡 最 适 宜 的 细 胞 接 种 量 和 生 长 条 件 在 不 同 细 胞 系 间 和 不 同 批 次 的 细 胞 间 很 可 能 是 有 差 异 的 在 脊 灰 病 毒 的 检 测 中, 细 胞 过 早 老 化 的 问 题 应 加 以 注 意, 因 为 这 将 降 61

71 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 低 对 病 毒 的 敏 感 性, 而 且 很 容 易 被 误 认 为 是 病 毒 引 起 的 细 胞 病 变 细 胞 老 化 的 问 题 通 常 可 由 适 当 调 整 细 胞 接 种 量 或 者 胎 牛 血 清 的 浓 度 来 解 决 因 此, 实 验 室 要 创 造 条 件, 使 细 胞 至 少 维 持 5~7 天 不 出 现 老 化 细 胞 系 之 间 的 交 叉 污 染 细 胞 生 长 于 其 中 的 液 体 营 养 充 足, 这 些 液 体 也 可 支 持 某 些 污 染 物, 如 微 生 物 和 其 他 细 胞 系 的 生 长 大 多 数 真 菌 和 细 菌 的 生 长 速 度 在 短 期 内 就 会 超 过 细 胞 的 生 长 速 度, 而 且 凭 肉 眼 即 可 发 现 所 有 细 胞 在 开 启 前 都 应 用 肉 眼 和 显 微 镜 检 查 是 否 有 污 染 一 些 有 污 染 迹 象 的 细 胞 应 直 接 丢 弃, 不 要 开 启, 以 尽 量 减 少 它 们 污 染 其 他 细 胞 或 液 体 的 机 会 只 要 实 验 室 中 维 持 着 生 长 迅 速 的 不 同 传 代 细 胞 系, 就 存 在 着 它 们 之 间 交 叉 污 染 的 可 能 性 这 个 问 题 的 存 在 可 谓 源 远 流 长, 但 却 经 常 被 忽 视 如 果 交 叉 污 染 发 生 在 对 不 同 病 毒 的 敏 感 性 差 异 很 大 的 细 胞 系 之 间 ( 如 L20B 和 RD 细 胞 ), 将 无 疑 会 影 响 到 病 毒 分 离 结 果 的 分 析 和 解 释 如 果 一 个 实 验 室 发 现 NPEV 即 非 脊 灰 肠 道 病 毒 容 易 在 L20B 细 胞 上 生 长, 那 么 细 胞 系 之 间 的 交 叉 污 染 是 必 须 要 考 虑 的 问 题 为 将 交 叉 污 染 的 可 能 性 降 至 最 低 限 度, 如 下 的 简 便 的 预 防 措 施 必 须 加 以 采 用 : 同 一 时 间 在 一 个 生 物 安 全 柜 里 只 能 操 作 一 种 细 胞 在 操 作 结 束 后, 移 走 柜 内 的 细 胞, 用 适 当 的 消 毒 剂 擦 拭 后 再 运 转 5 分 钟, 然 后 开 始 处 理 下 一 种 细 胞 瓶 装 的 或 分 装 好 的 液 体 在 细 胞 间 不 可 混 用 定 期 复 苏 细 胞 不 要 使 用 培 养 超 过 3 个 月 的 细 胞, 或 复 苏 后 传 代 超 过 15 代 的 细 胞 ( 不 论 培 养 时 间 有 多 短 ) 所 有 细 胞 培 养 器 皿 必 须 标 明 细 胞 系 名 称 代 数 和 传 代 日 期, 长 期 保 存 细 胞 要 使 用 液 氮 罐 细 胞 系 间 的 交 叉 污 染 很 容 易 通 过 检 查 细 胞 对 病 毒 的 敏 感 性 来 鉴 定 例 如, 将 非 脊 灰 肠 道 病 毒 如 柯 萨 奇 B 接 种 于 L20B 细 胞, 应 该 不 出 现 细 胞 病 变, 但 在 RD 细 胞 上 却 会 出 现 特 征 性 病 变,L20B 细 胞 任 何 这 方 面 的 改 变 都 说 明 发 生 了 交 叉 污 染 支 原 体 污 染 支 原 体 是 一 类 微 小 的 可 进 行 自 我 复 制 的 原 核 生 物 ( 直 径 为 µm), 没 有 细 胞 壁, 能 吸 附 在 宿 主 细 胞 上 62

72 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 支 原 体 污 染 通 常 不 易 察 觉, 只 有 通 过 适 当 的 检 验 或 观 察 到 细 胞 的 某 些 性 状 ( 如 保 持 细 胞 单 层 的 能 力 ) 发 生 变 化 时 才 能 发 现 细 胞 系 的 支 原 体 污 染 是 一 个 非 常 普 遍 的 问 题, 有 些 实 验 室 的 细 胞 已 传 了 很 多 代 却 没 有 进 行 过 支 原 体 污 染 的 检 验, 那 么 这 些 细 胞 其 实 已 有 可 能 被 支 原 体 污 染 了, 说 得 更 严 重 一 些, 这 些 实 验 室 的 细 胞 库 也 有 通 过 试 剂 培 养 基 操 作 者 或 工 作 台 污 染 了 支 原 体 的 可 能 性 污 染 源 有 时 可 追 溯 到 配 制 培 养 液 时 添 加 的 补 充 成 分 如 牛 血 清, 或 者 是 细 胞 培 养 过 程 中, 发 生 了 人 口 腔 的 支 原 体 通 过 液 滴 的 传 播 传 代 细 胞 培 养 中 的 支 原 体 污 染 或 许 是 不 可 避 免 的, 但 可 通 过 下 面 一 些 措 施 尽 量 降 低 其 发 生 的 可 能 性 : 从 信 誉 好 的 供 应 部 门 获 得 细 胞, 而 且 这 些 细 胞 要 有 支 原 体 检 验 阴 性 的 文 字 证 明 和 检 验 方 法 为 其 它 实 验 室 供 应 细 胞 的 地 区 参 比 实 验 室 应 进 行 支 原 体 检 查, 国 家 实 验 室 在 处 理 细 胞 时 一 旦 遵 从 以 下 附 加 的 注 意 事 项 则 可 不 进 行 支 原 体 检 查 : 采 用 推 荐 的 质 量 控 制 流 程 以 确 保 液 体 和 玻 璃 器 皿 灭 菌 方 法 的 有 效 性 ;. 处 理 细 胞 时 严 格 坚 持 无 菌 操 作 ; 细 胞 培 养 要 在 生 物 安 全 柜 里 操 作, 而 且 实 验 正 在 进 行 时 应 尽 量 减 少 人 员 在 工 作 区 的 走 动 ; 操 作 细 胞 时 应 避 免 谈 话 ; 操 作 结 束 后 应 正 确 消 毒 工 作 台 表 面 ; 细 胞 满 15 代 后 应 丢 弃 并 及 时 更 换 ; 所 有 细 胞 培 养 材 料 在 丢 弃 前 都 应 高 压 灭 菌, 特 别 是 发 现 任 何 有 支 原 体 污 染 的 细 胞 有 很 多 方 法 可 用 于 支 原 体 污 染 的 检 测, 总 结 如 下 : 表 4.3 检 测 支 原 体 的 方 法 方 法 敏 感 性 优 点 缺 点 直 接 DNA 染 色 ( 如 Hoechst 染 料 ) 低 迅 速, 成 本 低 廉 需 要 带 适 当 滤 光 片 的 荧 光 显 微 镜 ; 结 果 不 易 解 释 用 指 示 细 胞 ( 如 Vero, 3T3) 进 行 间 接 DNA 染 色 中 放 大 污 染, 结 果 容 易 解 释 因 为 是 间 接 的 方 法, 所 以 比 较 耗 时 单 克 隆 抗 体 免 疫 荧 光 法 高 容 易 操 作 敏 感 需 要 带 适 当 滤 光 片 的 荧 光 显 微 镜 肉 汤 和 琼 脂 培 养 高 敏 感 比 较 慢 而 且 需 要 专 业 解 释 ELISA 中 迅 速 可 检 出 的 支 原 体 种 类 有 限 PCR 中 ~ 高 迅 速 需 要 PCR 设 备 63

73 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 待 检 细 胞 应 培 养 在 没 有 抗 生 素 的 培 养 液 中, 因 为 一 些 抗 生 素 会 抑 制 支 原 体 的 生 长 4.5 Hoechst 直 接 DNA 染 色 法 检 测 支 原 体 污 染 这 种 方 法 非 常 迅 速 ( 不 到 30 分 钟 ), 但 只 有 在 污 染 严 重 的 情 况 下 (10 6 支 原 体 / 毫 升 ) 才 能 得 出 比 较 清 晰 的 阳 性 结 果 如 果 疑 似 污 染 的 细 胞 和 指 示 细 胞 ( 如 3T3, 它 能 使 阳 性 结 果 变 得 更 明 显 和 易 于 解 释 ) 共 同 孵 育 2~4 天, 则 会 大 大 提 高 实 验 的 敏 感 性 细 胞 经 荧 光 染 料 Hoechst 染 色 后, 因 为 这 种 染 料 能 特 异 性 地 结 合 DNA, 支 原 体 中 有 DNA, 所 以 就 可 以 通 过 细 胞 质 或 细 胞 间 形 成 的 特 征 性 的 荧 光 微 粒 或 纤 维 图 案 而 被 检 测 出 来 而 支 原 体 阴 性 的 细 胞 仅 在 细 胞 核 呈 现 明 亮 的 荧 光 Hoechst 染 料 也 可 检 测 到 细 菌 和 真 菌 的 污 染, 尽 管 这 种 污 染 通 常 可 以 通 过 肉 眼 可 见 的 培 养 液 混 浊 来 确 定 上 述 实 验 需 准 备 的 材 料 如 下 : 用 25 cm 2 培 养 瓶 培 养 的 待 检 细 胞, 细 胞 应 长 成 完 好 的 单 层 并 用 无 抗 生 素 的 生 长 液 至 少 传 代 1 次 ; 不 含 酚 红 的 平 衡 盐 溶 液 BSS,pH 7.0; Hoechst 染 料 (2-2(4- 间 苯 二 酚 l)-6- 苯 并 咪 唑 基 -6-/1- 甲 基 - 4-pierpazyl)-benzimidalol- 三 盐 酸 化 物 用 BSS-PR 液 配 成 1 mg/ml (w/v) 母 液, 20 存 放 使 用 时 取 10µl 母 液 加 到 200ml BSS-PR 液 中 注 意 :Hoechst 染 料 可 能 具 有 致 癌 性, 操 作 时 必 须 小 心 去 离 子 水 或 蒸 馏 水 ; 新 鲜 乙 酸 / 甲 醇 固 定 液 ( 低 温 的 ): 将 乙 酸 加 入 纯 甲 醇 溶 液 中, 比 例 为 1:3; 使 用 前 一 天 配 制 并 冷 藏 过 夜 ; 封 固 剂 :50% 甘 油 溶 于 0.044M 柠 檬 酸 盐,0.111 M 磷 酸 盐 缓 冲 液,pH5; 盖 玻 片 ; 8 孔 载 玻 片 ; 可 调 的 移 液 器 ; 36 孵 箱 ; 4~8 冰 箱 ; 带 有 330/380 nm 的 激 发 滤 光 片 和 440 nm 吸 收 滤 光 片 的 荧 光 显 微 镜 操 作 步 骤 : 1) 用 胰 蛋 白 酶 消 化 细 胞, 再 用 不 含 抗 生 素 的 细 胞 生 长 液 制 备 0.5 ~1 x10 5 个 细 胞 / 毫 升 的 细 胞 悬 液 ( 见 部 分 ); 2) 用 无 菌 吸 管 在 8 孔 载 玻 片 中 每 孔 加 入 0.5 ml 细 胞 悬 液,36 孵 育, 每 日 观 察 直 至 64

74 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 20-50% 的 细 胞 已 连 成 片 ; 3) 吸 出 并 弃 掉 每 孔 的 生 长 液 ; 4) 用 BSS-PR 液 轻 洗 细 胞 单 层 后 弃 掉 清 洗 液 ; 5) 每 孔 加 入 0.5 ml 用 乙 酸 / 甲 醇 稀 释 (50:50 v/v) 的 新 鲜 配 制 的 BSS-PR 液,, 清 洗 细 胞 单 层 后 弃 掉 清 洗 液 ; 6) 每 孔 加 入 0.5 ml 乙 酸 / 甲 醇 固 定 液 清 洗 后 弃 掉 清 洗 液 ; 7) 每 孔 加 入 0.5 ml 乙 酸 / 甲 醇 固 定 液, 作 用 10 分 钟 ; 8) 吸 出 并 弃 掉 每 孔 的 乙 酸 / 甲 醇 固 定 液 ; 9) 用 蒸 馏 水 清 洗 掉 乙 酸 / 甲 醇 后 弃 掉 洗 液 ; 10) 每 孔 加 入 0.1 ml 用 BSS-PR 液 稀 释 后 的 Hoechst 染 料, 保 证 每 孔 中 染 料 完 全 覆 盖 孔 的 表 面, 在 室 温 下 静 置 10 分 钟 ; 11) 吸 出 染 料 并 弃 掉 ; 12) 用 水 清 洗 细 胞 单 层 并 弃 掉 洗 液 ; 13) 剥 掉 小 室 的 塑 料 膜 及 硅 树 脂 的 封 口, 加 入 最 小 剂 量 的 固 封 剂, 能 恰 好 覆 盖 细 胞 单 层 即 可, 然 后 盖 上 盖 玻 片 ; 14) 使 用 带 有 330/380 nm 的 激 发 滤 光 片 和 440 nm 吸 收 滤 光 片 的 荧 光 显 微 镜 至 少 放 大 500 倍 (10 倍 目 镜 50 倍 物 镜 ) 观 察 结 果, 检 查 有 无 细 胞 核 外 的 荧 光 支 原 体 将 在 细 胞 质 呈 点 状 或 纤 维 状 荧 光, 若 感 染 严 重, 在 细 胞 间 也 可 见 到 荧 光 因 为 Hoechst 染 料 会 将 所 有 DNA 染 色, 所 有 细 胞 核 都 可 见 明 亮 的 荧 光 支 原 体 阴 性 的 细 胞 将 呈 现 细 胞 核 着 色 明 亮 而 细 胞 质 无 着 色 4.6 MYCO 免 疫 法 检 测 支 原 体 污 染 WHO 从 不 公 开 推 荐 使 用 某 种 特 定 的 商 品 化 实 验 方 法, 但 由 ICN (ImmunoMark MYCOTEST,Cat. No ) 生 产 的 MYCO- 免 疫 法 试 剂 盒, 经 过 一 些 实 验 室 使 用 后 发 现 它 操 作 简 单, 且 据 报 导 敏 感 性 很 高, 实 验 原 理 是 通 过 用 标 记 有 荧 光 染 料 的 抗 支 原 体 单 克 隆 抗 体 对 细 胞 进 行 免 疫 荧 光 染 色, 细 胞 染 色 后 在 显 微 镜 下 观 察 细 胞 周 界 和 细 胞 内 部 有 无 典 型 的 黄 绿 色 荧 光 MYCO-TEST 试 剂 盒 包 括 以 下 材 料 : 2ml 单 克 隆 CCM-2 荧 光 标 记 物, 稀 释 于 含 有 Evans blue 复 染 剂 的 有 稳 定 蛋 白 作 用 的 缓 冲 液 中 ; 2ml 异 硫 氰 酸 荧 光 素 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG, 稀 释 于 含 有 Evans blue 复 染 剂 的 有 稳 定 蛋 白 作 用 的 缓 冲 液 ; 2.5 ml 固 封 液 ; 操 作 说 明 此 实 验 还 需 准 备 下 列 试 剂 及 器 材 : 65

75 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 待 检 细 胞 接 种 在 在 25 cm 2 细 胞 培 养 瓶 里, 用 不 含 抗 生 素 的 培 养 液 至 少 培 养 2 天 ; 聚 四 氟 乙 烯 涂 层 的 十 孔 载 玻 片 ; PBS; 70% 冷 乙 醇 (-20 ); 巴 斯 德 吸 管 或 细 胞 刮 板 ; 移 液 器 和 20 ul 吸 尖 ; 50 孵 箱 ; 荧 光 显 微 镜 ( 异 硫 氰 酸 荧 光 素 滤 光 片 ) 操 作 步 骤 : 1) 从 25 ml 待 检 细 胞 的 培 养 瓶 中 倾 去 生 长 液 ; 2) 加 入 大 约 0.5 ml PBS; 3) 用 细 胞 刮 板 或 无 菌 巴 斯 德 吸 管 ( 用 本 生 灯 制 成 L 型 ) 将 细 胞 从 瓶 壁 剥 离, 混 合 细 胞 和 PBS 制 成 细 胞 悬 液 ; 4) 在 干 净 的 聚 四 氟 乙 烯 涂 层 的 玻 片 上, 至 少 选 2 孔 加 入 20 ul 细 胞 悬 液 ; 5) 在 50 孵 箱 ( 如 果 有 ) 或 室 温 条 件 下 干 燥 45 分 钟 ; 6) 将 玻 片 放 置 在 玻 片 瓶 内 用 20 C 的 70% 冷 乙 醇 固 定 60 秒 ; 7) 使 玻 片 干 燥 ; 8) 用 下 列 方 法 之 一 均 将 玻 片 染 色 : 一 歩 法 : 使 用 荧 光 染 料 标 记 的 单 克 隆 抗 体, 适 用 于 快 速 筛 检 疑 似 阳 性 的 标 本 a) 制 备 好 的 ( 已 固 定 并 干 燥 的 ) 细 胞 中 加 入 1 滴 CCM-2 荧 光 标 记 的 单 克 隆 抗 体 ( 试 剂 1), 保 证 试 剂 充 分 覆 盖 反 应 孔 ; b) 室 温 下 在 湿 盒 内 孵 育 20 分 钟 ( 若 试 剂 干 燥 在 标 本 上 会 引 起 非 特 异 性 染 色 ); c) 在 室 温 下 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 仔 细 清 洗 玻 片, 并 且 在 盛 装 着 磷 酸 盐 缓 冲 液 的 玻 片 染 色 盘 中 洗 两 次 共 2 分 钟 d) 在 室 温 下 干 燥 玻 片 ; e) 在 每 孔 中 央 滴 入 1 滴 固 封 液 ( 试 剂 3), 盖 上 盖 玻 片, 避 免 封 入 气 泡 两 歩 间 接 染 色 法 : 使 用 标 记 的 单 克 隆 抗 体 和 荧 光 染 料 标 记 的 第 二 抗 体, 对 支 原 体 检 测 极 其 敏 感 前 四 步 同 一 歩 法 ; f) 在 制 备 好 的 细 胞 中 加 入 1 滴 羊 抗 鼠 IgG 异 硫 酸 荧 光 素 标 记 的 单 克 隆 抗 体 ( 试 剂 2), 确 保 试 剂 覆 盖 全 孔 ; g) 室 温 下 在 湿 盒 内 孵 育 20 分 钟 ( 若 试 剂 干 燥 在 标 本 上 会 引 起 非 特 异 染 色 ); h) 在 室 温 下 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 仔 细 清 洗 玻 片, 并 且 在 盛 装 着 磷 酸 盐 缓 冲 液 的 玻 片 染 66

76 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 色 盘 中 洗 两 次 共 2 分 钟 i) 在 室 温 下 干 燥 玻 片 ; j) 在 每 孔 的 中 央 滴 入 1 滴 固 封 液 ( 试 剂 3), 盖 上 盖 玻 片, 避 免 封 入 气 泡 9) 在 玻 片 染 色 后 立 即 用 荧 光 显 微 镜 观 察 效 果 最 佳 着 色 后 的 支 原 体 在 放 大 500 倍 的 显 微 镜 下 很 容 易 观 察 到 (10 倍 目 镜 50 倍 物 镜 ) 如 果 有 支 原 体 污 染 存 在, 在 细 胞 周 界 上 可 见 典 型 的 黄 绿 色 荧 光, 在 复 染 的 细 胞 之 间 则 出 现 明 亮 的 红 色 4.7 PCR 法 检 测 支 原 体 污 染 科 学 文 献 中 报 导 过 很 多 基 于 PCR 法 的 支 原 体 检 测 方 法, 也 能 买 到 多 种 基 于 PCR 法 的 检 测 试 剂, 它 们 的 便 利 之 处 在 于 提 供 了 大 部 分 实 验 所 需 的 试 剂 及 对 照, 而 且 它 们 看 来 敏 感 性 很 高 WHO 不 公 开 推 荐 使 用 任 何 特 殊 的 商 业 化 方 法, 但 一 些 实 验 室 发 现 VenorGeM 支 原 体 检 测 试 剂 盒 是 商 业 化 支 原 体 检 测 试 剂 的 一 个 范 例, 它 操 作 简 单, 便 于 使 用 据 其 厂 家 报 道, 少 至 1-5 fg 支 原 体 DNA( 相 当 于 每 样 品 体 积 中 2~5 个 支 原 体 ) 即 可 发 生 阳 性 反 应 有 报 道 VenorGeM 试 剂 盒 可 检 测 到 一 定 种 属 范 围 内 的 支 原 体, 包 括 无 胆 甾 原 体 属 和 脲 原 体 属, 它 们 在 污 染 的 细 胞 中 普 遍 存 在 需 要 准 备 的 材 料 如 下 : 接 种 了 待 检 细 胞 的 25 cm 2 细 胞 培 养 瓶 ; VenorGeM 商 业 化 试 剂 盒 包 括 : - 寡 核 苷 酸 引 物 对 和 核 苷 酸 ; - 冻 干 的 引 物 对 和 脱 氧 核 苷 酸 datp, dctp, dgtp 和 dttp ( 最 适 浓 度 ); - 无 菌 的 PCR 10x 反 应 缓 冲 液 ; mm Tris- 盐 酸 (ph 8.5); mm 氯 化 钾 ; - 30 mm MgCl 2 ; - 阳 性 对 照 DNA; - 冻 干 的 支 原 体 oraledna 片 段 ( 不 具 有 感 染 性 ); - 内 部 对 照 DNA; - 冻 干 的 质 粒, 包 括 支 原 体 特 定 的 引 物 序 列 和 一 个 内 部 的 HTLV-1 tax gen 序 列 ( 长 度 大 约 为 191bp) 下 列 所 需 材 料 / 仪 器 非 VenorGeM 试 剂 盒 提 供 : - 不 含 核 糖 核 酸 酶 - 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 的 水 ; - 1U Taq DNA 聚 合 酶 ; - 生 物 安 全 柜,BSC; - 各 种 容 积 的 移 液 器 :0.5~10 ul,10~200 ul; - 无 菌 的 ART( 防 气 溶 胶 ) 吸 尖 ; 67

77 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 - PCR 仪 ; - 加 热 器 ; - 带 有 螺 旋 盖 的 或 可 锁 住 的 1.5 ml 无 菌 管 ; - 试 管 架 ; - 微 量 离 心 机 ; - 微 量 离 心 管 操 作 步 骤 : 样 品 的 制 备 1) 在 生 物 安 全 柜 中 从 25 cm 2 细 胞 培 养 瓶 中 吸 出 100 ul 液 体 置 于 标 记 过 的 无 菌 1.5 ml 微 量 离 心 管 中, 弃 掉 瓶 中 残 留 的 液 体 ; 2) 在 瓶 内 加 入 约 0.5 ml PBS, 并 用 细 胞 刮 板 或 无 菌 巴 斯 德 吸 管 ( 用 本 生 灯 制 成 L 型 ) 将 细 胞 从 瓶 壁 剥 离, 将 PBS 与 剥 离 的 细 胞 混 合 成 细 胞 悬 液 ; 3) 吸 出 100 ul 细 胞 悬 液 置 于 标 记 过 的 无 菌 1.5 ml 微 量 离 心 管 ; 4) 将 两 个 样 品 都 在 加 热 器 中 作 用 95,5 分 钟 ( 即 分 别 盛 装 细 胞 悬 液 和 液 体 的 微 量 离 心 管 ); 5) 将 样 品 离 心 5 秒 以 使 细 胞 碎 片 沉 淀,4 保 存 备 用 PCR 操 作 技 术 规 范 因 为 PCR 技 术 涉 及 到 模 板 的 扩 增,PCR 产 物 的 交 叉 污 染 是 一 个 严 重 的 问 题 遵 守 下 列 的 实 验 室 操 作 规 范 可 减 少 此 类 问 题 的 发 生 : PCR 的 前 期 和 后 期 工 作 要 分 别 在 单 独 的 房 间 或 屏 障 单 元 内 进 行 ( 如 配 有 紫 外 灯 的 生 物 安 全 柜 ); PCR 的 前 期 和 后 期 工 作 要 分 别 使 用 各 自 的 一 套 吸 管 和 其 它 仪 器, 不 可 混 用 ; 试 剂 要 分 装 保 存, 尽 量 减 少 重 复 用 一 管 试 剂 加 样 的 次 数 ; 准 备 和 分 装 试 剂 应 在 无 PCR 扩 增 产 物 的 区 域 中 进 行 ; 要 始 终 使 用 防 气 溶 胶 的 吸 尖 ( 带 滤 芯 ); 要 戴 手 套 ( 不 含 滑 石 粉 ), 并 且 经 常 更 换 ; 开 启 管 盖 时 要 小 心, 避 免 产 生 气 溶 胶 ; 尽 量 减 少 所 操 作 的 样 品 数 量 ; 在 反 应 管 中 要 先 加 非 样 品 成 分, 后 加 样 品 和 对 照 ; 加 完 一 个 样 品 后 要 扣 好 盖 子, 再 加 下 一 个 样 品 ; 使 用 阳 性 对 照 ( 和 样 品 同 时 进 行 扩 增 ); 使 用 阴 性 对 照 ; 每 次 扩 增 都 要 做 1 个 或 多 个 试 剂 对 照, 试 剂 对 照 应 包 括 所 有 PCR 成 分, 除 了 模 板 RNA 68

78 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 PCR 反 应 : 1) 在 PCR 清 洁 区 水 化 PCR 引 物 核 苷 酸 和 阳 性 对 照 DNA: 在 水 化 之 前, 需 将 所 有 管 子 瞬 时 离 心 以 保 证 冻 干 物 沉 淀 水 化 材 料 时 请 使 用 下 列 操 作 步 骤 : 加 入 适 量 的 水 并 使 管 子 在 室 温 下 放 置 5 分 钟 ; 用 涡 流 搅 拌 器 混 合 几 秒 或 用 吸 管 重 复 吹 打 使 DNA 完 全 溶 解, 再 瞬 时 离 心 ; 用 130 ul 不 含 核 糖 核 酸 酶 - 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 的 无 菌 水 水 化 PCR 引 物 和 核 苷 酸, 引 物 和 核 苷 酸 需 分 装 并 冷 冻 保 存 备 用 ; 用 100ul 不 含 核 糖 核 酸 酶 - 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 的 无 菌 水 水 化 阳 性 对 照 ; 用 220ul 不 含 核 糖 核 酸 酶 - 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 的 无 菌 水 水 化 内 部 对 照 2) 取 1.5 ml 管 子 制 备 足 量 的 PCR 主 反 应 液, 要 保 证 每 个 样 品 和 对 照 都 有 48 ul 的 体 积 : 试 剂 10X PCR 反 应 缓 冲 液 支 原 体 引 物 和 dntps Taq DNA 聚 合 酶 内 部 对 照 DNA 不 含 核 糖 核 酸 酶 - 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 的 水 总 体 积 每 个 反 应 的 体 积 5.0 ul 5.0 ul 0.2 ul 2.0 ul 35.8 ul 48.0 ul 在 每 个 PCR 反 应 管 中 加 入 48 ul 主 液, 包 括 对 照 管 3) 在 样 品 准 备 区 将 样 品 和 对 照 加 到 PCR 主 液 中 : 将 所 用 的 样 品 对 照 和 主 反 应 液 放 在 冰 浴 内 的 架 子 上 ; 在 生 物 安 全 柜 中 将 每 份 样 品 和 对 照 各 取 2 ul 分 别 加 到 正 确 标 记 的 装 有 主 反 应 液 的 PCR 管 中, 包 括 2ul 试 剂 盒 中 的 阳 性 对 照 和 2 ul 不 含 核 糖 核 酸 酶 - 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 的 水 作 为 阴 性 对 照 4) 使 用 下 列 参 数 在 PCR 仪 上 运 行 样 品, 时 间 大 约 需 3 小 时 : 循 环 1:94 2 分 钟,55 2 分 钟,72 3 分 钟 ; 循 环 2~35:94 30 秒,55 1 分 钟,72 1 分 钟 ; 72 静 置 4 分 钟 ; 4 静 置 备 用 5) 取 10 ul 扩 增 后 的 产 物 在 2% 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 110V 1 小 时, 包 括 100bp 分 子 量 对 照 ( 阶 梯 状 ); 6) 将 此 琼 脂 糖 凝 胶 放 入 溴 化 乙 锭 溶 液 中 染 色 并 照 相 长 期 保 存 69

79 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 培 养 技 术 结 果 的 解 释 : 通 过 和 阳 性 对 照 比 较, 观 察 待 检 样 品 有 无 PCR 产 物 及 产 物 的 分 子 量 大 小, 即 可 得 出 结 果 阳 性 对 照 应 呈 现 出 1 条 明 亮 的 270-bp 条 带, 而 阴 性 对 照 在 此 区 无 条 带 显 现 内 部 对 照 DNA 将 呈 现 191-bp 条 带, 表 示 PCR 反 应 未 受 抑 制 任 何 有 支 原 体 DNA 的 样 品 与 阳 性 对 照 一 样, 都 会 呈 现 出 一 条 清 晰 的 而 且 通 常 比 较 亮 的 270-bp 条 带, 未 感 染 的 样 品 将 没 有 这 样 的 条 带 VenorGeM 支 原 体 检 测 试 剂 盒 是 为 高 敏 感 性 而 设 计 的, 因 此 可 能 会 出 现 非 特 异 性 的 退 火 而 产 生 长 度 不 等 的 不 清 晰 条 带, 这 并 不 表 明 为 阳 性 结 果 引 物 的 自 身 退 火 可 产 生 一 个 80~99 bp 的 产 物, 这 也 不 会 影 响 检 测 的 精 确 性 和 实 验 结 果 的 解 释 70

80 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 第 5 部 分 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 随 着 脊 灰 在 全 球 即 将 消 灭, 假 阴 性 的 病 毒 分 离 结 果 可 能 导 致 非 常 严 重 的 后 果 因 此, 在 病 毒 监 测 过 程 中, 整 个 病 毒 分 离 过 程 的 高 度 敏 感 性 至 关 重 要 用 于 病 毒 分 离 的 细 胞 敏 感 性 的 常 规 监 测 是 实 验 室 质 量 保 证 体 系 中 的 重 要 组 成 部 分, 为 从 细 胞 中 扩 增 出 既 使 低 滴 度 的 脊 灰 病 毒 提 供 了 保 证 就 象 下 面 所 说 的 一 样, 应 该 制 备 具 有 已 知 滴 度 的 并 且 滴 度 稳 定 的 参 考 病 毒 定 期 的 进 行 细 胞 敏 感 性 的 评 价 有 多 种 因 素 对 细 胞 的 敏 感 性 有 负 面 影 响, 其 中 包 括 : 支 原 体 污 染 培 养 液 的 质 量 ( 如 胎 牛 血 清 水 PH 值 ) 生 长 条 件 ( 如 孵 育 温 度 ), 这 是 需 要 监 控 和 持 续 记 录 这 些 培 养 条 件 的 原 因 之 一 当 更 换 了 新 牛 血 清 新 孵 箱 新 技 术 人 员 或 者 任 何 重 要 的 操 作 步 骤 发 生 改 变 时, 就 需 要 对 用 于 脊 灰 病 毒 检 测 的 细 胞 的 敏 感 性 进 行 评 价 从 显 微 镜 中 很 难 观 察 到 细 胞 敏 感 性 的 降 低, 所 以 形 态 学 或 者 某 些 物 理 特 征 不 能 作 为 衡 量 细 胞 敏 感 性 的 标 志, 但 是, 有 些 特 殊 情 况 下, 不 得 不 用 看 起 来 形 态 已 有 异 常 的 细 胞 做 病 毒 分 离, 这 时 应 该 进 行 细 胞 对 脊 灰 病 毒 的 敏 感 性 实 验 实 验 室 应 该 了 解 所 有 冻 存 细 胞 的 敏 感 性, 并 且 在 复 苏 细 胞 或 收 到 新 细 胞 时 都 要 进 行 细 胞 敏 感 性 的 评 价 建 议 在 传 代 15 代 的 中 途 也 要 进 行 敏 感 性 的 评 价 数 据 记 录 和 任 何 纠 正 措 施 的 概 要 都 需 记 录 在 案, 以 便 与 WHO 脊 灰 网 络 实 验 室 的 认 证 要 求 保 持 一 致 5.1 细 胞 系 质 量 控 制 参 考 毒 株 的 选 择 从 英 国 国 家 生 物 标 准 品 与 控 制 样 品 研 究 所 (NIBSC) 可 以 订 购 到 经 过 鉴 定 且 已 知 滴 度 的 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 株 ( 见 下 面 5.6 部 分 ) 实 验 室 应 该 从 NIBSC 至 少 每 种 血 清 型 的 病 毒 订 购 5 管 收 到 参 考 株 以 后, 应 该 立 即 将 管 子 原 封 不 动 冻 存 于 -20 备 用 参 考 毒 株 对 实 验 室 有 两 个 主 要 意 义 :a) 可 以 为 制 备 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 库 和 其 他 参 考 样 品 提 供 一 个 经 过 证 实 和 鉴 定 的 参 考 毒 株 来 源 ; 和 b) 作 为 标 定 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 库 的 已 知 滴 度 的 样 品 经 过 鉴 定 的 每 个 血 清 型 的 Sabin 病 毒 分 装 在 5 个 安 瓿, 这 5 安 瓿 毒 株 要 按 如 下 要 求 进 行 处 理 2 安 瓿 冻 存 在 -20 以 下 备 用 ( 不 要 开 封 ) 解 冻 2 个 安 瓿 管, 用 无 菌 吸 管 或 带 有 无 菌 且 防 气 溶 胶 吸 尖 的 吸 枪 混 匀 内 容 物, 分 装 成 0.1ml/ 管, 冻 存 于 -20 以 下 ( 注 意 : 共 分 装 成 16 管 ) 1 安 瓿 用 来 在 RD 和 L20B 细 胞 中 扩 增 病 毒 后 保 存, 作 为 实 验 室 质 量 控 制 的 标 准 71

81 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 毒 株 和 这 些 细 胞 系 的 参 考 毒 株 库 ( 见 5.2 部 分 ) 5.2 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 制 备 首 先 要 准 备 好 以 下 材 料 : 1ml 和 10ml 的 一 次 性 无 菌 塑 料 吸 管 为 各 种 血 清 型 的 参 考 病 毒 和 各 种 不 同 的 细 胞 准 备 50ml 无 菌 带 螺 旋 盖 的 离 心 管 为 各 种 血 清 型 的 参 考 病 毒 和 各 种 不 同 的 细 胞 准 备 250 个 带 刻 度 的 外 螺 旋 盖 保 存 管 (1.8 ~ 2.0 ml) 每 种 血 清 型 的 NIBSC Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 毒 株 各 1 安 瓿 管 75cm 2 培 养 瓶 中 长 满 单 层 的 健 康 L20B 细 胞 及 RD 细 胞 ( 每 一 种 血 清 型 的 病 毒 需 一 瓶 ), 内 装 25ml 维 持 液 然 后 进 行 以 下 操 作 : 1) 检 查 细 胞 的 质 量 ( 如 : 是 否 为 长 满 单 层 的 健 康 细 胞 ) 和 通 过 视 觉 观 察 确 定 有 无 污 染 合 适 的 细 胞 单 层 应 该 是 传 代 后 至 少 培 养 了 两 天 2) 标 记 要 接 种 的 细 胞 培 养 瓶 3) 要 在 生 物 安 全 柜 中 进 行 操 作, 每 次 只 能 操 作 一 种 血 清 型 的 病 毒 先 将 1 安 瓿 管 的 NIBSC Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 株 用 一 次 性 无 菌 塑 料 吸 管 混 匀, 吸 一 半 内 容 物 ( 大 概 0.4ml) 加 到 准 备 好 的 L20B 或 RD 细 胞 培 养 瓶 中, 剩 下 的 一 半 用 于 接 种 到 另 一 细 胞 系, 如 果 同 一 天 就 能 接 种 到 另 一 种 细 胞, 可 保 存 在 4, 否 则 冻 存 于 -20 以 下 4) 接 种 过 的 培 养 瓶 置 于 36 孵 育 5) 每 天 用 倒 置 显 微 镜 观 察 细 胞 病 变 (CPE) 的 出 现 6) 当 75% 到 100% 细 胞 出 现 CPE(3+ 至 4+CPE) 的 时 候, 将 瓶 养 瓶 置 于 0 以 下 冷 冻 后 融 化 其 内 容 物, 在 半 解 冻 时 摇 动 塑 料 瓶 以 确 保 所 有 细 胞 都 能 从 瓶 壁 上 分 离 下 来 然 后 再 反 复 冻 融 两 次 7) 在 生 物 安 全 柜 中, 用 10ml 的 无 菌 吸 管 混 匀 培 养 瓶 中 的 内 容 物 并 吸 出 一 半 至 标 记 好 的 50ml 离 心 管 中 8) 确 保 离 心 机 的 盖 盖 好 和 离 心 杯 密 封 好 后, 将 其 在 冷 冻 离 心 机 中 1500g 1 离 心 20 分 钟 9) 在 每 个 保 存 管 上 标 记 所 用 的 细 胞 名 称, 制 备 的 病 毒 名 称 和 接 种 日 期 在 生 物 安 全 柜 中, 将 上 清 夜 分 装 在 标 记 好 的 保 存 管 中 ( 每 管 0.1ml 上 清 夜, 总 共 250 管 ) 10) 制 备 好 的 病 毒 要 冻 存 于 指 定 的 用 于 保 存 感 染 性 物 质 的 -20 冰 箱, 作 为 将 来 实 验 室 质 量 控 制 的 标 准 毒 株 1 g= 相 对 离 心 力, 可 用 下 面 的 公 式 换 算 成 RPM( 转 数 / 分 钟 ): g=( )RN 2 R= 离 心 机 的 轴 心 到 管 套 最 外 端 的 半 径, 用 mm 表 示 N= 离 心 机 的 转 数, 用 RPM 表 示 72

82 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 5.3 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 测 定 操 作 要 点 : 确 定 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 质 量 控 制 标 准 毒 株 在 投 入 常 规 使 用 之 前, 应 至 少 有 3 次 独 立 的 滴 度 水 平 测 定 结 果 具 有 可 重 复 性 同 时 用 NIBSC 参 考 标 准 株 做 平 行 实 验, 用 来 验 证 这 3 次 实 验 的 滴 度 测 定 是 有 效 的 NIBSC 参 考 标 准 株 滴 度 是 : -Sabin1: 在 RD 细 胞 上 为 5.1 log 10 CCID 50 /0.1ml, 在 L20B 细 胞 上 为 4.9 log 10 CCID 50 /0.1ml -Sabin2: 在 RD 细 胞 上 为 5.1 log 10 CCID 50 /0.1ml, 在 L20B 细 胞 上 为 4.8log 10 CCID 50 /0.1ml -Sabin3: 在 RD 细 胞 上 为 5.3 log 10 CCID 50 /0.1ml, 在 L20B 细 胞 上 为 4.9log 10 CCID 50 /0.1ml 一 般 来 说, 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 要 高 于 NIBSC 参 考 标 准 株, 且 3 次 实 验 结 果 的 滴 度 波 动 不 应 该 超 过 +/- 0.5log 10 如 果 符 合 上 述 要 求, 则 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 病 毒 滴 度 值 取 3 次 实 验 的 平 均 滴 度 即 可 随 后 的 细 胞 敏 感 性 的 常 规 监 测 只 有 当 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 已 制 备 好, 并 且 滴 度 已 经 确 定, 滴 度 结 果 具 有 可 重 复 性 的 时 候, 才 能 开 展 细 胞 敏 感 性 的 常 规 监 测 需 准 备 以 下 材 料 : 1ml 和 10ml 的 一 次 性 塑 料 吸 管 5 ml 稀 释 用 的 带 盖 无 菌 管 旋 涡 式 混 匀 器 带 盖 的 无 菌 96 孔 平 底 微 量 细 胞 培 养 板 无 菌 无 毒 性 的 封 条 ( 在 不 用 CO 2 孵 箱 的 情 况 下 使 用 ) 配 有 防 气 溶 胶 吸 尖 的 吸 枪 将 要 进 行 病 毒 分 离 敏 感 性 评 价 的 长 满 单 层 的 健 康 细 胞 每 个 微 量 板 要 准 备 10ml 密 度 为 1~ 个 细 胞 /ml 的 细 胞 悬 液 ( 见 第 4 部 分 ) 维 持 液 低 滴 度 的 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 株 操 作 步 骤 : 按 10-2 ~ 10-8 依 次 标 记 稀 释 管 ( 见 图 5.1) 每 管 加 9.0ml 维 持 液 迅 速 融 化 一 管 某 种 血 清 型 的 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 作 为 标 准 化 的 实 验 程 序, 所 有 3 个 血 清 型 的 毒 株 都 要 进 行 实 验 73

83 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 将 0.9ml 维 持 液 加 到 融 化 了 的 标 准 毒 株 中, 混 匀, 制 成 标 准 毒 株 的 10-1 稀 释 度 作 为 标 准 化 实 验 程 序, 也 要 同 时 融 化 一 管 相 同 血 清 型 的 NIBSC 标 准 病 毒, 用 同 样 的 方 法 稀 释 用 无 菌 吸 管 或 有 防 气 溶 胶 吸 尖 的 吸 枪 取 1.0ml 10-1 稀 释 度 的 病 毒 加 入 第 一 管 盖 上 管 盖, 轻 轻 混 匀 换 另 外 一 个 吸 管 或 吸 尖, 吸 1.0ml 至 第 二 管, 丢 弃 吸 管 或 吸 尖 盖 上 管 盖, 轻 轻 混 匀 重 复 稀 释 步 骤 每 次 吸 1.0ml 并 且 保 持 两 个 稀 释 度 之 间 换 吸 管 或 吸 尖, 直 至 第 7 管 ( 图 5.1) 加 100ul 稀 释 好 的 病 毒 至 A-H 行 的 1-10 孔 ( 即 每 个 稀 释 度 20 孔, 见 图 5.2), 以 获 得 有 效 的 实 验 结 果 : - 使 用 NIBSC 参 考 标 准 毒 株 时, 在 板 子 上 加 稀 释 度 - 使 用 5.2 部 分 制 备 的 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 时, 在 板 子 上 加 稀 释 度 加 100ul 维 持 液 至 A-H 排 的 A11-H12 孔, 以 备 作 为 细 胞 对 照 制 备 密 度 大 约 为 1~ 个 细 胞 /ml 的 细 胞 悬 液, 每 块 板 子 至 少 按 10ml 准 备 ( 见 第 4 部 分 ) 如 图 5.2 所 示 在 微 量 板 的 边 缘 进 行 简 要 的 标 记, 加 100ul 制 备 好 的 细 胞 悬 液 至 A-H 排 的 每 一 孔 盖 上 板 子, 用 无 毒 的 封 条 封 上 ( 如 果 不 使 用 CO 2 孵 箱 ),36 孵 育 用 倒 置 显 微 镜 每 天 观 察 CPE 的 进 展, 并 且 连 续 记 录 结 果 5~7 天 细 胞 对 照 应 为 完 整 单 层 的 健 康 细 胞, 这 样 实 验 才 具 有 有 效 性 图 5.1 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 毒 株 的 稀 释 1.0ml 病 毒 10-1 稀 释 度 ml 维 持 液 病 毒 稀 释 -2.0 度

84 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 图 5.2 实 验 室 质 量 控 制 标 准 品 滴 定 的 板 面 设 计 病 毒 的 稀 释 度 细 胞 对 照 图 5.3 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 标 准 毒 株 滴 定 结 果 示 例 病 毒 的 稀 释 度 有 CPE 无 CPE 细 胞 对 照 75

85 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 5.4 用 Kärber 公 式 计 算 病 毒 滴 度 log CCID 50 = L-d (S -0.5 ), 其 中 : L = 实 验 中 使 用 的 最 低 稀 释 度 的 log 值 ; d = 稀 释 梯 度 的 log 值 ; S = 终 判 时 阳 性 部 分 的 总 和 ( 即 出 现 CPE 的 细 胞 孔 所 占 的 比 例 之 和 ) 在 这 个 例 子 中 : L = -5.0; d = 1.0; S = = 2.10; 于 是 : log CCID50 = ; 病 毒 滴 度 = CCID50 / 0.1 ml 5.5 细 胞 系 敏 感 性 实 验 的 结 果 解 释 及 解 决 办 法 细 胞 系 敏 感 性 实 验 的 有 效 性 : 在 实 验 中, 有 两 个 常 见 的 原 因 会 导 致 滴 度 结 果 无 效 用 Kärber 法 计 算 滴 度 需 要 终 点 观 察 值 有 100%CPE 及 0%CPE 的 稀 释 度, 如 果 加 到 微 量 板 上 的 病 毒 滴 度 太 高 或 太 低, 有 可 能 导 致 100%CPE 或 0%CPE 的 终 点 观 察 值 无 法 出 现, 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 滴 度 偏 高 或 偏 低, 就 会 出 现 上 述 情 况 实 验 程 序 中 推 荐 的 加 样 浓 度 ( 如 5.3 部 分 及 图 5.2 所 述 ) 是 基 于 具 有 代 表 性 的 参 考 毒 株 制 定 的 在 日 常 工 作 中, 完 全 可 以 修 改 推 荐 的 加 样 浓 度, 在 适 当 的 情 况 下, 为 了 得 到 有 效 的 实 验 结 果, 高 一 个 稀 释 度 或 低 一 个 稀 释 度 都 是 可 以 的 但 是, 图 5.1 中 所 列 出 的 滴 度 范 围 绝 不 能 更 改 实 验 结 果 无 效 的 另 一 个 原 因 是 偶 尔 出 现 的 加 到 板 子 上 的 第 一 个 稀 释 度 CPE 观 察 值 90%, 或 最 后 一 个 稀 释 度 CPE 10% 这 种 结 果 还 可 以 接 受, 在 用 公 式 计 算 最 终 滴 度 时, 把 低 一 个 稀 释 度 算 做 100%CPE, 或 把 高 一 稀 释 度 算 做 0%CPE, 滴 度 的 计 算 都 要 统 一 按 5.3 部 分 的 说 明 去 做 NIBSC 参 考 毒 株 的 测 定 : 如 果 任 何 型 别 NIBSC 参 考 毒 株 使 用 任 何 一 种 细 胞 最 初 的 滴 度 测 定 结 果 连 续 低 于 所 给 的 预 期 值 0.5 log10 以 上, 那 么 就 可 能 是 细 胞 系 敏 感 性 的 问 题 或 是 实 验 操 作 的 问 题, 这 种 情 况 下, 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 测 定 就 要 暂 停 了, 直 到 找 到 了 问 题 所 在, 并 且 解 决 了 问 题 出 现 问 题 后, 强 烈 建 议 立 即 评 估 实 验 程 序, 同 时 向 地 区 实 验 室 协 调 员 通 报 评 估 结 果 如 果 调 查 证 明 实 验 过 程 没 有 问 题, 那 就 很 可 能 是 细 胞 的 问 题, 可 能 与 细 胞 本 身 或 培 养 液 有 关, 重 要 的 是 要 尽 快 解 决 问 题 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 测 定 : 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 一 旦 确 定, 就 可 以 投 入 常 规 使 用 ( 注 意, 供 电 不 稳 定 的 实 验 室 应 该 意 识 到 实 验 室 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 反 复 冻 融 会 影 响 其 滴 度 和 性 能 ) 每 次 评 价 细 胞 敏 感 性 时, 根 据 实 验 得 出 的 质 量 控 制 标 准 毒 株 的 滴 度 应 该 和 已 经 确 定 的 参 考 值 相 比 较 如 果 滴 度 和 预 期 的 参 考 值 相 同 或 波 动 幅 76

86 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 细 胞 系 敏 感 性 的 评 价 度 在 ±0.5log10 以 内, 就 提 示 细 胞 系 的 敏 感 性 没 有 下 降, 整 个 实 验 程 序 也 没 有 任 何 问 题 ; 滴 度 值 比 预 期 值 高 0.5log10 或 更 多, 可 能 是 在 实 验 过 程 中 稀 释 病 毒 一 步 有 些 问 题 ; 滴 度 值 比 预 期 值 低 0.5log10 或 更 多, 可 能 是 细 胞 系 敏 感 性 衰 退 的 迹 象, 应 该 新 拿 一 管 分 装 的 标 准 毒 株 按 照 上 述 方 法 重 复 测 定 一 次, 以 排 除 人 为 错 误 的 可 能 性, 同 时, 应 该 评 估 所 记 录 的 关 于 培 养 条 件 改 变 的 资 料 如 果 滴 度 仍 然 和 上 次 测 的 一 样 低, 并 且 排 除 了 是 培 养 条 件 的 改 变 所 致, 就 应 复 苏 本 实 验 室 液 氮 中 冻 存 的 具 有 更 高 敏 感 性 的 细 胞 进 行 更 换, 或 者 从 世 界 卫 生 组 织 地 区 参 考 脊 灰 实 验 室 预 订 新 的 细 胞 系, 引 进 的 新 细 胞 系 也 要 经 过 敏 感 性 测 试, 符 合 要 求 的 才 可 投 入 常 规 使 用 这 种 情 况 应 该 向 地 区 实 验 室 的 协 调 员 报 告, 以 决 定 是 否 有 对 标 本 进 行 再 次 检 测 的 必 要 性 5.6 如 何 获 得 脊 灰 病 毒 参 考 毒 株 Sabin 脊 灰 病 毒 参 考 毒 株 由 NIBSC 提 供 他 们 用 安 瓿 提 供, 每 瓿 含 有 0.8ml, 用 干 冰 运 输 请 根 据 以 下 的 参 考 毒 株 编 号 和 联 系 地 址 进 行 预 订 Sabin 1 NIBSC 参 考 号 01/528 Sabin 2 NIBSC 参 考 号 01/530 Sabin 3 NIBSC 参 考 号 01/532 联 系 地 址 : Dr. Javier Martin Division of Virology, National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar Hertfordshire EN6 3QG, United Kingdom Tel.: ; Fax: jmartin@nibsc.ac.uk 77

87 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 的 接 收 和 处 理 第 6 部 分 标 本 的 接 收 和 处 理 6.1 标 本 的 接 收 当 标 本 送 达 实 验 室 的 时 候, 运 输 的 硬 纸 盒 或 运 输 容 器 应 该 立 即 在 指 定 的 有 废 弃 物 收 集 容 器 酒 精 棉 签 和 纸 巾 的 区 域 内 打 开 包 装 保 护 实 验 室 工 作 人 员 的 安 全 是 首 位 的, 如 果 有 条 件, 应 该 使 用 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 (BSC) 以 避 免 实 验 室 工 作 人 员 暴 露 于 潜 在 的 病 原 体 中 如 果 没 有 生 物 安 全 柜, 可 以 使 用 超 净 工 作 台 工 作 台 的 表 面 应 该 可 耐 受 实 验 室 常 规 消 毒 剂 (70% 酒 精, 次 氯 酸 钠 溶 液,2% 戊 二 醛 溶 液 等 ) 并 且 应 该 放 置 在 远 离 实 验 室 其 他 操 作 的 区 域 肠 道 病 毒 是 不 能 被 纯 酒 精 所 灭 活 的, 但 是 70% 的 酒 精 却 是 一 种 有 效 的 抗 细 菌 和 真 菌 的 消 毒 剂, 能 通 过 脱 水 的 原 理 来 灭 活 肠 道 病 毒 ( 溶 液 完 全 干 燥 后 ) 最 好 安 排 两 个 人 来 进 行 标 本 的 开 箱 和 登 记, 一 个 人 登 记 相 关 资 料, 另 一 个 人 戴 上 手 套 负 责 打 开 包 装 检 查 标 本 容 器 有 无 破 损 和 泄 漏, 以 及 附 随 表 格 文 件 是 否 有 污 染 任 何 污 染 的 纸 张 应 该 临 时 放 置 在 生 物 安 全 柜 中, 同 时 把 资 料 手 写 记 录 在 其 它 干 净 的 纸 上 污 染 的 文 件 应 视 如 污 染 废 弃 物 处 理 标 本 的 接 收 记 录 必 须 仔 细 检 查 标 本 标 签 上 的 信 息, 以 确 保 与 送 样 申 请 单 上 的 相 符 合 随 标 本 一 同 送 达 的 送 样 申 请 单 应 该 包 括 以 下 信 息 : EPId 编 码 ( 按 要 求 的 统 一 格 式 ) 病 人 的 姓 名 ( 最 好 包 括 拼 音 ) 报 告 的 省 份 ( 或 地 区 ) 报 告 的 城 镇 / 区 病 例 所 在 省 份 ( 或 地 区 ) 病 例 所 在 城 镇 / 区 国 家 代 码 病 例 是 否 有 免 疫 史 最 后 一 次 服 苗 日 期 标 本 来 源 是 来 源 于 AFP 病 例, 还 是 接 触 者, 或 是 其 它 如 果 是 接 触 者, 所 接 触 的 病 例 的 EPId 号 标 本 的 类 型 ( 粪 便, 肛 拭 子 等 ) 麻 痹 日 期 ( 精 确 日 期, 最 低 要 求 到 月 份 ) 标 本 采 集 日 期 标 本 送 出 日 期 78

88 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 的 接 收 和 处 理 实 验 室 收 到 标 本 时 还 应 该 记 录 以 下 信 息 : 实 验 室 收 到 标 本 的 日 期 标 本 是 否 冷 冻 或 带 冰 ( 用 于 反 馈 给 EPI 组 )( 是 / 否 ) 收 到 的 标 本 量 是 否 足 够 进 行 全 部 实 验 室 分 析 ( 是 / 否 ) 收 到 的 标 本 有 无 明 显 的 渗 漏 或 干 燥 ( 是 / 否 ) 这 是 病 例 的 第 一 份 还 是 第 二 份 标 本 每 个 标 本 应 该 分 配 一 个 专 门 的 标 识 编 号, 此 编 号 要 写 入 实 验 室 的 日 志 中 标 本 申 请 单 中 以 及 标 本 的 标 签 上 这 个 编 号 可 以 是 EPId 编 号 的 缩 写, 或 者 是 一 个 实 验 室 内 部 使 用 的 连 续 编 号 这 个 编 号 应 该 标 记 在 所 有 的 标 本 容 器 离 心 管 细 胞 培 养 管 以 及 后 来 的 全 部 实 验 室 程 序 中 的 小 管 上 6.2 标 本 的 处 理 标 本 在 接 种 之 前 要 求 进 行 预 处 理, 所 有 的 粪 便 标 本 必 须 使 用 肠 道 病 毒 对 其 有 抵 抗 力 的 氯 仿 进 行 处 理 这 种 方 法 除 了 可 以 除 去 细 菌 和 真 菌, 还 可 以 除 去 潜 在 的 细 胞 毒 性 脂 类 并 且 使 聚 集 的 病 毒 分 散 开 来 为 了 保 护 实 验 室 工 作 人 员, 所 有 粪 便 标 本 和 便 悬 液 的 处 理 必 须 在 Ⅱ 级 生 物 安 全 柜 (BSC) 中 进 行 生 物 安 全 柜 的 效 力 取 决 于 它 的 摆 放 位 置 正 确 使 用 定 期 的 测 试 和 维 护 柜 体 应 该 放 置 在 远 离 门 口 和 过 道 的 地 方 生 物 安 全 柜 所 在 区 域 的 活 动 会 干 扰 气 流, 因 此 只 有 必 需 的 人 员 才 可 进 入 此 区 域 在 生 物 安 全 柜 中 操 作 时, 尽 量 降 低 工 作 环 境 的 潜 在 污 染 和 标 本 之 间 的 交 叉 污 染 是 非 常 重 要 的, 以 下 的 工 作 会 对 其 有 很 大 的 帮 助 : 生 物 安 全 柜 在 使 用 前 和 使 用 后 应 运 转 10~20 分 钟 生 物 安 全 柜 中 操 作 动 作 不 要 过 快, 否 则 会 干 扰 气 流 生 物 安 全 柜 内 不 要 过 于 拥 挤, 并 且 千 万 不 要 阻 塞 前 面 的 开 口 划 分 工 作 区 域, 以 避 免 无 菌 试 剂 和 标 本 相 互 接 触 ( 例 如, 可 以 在 中 间 处 理 标 本, 废 液 缸 放 在 左 边, 无 菌 的 基 质 液 放 在 右 边 ) 应 该 定 期 测 试 生 物 安 全 柜 滤 板 的 完 整 性 ( 如 油 雾 试 验 ) 和 对 操 作 者 的 保 护 性 能 ( 如 碘 化 钾 释 放 试 验 ) 这 些 试 验 在 BC2756 中 有 说 明, 并 且 当 移 动 生 物 安 全 柜 或 实 验 室 布 局 发 生 明 显 改 变 的 时 候, 应 该 重 复 这 些 试 验 每 次 工 作 后 清 洁 和 消 毒 生 物 安 全 柜 的 内 表 面 ( 包 括 水 平 面 和 垂 直 面 ), 定 期 ( 如 每 月 一 次 ) 消 毒 和 清 洁 生 物 安 全 柜 工 作 台 面 下 的 托 盘 不 使 用 的 时 候 应 放 下 生 物 安 全 柜 的 工 作 窗 以 防 灰 尘 和 气 溶 胶 进 入 病 毒 分 离 用 粪 便 标 本 的 处 理 79

89 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 的 接 收 和 处 理 需 要 准 备 以 下 材 料 : 15ml 或 50ml 耐 氯 仿 离 心 管 1ml 或 5ml 吸 氯 仿 用 的 玻 璃 吸 管 5ml 和 10ml 吸 管 木 制 便 签 外 螺 旋 盖 的 冻 存 管 (5ml) 直 径 大 约 3mm 的 玻 璃 珠 混 有 抗 生 素 的 PBS( 见 6.3 部 分 ) 氯 仿 操 作 步 骤 如 下 : 在 离 心 管 上 标 记 标 本 号 每 管 中 加 入 10ml PBS 1g 玻 璃 珠 1ml 氯 仿 在 生 物 安 全 柜 中 将 每 一 份 粪 便 标 本 取 大 约 2g 加 入 标 记 好 的 离 心 管 中 ( 确 保 离 心 管 上 的 标 号 与 原 始 标 本 的 标 号 一 致 ) 剩 余 的 原 始 标 本 最 好 留 在 原 容 器 中, 冻 存 于 -20 确 保 拧 紧 离 心 管, 用 机 械 震 荡 器 剧 烈 震 荡 20 分 钟 在 确 保 离 心 机 的 盖 子 盖 好 和 离 心 桶 密 封 的 情 况 下, 用 冷 冻 离 心 机 离 心 1500g*20 分 钟 在 生 物 安 全 柜 中 将 每 一 份 标 本 的 上 清 液 分 别 吸 入 2 个 有 外 螺 旋 盖 的 冻 存 管 中 ( 如 果 上 清 液 不 清 澈, 应 再 用 氯 仿 处 理 一 次 ) 一 管 粪 便 悬 液 冻 存 于 -20 作 为 备 份, 另 一 管 存 于 4-8 以 备 接 种 粪 便 标 本 和 悬 液 的 保 存 收 到 粪 便 标 本 后, 应 该 在 第 一 个 工 作 日 或 者 尽 快 按 照 世 界 卫 生 组 织 的 操 作 手 册 进 行 处 理, 以 使 粪 便 悬 液 可 以 及 时 接 种 到 细 胞 上 然 而, 实 验 室 不 可 能 随 时 都 有 适 合 接 种 的 单 层 细 胞, 因 此 有 时 粪 便 悬 液 在 接 种 之 前 需 要 保 存 一 段 时 间 如 果 粪 便 悬 液 能 在 48 小 时 内 接 种 到 细 胞 上, 应 于 4~8 冷 藏 如 果 耽 搁 的 时 间 超 过 48 小 时, 就 应 将 所 有 粪 便 悬 液 都 冻 存 于 -20 考 虑 到 可 能 会 出 现 异 常 或 可 疑 的 实 验 结 果, 所 以 原 始 粪 便 标 本 从 收 到 之 日 起, 至 少 保 存 6 个 月, 最 好 是 12 个 月 而 且 最 好 用 原 容 器 将 其 冻 存 于 -20 由 于 许 多 实 验 室 -20 储 存 空 间 有 限, 也 可 能 有 必 要 将 原 始 粪 便 标 本 保 存 于 比 较 小 的 容 器 中, 例 如 标 记 好 的 有 外 螺 旋 盖 的 2~5ml 冻 存 管 80

90 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 的 接 收 和 处 理 在 将 粪 便 标 本 从 原 始 容 器 转 移 至 储 存 管 的 过 程 中, 必 须 格 外 小 心 避 免 它 们 之 间 的 交 叉 污 染 从 收 到 标 本 之 日 算 起, 粪 便 悬 液 要 冻 存 于 -20 至 少 3 个 月, 或 者 直 到 所 有 的 实 验 结 果 都 出 来 后 ( 有 必 要 的 话 要 包 括 型 内 鉴 别 和 序 列 分 析 结 果 ) 粪 便 悬 液 不 应 该 保 存 超 过 12 个 月, 因 为 这 会 浪 费 宝 贵 的 -20 储 存 空 间 实 验 室 操 作 技 术 规 范 所 有 粪 便 标 本 及 其 提 取 物 必 须 盛 装 在 足 够 大 的 标 记 好 的 容 器 中 ( 不 要 超 过 全 部 容 积 的 3/4, 以 留 出 膨 胀 的 空 间 ), 放 到 专 门 存 放 感 染 性 物 质 的 冰 箱 里, 绝 不 要 存 放 到 保 存 细 胞 培 养 用 品 的 冰 箱 中 实 验 室 应 该 有 冰 箱 中 内 容 物 的 清 单, 并 且 定 期 清 理 冰 箱 中 到 期 的 物 品 6.3 处 理 标 本 的 试 剂 1) 磷 酸 盐 缓 冲 液,pH (PBS) PBS 通 常 有 两 种 形 式, 即 不 完 全 PBS 和 完 全 PBS, 这 两 种 形 式 都 有 成 品 供 应 不 完 全 PBS 不 含 钙 镁 离 子 完 全 PBS 含 有 钙 镁 离 子, 用 于 制 备 粪 便 悬 液 和 稀 释 病 毒 钙 镁 离 子 的 存 在 有 助 于 病 毒 的 稳 定, 尤 其 是 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 和 其 他 肠 道 病 毒 A 液 NaCl 8.00g KCl 0.20g Na 2HPO 4( 无 水 ) 0.91g KH 2PO g 用 600~800ml 蒸 馏 水 溶 解 以 上 盐 类, 加 蒸 馏 水 补 至 1000ml,10 psi (70Kpa) 15 分 钟 高 压 灭 菌, 即 为 不 完 全 PBS 工 作 液 ( 不 含 钙 镁 离 子 ) B 液 MgCl 2.6H 2O 0.10g 溶 解 于 100ml 蒸 馏 水 中,10 psi (70Kpa) 15 分 钟 高 压 灭 菌 C 液 CaCl g 溶 解 于 100ml 蒸 馏 水 中,10 psi (70Kpa) 15 分 钟 高 压 灭 菌 81

91 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 的 接 收 和 处 理 完 全 PBS 工 作 液 完 全 PBS 工 作 液 含 有 0.11M 的 NaCl 取 1 份 B 液 和 1 份 C 液 加 到 8 份 A 液 中 即 可 也 可 以 使 用 市 售 的 成 品 片 剂 和 粉 剂, 按 照 厂 家 的 说 明 配 制 和 灭 菌 2) 含 有 抗 生 素 的 PBS 将 1X10 6 单 位 的 结 晶 青 霉 素 G 和 1g 硫 酸 链 霉 素 溶 解 于 100ml 无 菌 的 完 全 PBS 中 ; 分 装 成 5ml 每 管 冻 存 于 -20 使 用 时, 取 5ml 母 液 加 到 500ml 完 全 PBS 中, 使 青 链 霉 素 最 终 含 量 分 别 为 100 单 位 /ml 和 100ug/ml,4~8 可 以 保 存 一 周 以 上 3) 其 他 的 抗 生 素 青 霉 素 和 链 霉 素 是 细 胞 培 养 和 常 规 病 毒 培 养 中 最 常 用 的 抗 生 素, 也 最 为 便 宜 在 达 到 终 浓 度 要 求 的 情 况 下, 配 合 氯 仿 的 提 取, 青 链 霉 素 通 常 能 限 制 粪 便 悬 液 中 细 菌 污 染 水 平 但 有 时 使 用 青 霉 素 和 链 霉 素 也 不 能 提 供 足 够 的 保 护, 这 时 可 尝 试 使 用 其 它 抗 生 素 庆 大 霉 素 比 青 霉 素 和 链 霉 素 的 价 格 贵, 但 它 的 抑 菌 谱 较 广 并 且 可 以 高 压 庆 大 霉 素 使 用 的 终 浓 度 为 50ug/ml 终 浓 度 25 单 位 /ml 的 制 霉 菌 素 可 抗 真 菌 和 酵 母 菌 污 染, 但 只 是 抑 制 真 菌, 并 不 能 杀 灭 真 菌, 它 在 36 会 很 快 失 活 ( 常 规 的 细 胞 孵 育 温 度 ), 并 且 某 些 批 号 的 制 霉 菌 素 具 有 轻 微 的 细 胞 毒 性 82

92 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 第 7 部 分 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 7.1 推 荐 用 于 分 离 脊 灰 病 毒 的 细 胞 系 脊 灰 病 毒 在 许 多 不 同 的 人 或 哺 乳 动 物 传 代 细 胞 系 上 都 易 于 生 长 所 有 怀 疑 含 有 脊 灰 病 毒 的 标 本 都 应 该 接 种 到 下 面 两 种 细 胞 系 上 : L20B 细 胞, 一 种 小 鼠 细 胞 系 ( 肺 细 胞 ), 通 过 基 因 工 程 的 方 法 使 其 表 达 了 人 类 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 受 体 ;( 有 的 实 验 室 可 能 需 要 向 当 地 政 府 声 明 L20B 细 胞 为 基 因 修 饰 物, 以 符 合 相 应 的 要 求 ) RD 细 胞, 来 源 于 人 横 纹 肌 肉 瘤 选 择 这 两 种 细 胞 系 用 于 脊 髓 灰 质 炎 的 实 验 室 诊 断 可 以 使 技 术 标 准 化, 并 且 使 不 同 实 验 室 的 结 果 可 以 比 较 这 些 细 胞 系 对 肠 道 病 毒 的 敏 感 性 如 下 所 述 : L20B 细 胞 对 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 敏 感, 感 染 后 产 生 特 征 性 的 肠 道 病 毒 致 细 胞 病 变 效 应 (CPE) 该 细 胞 对 脊 灰 病 毒 具 有 高 度 的 选 择 性 一 些 在 肺 组 织 细 胞 上 可 以 产 生 CPE 的 非 脊 灰 的 其 它 病 毒 ( 如 腺 病 毒 和 呼 肠 孤 病 毒 ) 也 可 以 在 L20B 细 胞 产 生 CPE, 但 这 些 病 毒 产 生 的 CPE 通 常 与 脊 灰 病 毒 产 生 的 CPE 明 显 不 同 少 数 NPEV( 如 柯 萨 奇 A 组 病 毒 ) 也 能 在 L20B 细 胞 上 生 长 ( 偶 尔 并 且 仅 当 它 们 已 经 先 在 其 它 细 胞 系 上 生 长 繁 殖 过 ), 他 们 能 产 生 典 型 的 肠 道 病 毒 CPE RD 细 胞 对 脊 灰 病 毒 许 多 ECHO 病 毒 和 一 些 其 它 肠 道 病 毒 高 度 敏 感, 感 染 后 产 生 特 征 性 的 肠 道 病 毒 CPE 两 种 细 胞 的 结 合 使 用, 使 检 测 脊 髓 灰 质 炎 病 毒 的 敏 感 性 和 特 异 性 大 大 提 高, 同 时 还 保 留 了 检 出 一 些 肠 道 病 毒 的 能 力, 可 以 作 为 良 好 的 实 验 技 术 的 保 证 第 3 种 细 胞 系,HEp-2( 辛 辛 那 提 ), 在 最 初 的 时 候 曾 经 在 网 络 实 验 室 中 常 规 使 用, 现 在 已 经 被 L20B 细 胞 所 代 替 脊 灰 病 毒 和 柯 萨 奇 B 组 病 毒 可 以 在 Hep-2 上 生 长 并 产 生 CPE 取 消 使 用 这 种 细 胞 会 导 致 非 脊 灰 肠 道 病 毒 分 离 率 的 下 降, 特 别 是 柯 萨 奇 B 组 病 毒 在 社 区 中 流 行 的 时 候 但 是, 当 联 合 使 用 L20B 和 RD 细 胞 时, 极 大 地 提 高 了 脊 灰 的 检 出 率 这 个 优 点 可 以 弥 补 上 述 的 缺 点, 特 别 当 标 本 是 含 有 其 它 肠 道 病 毒 的 混 合 标 本 时 83

93 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 实 验 室 操 作 技 术 规 范 定 期 地 使 用 脊 灰 疫 苗 参 考 株 来 滴 定 RD 和 L20B 细 胞, 以 监 测 两 种 细 胞 对 脊 灰 病 毒 的 敏 感 性 是 很 重 要 的 也 应 该 注 意 避 免 细 胞 被 支 原 体 所 污 染, 如 有 污 染 需 要 丢 弃 该 细 胞, 并 且 每 传 15 代 或 者 使 用 3 个 月 就 要 更 换 工 作 细 胞 系, 即 从 实 验 室 细 胞 库 中 复 苏 保 存 在 液 氮 中 的 细 胞 7.2 分 离 脊 灰 病 毒 及 其 它 肠 道 病 毒 需 要 有 以 下 物 品 : 试 管 培 养 的 L20B 和 RD 细 胞 维 持 液 1ml 和 5ml 的 一 次 性 塑 料 移 液 管 按 以 下 步 骤 操 作 : 显 微 镜 下 观 察 单 层 细 胞, 以 确 保 细 胞 是 健 康 的 一 个 合 适 的 单 层 细 胞 会 在 传 代 后 2~3 天 内 形 成 倒 掉 生 长 液, 换 上 1ml 的 维 持 液 每 一 份 标 本 接 种 需 要 2 支 RD 细 胞 的 培 养 管 和 2 支 L20B 细 胞 的 培 养 管, 正 确 标 记 每 支 试 管 ( 包 括 标 本 的 编 号 日 期 传 代 数 ) 对 每 一 种 细 胞 标 记 一 管 作 为 阴 性 对 照 注 意 : 要 同 时 接 种 两 种 细 胞 系 每 支 试 管 接 种 0.2ml 的 标 本 悬 液, 接 种 时 温 度 要 求 36, 并 置 于 一 个 稳 定 的 斜 面 (5 ) 上 如 果 旋 转 的 话,L20B 细 胞 不 会 生 长, 并 且 不 利 于 脊 灰 病 毒 的 分 离 使 用 标 准 或 倒 置 显 微 镜 每 天 观 察 细 胞 培 养 管, 以 发 现 CPE 的 出 现 记 录 接 种 管 和 对 照 管 细 胞 所 发 生 的 变 化 至 少 一 周, 记 录 CPE(1+~4+) 提 示 细 胞 受 毒 性 反 应 老 化 或 污 染 的 影 响 而 发 生 的 变 化 (1+,<25%; 2+, 25%~50%; 3+, 50%~75%; 4+, 75%~100%) 如 果 有 特 征 性 的 肠 道 病 毒 CPE 出 现, 例 如 细 胞 变 圆, 折 光 增 强 并 脱 离 管 壁, 那 么 请 记 录 下 来, 并 观 察 直 到 75% 的 细 胞 发 生 变 化 (3+ CPE), 然 后 储 藏 在 -20 以 备 二 次 传 代, 此 时 试 管 种 含 有 2ml 的 液 体 同 一 病 例 的 二 次 传 代 的 病 毒 分 离 物 可 以 放 到 一 起 用 于 定 型 或 型 内 鉴 别 如 果 7 天 之 后 没 有 CPE 出 现, 那 么 再 盲 传 1 代 继 续 观 察 7 天 ( 注 意 : 同 一 病 84

94 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 例 标 本 的 细 胞 培 养 物 不 能 混 在 一 起 再 传 代, 例 如 : 不 同 细 胞 的 培 养 物 应 单 独 传 代 ) 阴 性 对 照 在 丢 弃 之 前 要 至 少 观 察 14 天 ( 见 图 6.1) 如 果 RD 细 胞 出 现 阳 性 结 果 而 14 天 后 L20B 细 胞 仍 然 阴 性, 要 将 RD 细 胞 的 阳 性 分 离 物 在 L20B 细 胞 上 续 种 一 代, 并 且 再 观 察 7 天 以 排 除 脊 灰 病 毒 存 在 的 可 能 性 ( 见 图 6.1) 除 了 肠 道 病 毒 外, 含 有 一 些 其 他 病 毒 的 粪 便 标 本 接 种 到 L20B 细 胞 上 也 会 产 生 CPE( 例 如 呼 肠 孤 病 毒 和 腺 病 毒 ) 一 些 由 非 肠 道 病 毒 产 生 的 CPE 也 要 如 实 记 录 下 来 一 些 非 脊 灰 肠 道 病 毒 也 可 以 在 肺 组 织 细 胞 上 产 生 CPE, 因 此 也 可 以 在 L20B 细 胞 上 产 生 CPE 这 些 标 本 也 应 该 进 行 脊 灰 病 毒 定 型 实 验 以 排 除 这 些 标 本 含 有 脊 灰 病 毒 的 可 能 性 如 果 定 型 结 果 不 能 确 定 或 无 法 解 释, 那 么 这 个 标 本 必 须 送 至 地 区 参 比 实 验 室 进 行 分 析 注 意 : 毒 性 反 应 : 如 果 在 接 种 后 1~2 天 内 细 胞 迅 速 老 化, 这 可 能 是 由 于 标 本 中 含 有 毒 性 物 质 而 导 致 的 非 特 异 性 毒 性 反 应 这 些 已 接 种 标 本 的 试 管 应 在 -20 冻 存, 融 化 后 取 0.2ml 接 种 到 同 一 类 型 细 胞 中 ( 此 时 是 第 二 代 ) 如 果 又 出 现 了 毒 性 反 应, 那 么 应 该 取 原 始 标 本 用 PBS 稀 释 10 倍, 再 次 接 种 到 同 种 细 胞 中 这 次 应 被 认 为 是 第 一 代 微 生 物 污 染 : 由 于 细 菌 污 染 而 造 成 培 养 液 混 浊 或 细 胞 死 亡 经 常 使 病 毒 造 成 的 CPE 无 法 确 定 或 根 本 无 法 出 现 重 新 取 原 始 标 本, 用 氯 仿 处 理, 按 上 述 步 骤 重 新 接 种 到 新 鲜 细 胞 上 盲 传 : 有 时 一 周 之 后 传 代 细 胞 会 老 化, 甚 至 细 胞 对 照 也 出 现 了 病 变 这 时 已 接 种 标 本 的 试 管 应 在 -20 冻 存, 融 化 后 取 0.2ml 接 种 到 同 一 类 型 的 新 鲜 单 层 细 胞 中, 再 观 察 7~10 天 如 果 此 时 仍 然 没 有 产 生 CPE, 那 么 认 为 这 个 标 本 是 阴 性 在 L20B 细 胞 上 续 种 一 代 : 现 在 已 知, 少 量 的 脊 灰 病 毒 接 种 第 一 代 时, 在 L20B 细 胞 上 生 长 状 态 较 差, 无 法 产 生 可 识 别 的 CPE 但 是 它 们 可 在 RD 细 胞 上 生 长, 此 时 再 接 种 到 L20B 细 胞 上 可 产 生 可 识 别 的 CPE 因 此, 为 了 不 漏 检 脊 灰 病 毒, 对 于 L20B 阴 性 而 RD 阳 性 的 标 本, 应 取 0.2mlRD 细 胞 的 阳 性 分 离 物 接 种 到 L20B 细 胞 上 ( 见 图 6.1) 85

95 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 实 验 室 操 作 技 术 规 范 尽 量 小 心 以 避 免 在 接 种 细 胞 或 传 代 时 发 生 病 毒 交 叉 污 染 不 要 将 已 接 种 病 毒 的 细 胞 培 养 管 中 的 液 体 倾 倒 掉 ; 应 该 用 移 液 管 来 移 走 液 体, 每 一 步 都 要 换 新 的 移 液 管 不 要 用 微 量 移 液 器, 除 非 使 用 带 滤 膜 的 可 阻 止 气 溶 胶 产 生 的 吸 头 (ARTs) 避 免 剧 烈 震 荡 而 产 生 气 溶 胶, 如 有 液 滴 溅 出, 要 立 即 用 消 毒 剂 清 理 干 净 用 于 脊 灰 病 毒 分 离 的 补 充 实 验 在 项 目 的 最 后 阶 段, 当 脊 灰 成 为 焦 点 或 发 生 零 星 的 疾 病 病 例 时, 要 考 虑 到 从 AFP 病 例 中 分 离 出 的 标 本 中 有 脊 灰 野 病 毒 漏 检 情 况 在 这 种 情 况 下, 就 需 要 用 1 种 或 2 种 额 外 的 方 法 来 检 验 额 外 的 传 代 : 如 上 所 述, 接 种 过 病 毒 的 细 胞 悬 液 要 经 过 冻 化 后, 重 新 接 种 到 新 的 单 层 细 胞 上 以 释 放 存 在 的 病 毒 标 本 培 养 没 有 产 生 CPE 的 情 况 下, 特 别 是 如 果 发 生 毒 性 反 应 或 污 染 时, 使 用 新 的 健 康 的 细 胞 可 能 会 产 生 可 识 别 的 CPE 但 病 毒 传 代 不 要 超 过 3 次, 因 为 每 一 次 操 作 都 会 增 加 病 毒 交 叉 污 染 的 机 会, 从 而 产 生 假 阳 性 结 果 标 本 吸 附 到 单 层 细 胞 上 : 不 要 将 标 本 悬 液 直 接 加 到 含 有 维 持 液 的 细 胞 上, 要 将 细 胞 生 长 液 先 倒 掉, 用 无 菌 PBS 清 洗 单 层 细 胞, 在 室 温 条 件 下, 使 0.2ml 标 本 悬 液 先 吸 附 到 单 层 细 胞 上, 吸 附 过 程 中 轻 轻 摇 动, 偶 尔 旋 转 使 接 种 液 分 布 均 匀, 并 可 以 防 止 周 围 层 细 胞 干 燥 然 后 再 加 入 1ml 的 维 持 液 使 用 这 种 方 法 可 以 检 测 得 到 稍 低 浓 度 的 病 毒, 减 小 标 本 的 毒 性 反 应, 而 且 至 少 可 以 使 CPE 提 前 一 天 产 生 缺 点 就 是 必 须 考 虑 到 它 会 增 加 病 毒 ( 和 可 能 的 细 菌 ) 交 叉 污 染 的 问 题, 因 为 在 这 个 步 骤 中 增 加 了 开 盖 / 关 盖 的 次 数 因 为 当 使 用 含 有 很 高 滴 度 病 毒 标 本 的 时 候 交 叉 污 染 的 可 能 性 很 大, 所 以 不 许 用 这 种 方 法 接 种 病 毒 分 离 物 7.3 脊 灰 病 毒 分 离 物 的 鉴 定 进 行 脊 灰 分 离 物 定 型 时, 稀 释 后 的 标 本 与 等 体 积 的 一 组 抗 血 清 混 合, 它 们 分 别 是 在 动 物 体 内 生 成 的 抗 脊 灰 1,2 和 3 型 抗 血 清 这 些 血 清 是 由 荷 兰 Bilthoven 国 家 公 共 健 康 和 环 境 研 究 院 (RIVM) 研 制 的, 并 由 WHO 免 费 提 供 给 WHO 脊 灰 网 络 实 验 室 使 用 微 量 中 和 实 验 技 术, 血 清 / 病 毒 混 合 物 在 36 孵 育 1 小 时 使 得 抗 体 与 病 毒 结 合 然 后, 将 细 胞 悬 液 加 入 到 微 孔 板 中, 逐 日 观 察 CPE 能 够 阻 止 产 生 CPE 的 抗 血 清 意 味 着 与 病 毒 属 同 一 型 别 86

96 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 图 7.1 在 RD 和 L20B 细 胞 上 分 离 脊 灰 病 毒 流 程 图 粪 便 标 本 RD 和 L20B 细 胞 培 养 报 告 阴 性 RD 细 胞 悬 液 接 种 到 L20B 细 胞 在 L20B 细 胞 中 定 血 清 型 可 定 型 报 告 脊 灰 血 清 型 并 将 标 本 送 地 区 参 比 实 验 室 进 行 型 内 鉴 别 不 可 定 型 报 告 L20B 细 胞 中 生 长 的 病 毒 无 法 定 型 **, 并 将 标 本 送 地 区 参 比 实 验 室 型 内 鉴 别 报 告 非 脊 灰 病 毒 无 法 定 型 的 肠 道 病 毒 用 RD 细 胞 定 肠 道 病 毒 血 清 型 *** 可 定 型 报 告 肠 道 病 毒 血 清 型 * 传 两 代, 至 少 观 察 14 天 ** 如 果 从 无 流 行 或 最 近 才 流 行 的 国 家 和 地 区 中 采 集 的 标 本 在 L20B 细 胞 中 生 长 而 无 法 定 型, 要 通 知 地 区 参 比 实 验 室 协 调 员 和 国 家 项 目 组 人 员 *** 对 非 脊 灰 肠 道 病 毒 进 行 定 型 仅 仅 在 EPI 要 求 时 才 做 87

97 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 准 备 RIVM 脊 灰 定 型 血 清 参 与 脊 灰 消 除 计 划 的 实 验 室 的 一 个 最 基 本 的 功 能 是 从 临 床 标 本 中 鉴 定 脊 灰 分 离 物 而 鉴 定 的 第 一 步 就 是 使 用 这 种 血 清, 即 用 一 组 型 特 异 的 包 括 1,2 和 3 型 的 多 克 隆 脊 灰 抗 血 清 制 成 组 合 血 清, 型 特 异 的 抗 血 清 可 以 用 来 进 行 脊 灰 病 毒 血 清 型 的 鉴 别 兔 抗 血 清 相 应 的 滴 度 为 : 抗 脊 灰 1 型 40,960, 抗 脊 灰 2 型 163,840, 抗 脊 灰 3 型 40,960 这 种 抗 血 清 可 以 通 过 日 内 瓦 VAM/V&B/WHO 获 得, 并 由 WHO 分 发 给 参 与 脊 灰 消 除 计 划 的 实 验 室 全 球 的 储 备 有 限, 所 以 要 求 各 实 验 室 正 确 使 用 每 一 支 RIVM 脊 灰 定 型 抗 血 清 管 含 有 0.5ml 的 兔 抗 血 清 应 该 加 入 63.5ml 的 维 持 液 使 其 稀 释 至 工 作 浓 度 为 1:128, 总 体 积 为 64ml 按 表 7.1 来 准 备 组 合 血 清 表 7.1 准 备 RIVM 定 型 试 剂 组 合 血 清 Polio 1, 2, 3 Polio 1, 2 Polio 1, 3 Polio 2, 3 1/128 稀 释 度 抗 血 清 的 体 积 脊 灰 1 型 10ml 15ml 15ml / 脊 灰 2 型 10ml 15ml / 15ml 脊 灰 3 型 10ml / 15ml 15ml 总 体 积 30ml 30ml 30ml 30ml 将 组 合 血 清 分 装 在 清 楚 标 记 好 的 有 螺 旋 盖 的 冻 存 管 中, 每 支 1ml, 保 存 在 -20 剩 余 的 单 价 抗 血 清 也 应 该 保 存 在 冻 存 管 中 保 存 于 -20, 用 来 鉴 定 已 分 成 单 型 的 病 毒 分 离 物 或 者 下 一 次 用 来 配 制 组 合 血 清 每 30ml 储 存 液 足 可 以 进 行 150 次 定 型 实 验 实 验 室 操 作 技 术 规 范 当 新 配 制 一 批 组 合 血 清 时, 应 该 使 用 脊 灰 疫 苗 株 来 证 实 该 组 合 血 清 可 以 正 确 地 定 型, 这 点 是 非 常 必 要 的 88

98 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 脊 灰 病 毒 定 型 的 中 和 实 验 使 用 高 滴 度 的 多 克 隆 抗 血 清, 与 大 约 100 CCID 50 的 未 知 病 毒 标 本 混 合 因 为 一 般 认 为 能 够 使 健 康 的 细 胞 出 现 3+ 或 者 4+ 的 CPE 的 病 毒 量 大 约 是 10 5 ~10 6 CCID 50 /ul 因 此 我 们 选 择 10-3 和 10-4 两 个 稀 释 度 直 接 用 于 实 验, 这 样 由 于 不 用 每 次 实 验 前 都 做 病 毒 的 滴 定 实 验, 因 而 节 省 了 时 间 和 实 验 材 料 当 然 每 次 实 验 中 都 要 进 行 回 滴, 以 便 计 算 实 验 中 所 用 病 毒 的 滴 度 是 否 正 确 如 果 标 本 接 种 后 在 RD 和 L20B 细 胞 上 都 出 现 了 病 变, 那 么 应 该 首 先 鉴 定 L20B 细 胞 分 离 物 这 样 能 够 很 快 地 得 到 重 要 的 结 果 如 果 这 样 无 法 鉴 定 出 脊 灰 病 毒 的 型 别, 那 么 就 要 使 用 RD 细 胞 分 离 物 L20B 细 胞 分 离 物 应 该 送 至 地 区 参 比 实 验 室 进 一 步 鉴 定 图 7.2 脊 灰 病 毒 定 型 实 验 的 板 面 设 计 P1+P2+P3 病 毒 对 照 病 毒 编 号 : 病 毒 编 号 : 回 滴 编 号 : 回 滴 编 号 : 细 胞 对 照 (i) 脊 灰 病 毒 中 和 实 验 的 操 作 步 骤 : 进 行 中 和 实 验 所 需 要 的 材 料 : 带 盖 子 的 无 菌 96 孔 平 底 微 量 细 胞 培 养 板 无 菌 无 毒 的 封 条 ( 如 果 使 用 的 不 是 CO 2 孵 箱 的 话 ) 用 于 稀 释 的 5ml 无 菌 的 管 子 1ml 和 2ml 一 次 性 塑 料 移 液 管 灭 菌 的 50ul 带 有 可 阻 止 气 溶 胶 产 生 的 (ARTs) 带 滤 芯 的 吸 尖 适 合 于 病 毒 生 长 的 健 康 细 胞 ( 通 常 是 L20B 细 胞 ) 89

99 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 抗 脊 灰 组 合 血 清 维 持 液 按 下 列 步 骤 进 行 操 作 : 1) 在 微 孔 板 的 边 缘 按 图 7.2 所 示 ( 每 板 可 以 鉴 定 两 株 病 毒 ) 做 好 标 记 2) 将 4 组 抗 血 清 储 存 液 分 别 加 入 到 1~8 列,A~D 行 中 去, 每 孔 50ul, 加 不 同 的 组 合 血 清 时 需 要 更 换 吸 尖 3) 加 50ul 维 持 液 到 病 毒 对 照 孔 中,A9~D10 4) 加 50ul 维 持 液 到 回 滴 孔 中,E1~H10 5) 加 100ul 维 持 液 到 细 胞 对 照 孔 中,G11~H12, 然 后 盖 上 盖 子 6) 按 10-1 ~10-7 标 记 稀 释 管, 如 图 7.4 标 记 好 每 组 需 要 稀 释 的 标 本 号 7) 取 0.9ml 维 持 液 到 1~2 号 管 和 5~7 号 管 中, 取 1.8ml 维 持 液 到 3 号 和 4 号 管 中 8) 用 无 菌 移 液 器 和 带 滤 芯 的 移 液 管 加 0.1ml 病 毒 悬 液 到 第 一 个 管 (10-1 稀 释 度 ) 中 9) 换 一 个 吸 尖, 轻 轻 地 并 彻 底 地 混 匀, 避 免 产 生 气 溶 胶 10) 取 0.1ml 到 第 二 个 管 子 中, 丢 弃 使 用 过 的 吸 尖 11) 重 复 稀 释 的 步 骤, 取 0.2ml 到 第 3 管 和 第 4 管 中 ( 图 7.3) 图 7.3 病 毒 的 稀 释 0.1ml 病 毒 0.9ml 维 持 液 病 毒 稀 释 度 12) 在 第 9 和 第 10 列,E 和 F 行 中, 先 后 加 入 10-7 和 10-6 稀 释 度 的 病 毒 到 回 滴 孔 中 13) 取 一 个 病 毒 可 以 使 用 同 一 支 带 滤 芯 的 吸 尖,, 顺 序 为 从 高 稀 释 度 向 低 稀 释 度 加, 即 10-7 到

100 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 14) 加 入 50ul 的 病 毒 到 待 测 孔 中 : 标 本 1 的 10-3 稀 释 度 加 入 到 A1~A10,10-4 稀 释 度 加 入 到 B1~B10 等 等 15) 重 复 上 两 个 步 骤, 加 入 2 号 病 毒 标 本,G 和 H 行 作 病 毒 滴 度 回 滴,2 号 病 毒 10-3 稀 释 度 加 入 到 C1~C10 孔,10-4 稀 释 度 加 入 到 D1~D10 孔 16) 盖 上 盖 子, 在 36 孵 育 1~3 个 小 时 17) 在 孵 育 期 间, 用 胰 酶 消 化 细 胞, 并 制 备 细 胞 悬 液, 浓 度 大 约 为 每 毫 升 个 细 胞, 每 块 扳 子 至 少 需 要 10ml( 见 第 4 部 分 ) 18) 加 入 100ul 细 胞 悬 液 到 每 个 待 测 和 对 照 孔 中 19) 如 果 不 使 用 CO 2 孵 箱, 要 使 用 无 毒 性 的 封 口 膜 封 闭 扳 子 20) 在 36 孵 育 21) 使 用 倒 置 显 微 镜 每 天 观 察 并 记 录 有 无 CPE 的 产 生 22) 在 病 毒 对 照 孔 出 现 100% CPE 的 时 候 ( 通 常 在 3~5 天 ), 继 续 观 察 并 记 录 24 小 时 实 验 室 操 作 技 术 规 范 当 进 行 稀 释 的 时 候, 加 完 病 毒 之 后 要 记 得 换 吸 尖 或 移 液 管, 以 避 免 带 出 吸 附 在 管 壁 上 的 病 毒 (ii) 结 果 的 解 释 : 细 胞 对 照 孔 应 该 有 完 整 的 单 层 细 胞 病 毒 对 照 孔 应 该 完 全 出 现 CPE 病 毒 回 滴 孔 用 来 证 实 本 次 实 验 所 用 的 病 毒 量 至 少 有 一 个 稀 释 度 在 32~320 CCID 50 ( 也 就 是 说, 在 50ul 病 毒 中, 病 毒 的 滴 度 在 和 之 间 时, 相 当 于 原 始 标 本 中 为 至 ) 应 该 根 据 适 当 的 病 毒 滴 度 来 判 读 实 验 结 果 如 果 实 验 中 病 毒 的 滴 度 不 在 适 当 的 范 围 内, 那 么 应 该 根 据 调 整 后 的 滴 度 ( 或 者 高, 或 者 低, 以 合 适 的 滴 度 值 计 算 ) 重 新 进 行 实 验, 使 其 含 有 正 确 的 病 毒 量 微 孔 板 中, 能 够 阻 止 产 生 CPE 的 抗 血 清 意 味 着 它 可 以 识 别 病 毒 分 离 物 或 者 混 合 病 毒, 因 而, 通 过 抗 血 清 的 型 别 可 以 判 读 病 毒 的 血 清 型 因 为 抗 血 清 可 以 中 和 病 毒 的 感 染 性, 因 此 在 这 种 抗 血 清 存 在 的 孔 中 该 病 毒 不 能 复 制 图 7.4 示 出 了 一 个 典 型 的 判 读 结 果 的 示 意 图 91

101 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 图 7.4 中 和 实 验 鉴 定 脊 灰 型 别 示 意 图 P1+P2+P3 病 毒 对 照 病 毒 编 号 : 病 毒 编 号 : 回 滴 编 号 : 回 滴 编 号 : 细 胞 对 照 病 变 未 病 变 未 使 用 病 毒 X 的 滴 度 : CCID 50 /50ul; 在 10-3 稀 释 度 的 实 验 中, 病 毒 量 为 320 ( ) CCID 50 在 10-4 稀 释 度 的 实 验 中, 病 毒 数 量 为 32 ( ) CCID 50 病 毒 被 抗 血 清 1+2+3;1+2;1+3 所 中 和, 所 以 是 脊 灰 1 型 病 毒 病 毒 Y 的 滴 度 :10 5 CCID 50 /50ul; 在 10-3 稀 释 度 的 实 验 中, 病 毒 数 量 为 100 ( ) CCID 50 在 10-4 稀 释 度 的 实 验 中, 病 毒 数 量 为 10 ( ) CCID 50 病 毒 被 抗 血 清 1+2+3; 1+2; 2+3 所 中 和, 所 以 是 脊 灰 2 型 病 毒 细 胞 对 照 : 细 胞 正 常 生 长 92

102 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 表 7.2 病 毒 中 和 实 验 鉴 定 脊 灰 病 毒 型 别 的 结 果 解 释 抗 血 清 P1+P2+P3 抗 血 清 P1+P2 抗 血 清 P1+P3 抗 血 清 P2+P3 病 毒 型 别 鉴 定 脊 灰 病 毒 1 型 脊 灰 病 毒 2 型 脊 灰 病 毒 3 型 脊 灰 1 型 2 型 混 合 病 毒 脊 灰 1 型 3 型 混 合 病 毒 脊 灰 2 型 3 型 混 合 病 毒 脊 灰 1 型 2 型 3 型 混 合 病 毒 非 脊 灰 病 毒, 或 者 脊 灰 病 毒 与 其 他 肠 道 病 毒 的 混 合 病 毒 + 代 表 出 现 CPE 0 代 表 未 出 现 CPE 注 意 : 当 含 有 所 有 脊 灰 病 毒 型 别 的 抗 血 清 的 孔 出 现 CPE 的 时 候 ( 上 表 的 最 后 一 行 ), 有 两 种 可 能 性 第 1 种 可 能 性 是 该 病 毒 不 是 脊 灰 病 毒, 而 是 其 它 病 毒 ( 例 如 肠 道 病 毒 或 腺 病 毒 ) 第 2 种 可 能 性 是 该 病 毒 是 脊 灰 病 毒 和 其 它 病 毒 的 混 合 病 毒 因 为 检 测 脊 灰 病 毒 才 是 重 中 之 重, 所 以 L20B 细 胞 悬 液 应 该 立 即 送 至 地 区 参 比 实 验 室 作 进 一 步 的 鉴 定 在 表 7.2 中, 列 出 了 所 有 可 能 产 生 CPE 或 无 CPE 产 生 的 组 合, 在 孔 中 含 有 不 同 的 病 毒 抗 血 清 时 可 出 现 不 同 的 结 果, 每 种 结 果 都 列 表 给 出 了 正 确 的 解 释 如 果 实 验 中 病 毒 病 毒 对 照 量 太 多, 或 者 含 有 两 种 病 毒 时, 第 2 种 病 毒 的 浓 度 太 低 时, 结 果 会 发 生 病 毒 的 突 破 现 象 ; 因 此 建 议 所 有 的 混 合 病 毒 都 要 用 单 型 抗 血 清 来 鉴 定 用 所 有 的 抗 血 清 来 定 型 是 没 有 必 要 的 (iii) 核 实 病 毒 型 别 的 方 案 1) 从 脊 灰 定 型 板 中 适 当 的 孔 中 收 集 病 毒 2) 当 有 密 封 条 封 住 板 子 时, 不 要 去 除, 因 为 这 样 会 导 致 交 叉 污 染 用 70% 的 酒 精 擦 拭 密 封 条, 然 后 用 一 支 热 的 玻 璃 移 液 管 或 无 菌 的 针 头 刺 破 密 封 膜 千 万 不 要 用 玻 璃 移 液 管 硬 刺 塑 料 盖 子, 因 为 这 样 会 打 破 玻 璃 移 液 管 而 造 成 严 重 的 伤 害 3) 将 病 毒 稀 释 10 倍 4) 准 备 一 块 板 子, 为 每 份 待 测 病 毒 标 本 划 出 一 部 分, 其 中 两 孔 加 入 50ul 的 抗 脊 93

103 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 灰 1 型 血 清, 两 孔 加 入 50ul 的 抗 脊 灰 2 型 血 清, 两 孔 加 入 50ul 的 抗 脊 灰 3 型 血 清, 还 有 两 孔 加 入 50ul 的 生 长 液, 它 们 作 为 病 毒 对 照 5) 向 这 8 个 孔 中 加 入 50ul 的 稀 释 好 的 病 毒 6) 在 37 孵 育 1 个 小 时, 然 后 加 入 100ul 的 细 胞 悬 液 7) 将 板 子 密 封, 在 36 孵 育 24~48 小 时, 并 记 录 CPE 的 产 生 (iv) 毒 株 的 送 检 消 灭 脊 灰 规 划 组 尽 快 获 悉 野 病 毒 和 VDPV 的 信 息 是 很 关 键 的 从 AFP 病 例 中 接 触 者 中 以 及 疑 似 脊 灰 病 例 中 分 离 到 的 脊 灰 病 毒, 都 要 及 时 地 送 到 地 区 参 比 实 验 室 ( 详 细 内 容 请 参 考 第 10 部 分 标 本 和 分 离 物 的 运 输 ) 如 果 分 离 到 脊 灰 病 毒 的 混 合 物, 那 么 要 将 混 合 物 和 分 成 单 型 的 分 离 物 都 送 到 地 区 参 比 实 验 室 进 行 定 型 和 型 内 鉴 别 如 果 一 个 实 验 室 将 混 合 病 毒 分 成 单 型 或 者 鉴 定 病 毒 有 困 难, 那 么 请 尽 快 将 分 离 物 和 一 部 分 原 始 标 本 送 至 合 适 的 地 区 参 比 实 验 室 或 专 项 实 验 室 7.4 鉴 定 非 脊 灰 肠 道 病 毒 在 所 有 人 群 中 都 有 非 脊 灰 肠 道 病 毒 (NPEVs) 的 循 环, 而 且 肠 道 病 毒 的 感 染 有 不 同 的 临 床 表 现 形 式, 有 的 是 无 症 状, 而 有 的 表 现 为 类 脊 灰 的 急 性 弛 缓 性 麻 痹 症 状 一 般 来 说, 根 据 当 地 环 境 和 气 候 的 不 同, 从 健 康 儿 童 采 集 的 粪 便 标 本 中 有 5%~25% 的 可 能 含 有 NPEVs 为 了 达 到 消 灭 脊 灰 的 目 的, 没 有 必 要 对 这 些 病 毒 进 行 定 型, 报 结 果 时 只 要 报 NPEVs 就 可 以 了 另 外, 随 着 L20B 细 胞 的 引 入 和 使 用, 再 也 不 需 要 对 混 合 病 毒 标 本 中 可 能 掩 盖 脊 灰 病 毒 存 在 的 非 脊 灰 肠 道 病 毒 进 行 中 和 了 但 是, 许 多 实 验 室 希 望 对 这 些 肠 道 病 毒 标 本 进 行 定 型 以 获 得 它 们 的 流 行 病 学 信 息 根 据 推 荐 的 脊 灰 病 毒 和 肠 道 病 毒 的 分 离 和 鉴 定 的 流 程 图 ( 图 7.1), 可 以 将 临 床 标 本 接 种 到 RD 细 胞 进 行 肠 道 病 毒 的 鉴 定 (i) 抗 血 清 可 以 在 动 物 体 内 获 得 许 多 抗 艾 柯 病 毒 和 柯 萨 奇 病 毒 的 抗 血 清 因 为 病 毒 的 类 型 众 多, 在 实 践 中 作 单 型 中 和 实 验 是 划 不 来 的, 有 一 种 方 法 只 用 9 组 抗 血 清 就 可 以 鉴 定 许 多 种 病 毒 由 荷 兰 Bilthoven 国 家 公 众 健 康 与 环 境 研 究 院 (RIVM) 制 备 的 抗 大 多 数 常 见 的 ECHO 病 毒 和 柯 萨 奇 病 毒 的 马 抗 血 清, WHO(V&B/VAM) 免 费 提 供 给 WHO 脊 灰 网 络 实 验 室 每 个 RIVM 肠 道 病 毒 定 型 试 剂 的 组 合 抗 血 清 包 括 抗 肠 道 病 毒 组 合 A,B,C,D,E, F 和 G, 抗 柯 萨 奇 B 组 病 毒 的 组 合, 和 3 价 抗 脊 灰 病 毒 的 组 合 这 些 抗 血 清 在 使 用 前 必 须 稀 释 94

104 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 推 荐 的 稀 释 度 为 1:20; 0.5ml 的 抗 血 清 加 入 到 9.5ml 的 特 定 稀 释 液 当 中 将 稀 释 好 的 抗 血 清 分 装 在 清 楚 标 记 的 冻 存 管 中, 每 管 分 装 1ml, 储 藏 在 -20 每 鉴 定 1 株 病 毒, 应 作 2 个 稀 释 度 每 个 试 剂 盒 包 含 从 A 到 G(10ml) 的 组 合, 有 足 够 作 100 次 鉴 定 实 验 的 抗 血 清 的 量 (ii) 鉴 定 肠 道 病 毒 的 中 和 实 验 : 要 有 以 下 的 材 料 : 带 盖 子 的 96 孔 平 底 微 量 细 胞 培 养 板 无 毒 性 的 封 条 ( 如 果 使 用 的 不 是 CO 2 孵 箱 的 话 ) 用 于 稀 释 的 5ml 无 菌 的 管 子 1ml 和 2ml 一 次 性 塑 料 移 液 管 灭 菌 的 50ul 带 有 可 阻 止 气 溶 胶 产 生 的 (ARTs) 带 滤 芯 的 吸 尖 适 合 于 病 毒 生 长 的 健 康 的 细 胞 稀 释 好 的 肠 道 病 毒 抗 血 清 储 存 液 维 持 液 鉴 定 1 个 未 知 的 病 毒, 要 作 2 个 稀 释 度, 分 别 加 入 抗 3 价 脊 灰 抗 血 清 (PP), 抗 柯 萨 奇 B 组 ( B1~6) 病 毒 抗 血 清,7 组 抗 柯 萨 奇 A9 病 毒 和 20 种 ECHO 病 毒 的 抗 血 清 (A~G) 一 些 不 能 用 这 些 抗 血 清 定 型 的 非 脊 灰 病 毒, 可 能 是 因 为 病 毒 聚 集 成 团, 从 而 干 扰 了 特 异 抗 血 清 的 中 和 作 用 这 时 可 以 使 用 氯 仿 使 之 乳 化 ( 大 约 加 入 10% 的 体 积 ), 并 去 除 氯 仿 后 重 新 定 型 经 氯 仿 处 理 后 的 悬 液 冷 冻 后 病 毒 会 重 新 聚 集 成 团, 所 以 氯 仿 处 理 后 即 进 行 定 型 比 较 合 适, 然 后 再 冷 冻 保 存 操 作 步 骤 如 下 : 在 微 孔 板 的 边 缘 按 图 7.5 所 示 标 记 好 在 1~9 列 中 加 入 50ul 正 确 的 抗 血 清 在 第 10 列,A~D 行 中 加 入 50ul 的 维 持 液, 作 为 病 毒 对 照 孔 在 第 11 和 12 列,A~D 行 中 加 入 100ul 的 维 持 液, 作 为 细 胞 对 照 准 备 10-2 稀 释 度 的 病 毒 ( 最 好 在 实 验 前 测 定 病 毒 的 滴 度, 将 滴 度 调 至 实 验 所 需 ) 在 第 1~10 列,A~B 行 中 加 入 50ul 的 标 本 X,C~D 行 中 加 入 50ul 的 标 本 Y 在 E~F 行 作 病 毒 X 的 回 滴, 在 G~H 行 作 病 毒 Y 的 回 滴 盖 好 盖 子, 在 36 孵 育 1 小 时 在 孵 育 期 间, 用 胰 酶 消 化 RD 细 胞, 制 备 细 胞 悬 液, 浓 度 大 约 为 每 毫 升

105 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 个 细 胞, 每 块 扳 子 至 少 需 要 10ml 加 入 100ul 细 胞 悬 液 到 所 有 的 孔 中 用 无 毒 性 的 密 封 条 密 封 板 子, 在 36 孵 育 使 用 倒 置 显 微 镜 每 天 观 察 并 记 录 有 无 CPE 的 产 生 在 病 毒 对 照 孔 出 现 100% CPE 的 时 候, 继 续 观 察 并 记 录 24 小 时 按 照 试 剂 盒 中 的 说 明 书, 根 据 被 抗 血 清 所 中 和 的 无 法 产 生 CPE 的 孔 的 出 现 情 况, 来 鉴 定 病 毒 的 型 别 如 果 在 所 有 含 有 病 毒 的 孔 中 都 出 现 了 CPE, 那 么 这 个 标 本 应 该 报 告 为 非 脊 灰 病 毒 图 7.5 用 微 孔 板 鉴 定 肠 道 病 毒 的 型 别 细 胞 对 照 病 毒 编 号 : 病 毒 编 号 : 回 滴 编 号 : 回 滴 编 号 : 96

106 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 第 8 部 分 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 从 AFP 病 例 中 分 离 和 鉴 定 脊 灰 病 毒 只 是 监 测 社 区 中 是 否 有 脊 灰 野 病 毒 和 VDPV 循 环 的 第 一 步 在 免 疫 活 动 期 间 或 过 后, 疫 苗 株 大 范 围 循 环, 并 且 可 能 在 健 康 儿 童 或 者 无 症 状 的 儿 童 中 分 离 到 因 此, 区 分 野 病 毒 和 疫 苗 株 就 显 得 尤 为 重 要 了 在 脊 灰 实 验 室 网 络 中, 有 5 种 型 内 鉴 别 (ITD) 的 方 法 被 推 荐 在 地 区 参 考 实 验 室 中 使 用, 其 中 3 种 方 法 目 前 在 实 验 室 网 络 中 使 用 它 们 是 : 1.RIVM 发 明 的 交 叉 吸 附 抗 血 清 ELISA 法, 2. 美 国 CDC 发 明 的 探 针 杂 交 法, 3. 美 国 CDC 发 明 的 诊 断 PCR 法 另 外 2 种 方 法, 一 种 是 位 于 巴 黎 的 巴 斯 德 研 究 所 和 日 本 东 京 的 NIID 发 明 的 PCR-RFLP 法, 另 一 种 是 巴 斯 德 研 究 所 和 英 国 的 NIBSC 发 明 的 单 克 隆 抗 体 法, 是 可 用 的 ITD 方 法, 但 是 现 在 并 没 有 被 网 络 所 支 持 使 用 8.1. 型 内 鉴 别 方 法 ELISA 法 用 于 型 内 鉴 别 的 RIVM 的 ELISA 法 的 实 验 对 象 必 须 是 单 血 清 型 的 标 本 如 果 标 本 中 含 有 2 种 或 3 种 血 清 型 的 脊 灰 病 毒, 那 么 就 必 须 用 相 应 的 抗 血 清 将 标 本 中 的 病 毒 中 和 掉 而 一 一 分 离 实 验 原 理 将 抗 脊 灰 1,2 和 3 型 病 毒 的 牛 IgG 抗 体 包 被 在 微 量 中 和 板 或 条 的 孔 中, 然 后 加 入 已 知 的 和 待 测 脊 灰 病 毒 株 孵 育 再 加 入 型 特 异 的, 交 叉 吸 附 的 兔 抗 血 清 将 未 结 合 的 兔 血 清 洗 去 之 后, 加 入 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 兔 IgG 抗 体, 来 检 测 已 经 结 合 的 兔 血 清 RIVM 提 供 的 试 剂 盒 已 经 包 含 了 进 行 ELISA 实 验 的 主 要 的 试 剂, 可 以 从 WHO 获 得 试 剂 盒 成 分 RIVM 提 供 的 试 剂 盒 包 括 : 97

107 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 1. 牛 血 清 抗 所 有 3 个 型 别 脊 灰 病 毒 的 型 特 异 性 的 牛 抗 血 清 IgG 2. 兔 血 清 抗 脊 灰 病 毒 的 型 特 异 性 的 兔 抗 血 清 3. 吸 附 的 兔 血 清 型 特 异 性 的, 交 叉 吸 附 的 兔 抗 血 清 1 型 脊 灰 病 毒,NSL 和 SL; 2 型 脊 灰 病 毒,NSL 和 SL;3 型 脊 灰 病 毒,NSL 和 SL 抗 血 清 已 经 在 56 加 热 灭 活 30 分 钟, 使 其 无 感 染 性 4. 原 型 病 毒 无 感 染 性 的 非 疫 苗 类 似 株 (NSL) 脊 灰 原 型 病 毒 1,2 和 3 型 脊 灰 原 型 病 毒 应 该 保 存 在 4, 千 万 不 要 冷 冻 实 验 需 要 的 但 是 并 未 包 括 在 试 剂 盒 中 的 材 料 : 碳 酸 盐 缓 冲 液,pH 9.5 将 1.27g Na 2CO 3 与 2.34g NaHCO 3 溶 解 于 1 升 蒸 馏 水 中 用 0.22um 的 滤 膜 过 滤 该 溶 液 在 4 可 以 保 存 1 年 醋 酸 钠 缓 冲 液,pH 5.5 将 9g 醋 酸 钠 溶 解 于 900ml 蒸 馏 水 中 用 10% 的 醋 酸 调 节 ph 值 到 5.5 调 节 总 体 积 至 1 升 洗 液 : 向 1 升 PBS 溶 液 中 加 入 0.5ml 的 吐 温 20( 聚 氧 乙 烯 山 梨 糖 醇 单 月 桂 酸 酯 ) 稀 释 缓 冲 液 : 稀 释 缓 冲 液 的 配 方 是 在 洗 液 中 加 入 5% 的 牛 血 清 稀 释 缓 冲 液 必 须 在 每 次 实 验 前 新 鲜 配 制 终 止 液 : 2N 的 硫 酸 酶 标 记 物 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG 底 物 液 TMB:3,3`,5,5` 四 甲 基 对 二 氨 基 联 苯 60mg 的 TMB 溶 解 于 10ml DMSO 中 过 氧 化 脲 : 在 10ml 蒸 馏 水 中 溶 解 1 粒 (Organon Technika 生 产 ) 将 0.2ml 的 TMB 溶 液 和 0.1ml 的 过 氧 化 脲 溶 液 加 入 到 12ml 的 0.11 M 的 醋 酸 钠 溶 液 中,PH 值 为 5.5 底 物 液 在 每 次 实 验 之 前 必 须 新 鲜 配 制, 并 避 光 保 存 另 外 也 有 含 有 底 物 液 的 商 业 试 剂 盒 可 以 替 代 ( 例 如 KPL:Kirkegaard & Perry 实 验 室 生 产 的, 目 录 号 为 ) 按 照 生 产 商 的 详 细 的 说 明 书 操 作 98

108 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 实 验 室 操 作 技 术 规 范 为 了 避 免 进 行 ELISA 实 验 时 发 生 问 题, 请 参 照 以 下 说 明 : 不 要 在 有 易 起 反 应 的 蒸 汽 ( 例 如 酸 蒸 汽 碱 蒸 汽 或 者 乙 醛 蒸 汽 ) 或 灰 尘 存 在 条 件 下 进 行 实 验, 因 为 这 些 东 西 会 影 响 酶 标 记 物 中 酶 的 活 性 只 能 使 用 极 其 洁 净 的 玻 璃 器 皿, 特 别 是 在 准 备 底 物 液 的 时 候 所 有 的 移 液 过 程 都 应 该 极 其 小 心 和 准 确 为 了 避 免 污 染, 不 要 用 手 触 摸 平 板 或 板 条 的 表 面, 而 且 当 用 吸 尖 加 酶 标 记 物 或 者 底 物 液 的 时 候, 吸 尖 不 要 触 碰 小 孔 的 边 缘 在 所 有 的 移 液 过 程 之 后, 要 检 查 有 无 气 泡, 如 果 有, 要 轻 拍 使 之 逸 出 检 查 洗 板 步 骤 的 效 果, 特 别 是 加 入 酶 结 合 物 孵 育 之 后 TMB 溶 液 和 / 或 过 氧 化 物 溶 液 不 要 接 触 金 属 或 金 属 离 子, 因 为 这 样 会 有 一 些 意 想 不 到 的 颜 色 出 现 如 果 洗 板 之 后 不 马 上 加 入 液 体 的 话, 平 板 / 板 条 应 该 倒 扣 在 湿 的 吸 收 性 材 料 上, 但 不 要 超 过 15 分 钟 在 准 备 和 使 用 2N 的 硫 酸 时 要 特 别 小 心 永 远 记 得 要 加 酸 到 水 里, 不 要 颠 倒 次 序 在 使 用 时 应 穿 防 护 衣, 戴 眼 罩, 因 为 在 稀 释 的 时 候 会 产 生 热 量 操 作 步 骤 需 要 准 备 下 列 材 料 : 96 孔 免 疫 学 的 微 孔 平 板 或 板 条 可 调 移 液 器 50ul~200ul 的 8 道 移 液 器 或 相 应 设 备 一 次 性 吸 尖 ELISA 洗 板 机 ELISA 酶 标 仪 36 的 孵 箱 4~8 冰 箱 (i) 准 备 在 实 际 操 作 之 前, 可 以 分 别 测 试 一 下 底 物 液 和 酶 标 记 物 的 效 能 1. 根 据 实 验 所 需 标 本 和 对 照 数 量 的 多 少, 选 用 足 够 数 量 的 平 板 或 板 条 实 验 中 每 株 病 毒 至 少 需 要 三 个 孔 的 位 置 : 一 孔 与 型 特 异 性 抗 血 清 反 应, 一 孔 与 NSL 特 异 性 交 叉 吸 附 抗 血 清 反 应, 还 有 一 孔 与 SL 特 异 性 交 叉 吸 附 抗 血 清 反 应 99

109 SL NSL SL NSL SL NSL 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 2. 将 平 板 上 的 各 孔 编 号, 并 在 记 录 纸 上 记 下 相 对 应 的 号 码 (ii) 包 被 1. 将 牛 抗 脊 灰 血 清 用 PH M 的 碳 酸 缓 冲 液 稀 释 500 倍 ( 或 者 根 据 试 剂 盒 说 明 ), 在 每 孔 中 加 入 0.1ml 2. 盖 上 盖 子 4 过 夜 图 8.1 示 出 了 使 用 8 针 洗 板 机 时 设 计 的 规 则 如 果 实 验 室 使 用 的 是 12 针 的 洗 板 机, 只 要 将 平 板 旋 转 90º 设 计 就 可 以 了 图 8.1 ELISA 法 用 于 脊 灰 病 毒 型 内 鉴 别 时 的 平 板 设 计 病 毒 A~F 病 毒 G~N 病 毒 O~V 空 白 孔 抗 总 抗 体 抗 抗 抗 总 抗 体 抗 抗 抗 总 抗 体 抗 抗 Sabin 株 非 Sabin 株 病 毒 A 病 毒 B 病 毒 C 病 毒 D 病 毒 E 病 毒 F 依 此 类 推 (iii) 洗 板 和 封 闭 1. 用 洗 液 洗 板 4 次 每 次 每 孔 加 入 0.3ml, 此 过 程 可 用 洗 板 机 操 作, 也 可 人 工 用 多 道 移 液 器 操 作 2. 用 吸 收 力 强 的 纸 巾 擦 干 平 板 表 面 3. 加 入 0.1ml 的 PBS 和 5% 的 牛 血 清 的 混 合 溶 液 至 每 一 个 孔 中,37 孵 育 1 小 时 这 100

110 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 将 避 免 脊 灰 病 毒 抗 原 抗 血 清 或 者 酶 结 合 物 非 特 异 性 结 合 到 固 相 平 板 上 (iv) 抗 原 1. 如 上 所 述 洗 板 4 次 2. 加 入 活 的 脊 灰 病 毒 ( 有 可 能 是 野 毒 ) 到 平 板 中 时, 这 一 步 骤 应 在 生 物 安 全 柜 中 操 作 每 三 个 孔 (A2~A4,B2~B4 等 ) 加 入 0.1ml 未 稀 释 的 病 毒 ( 如 果 进 行 双 份 实 验, 需 要 使 用 6 孔 ); 每 株 病 毒 都 按 同 样 步 骤 操 作 3. 每 块 平 板 都 要 设 立 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 4. 在 第 一 列 (A1~H1) 加 入 0.1ml 的 稀 释 缓 冲 液 作 为 空 白 对 照 孵 育 2 小 时 注 意 在 孵 育 的 时 候 要 盖 好 盖 子, 以 避 免 孵 育 时 孵 箱 被 脊 灰 野 病 毒 的 气 溶 胶 或 液 滴 所 污 染 (v) 抗 体 1. 如 上 所 述 洗 板 4 次 当 从 平 板 中 洗 涤 活 的 脊 灰 病 毒 ( 有 可 能 是 野 毒 ) 时, 废 液 应 被 看 作 是 有 感 染 性 的 材 料, 应 在 生 物 安 全 柜 中 操 作 2. 在 洗 板 的 同 时, 用 稀 释 液 稀 释 交 叉 吸 附 型 特 异 性 的 兔 抗 血 清 根 据 每 批 抗 血 清 批 号 的 不 同, 其 交 叉 吸 附 血 清 的 确 切 稀 释 度 也 不 同 3. 将 0.1ml 稀 释 的 型 特 异 性 兔 抗 血 清,NSL 特 异 性 抗 血 清,SL 特 异 性 抗 血 清 加 入 相 对 应 的 孔 中 ( 型 特 异 性 的 加 入 到 A2~H2 孔 中 :NSL 加 入 到 A3~H3 孔 中 :SL 加 入 到 A4~H4 孔 中 ) 加 入 0.1ml 稀 释 液 到 空 白 对 照 孔 中 (A1~H1) 37 孵 育 1 小 时 (vi) 酶 结 合 物 1. 如 上 所 述 洗 板 4 次 2. 将 酶 结 合 物 在 稀 释 液 中 稀 释 1000 倍 ( 或 者 根 据 说 明 书 操 作 ), 加 入 0.1ml 的 酶 结 合 物 到 每 一 个 孔 中 孵 育 1 小 时 (vii) 底 物 液 1. 如 上 所 述 洗 板 4 次 2. 洗 板 的 过 程 中 可 准 备 底 物 液, 加 0.1ml 的 底 物 液 到 每 个 孔 中 3. 室 温 避 光 孵 育 至 少 10 分 钟 (viii) 终 止 反 应 并 读 取 光 密 度 值 1. 按 加 入 底 物 液 的 顺 序, 每 孔 依 次 加 入 0.1ml 的 2N 硫 酸, 终 止 反 应 阳 性 反 应 时, 孔 中 的 颜 色 会 由 蓝 色 变 为 黄 色 101

111 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 2. 在 读 OD 值 之 前, 擦 干 平 板 的 底 部 3. 在 反 应 终 止 30 分 钟 内, 用 分 光 光 度 计 在 450nm 波 长 处 读 取 OD 值 仅 仅 加 入 稀 释 液 的 孔 作 为 空 白 对 照 孔 读 取 NSL 和 SL 对 应 孔 的 OD 值, 用 如 下 方 法 检 测 其 有 效 性 质 量 控 制 和 结 果 解 释 如 果 一 次 实 验 中 包 括 了 Sabin 阳 性 对 照, 无 感 染 性 的 NSL( 非 Sabin) 阳 性 对 照 和 一 个 未 知 的 病 毒, 观 察 了 从 A 孔 到 I 孔 的 光 密 度 (OD) 值, 那 么 本 次 实 验 的 有 效 性 和 结 果 解 释 如 下 所 述 抗 总 抗 体 抗 NSL 抗 SL Sabin 孔 A B C 非 Sabin 孔 D E F 病 毒 孔 G H I 实 验 有 效 的 条 件 为 :A D 和 G 孔 OD 值 C 和 E 孔 OD 值 B 和 F 孔 OD 值 C/B 的 比 值 2.5, 并 且 E/F 的 比 值 2.5 结 果 解 释 : H/I 的 比 值 2.5 非 疫 苗 类 似 株 病 毒 ( 例 如 野 病 毒 ) I/H 的 比 值 2.5 疫 苗 类 似 株 病 毒 H/I I/H< 2.5, 且 H 和 I 的 OD 值 双 反 应 病 毒 H/I I/H< 2.5, 且 H 和 I 的 OD 值 <0.400 G<1.000, 但 >0.400 G<0.400 无 反 应 毒 株 无 效 反 应, 需 重 新 扩 增 病 毒 无 效 反 应, 核 查 标 本 的 血 清 型 参 见 8.5 章 节 关 于 结 果 的 解 释 以 及 所 采 取 的 下 一 步 措 施 102

112 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 ELISA 实 验 的 疑 难 解 答 问 题 可 能 的 原 因 及 解 决 方 法 包 括 阳 性 对 照 在 内 的 所 有 反 应 - 实 验 过 程 中 漏 加 某 种 试 剂 ; 都 是 阴 性 - 包 被 了 错 误 的 抗 血 清 ( 例 如 包 被 了 抗 脊 灰 I 型 血 清 来 进 行 脊 灰 II 型 实 验 ) 所 有 标 本 和 对 照 孔 的 OD 值 都 - 包 被 步 骤 出 现 错 误 : 牛 抗 脊 灰 病 毒 血 清 浓 度 过 低 ; 包 很 低, 例 如 抗 总 抗 体 孔 OD 值 被 缓 冲 液 的 PH 值 不 正 确 ; < 底 物 液 配 制 不 正 确 或 底 物 液 失 效 ; - 酶 结 合 物 浓 度 不 正 确 ( 实 验 者 应 事 先 确 定 使 用 的 正 确 浓 度, 尤 其 在 使 用 新 批 号 的 时 候 应 注 意 ); - 平 板 吸 附 性 较 差 ( 有 时 是 使 用 了 新 的 扳 子 或 新 供 应 商 提 供 的 扳 子 ); 在 洗 板 步 骤 间 期, 孔 内 过 度 干 燥 ; 或 使 用 了 错 误 类 型 的 平 板 ; - 移 液 器 需 要 校 正 ( 每 次 加 的 体 积 不 足 ); - 稀 释 缓 冲 液 的 PH 值 不 正 确 所 有 孔 的 OD 值 太 高, 空 白 对 - 底 物 液 过 度 孵 育 ; 照 孔 的 本 底 较 高 - 忘 记 终 止 反 应 ; - 洗 板 次 数 过 少 ; - 洗 液 配 制 出 现 问 题 ; - 洗 板 机 出 现 问 题 在 不 同 的 平 板 但 相 同 的 位 置, - 歧 管 装 置 (manifold) 堵 塞, 或 洗 板 机 出 现 问 题 一 孔 或 多 孔 出 现 持 续 的 高 的 OD 值 对 照 孔 OD 值 有 效, 但 有 时 标 - 病 毒 浓 度 过 低, 需 重 新 扩 增 病 毒 ( 推 荐 使 用 MEM 加 本 的 OD 值 无 效, 因 为 抗 总 抗 2% 牛 血 清 的 RD 细 胞 扩 增 病 毒 更 好 ), 然 后 重 复 实 验 体 的 OD 值 <1.0 但 是 0.4 对 照 孔 OD 值 有 效, 但 有 时 样 - 定 型 错 误 本 的 OD 值 无 效, 因 为 抗 总 抗 体 的 OD 值 <0.4 NSL 对 照 的 OD 值 太 低 - NSL 对 照 的 稀 释 度 或 储 存 条 件 不 正 确 ( 应 于 4 储 存 ) SL 对 照 的 OD 值 太 低 或 不 正 - 重 新 扩 增 低 代 数 内 部 SL 对 照, 使 其 滴 度 增 高 确 SL 和 NSL 血 清 特 异 性 低 ( 血 - 与 试 剂 生 产 商 联 系 (RIVM) 并 提 供 包 括 批 号 在 内 的 清 未 满 足 指 示 OD 标 准 ) 试 剂 详 细 资 料 103

113 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 8.2. 型 内 鉴 别 方 法 核 酸 探 针 杂 交 实 验 原 理 RNA 探 针 杂 交 实 验 的 对 象 是 高 滴 度 的 已 经 鉴 定 型 别 的 脊 灰 病 毒 提 取 病 毒 的 RNA, 再 固 定 到 滤 膜 上 再 加 入 地 高 辛 (DIG) 标 记 的 肠 道 病 毒 组 探 针 ;Sabin 型 特 异 探 针 ; 野 病 毒 基 因 型 特 异 探 针, 使 之 与 固 定 在 膜 上 的 RNA 杂 交 ( 野 病 毒 基 因 型 特 异 探 针 通 常 只 提 供 给 仍 然 有 脊 灰 流 行 国 家 的 实 验 室 ) 通 过 洗 膜 过 程 去 除 未 结 合 到 膜 上 的 探 针, 并 用 比 色 试 剂 检 测 已 结 合 在 膜 上 的 探 针 CDC 提 供 的 试 剂 盒 包 含 了 作 探 针 杂 交 实 验 所 需 的 关 键 试 剂, 并 且 可 以 通 过 WHO 获 得 试 剂 盒 的 组 成 试 剂 盒 中 包 含 下 列 试 剂 : 1.DIG 标 记 的 RNA 探 针 (4 管 : 肠 道 病 毒 组 探 针,Sabin 1 探 针,Sabin 2 探 针, Sabin 3 探 针 ), 它 们 都 是 约 100nt 的 负 链 RNA 转 录 本, 可 以 和 Sabin 株 基 因 组 的 目 标 序 列 形 成 稳 定 的 碱 基 对 2. 未 标 记 的 无 感 染 性 的 阳 性 对 照 RNA, 是 约 1350nt 长 的 正 链 RNA( 相 当 于 无 感 染 性 的 基 因 组 片 段 ), 含 有 可 以 被 探 针 或 者 脊 灰 病 毒 诊 断 性 PCR 引 物 识 别 的 3 个 Sabin 株 序 列 (Sabin 1,Sabin 2,Sabin 3), 还 有 3 个 脊 灰 野 病 毒 阴 性 对 照 RNA(P1W,P2W, P3W), 它 们 含 有 从 美 国 分 离 的 已 经 灭 绝 的 脊 灰 野 病 毒 的 相 关 序 列 试 剂 以 冻 干 的 形 式 存 在, 以 保 护 试 剂 的 活 性 并 易 于 运 输 和 储 存 用 20ul 无 核 酸 酶 的 蒸 馏 水 溶 解 RNA 探 针, 使 用 其 中 的 5ul 在 重 新 溶 解 之 后 储 存 在 -20 用 200ul 无 核 酶 的 蒸 馏 水 重 新 溶 解 约 500ngRNA 用 作 对 照 ( 包 括 Sabin 株 和 野 毒 株 ) 将 其 分 装 到 20 支 小 管 中, 每 支 含 10ul, 并 储 存 在 -20 每 次 实 验 使 用 一 支 小 管, 取 出 5ul 的 RNA 加 入 到 一 支 新 的 1.5ml 离 心 管 中, 再 加 入 495ul 的 无 核 酸 酶 的 蒸 馏 水 或 者 495ul 的 10mM 的 Tris 溶 液 (PH7.0) 稀 释 PH 值 不 能 高 于 7.5, 否 则 在 微 碱 性 条 件 下 RNA 会 降 解 该 稀 释 后 的 溶 液 在 室 温 条 件 下 不 能 保 存 太 久 时 间 剩 余 的 RNA 溶 液 要 丢 弃 使 用 每 一 个 试 剂 盒 使 用 时 各 种 试 剂 要 分 开 标 记, 因 为 各 试 剂 的 使 用 频 率 不 同, 以 便 连 续 其 它 必 需 的 试 剂 但 是 试 剂 盒 中 未 包 括 的 还 有 : 尼 龙 膜 104

114 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 封 闭 液 ( 特 殊 ) 抗 地 高 辛 碱 性 磷 酸 酶 共 扼 结 合 物 显 色 的 或 化 学 发 光 的 碱 性 磷 酸 酶 底 物 液 厚 的 滤 纸 歧 管 装 置 (manifold) 真 空 泵 操 作 步 骤 : (i) 准 备 样 品 1. 为 了 得 到 好 的 结 果, 应 该 先 在 用 MEM( 无 胎 牛 血 清 ) 培 养 液 培 养 的 RD 单 层 细 胞 上 扩 增 病 毒 标 本 以 产 生 高 滴 度 的 病 毒 因 为 与 L20B 细 胞 相 比, 脊 灰 病 毒 在 RD 细 胞 上 生 长 可 以 产 生 更 高 的 滴 度, 所 以 在 RD 细 胞 上 再 扩 增 一 代 病 毒 会 使 探 针 杂 交 实 验 产 生 更 强 的 信 号 并 且 在 病 毒 标 本 中 如 果 有 大 剂 量 的 胎 牛 血 清 的 话, 会 减 少 结 合 到 膜 上 的 RNA 的 量, 从 而 使 实 验 结 果 的 信 号 很 弱 注 意 : 步 骤 2~7 应 该 在 生 物 安 全 柜 中 进 行 2. 细 胞 病 变 出 现 4+ CPE 的 时 候, 将 感 染 的 细 胞 悬 浮 起 来, 通 过 2 轮 冻 - 融 过 程 ( 干 冰 - 乙 醇 浴 或 者 放 在 冰 箱 中 /36 ) 释 放 病 毒 3. 准 备 甲 醛 混 合 液 ( 最 好 戴 一 个 防 护 面 罩 以 避 免 吸 入 甲 醛 蒸 气 ): 20 SSC 0.3ml/ 样 品 37% 甲 醛 0.2ml/ 样 品 (20 SSC 溶 液 含 有 3.0M NaCl, 300mM 柠 檬 酸 钠 ;PH7.0) 4. 在 每 支 1.5ml 的 离 心 管 中 加 入 0.5ml 的 甲 醛 混 合 液 5. 加 0.6ml 细 胞 悬 液 到 一 支 新 的 1.5ml 的 离 心 管 中 在 微 量 离 心 机 中 离 心 (>10000 g) 1 分 钟 以 沉 淀 细 胞 碎 片 6. 取 0.5ml 病 毒 悬 液 加 入 到 相 对 应 的 含 有 甲 醛 的 1.5ml 的 离 心 管 中 7. 震 荡 充 分 混 匀, 在 65 孵 育 15 分 钟 注 意 :65, 在 3.7% 的 甲 醛 溶 液 中 孵 育 可 以 彻 底 地 灭 活 脊 灰 病 毒 后 续 的 工 作 可 以 在 一 个 开 放 的 实 验 室 操 作 台 上 完 成 因 为 RNA 分 子 在 甲 醛 溶 液 中 时 间 太 久 会 降 解, 所 以 准 备 的 样 品 要 足 量, 并 马 上 进 行 下 一 步 实 验 (ii) 将 脊 灰 病 毒 RNA 固 定 到 膜 上 1. 将 厚 滤 纸 和 尼 龙 膜 的 四 角 剪 掉, 这 样 不 会 阻 挡 歧 管 装 置 (manifold) 的 固 定 钉 用 铅 105

115 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 笔 在 尼 龙 膜 的 一 角 画 上 标 记 以 便 识 别 A1 孔 注 意 不 要 用 手 指 触 碰 尼 龙 膜 ( 请 戴 手 套, 并 使 用 滤 膜 夹 夹 取 尼 龙 膜 ), 因 为 皮 肤 上 的 油 脂 会 干 扰 RNA 结 合 到 膜 上 2. 在 20 SSC 溶 液 中 浸 湿 一 张 厚 滤 纸, 并 将 其 铺 在 歧 管 装 置 上 3. 将 尼 龙 膜 漂 浮 在 盛 有 蒸 馏 水 的 浅 容 器 中 使 之 浸 湿 30 秒 后, 翻 转 尼 龙 膜 使 另 一 面 浸 湿 4. 排 干 过 多 的 水, 用 与 步 骤 3 同 样 的 方 法 在 20 SSC 溶 液 中 浸 泡 5. 将 尼 龙 膜 放 置 在 厚 滤 纸 的 上 表 面 夹 紧 并 轻 微 地 排 真 空 为 了 确 保 每 个 孔 都 通 畅, 先 使 每 个 孔 都 滤 过 200ul 的 6 SSC 溶 液 气 泡 会 阻 止 样 品 完 全 通 过 滤 膜, 但 可 以 通 过 在 桌 面 上 轻 拍 歧 管 装 置 而 去 除 液 体 全 部 通 过 之 后, 关 闭 真 空 泵 6. 用 微 量 移 液 器 贴 着 孔 壁 向 尼 龙 膜 上 加 样 品 ( 不 超 过 0.2ml) 7. 每 个 样 品 至 少 加 4 组 孔, 每 1 组 对 应 着 1 个 探 针 每 次 实 验 都 要 使 用 所 有 3 个 血 清 型 的 阳 性 和 阴 性 对 照 RNA 至 少 需 要 作 2 组 : 一 组 加 入 组 探 针 一 组 加 入 各 病 毒 株 特 异 的 探 针 8. 当 加 完 所 有 的 样 品 后, 轻 抽 真 空 直 到 所 有 的 孔 都 抽 干 为 止 拆 开 歧 管 装 置, 小 心 取 出 尼 龙 膜 9. 在 紫 外 透 照 仪 中 照 射 尼 龙 膜 3 分 钟 直 到 RNA 交 联 到 尼 龙 膜 上 为 止 注 意 : 避 免 被 紫 外 线 照 射 要 戴 面 罩, 穿 长 袖 防 护 衣, 戴 塑 料 手 套 此 时 尼 龙 膜 可 以 进 行 杂 交 了 (iii) 杂 交 1. 预 杂 交 : 按 组 别 的 不 同 将 尼 龙 膜 剪 开 将 尼 龙 膜 放 置 在 含 有 预 杂 交 液 的 塑 料 杂 交 盒 中 [ 杂 交 液 :6 SSC,50%(V/V) 甲 酰 铵,0.1%(W/V)SDS,2%(V/V) 封 闭 因 子 ], 按 每 平 方 厘 米 的 尼 龙 膜 需 要 1ml 预 杂 交 液 计 算 多 个 膜 可 以 放 在 同 一 个 杂 交 盒 中 密 封 杂 交 盒, 在 摇 床 水 浴 箱 内 65 孵 育 2 个 小 时 ( 转 速 120 转 / 分 ) 2. 杂 交 : 预 杂 交 后, 排 干 预 杂 交 液, 再 加 入 杂 交 液, 按 每 平 方 厘 米 的 尼 龙 膜 需 要 0.1ml 杂 交 液 计 算 ( 是 预 杂 交 步 骤 所 需 量 的 1/10, 例 如, 对 于 上 面 有 24 孔 的 尼 龙 膜, 使 用 5ul 的 探 针, 加 在 5ml 的 缓 冲 液 中 ) 3. 用 微 量 移 液 器 将 探 针 加 到 杂 交 液 中 4. 密 封 杂 交 盒, 放 置 在 65, 转 速 为 120 转 / 分 的 摇 床 水 浴 箱 内 5. 孵 育 过 夜 6. 将 尼 龙 膜 放 在 一 个 浅 的 容 器 内 洗 涤, 例 如 使 用 密 封 的 塑 料 饭 盒 含 有 探 针 的 杂 交 液 保 存 在 -20 可 以 使 用 3 次 (iv) 洗 膜 1. 在 25ml 洗 液 1 中 [2 SSC,0.1%(W/V)SDS],75, 摇 动, 洗 膜 15 分 钟 106

116 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 2. 在 25ml 洗 液 2 中 [0.1 SSC,0.1%(W/V)SDS],75, 摇 动, 洗 膜 15 分 钟 (v) 抗 地 高 辛 碱 性 磷 酸 酶 共 扼 结 合 物 与 结 合 到 膜 上 的 RNA 探 针 结 合 1. 在 杂 交 过 程 后, 将 膜 在 25ml 缓 冲 液 A(100mM 马 来 酸,150mM NaCl;PH7.5) 中 平 衡 1 分 钟 2. 轻 轻 倒 出 缓 冲 液 A 再 加 入 25ml 缓 冲 液 B( 溶 解 在 缓 冲 液 A 中 的 2% 的 封 闭 因 子 ) 不 要 让 膜 干 燥 3. 轻 摇, 使 膜 孵 育 至 少 1 小 时 4. 在 封 闭 步 骤 即 将 结 束 之 时, 在 缓 冲 液 B 中 1:5000 稀 释 抗 地 高 辛 碱 性 磷 酸 酶 共 扼 结 合 物, 使 其 工 作 浓 度 为 150mU/ml 5. 从 缓 冲 液 B 中 ( 步 骤 3) 取 出 尼 龙 膜, 放 在 共 扼 结 合 物 溶 液 中 6. 轻 摇, 使 膜 孵 育 30 分 钟 7. 排 干 共 扼 结 合 物 溶 液, 在 20ml 缓 冲 液 A 中 洗 膜 2 次, 每 次 15 分 钟 8. 在 10ml 新 鲜 配 制 的 缓 冲 液 C (100mM Tris-HCl,100mM NaCl,50mM MgCl 2 ;PH9.5) 中, 将 洗 好 的 尼 龙 膜 平 衡 2 分 钟 (vi) 用 显 色 底 物 液 呈 现 杂 交 结 果 1. 准 备 显 色 底 物 液 ( 将 45ul 的 100mg/ml NBT 和 35ul 的 50mg/ml BCIP 溶 解 在 10ml 缓 冲 液 C 中 ) 一 般 说 来, 每 100 平 方 厘 米 需 要 10ml NBT 化 学 名 为 4- 硝 基 蓝 四 唑 ( 储 存 在 100% 的 二 甲 替 甲 酰 胺 中 [DMF]) BCIP 化 学 名 为 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 - 磷 酸 盐 ( 储 存 在 70% DMF 中 ) NBT 和 DMF 盛 在 玻 璃 管 或 聚 丙 烯 塑 料 管 中, 保 存 在 暗 处 2. 排 干 缓 冲 液 C 加 入 显 色 底 物 液 3. 在 黑 暗 中 孵 育 30 分 钟 如 果 出 现 理 想 的 颜 色 反 应, 在 缓 冲 液 C 中 漂 洗 尼 龙 膜 4. 用 宝 利 来 相 机 照 相 记 录 结 果 结 果 解 释 组 探 针 与 所 有 肠 道 病 毒 和 脊 灰 病 毒 杂 交 Sabin 特 异 性 探 针 与 各 自 型 别 的 Sabin 株 杂 交 脊 灰 野 病 毒 与 组 探 针 和 相 应 型 别 的 野 病 毒 基 因 型 特 异 探 针 杂 交 ( 如 果 设 计 的 话 ) 图 8.2 是 杂 交 点 样 的 一 个 例 子, 显 示 的 是 4 块 滤 膜 的 结 果, 每 块 滤 膜 上 都 加 了 6 株 疫 苗 相 关 株 和 6 株 脊 灰 野 病 毒 株, 分 别 代 表 不 同 的 血 清 型 每 个 样 品 都 有 4 种 探 针 与 之 杂 交 107

117 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 图 8.2 杂 交 点 样 的 一 个 例 子 组 探 针 Sabin 1 探 针 1 型 疫 苗 株 1 型 野 毒 株 2 型 疫 苗 株 2 型 野 毒 株 3 型 疫 苗 株 3 型 野 毒 株 细 胞 对 照 Sabin 2 探 针 Sabin 3 探 针 1 型 疫 苗 株 1 型 野 毒 株 2 型 疫 苗 株 2 型 野 毒 株 3 型 疫 苗 株 3 型 野 毒 株 细 胞 对 照 已 杂 交 点 未 杂 交 点 参 见 8.4 章 节 关 于 结 果 的 解 释 以 及 所 采 取 的 下 一 步 措 施 8.3. 型 内 鉴 别 方 法 PCR 法 实 验 原 理 作 为 诊 断 PCR 技 术 实 验 对 象 的 脊 灰 病 毒 必 须 是 已 经 鉴 定 出 血 清 型 的 脊 灰 病 毒 通 过 加 热 释 放 病 毒 RNA, 并 在 逆 转 录 酶 的 作 用 下 合 成 互 补 DNA(cDNA) 接 着 用 Taq 聚 合 酶 用 常 规 的 PCR 技 术 扩 增 cdna 通 过 凝 胶 电 泳 来 确 定 PCR 产 物 的 大 小, 和 证 实 结 108

118 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 果 cdna 的 合 成 与 PCR 反 应 都 使 用 了 多 组 特 异 的 寡 聚 核 苷 酸 引 物 与 核 酸 探 针 杂 交 相 类 似, 引 物 包 括 肠 道 病 毒 组 特 异 的 和 对 3 个 血 清 型 Sabin 株 特 异 的 引 物 ; 还 有 引 物 可 以 扩 增 所 有 脊 灰 病 毒 的, 以 及 扩 增 各 个 血 清 型 病 毒 的 这 样 的 引 物 组 合 可 以 对 脊 灰 病 毒 进 行 型 内 鉴 别, 同 时 可 以 鉴 定 病 毒 的 血 清 型 CDC 提 供 的 试 剂 盒 包 含 了 作 诊 断 性 PCR 实 验 所 需 的 关 键 试 剂 ( 没 有 酶 类 ), 并 且 可 以 通 过 WHO 获 得 实 验 室 操 作 技 术 规 范 : 因 为 PCR 技 术 是 一 个 扩 增 的 过 程, 得 到 PCR 产 物 的 同 时 遗 留 了 一 个 很 大 的 问 题 交 叉 污 染 按 下 列 好 的 实 验 室 操 作 规 程 操 作, 可 以 减 少 问 题 的 发 生 : PCR 之 前 的 准 备 工 作 和 之 后 的 处 理 分 别 在 不 同 的 房 间 内 操 作 ( 生 物 安 全 柜 要 装 备 紫 外 灯 ) PCR 之 前 的 准 备 工 作 和 之 后 的 处 理 分 别 使 用 2 套 移 液 器 以 及 其 他 设 备 将 试 剂 分 装 保 存, 尽 量 减 少 重 复 使 用 的 频 率 准 备 和 分 装 试 剂 应 该 在 无 PCR 扩 增 产 物 的 区 域 内 进 行 准 备 寡 聚 核 苷 酸 引 物 应 该 在 无 PCR 扩 增 产 物 的 环 境 中 进 行 只 使 用 能 阻 止 气 溶 胶 产 生 的 吸 尖 戴 手 套 ( 无 滑 石 粉 ), 并 经 常 更 换 打 开 各 种 管 子 要 小 心, 避 免 气 溶 胶 的 产 生 减 少 每 次 处 理 样 品 的 数 量 将 除 了 核 酸 之 外 的 其 他 试 剂 先 加 到 反 应 管 中, 最 后 再 加 入 核 酸 加 入 一 个 核 酸 后 要 盖 上 盖 子, 然 后 再 加 入 其 它 核 酸 使 用 阳 性 对 照 ; 选 取 一 个 稳 定 的 每 次 都 能 扩 增 出 结 果 的 样 品 作 阳 性 对 照 使 用 一 个 已 知 性 质 的 样 品 作 阴 性 对 照 每 次 实 验 都 要 用 试 剂 混 合 物 作 为 空 白 对 照 它 包 含 除 了 标 本 RNA 以 外 的 PCR 反 应 所 需 的 所 有 其 它 成 分 试 剂 盒 组 成 该 试 剂 盒 由 3 个 部 分 组 成 : 盒 1: 储 存 在 缓 冲 液 A 中 的 4 支 引 物 ( 血 清 型 1 型 引 物 PV-Serotype 1, 血 清 型 2 型 引 物 PV-Serotype 2, 血 清 型 3 型 引 物 PV-Serotype 3,Sabin 引 物 ) 每 对 引 物 的 相 应 的 阳 性 对 照 (4 支 ) 109

119 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 为 了 方 便 以 及 减 小 其 它 试 剂 的 使 用 量,3 对 Sabin 特 异 性 引 物 混 合 在 1 支 管 中 兼 并 引 物 对 不 要 混 合 在 一 起, 因 为 这 样 在 PCR 扩 增 后 会 产 生 非 特 异 性 反 应 产 物 盒 2: 储 存 在 缓 冲 液 A 中 的 2 支 引 物 ( 扩 增 所 有 肠 道 病 毒 组 引 物 PanEV 和 扩 增 所 有 脊 灰 病 毒 组 引 物 PanPV) 每 对 引 物 的 相 应 的 阳 性 对 照 (2 支 ) 盒 3: 6 支 缓 冲 液 B( 在 首 次 使 用 时, 需 要 将 DTT 和 酶 先 加 到 管 中 ) 1 支 DTT 1 支 1 PCR 缓 冲 液, 用 于 稀 释 DNA 分 子 量 对 照 1 份 包 装 单 每 一 部 分 在 使 用 时 各 种 试 剂 要 分 开 标 记, 因 为 各 试 剂 的 使 用 频 率 不 同, 以 便 连 续 使 用 其 它 必 需 的 试 剂 但 是 试 剂 盒 中 未 包 括 的 还 有 : 酶 (RNA 酶 抑 制 剂,AMV 逆 转 录 酶,Taq DNA 聚 合 酶 ) DNA 分 子 量 对 照 6 电 泳 载 样 缓 冲 液 ( 溴 酚 兰 ) 溴 化 乙 锭 (1ug/ml) 不 含 核 酸 酶 的 水 各 管 盖 子 和 插 入 物 的 颜 色 指 示 管 的 内 容 肠 道 病 毒 组 引 物 + 缓 冲 液 A 脊 灰 病 毒 组 引 物 + 缓 冲 液 A 脊 灰 血 清 型 1 型 引 物 + 缓 冲 液 A 脊 灰 血 清 型 2 型 引 物 + 缓 冲 液 A 脊 灰 血 清 型 3 型 引 物 + 缓 冲 液 A Sabin 株 引 物 + 缓 冲 液 A 缓 冲 液 B 和 其 它 试 剂 管 盖 紫 色 白 色 黄 色 橙 色 红 色 自 然 色 兰 色 110

120 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 引 物 对 所 在 的 管 子 都 有 红 色 的 插 入 物, 相 对 应 的 对 照 所 在 的 管 子 盖 子 的 颜 色 与 引 物 相 同, 并 且 有 黄 色 的 插 入 物 实 验 步 骤 (i) RT-PCR 反 应 1. 实 验 设 计, 在 PCR 记 录 纸 上 记 录 本 次 实 验 操 作 者 姓 名, 实 验 日 期, 所 鉴 定 标 本 的 名 称 以 及 标 本 的 顺 序, 与 PCR 仪 排 列 的 顺 序 一 致 A. 标 记 好 盛 标 本 和 对 照 的 PCR 管 ( 阳 性 对 照, 阴 性 对 照 和 试 剂 对 照 ) B. 阳 性 对 照 : 该 试 剂 盒 中 提 供 无 感 染 性 的 对 照 RNA C. 细 胞 对 照 : 使 用 未 接 种 病 毒 的 细 胞 悬 液, 最 好 使 用 与 扩 增 病 毒 所 用 的 细 胞 类 型 与 代 数 相 同 的 细 胞 每 一 次 实 验 设 2 个 细 胞 对 照 D. 试 剂 对 照 : 用 水 代 替 标 本 2. 在 冰 面 上 融 化 病 毒 标 本 和 各 种 PCR 试 剂 3. 向 每 1 对 引 物 的 管 中 加 入 19ul 缓 冲 液 A 和 引 物 的 混 合 物 4. 如 果 使 用 的 是 无 加 热 盖 的 PCR 仪, 那 么 每 管 要 加 入 20ul 灭 菌 的 矿 物 油 5. 将 病 毒 标 本 在 水 中 或 MEM( 无 血 清 ) 中 稀 释 4 倍 6. 在 生 物 安 全 柜 中, 向 相 对 应 的 管 中 加 入 1ul 的 稀 释 后 的 标 本 7. 在 PCR 仪 中 95 加 热 5 分 钟, 然 后 快 速 置 于 冰 面 上 8. 当 管 中 内 容 物 冷 却 后, 加 5ul 的 缓 冲 液 B 和 引 物 的 混 合 物 ( 第 1 次 使 用 缓 冲 液 B 时, 要 先 加 入 0.7ul 的 1 M DTT,6.9ul 40U/ul 的 RNA 酶 抑 制 剂,3.6ul 25U/ul 的 AMV 逆 转 录 酶, 和 13.7ul 的 5U/ul 的 Taq DNA 聚 合 酶, 并 混 匀 这 个 酶 的 混 合 物 在 -20 可 以 稳 定 保 存 6 个 月 当 已 经 加 入 酶 后, 用 一 支 不 能 拭 除 的 记 号 笔 在 管 盖 上 书 写 +E ) 9. 将 管 子 放 进 PCR 仪 中, 按 下 列 步 骤 开 始 循 环 反 应 ( 注 意, 如 果 使 用 的 PCR 仪 有 很 快 的 升 降 温 速 度, 例 如 PE Biosystems 9700 型 PCR 仪, 温 度 从 42 变 化 到 60 所 用 时 间 请 重 新 设 置 为 45 秒 ; 其 它 过 程 的 升 降 温 速 度 请 设 置 为 缺 省 值 ): A. RT 反 应,42,20 分 钟 B. 灭 活 逆 转 录 酶,95,3 分 钟 C. PCR 反 应 i. 兼 并 引 物 ( 脊 灰 病 毒 组 引 物 和 血 清 型 引 物 ):95 反 应 45 秒,42 反 应 45 秒,60 反 应 45 秒, 共 30 个 循 环 ii. 非 兼 并 引 物 ( 肠 道 病 毒 组 引 物 和 Sabin 株 引 物 ):95 反 应 45 秒,55 反 应 45 秒,70 反 应 45 秒, 共 30 个 循 环 D. 在 反 应 结 束 后 如 果 不 立 即 取 走 PCR 管 的 话, 应 该 使 PCR 仪 的 温 度 保 持 在 4 如 果 不 立 即 进 行 电 泳 分 析 的 话,PCR 产 物 应 该 储 存 在

121 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 (ii) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 在 进 行 PCR 反 应 的 同 时, 制 备 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 : 30% 丙 烯 酰 胺 - 双 丙,29:1 5.0ml 10 TBE 缓 冲 液,PH 值 ml 蒸 馏 水 8.5ml 10% W/V 过 硫 酸 铵 75ul TEMED 30ul 总 体 积 15ml 可 铺 2 块 胶, 每 块 8.0cm 7.3cm 配 制 10 TBE : 加 108 克 Tris-base,55 克 硼 酸 和 9.3 克 EDTA 到 800 毫 升 水 中 用 盐 酸 将 PH 值 调 到 8.4 补 充 水 到 1 升, 然 后 高 压 过 硫 酸 铵 溶 液 必 须 现 用 现 配, 或 者 分 装 成 小 包 装 储 存 在 -20, 可 以 保 存 1 年 组 装 铺 胶 板, 铺 好 2 块 胶, 用 0.75mm 厚 的 间 隔 条 使 胶 的 厚 度 为 0.75mm, 再 插 入 15 孔 的 梳 子 聚 合 反 应 至 少 45 分 钟, 也 可 以 过 夜 ( 用 浸 润 了 1 TBE 缓 冲 液 的 厚 滤 纸 保 护 胶 避 免 干 燥, 并 用 塑 料 膜 封 好 ) 1. 将 已 经 聚 合 的 凝 胶 转 移 到 电 泳 装 置 上 2. 在 96 孔 微 量 滴 定 板 上 或 帕 拉 膜 (Parafilm) 上 加 上 6 凝 胶 上 样 染 料 ( 每 个 反 应 需 2ul) 用 一 滴 染 料 加 上 10ul 的 PCR 反 应 产 物 上 样 前 迅 速 混 合 将 1ul 的 DNA 分 子 量 对 照 marker V(Roche 公 司 ),9ul 的 1 反 应 缓 冲 液,2ul 的 6 电 泳 上 样 染 料 混 合 在 一 起, 配 制 分 子 量 对 照 溶 液 3. 用 0.5ml 的 TBE 缓 冲 液 冲 孔 用 0.4mm 圆 头 或 平 头 吸 尖 将 样 品 与 载 样 缓 冲 液 的 混 合 溶 液 加 到 孔 中 将 阳 性 对 照 加 在 第 7 道, 分 子 量 对 照 加 在 第 2 和 14 道 剩 余 的 加 样 品 和 阴 性 对 照, 用 阴 性 对 照 将 样 品 分 隔 开 来 ( 见 图 7.3) 4. 配 制 400ml 的 0.5 TBE 电 泳 缓 冲 液, 配 制 方 法 是 将 20ml 的 10 TBE 缓 冲 液 加 入 到 380ml 的 蒸 馏 水 中 5. 将 电 泳 缓 冲 液 倒 在 电 泳 装 置 中, 盖 上 盖 子, 接 通 电 源 以 20mA 电 流 ( 持 续 电 流 ) 电 泳, 大 约 35 到 40 分 钟, 直 到 溴 酚 兰 跑 到 凝 胶 的 底 部 的 时 候, 停 止 电 泳 6. 将 胶 取 出, 如 果 同 时 有 多 块 凝 胶 电 泳, 要 切 除 凝 胶 的 边 缘 以 作 标 记, 并 注 意 保 持 凝 胶 的 方 向 7. 在 1ug/ml 的 溴 化 乙 锭 溶 液 中 染 色 15 分 钟, 同 时 轻 摇 注 意 : 溴 化 乙 锭 溶 液 是 有 毒 致 畸 并 且 致 肿 瘤 的 物 质, 操 作 时 要 加 小 心, 并 戴 双 层 手 套 如 果 储 存 在 避 光 的 容 器 中, 溴 化 乙 锭 溶 液 可 以 重 复 使 用 112

122 MW MW 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 8. 在 蒸 馏 水 中 洗 一 下 凝 胶 9. 在 紫 外 透 射 仪 下 观 察 PCR 产 物, 并 用 宝 利 来 相 机 ( 或 相 当 的 相 机 ) 照 相 作 记 录 结 果 解 释 图 8.3 加 样 示 意 图 标 本 分 子 量 对 照 标 本 细 胞 对 照 标 本 细 胞 对 照 通 过 比 较 标 本 的 PCR 产 物 与 阳 性 对 照 的 PCR 产 物 在 凝 胶 上 的 位 置 以 及 大 小 来 解 释 结 果 表 8.1 示 出 了 每 对 引 物 扩 增 片 段 的 大 小 图 8.4 示 出 了 一 个 阳 性 对 照 扩 增 产 物 电 泳 结 果 的 例 子 引 物 对 分 别 是 :M 为 MW 分 子 量 对 照 ;EV 为 肠 道 病 毒 组 引 物 ;PV 为 脊 灰 病 毒 组 引 物 ;P1 为 血 清 型 1 型 病 毒 引 物 ;P2 为 血 清 型 2 型 病 毒 引 物 ;P3 为 血 清 型 3 型 病 毒 引 物 ;Sab 为 Sabin 株 病 毒 引 物 阳 性 对 照 细 胞 对 照 标 本 细 胞 对 照 标 本 试 剂 对 照 标 本 分 子 量 对 照 标 本 图 8.4 阳 性 对 照 扩 增 产 物 电 泳 结 果 示 意 图 113

123 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 表 8.1 PCR 实 验 结 果 解 释 表 标 本 PCR 结 果 所 有 引 物 (-) PanEV(+), 其 它 (-) PanEV(+), PanPV(+), Sabin(-), 1 组 或 多 组 血 清 型 (+) PanEV(+),PanPV(+),1 组 或 多 组 Sabin(+), 相 对 应 的 血 清 型 (+) PanEV(+),PanPV(+),1 组 或 多 组 Sabin(+), 更 多 的 血 清 型 (+) 鉴 定 结 果 非 肠 道 病 毒 (NEV) 非 脊 灰 肠 道 病 毒 (NPEV) 已 知 血 清 型 的 脊 灰 野 病 毒 已 知 血 清 型 的 脊 灰 疫 苗 株 病 毒 不 同 血 清 型 的 野 病 毒 和 疫 苗 株 病 毒 的 混 合 病 毒 PCR 结 果 如 果 超 出 表 8.1 的 范 围, 则 说 明 实 验 错 误, 需 要 重 新 实 验 表 8.2 PCR 引 物 列 表 引 物 对 名 称 引 物 序 列 扩 增 产 物 大 小 全 肠 道 病 毒 组 引 物 (PanEV) 5'-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCC-3' 114 碱 基 对 5'-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3' 全 脊 灰 病 毒 组 引 物 (PanPV)* 5'-TTIAIIGCRTGICCRTTRTT-3' 79 碱 基 对 5'-CITAITCIMGITTYGAYATG-3' 脊 灰 血 清 型 1 型 引 物 (Sero1)* 5'-ATCATICTYTCIARCATYTG-3' 70 碱 基 对 5'-TGCGIGAYACIACICAYAT-3' 脊 灰 血 清 型 2 型 引 物 (Sero2)* 5'-AYICCYTCIACIRCICCYTC-3' 79 碱 基 对 5'-TGCGIGAYACIACICAYAT-3' 脊 灰 血 清 型 3 型 引 物 (Sero3)* 5'-CCIAIYTGITCRTTIGYRTC-3' 140 碱 基 对 5'-AAYCCITCIRTITTYTAYAC-3' Sabin1 引 物 (Sabins) 5'-TCCACTGGCTTCAGTGTT-3' 97 碱 基 对 5'-AGGTCAGATGCTTGAAAGC-3' Sabin2 引 物 (Sabins) 5'-CGGCTTTGTGTCAGGC-3' 71 碱 基 对 5'-CCGTTGAAGGGATTACTAAA-3' Sabin3 引 物 (Sabins) 5'-AGTATCAGGTAAGCTATCC-3' 53 碱 基 对 5'-AGGGCGCCCTAACTTTG-3' *: 兼 并 引 物 :M=A+C;R=A+G;Y=C+T;I 为 嘌 呤 嘧 啶 使 用 这 些 引 物 的 时 候, 要 改 变 PCR 反 应 条 件, 使 之 适 合 这 些 引 物 114

124 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 PCR 实 验 的 实 验 的 疑 难 解 答 问 题 包 括 阳 性 对 照 在 内 的 所 有 反 应 均 为 阴 性 阳 性 对 照 扩 增 反 应 为 阴 性, 而 一 些 标 本 反 应 为 阳 性 细 胞 对 照 为 阳 性, 而 试 剂 对 照 为 阴 性 试 剂 对 照 为 阳 性, 而 细 胞 对 照 为 阴 性 细 胞 对 照 和 试 剂 对 照 都 为 阳 性 1 个 或 多 个 Sabin 引 物 对 反 应 为 阳 性, 但 是 相 对 应 的 血 清 型 引 物 反 应 和 / 或 PanPV 引 物 反 应 为 阴 性 PanPV 引 物 反 应 为 阳 性, 但 是 所 有 的 血 清 型 引 物 反 应 为 阴 性 可 能 的 原 因 及 解 决 方 法 忘 记 加 某 种 试 剂 成 分, 选 择 错 误 的 PCR 仪 程 序, 或 者 试 剂 失 效 对 照 RNA 降 解 或 未 加 细 胞 对 照 被 病 毒 或 扩 增 的 DNA 所 污 染 需 重 新 获 得 新 的 细 胞 对 照 作 为 试 剂 对 照 的 水 被 扩 增 的 DNA 所 污 染 试 剂 被 扩 增 的 DNA 所 污 染 确 认 血 清 型 引 物 的 PCR 反 应 退 火 温 度 为 42 确 认 PCR 仪 的 温 度 从 42 升 至 60 所 需 的 时 间 大 约 为 45 秒 非 常 少 见 (<0.1% 的 标 本 会 出 现 这 种 情 况 ),PanPV 引 物 可 能 扩 增 某 种 柯 萨 奇 A24 株 病 毒, 生 成 82bp 的 产 物 这 个 标 本 应 该 送 到 特 殊 参 考 实 验 室 作 进 一 步 的 鉴 定 8.4 使 用 两 种 方 法 进 行 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 常 规 使 用 的, 被 网 络 实 验 室 所 支 持 的 上 述 所 列 出 的 几 种 型 内 鉴 别 方 法 是 基 于 不 同 的 原 理 的 ELISA 法 用 多 克 隆 交 叉 吸 附 抗 血 清 检 测 脊 灰 野 病 毒 和 疫 苗 株 病 毒 抗 原 性 的 不 同, 而 核 酸 探 针 杂 交 法 和 诊 断 性 PCR 法 是 分 子 生 物 学 方 法, 能 够 检 测 病 毒 RNA 的 不 同 已 经 有 实 验 证 据 表 明 : 大 多 数 的 VDPV( 与 Sabin 株 序 列 相 比,VP1 区 基 因 序 列 相 差 1%~15%) 在 应 用 不 同 方 法 进 行 型 内 鉴 别 的 时 候, 得 出 的 结 果 不 一 致 一 些 VDPV 表 现 出 较 高 的 神 经 毒 性, 而 且 有 在 人 群 中 传 播 的 能 力 因 此 互 相 矛 盾 的 型 内 鉴 别 结 果 可 给 这 个 115

125 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 毒 株 打 上 一 个 标 记, 显 示 其 在 整 个 消 除 项 目 中 的 重 要 性 所 有 的 进 行 型 内 鉴 别 的 实 验 室 都 必 须 应 用 基 于 不 同 原 理 的 两 种 方 法 来 对 所 有 的 脊 灰 毒 株 进 行 鉴 定 另 外, 对 于 仅 仅 用 一 种 方 法 进 行 型 内 鉴 别 的 毒 株 来 说, 还 必 须 作 全 长 VP1 区 基 因 序 列 分 析, 按 照 项 目 要 求, 在 14 天 内 得 出 型 内 鉴 别 和 VP1 区 基 因 序 列 的 资 料 使 用 2 种 方 法 进 行 型 内 鉴 别 报 告 结 果 模 式 如 表 8.5 所 示 表 8.3 使 用 ELISA 法 和 核 酸 探 针 杂 交 法 / 诊 断 性 PCR 法 进 行 型 内 鉴 别 的 方 案 编 号 ELISA 实 验 结 果 探 针 杂 交 /PCR 法 结 果 采 取 的 措 施 1 野 病 毒 野 病 毒 报 告 野 病 毒, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 2 Sabin 株 病 毒 Sabin 株 病 毒 报 告 Sabin 株 病 毒 3 双 反 应 野 病 毒 视 为 野 病 毒, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 4 双 反 应 Sabin 株 病 毒 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 5 双 反 应 弱 反 应 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 6 无 反 应 野 病 毒 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 7 无 反 应 Sabin 株 病 毒 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 8 无 反 应 弱 反 应 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 9 野 病 毒 弱 反 应 视 为 野 病 毒, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 10 Sabin 株 病 毒 弱 反 应 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 11 Sabin 株 病 毒 野 病 毒 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 12 野 病 毒 Sabin 株 病 毒 引 起 注 意, 将 标 本 送 至 全 球 特 殊 实 验 室 * 这 样 的 标 本 应 该 通 报 给 国 家 实 验 室 的 协 调 员 ( 如 果 接 受 标 本 的 话 ), 或 者 国 家 项 目 计 划 ( 来 自 地 区 参 考 实 验 室 的 国 家 ) 和 地 区 参 考 实 验 室 的 协 调 员 116

126 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 说 明 : 结 果 1 和 2: 如 果 2 种 实 验 结 果 一 致, 那 么 应 该 很 有 自 信 地 报 告 结 果 所 有 的 脊 灰 野 病 毒 标 本 应 该 送 检 测 序 结 果 3 : 相 同 血 清 型 的 脊 灰 野 病 毒 和 疫 苗 株 病 毒 的 混 合 病 毒, 或 者 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒, 这 些 标 本 的 ELISA 实 验 结 果 可 能 是 双 反 应 如 果 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 显 示 为 野 病 毒, 那 么 不 存 在 Sabin 株 病 毒, 应 该 报 告 脊 灰 野 病 毒 结 果 4 和 5: 如 果 ELISA 法 结 果 为 双 反 应, 而 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 显 示 为 Sabin 株 病 毒, 那 么 提 示 脊 灰 野 病 毒 可 能 存 在 于 混 合 物 中, 或 者 存 在 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒, 这 样 的 标 本 应 该 送 检 做 进 一 步 的 分 析 无 法 作 出 确 切 的 报 告 结 果 6 : ELISA 法 结 果 为 无 反 应, 可 能 是 由 于 存 在 无 法 被 交 叉 吸 附 抗 血 清 识 别 的 脊 灰 野 病 毒 如 果 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 显 示 为 野 病 毒, 那 么 结 果 无 法 判 定, 需 要 向 全 球 特 殊 实 验 室 送 检 该 标 本 结 果 7 和 8: ELISA 法 结 果 为 无 反 应, 可 能 是 由 于 存 在 无 法 被 交 叉 吸 附 抗 血 清 识 别 的 脊 灰 野 病 毒 如 果 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 显 示 为 Sabin 株 病 毒, 或 者 为 弱 反 应, 那 么 结 果 相 互 矛 盾, 该 标 本 需 要 送 检 结 果 9 : 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 显 示 为 弱 反 应, 可 能 是 由 于 病 毒 RNA 的 浓 度 过 低 如 果 ELISA 法 结 果 为 脊 灰 野 病 毒, 须 报 告 疑 似 脊 灰 野 病 毒, 并 将 标 本 送 检 到 全 球 特 殊 实 验 室 做 进 一 步 的 分 析 结 果 10: 如 果 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 显 示 为 弱 反 应, 而 ELISA 法 结 果 显 示 为 Sabin 株 病 毒, 结 果 无 法 报 告 该 标 本 需 要 送 检 结 果 11 和 1 2 : 如 果 探 针 法 /PCR 法 的 结 果 与 ELISA 法 的 结 果 完 全 矛 盾 时, 无 法 报 告 结 果 可 能 存 在 疫 苗 衍 生 脊 灰 病 毒, 将 标 本 送 检 到 全 球 特 殊 实 验 室 做 进 一 步 的 分 析 对 4 到 12 报 告 结 果 形 式 的 建 议 : 117

127 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 分 离 到 X 型 脊 灰 病 毒 型 内 鉴 别 结 果 无 法 判 断, 该 标 本 已 经 送 检 到 全 球 特 殊 实 验 室 做 进 一 步 的 分 析 使 用 核 酸 探 针 杂 交 法 和 PCR 法 得 到 的 结 果 应 该 一 致 否 则 的 话, 该 标 本 应 该 送 检 到 全 球 特 殊 实 验 室 做 进 一 步 的 分 析 如 果 型 内 鉴 别 的 结 果 相 互 矛 盾 或 者 无 法 判 定, 这 样 的 标 本 应 该 通 报 给 国 家 实 验 室 的 协 调 员 ( 如 果 接 受 标 本 的 话 ), 或 者 国 家 项 目 计 划 ( 来 自 地 区 参 考 实 验 室 的 国 家 ) 和 地 区 参 考 实 验 室 的 协 调 员 ( 在 1 个 工 作 日 内 ) 实 验 室 应 该 将 一 部 分 原 始 标 本 尽 快 送 到 全 球 特 殊 实 验 室, 不 要 试 图 自 己 解 决 问 题 而 浪 费 了 宝 贵 的 时 间 118

128 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 第 9 部 分 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 在 脊 髓 灰 质 炎 消 除 过 程 中, 实 验 室 扮 演 着 非 常 重 要 的 角 色 实 验 室 的 结 果 通 常 可 以 用 来 监 测 脊 灰 野 病 毒 出 现 的 时 间 以 及 地 点, 并 研 究 病 毒 之 间 的 关 系, 将 脊 髓 灰 质 炎 病 例 分 类, 以 便 有 针 对 性 地 进 行 免 疫 活 动 如 果 从 AFP 病 例 中 分 离 到 了 脊 灰 野 病 毒, 那 将 会 引 发 一 系 列 的 现 场 应 对 行 动 : 包 括 必 须 进 行 现 场 调 查 以 发 现 是 否 有 另 外 的 脊 灰 病 例, 并 且 在 消 除 计 划 的 最 后 阶 段, 进 行 一 场 大 规 模 的, 昂 贵 的 扫 荡 运 动 以 阻 断 最 后 的 传 播 链 因 此, 准 确 及 时 的 实 验 室 结 果 是 极 其 重 要 的 如 果 根 本 没 有 脊 灰 野 病 毒 存 在, 而 实 验 室 结 果 报 告 存 在, 这 将 引 起 严 重 的 后 果, 表 现 在 以 下 几 个 方 面 : 浪 费 了 大 量 的 财 力 资 源, 现 场 调 查 人 员 花 时 间 和 精 力 进 行 不 必 要 的 现 场 调 查, 使 实 验 室 的 名 声 受 到 损 害, 使 实 验 室 人 员 的 自 信 心 受 到 打 击 只 要 怀 疑 有 脊 灰 野 病 毒 的 污 染, 无 论 何 时 都 要 立 即 进 行 调 查 因 为 这 类 事 件 的 发 生 意 味 着 要 着 手 制 订 现 场 调 查 的 计 划, 所 以 要 立 即 通 知 地 区 实 验 室 的 协 调 员 他 应 该 提 供 帮 助, 或 者 请 其 他 病 毒 学 专 家 给 予 帮 助, 在 报 告 有 野 病 毒 的 实 验 室 中 进 行 该 事 件 的 调 查 协 调 员 也 应 该 敦 促 参 比 实 验 室 立 即 进 行 型 内 鉴 别 实 验 (ITD) 或 进 行 基 因 序 列 分 析 9.1 什 么 时 候 怀 疑 有 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 在 下 列 情 况 下, 应 怀 疑 实 验 室 发 生 了 脊 灰 野 病 毒 的 污 染, 并 进 行 调 查 在 某 一 地 点 ( 例 如 所 有 报 告 都 来 自 于 同 一 个 实 验 室 ), 或 某 一 时 间 ( 例 如 所 有 报 告 都 发 生 在 一 个 星 期 内 ), 脊 灰 野 病 毒 阳 性 报 告 结 果 不 同 寻 常 地 集 中 实 验 室 的 结 果 与 流 行 病 学 的 调 查 结 果 不 一 致 在 几 个 没 有 明 显 流 行 病 学 联 系 的 患 者 中 分 离 的 脊 灰 野 病 毒, 序 列 分 析 资 料 表 明 核 苷 酸 序 列 完 全 一 致, 特 别 是 当 所 有 的 病 例 标 本 是 由 同 一 个 实 验 室 检 测 的 时 候 应 该 对 所 有 的 实 验 室 操 作 程 序 或 者 步 骤 进 行 彻 底 的 回 顾 性 调 查 以 便 查 出 可 能 的 污 染 源 下 面 的 一 些 指 导 方 针 可 以 帮 助 实 验 室 进 行 调 查, 并 制 定 一 些 可 以 减 小 实 验 室 污 染 危 险 性 的 方 法 由 于 野 病 毒 会 造 成 一 系 列 的 影 响, 所 以 本 指 导 方 针 着 重 于 脊 灰 野 病 毒 但 是, 实 验 室 也 应 该 调 查 可 能 的 Sabin 株 或 其 他 非 脊 灰 肠 道 病 毒 的 污 染, 因 为 对 这 一 类 病 毒 来 说, 他 们 都 是 造 成 污 染 潜 在 的 原 因, 并 且 处 理 方 法 也 很 类 似 119

129 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 9.2 调 查 可 能 的 脊 灰 野 病 毒 污 染 源 脊 灰 野 病 毒 可 能 来 自 参 考 毒 株 接 种 标 本 误 鉴 定 的 或 已 污 染 的 病 毒 库 如 果 这 些 来 源 的 脊 灰 野 病 毒 混 入 了 在 同 时 鉴 定 的 其 他 标 本 中 的 话, 那 么 污 染 就 发 生 了 应 该 回 答 的 一 些 问 题 包 括 : 实 验 室 中 现 有 的 脊 灰 参 考 病 毒 株 有 哪 些? 在 国 家 实 验 室 中, 仅 仅 OPV 来 源 的 毒 株 可 以 用 作 参 考 毒 株 应 灭 活 所 有 可 繁 殖 的 脊 灰 野 病 毒 毒 株, 或 者 封 存 起 来 严 格 限 制 接 触 ELISA 探 针 杂 交 或 PCR 法 等 脊 灰 病 毒 的 型 内 鉴 别 实 验 (ITD) 中 的 病 毒 对 照 应 该 使 用 从 WHO 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 获 得 的 非 感 染 性 的 参 考 毒 株 实 验 室 如 果 使 用 WHO 现 在 还 没 有 认 可 的 其 他 型 内 鉴 别 方 法 时, 应 该 使 用 带 有 易 于 识 别 的 分 子 标 记 的 对 照 毒 株, 以 易 于 与 现 在 流 行 的 脊 灰 野 病 毒 鉴 别 实 验 室 现 存 哪 些 现 在 的 或 过 去 的 脊 灰 毒 株 或 非 脊 灰 肠 道 毒 株? 没 有 进 行 血 清 定 型 的 肠 道 病 毒 ; 误 判 型 别 的 肠 道 病 毒 ; 没 有 进 行 型 内 鉴 别 的 脊 灰 病 毒 ; 或 使 用 非 WHO 推 荐 的 型 内 鉴 别 方 法 进 行 型 内 鉴 别 的 脊 灰 病 毒, 根 据 它 们 所 分 离 的 时 间 和 地 点, 都 可 能 成 为 脊 灰 野 病 毒 的 潜 在 的 来 源 经 过 WHO 地 区 实 验 室 协 调 员 认 定 脊 灰 病 毒 分 离 株 已 经 没 有 价 值 后, 一 些 不 再 需 要 的 过 去 的 肠 道 病 毒 和 脊 灰 病 毒 分 离 物 应 该 灭 活 过 去 的 脊 灰 病 毒 和 非 脊 灰 肠 道 病 毒 分 离 物 应 该 和 现 在 的 患 者 标 本 或 分 离 物 分 开 处 理, 并 且 由 有 经 验 的, 已 经 对 脊 灰 病 毒 有 免 疫 力 的 人 员 在 生 物 安 全 2 级 条 件 下 操 作 实 验 室 中 保 存 有 哪 些 从 有 潜 在 传 染 性 患 者 或 从 环 境 中 分 离 到 的 脊 灰 野 病 毒 标 本? 在 脊 灰 野 病 毒 流 行 的 时 间 或 地 点 采 集 标 本 时, 标 本 中 可 能 就 含 有 脊 灰 野 病 毒 那 么, 在 实 验 中 如 果 标 签 有 误 或 / 和 通 过 物 理 途 径 导 致 交 叉 污 染, 如 无 意 中 污 染 了 同 时 操 作 的 已 接 种 了 现 在 标 本 的 细 胞, 这 种 情 况 是 很 危 险 的 实 验 室 中 有 哪 些 可 以 在 脊 灰 病 毒 敏 感 细 胞 上 生 长 的 参 考 病 毒 株? 有 报 道 说, 一 些 鼻 病 毒 或 非 脊 灰 肠 道 病 毒 参 考 毒 株 中 可 能 含 有 脊 灰 病 毒 这 些 毒 株 通 常 是 在 动 物 或 哺 乳 动 物 来 源 的 细 胞 系 中 传 代 得 到 的, 而 在 这 些 情 况 下, 脊 灰 病 毒 也 可 以 复 制 实 验 室 应 该 鉴 定 病 毒 库 和 参 考 毒 株 的 血 清 型 以 及 它 们 的 特 性 ( 例 如 用 中 和 实 验 或 蚀 斑 减 少 实 验 等 ) 来 排 除 脊 灰 病 毒 的 存 在 120

130 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 9.3 检 查 在 实 验 室 操 作 中 有 无 失 误 逐 渐 地 背 离 常 规 的 实 验 室 操 作 步 骤, 走 捷 径, 或 是 使 用 新 的 操 作 步 骤, 这 些 都 会 使 污 染 乘 机 而 入, 而 且 经 常 发 生 在 实 验 者 对 可 能 产 生 的 问 题 不 明 了 的 时 候 所 以 要 对 所 有 的 实 验 者 进 行 细 致 的 回 顾 性 调 查, 调 查 的 内 容 应 该 包 括 : 是 不 是 所 有 装 标 本 和 病 毒 的 容 器 都 是 防 泄 露 并 带 有 外 螺 旋 盖 的 容 器? 如 果 不 用 这 种 容 器, 那 么 在 进 行 开 启 盖 子 等 操 作 时 会 发 生 一 些 不 利 的 事 件, 例 如 会 产 生 气 溶 胶 或 飞 沫, 污 染 容 器 的 外 表 面, 污 染 操 作 者 的 手 等 标 本 和 接 种 了 病 毒 的 细 胞 的 开 启 和 操 作 是 不 是 在 用 于 操 作 有 感 染 性 材 料 的 II 级 生 物 安 全 柜 中 进 行? 调 查 的 内 容 包 括 检 查 生 物 安 全 柜 的 气 流, 以 及 在 生 物 安 全 柜 中 的 操 作 步 骤, 特 别 是 检 查 有 没 有 能 够 妨 碍 气 流 运 动 的 材 料 或 仪 器 的 存 在 另 外, 证 实 生 物 安 全 柜 进 行 了 维 护 检 查, 以 及 使 用 正 确 的 消 毒 剂 对 生 物 安 全 柜 去 污 染, 这 也 是 很 重 要 的 有 没 有 对 接 种 了 病 毒 的 细 胞 培 养 液 进 行 混 匀 或 倾 倒 的 操 作? 或 其 他 可 避 免 的 产 生 气 溶 胶 的 操 作? 气 溶 胶 或 飞 沫 的 产 生 会 对 操 作 者 仪 器 环 境 甚 至 整 个 实 验 带 来 污 染 在 进 行 病 毒 学 实 验 的 实 验 室 中 有 很 多 机 会 能 产 生 气 溶 胶 或 飞 沫, 例 如 : 震 荡 离 心 样 品 或 溶 液 的 混 匀 倾 倒 细 胞 培 养 液 移 液 打 开 病 毒 保 存 管 或 细 胞 培 养 瓶 的 盖 子 等 等 操 作 应 该 调 整 实 验 操 作 步 骤 以 便 减 小 这 些 步 骤 产 生 气 溶 胶 或 飞 沫 的 机 会 例 如 在 进 行 震 荡 或 离 心 过 程 时, 应 该 使 用 带 有 螺 旋 盖 的 样 品 管 或 细 胞 培 养 瓶 接 种 病 毒 或 传 细 胞 时, 移 液 器 的 使 用 是 否 正 确? 在 同 一 时 间, 进 行 不 同 的 细 胞 操 作 时, 由 于 移 液 技 术 使 用 不 当, 病 毒 会 在 不 经 意 间 污 染 细 胞 最 简 单 的 解 决 办 法 可 以 采 取 例 如 规 定 在 同 一 时 间 内, 只 允 许 打 开 一 个 细 胞 培 养 瓶 的 盖 子 进 行 操 作 使 用 一 次 性 的 移 液 管 并 且 确 保 移 液 管 在 丢 弃 之 前 只 进 行 过 一 个 细 胞 系 的 操 作 当 在 细 胞 上 接 种 病 毒, 或 分 离 病 毒 时, 仅 仅 使 用 消 过 毒 的 有 独 立 包 装 的, 并 且 带 有 棉 球 过 滤 的 移 液 管 在 特 殊 的 情 况 下, 如 果 使 用 移 液 器 代 替 有 刻 度 的 移 液 管, 那 么 移 液 器 所 使 用 的 吸 尖 必 须 可 以 截 留 气 溶 胶 无 论 如 何, 移 液 器 的 主 体 部 分 也 不 要 接 触 到 接 种 了 病 毒 的 细 胞 系 121

131 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 是 不 是 装 标 本 的 容 器 工 作 台 表 面 还 有 实 验 室 废 弃 物 都 消 毒 处 理 过? 纸 巾 棉 签 或 其 它 擦 拭 了 装 标 本 的 容 器 或 工 作 台 表 面 的 东 西 都 应 该 认 为 是 感 染 性 废 弃 物 用 于 擦 拭 装 标 本 的 容 器 或 工 作 台 表 面 的 任 何 消 毒 剂, 都 应 该 能 有 效 地 杀 灭 脊 髓 灰 质 炎 病 毒, 并 且 在 正 确 的 浓 度 下, 要 作 用 合 适 的 时 间 实 验 室 的 废 弃 物 应 该 直 接 放 入 可 高 压 的 容 器 中, 并 在 丢 弃 前 高 压 处 理 剩 余 的 粪 便 标 本 是 不 是 保 存 在 原 始 容 器 中, 是 不 是 保 存 在 -20 至 少 12 个 月? 万 一 需 要 重 复 进 行 病 毒 分 离 时, 这 个 步 骤 就 显 得 很 重 要 了 在 实 验 过 程 中 各 种 试 剂 有 没 有 被 误 贴 标 签? 将 标 本 转 移 到 一 个 未 贴 标 签 的 容 器 中 是 搞 混 标 本 最 常 见 的 原 因 在 对 一 个 脊 灰 野 病 毒 进 行 操 作 的 时 候, 如 果 贴 错 标 签, 那 么 报 告 结 果 就 会 发 生 张 冠 李 戴 为 了 避 免 这 种 事 情 发 生, 如 果 要 转 移 标 本 或 者 细 胞 培 养 所 需 的 各 种 试 剂, 就 必 须 转 移 到 已 经 标 记 好 的 管 子 中 一 个 很 好 的 做 法 就 是 在 接 收 标 本 的 时 候 分 配 给 每 个 标 本 一 个 唯 一 的 实 验 室 编 号 通 常 这 是 唯 一 的 一 次 机 会, 实 验 室 的 编 号 与 特 定 的 患 者 发 生 关 联 这 样, 实 验 室 操 作 人 员 转 移 标 本 的 时 候, 可 以 通 过 肉 眼 核 对 原 先 装 标 本 的 管 子 上 的 编 号 和 预 先 标 记 好 的 新 管 子 上 的 编 号 是 否 一 致 进 行 实 验 的 时 候, 再 检 查 一 下 原 始 记 录 上 标 本 的 编 号 是 否 正 确 也 是 很 重 要 的 9.4 确 定 标 本 结 果 是 否 可 以 追 踪 实 验 室 应 该 坚 持 良 好 的 记 录, 以 便 回 顾 性 调 查 时 有 据 可 查 实 验 室 认 证 要 求 实 验 室 记 录 所 有 的 操 作 步 骤 及 实 验 日 期 通 过 回 顾 性 调 查 实 验 室 记 录, 虽 然 不 是 每 次 都 能, 但 通 常 可 以 追 踪 污 染 的 来 源 如 果 怀 疑 有 污 染, 那 么 在 调 查 的 时 候, 通 常 被 要 求 回 答 下 列 问 题 : 还 有 哪 些 标 本 与 被 怀 疑 污 染 的 标 本 同 时 或 者 同 一 天 处 理? 这 时 的 回 顾 性 调 查 就 要 涉 及 所 有 的 操 作 步 骤, 包 括 病 毒 接 种 传 代 血 清 定 型 和 型 内 鉴 别 等 等 步 骤 是 不 是 所 有 与 被 怀 疑 污 染 的 标 本 同 时 处 理 的 标 本 都 重 新 进 行 了 检 测? 建 议 对 被 怀 疑 污 染 的 标 本 的 原 始 标 本 进 行 重 新 检 测 该 实 验 室 应 该 向 全 球 专 项 实 验 室 提 交 装 在 原 始 容 器 中 的 原 始 标 本 以 便 进 行 进 一 步 的 调 查, 尽 快 得 出 重 新 鉴 定 的 结 果 和 该 毒 株 的 序 列 资 料 该 实 验 室 在 等 待 全 球 专 项 实 验 室 的 结 122

132 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 调 查 在 细 胞 培 养 中 脊 灰 野 病 毒 的 污 染 果 时, 也 可 以 对 本 实 验 室 保 存 的 粪 便 标 本 悬 液 进 行 重 新 鉴 定 如 果 原 先 报 告 为 野 病 毒 毒 株 的 结 果 经 再 次 实 验 无 法 重 现, 那 么 就 明 显 证 明 发 生 了 污 染 9.5 在 调 查 时 加 强 与 脊 灰 项 目 组 的 联 系 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 中 的 每 一 个 实 验 室 都 要 求 向 项 目 组 报 告 所 有 脊 灰 野 病 毒 阳 性 结 果 每 份 报 告, 除 非 被 证 明 有 问 题, 都 被 认 为 是 正 确 可 信 的 如 果 报 告 为 脊 灰 野 病 毒 病 例, 特 别 是 在 历 史 上 或 最 近 无 脊 灰 流 行 的 国 家 和 地 区, 将 会 引 发 迅 速 的 现 场 应 对 行 动 现 场 调 查 包 括 对 病 例 的 调 查 ( 临 床 症 状 免 疫 史 外 出 史 或 者 与 疾 病 流 行 区 人 员 的 接 触 史 ), 还 要 寻 找 报 告 的 病 例 所 在 地 区 有 无 其 他 的 AFP 病 例 实 验 室 与 脊 灰 项 目 组 全 面 及 时 地 联 系 在 解 决 可 能 发 生 污 染 事 件 上 是 非 常 关 键 的 123

133 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 第 10 部 分 标 本 和 分 离 物 的 运 输 在 正 确 条 件 下 合 理 运 输 样 品 标 本 和 细 胞 株 是 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 至 关 重 要 的 问 题 要 成 功 地 完 成 上 述 材 料 的 运 输 就 必 须 遵 守 一 系 列 的 国 内 和 国 际 条 例, 否 则 容 易 造 成 一 些 不 必 要 的 耽 搁 标 本 活 性 的 降 低 或 者 一 些 潜 在 性 感 染 材 料 对 运 输 人 收 件 人 和 公 众 的 危 害 按 照 惯 例 是 严 禁 在 国 际 航 空 运 输 过 程 中 由 运 输 人 以 手 提 方 式 携 带 感 染 性 材 料 的, 如 包 装 在 塑 胶 封 袋 中 携 带 要 成 功 地 在 全 球 脊 灰 实 验 室 网 络 间 运 输 样 品 事 先 必 须 要 有 详 细 而 周 全 的 计 划 合 理 的 包 装 清 晰 的 标 记 完 整 的 文 件 以 及 运 输 过 程 中 相 关 托 运 方 承 运 方 和 接 收 方 之 间 良 好 的 沟 通 10.1 运 输 计 划 所 有 实 验 室 运 送 的 材 料 都 应 由 托 运 人 负 责 作 清 晰 的 标 记 正 确 的 包 装 和 准 备 相 关 的 运 输 文 件 为 了 安 全 及 时 并 能 在 良 好 的 条 件 下 运 送 感 染 性 材 料, 需 要 运 输 过 程 中 相 关 托 运 方 承 运 方 和 接 收 方 ( 即 接 收 材 料 的 实 验 室 ) 之 间 良 好 的 合 作 这 种 良 好 的 合 作 是 基 于 三 方 之 间 业 已 建 立 的 良 好 沟 通 和 友 好 的 合 作 关 系 和 接 收 方 事 先 的 沟 通 一 旦 实 验 室 决 定 寄 送, 首 先 应 该 通 知 对 方 实 验 室 并 告 知 所 要 寄 送 材 料 的 种 类 并 且 托 运 方 要 充 分 了 解 接 收 方 国 家 所 要 求 的 相 关 法 律 规 定 材 料, 如 果 需 要, 接 收 方 实 验 室 需 要 将 许 可 证 明 材 料 送 给 ( 通 常 是 传 真 ) 托 运 方 实 验 室 关 于 采 用 何 种 托 运 方 式, 托 运 方 应 该 征 求 接 收 方 的 建 议, 双 方 在 时 间 安 排 上 尽 量 做 到 最 为 合 理, 以 使 接 收 人 能 很 方 便 地 接 收, 最 好 将 接 收 日 期 避 开 周 末 和 承 运 方 提 前 做 准 备 在 通 知 接 收 方 托 运 事 宜 后, 托 运 方 需 寻 找 一 个 有 资 质 可 以 承 运 感 染 性 材 料 和 诊 断 标 本 的 承 运 者, 并 且 确 保 : 可 以 承 运 材 料 运 输 尽 可 能 直 达 并 且 避 免 周 末 到 达 能 妥 善 保 存 运 输 相 关 材 料 全 程 确 保 运 输 条 件 一 旦 有 任 何 延 误, 要 及 时 通 知 托 运 方 124

134 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 托 运 方 亦 要 准 备 好 所 有 相 关 材 料, 以 便 承 运 方 能 够 顺 利 运 输, 承 运 方 也 可 在 材 料 包 装 方 面 提 供 建 议 10.2 运 输 材 料 的 包 装 合 理 的 包 装 是 保 证 运 输 材 料 在 运 输 过 程 中 保 持 完 好 避 免 事 故 以 及 避 免 违 反 任 何 相 关 规 定 而 顺 利 到 达 的 关 键 不 同 的 实 验 室 材 料 的 包 装 要 根 据 不 同 的 国 际 和 国 内 规 定 来 执 行 世 界 范 围 内 有 大 量 的 经 过 资 格 认 证 并 熟 知 国 际 规 则 的 包 装 代 理 公 司 建 议 全 球 脊 灰 网 络 实 验 室 能 够 和 这 样 具 有 资 质 的 公 司 所 认 可 的 合 格 包 装 人 员 建 立 工 作 联 系 不 论 采 取 何 种 方 式 运 输 实 验 室 感 染 性 材 料 都 必 须 遵 循 以 下 组 织 的 相 关 规 定 : 联 合 国 危 险 物 运 输 专 家 委 员 会 (UN), 国 际 组 织 如 邮 联 (UPU), 国 际 民 航 组 织 (ICAO), 国 际 航 空 运 输 协 会 (IATA) 世 界 卫 生 组 织 的 作 用 是 为 以 上 组 织 提 供 咨 询, 是 顾 问 的 角 色 目 前 规 定 有 以 下 5 类 材 料 必 须 符 合 安 全 运 输 条 例, 而 且 根 据 运 输 材 料 的 类 别 不 同, 要 求 也 不 同 感 染 性 材 料 - 含 有 或 可 能 含 有 病 原 体 的 物 质 病 原 体 是 指 微 生 物 ( 包 括 细 菌 病 毒 立 克 次 氏 体 寄 生 虫 真 菌 ) 及 已 知 的 或 者 可 能 使 人 或 动 物 感 染 疾 病 的 重 组 微 生 物 ( 由 杂 交 或 突 变 产 生 ) 生 物 制 品 - 由 政 府 部 门 授 权 用 于 预 防 治 疗 或 人 和 动 物 的 疾 病 诊 断 及 相 关 试 验 研 究 和 调 查 目 的, 来 源 于 活 体 组 织 的 任 何 物 质, 包 括 ( 不 仅 局 限 于 此 ) 成 品 或 半 成 品, 例 如 疫 苗 和 诊 断 试 剂 诊 断 标 本 - 用 于 诊 断 和 调 查 目 的 的 人 或 动 物 的 排 泄 物 分 泌 物 血 液 及 其 组 分 组 织 和 组 织 液 遗 传 修 饰 的 微 生 物 和 生 物 - 经 过 有 目 的 的 基 因 工 程 改 造 而 自 然 界 并 不 存 在 的 微 生 物 和 生 物 临 床 和 医 学 废 弃 物 - 来 源 于 人 或 动 物 的 临 床 治 疗 或 者 生 物 学 研 究 中 产 生 的 废 弃 物 这 些 废 弃 物 中 含 有 感 染 性 成 分 的 可 能 性 相 对 来 讲 要 低 一 些 通 常 来 说, 所 有 以 上 材 料 在 运 输 过 程 中 要 求 采 取 三 层 包 装 系 统, 有 特 别 要 求 的 材 料 除 外 ( 见 后 面 的 特 别 说 明 ) 包 装 材 料 必 须 是 按 照 危 险 物 品 法 规 的 要 求 特 别 设 计 的, 这 样 可 以 确 保 包 装 材 料 是 经 过 严 格 测 试 的, 例 如 坠 落 试 验 和 PI 602( 用 于 包 装 感 染 性 材 料 ) 的 刺 穿 试 验 有 大 量 的 厂 商 可 以 提 供 这 样 的 专 用 包 装 材 料, 全 球 脊 灰 网 络 实 验 室 应 该 备 有 充 足 的 包 装 材 料 存 货 以 备 急 需 三 层 包 装 系 统 ( 见 图 10.1) 包 括 : 1) 初 级 容 器 指 第 一 层 不 透 水 防 泄 漏 的 样 品 储 存 容 器 这 种 容 器 外 面 要 包 125

135 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 裹 足 够 的 吸 收 材 料, 一 旦 有 泄 漏 可 以 将 所 有 液 体 完 全 吸 收 掉 2) 次 级 容 器 指 第 二 层 结 实 的 防 水 及 防 泄 漏 的 容 器, 它 的 作 用 是 包 装 及 保 护 初 级 容 器 几 个 包 裹 好 的 初 级 容 器 可 以 放 入 同 一 个 次 级 容 器 中, 但 在 多 个 初 级 容 器 中 必 须 再 衬 以 足 够 的 吸 收 性 材 料 相 关 文 件, 例 如 样 品 数 据 表 格 信 件 样 品 鉴 定 资 料 发 送 者 和 接 收 者 信 息 应 该 放 入 一 个 防 水 的 袋 中, 并 贴 在 次 级 容 器 外 面 3) 最 外 层 的 运 输 包 装 指 包 裹 在 次 级 容 器 外 面, 在 运 输 过 程 中 使 其 免 受 外 界 影 响 如 破 损 浸 水 等 的 一 层 包 装 图 10.1 三 层 包 装 系 统 三 层 包 装 系 统 第 一 层 培 养 物 容 器 吸 收 性 包 装 材 料 容 器 的 盖 子 第 二 层 容 器 标 本 的 信 息 外 螺 旋 盖 生 物 危 险 标 志 外 层 容 器 ( 第 三 层 容 器 ) 地 址 标 签 126

136 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 托 运 者 首 先 要 确 定 拟 运 输 的 材 料 最 适 于 划 分 到 哪 一 类 别, 再 参 照 下 列 相 应 的 注 意 事 项 进 行 包 装 : 目 前 国 际 航 空 运 输 协 会 (IATA) 基 于 拟 运 输 材 料 所 在 的 危 险 组 对 其 进 行 分 类, 危 险 组 的 定 义 是 建 立 在 生 物 体 致 病 性 的 大 小 疾 病 的 传 播 方 式 是 否 易 于 传 播 对 个 人 或 社 会 的 危 害 性 及 是 否 有 已 知 有 效 的 预 防 和 治 疗 措 施 的 基 础 上 危 险 组 的 具 体 划 分 原 则 如 下 : a) 危 险 组 4( 对 个 体 和 社 会 均 具 有 高 度 危 险 性 ) 指 那 些 可 以 致 人 和 动 物 产 生 严 重 疾 病 并 且 在 不 同 个 体 之 间 可 以 直 接 或 间 接 传 染, 目 前 还 没 有 有 效 预 防 和 治 疗 措 施 的 病 原 体 b) 危 险 组 3( 对 个 体 高 度 危 险, 对 社 会 低 度 危 险 ) 指 那 些 可 以 致 人 和 动 物 产 生 严 重 疾 病 但 是 一 般 个 体 之 间 不 会 传 染, 并 且 通 过 措 施 可 以 有 效 预 防 和 治 疗 的 病 原 体 c) 危 险 组 2( 对 个 体 中 度 危 险, 对 社 会 低 度 危 险 ) 指 那 些 可 以 致 人 和 动 物 产 生 疾 病 但 是 通 常 并 不 严 重, 个 体 之 间 不 会 传 染, 即 使 有 时 暴 露 后 能 导 致 严 重 感 染, 通 过 措 施 也 可 以 有 效 预 防 和 治 疗 的 病 原 体, 而 且 感 染 的 传 播 有 限 d) 危 险 组 1 指 一 些 通 常 不 会 引 起 人 和 动 物 疾 病 的 微 生 物, 按 规 定 仅 含 有 这 类 微 生 物 的 材 料 不 属 于 感 染 性 材 料 感 染 性 材 料 全 球 脊 灰 网 络 实 验 室 经 常 会 运 输 一 些 病 毒 分 离 物, 这 些 属 于 感 染 性 材 料, 编 号 为 UN2814 必 须 用 无 菌 的 带 有 外 螺 旋 盖 的 管 子 如 1.8ml 的 冻 存 管 盛 装 病 毒 分 离 物 ( 见 图 8.2), 管 子 必 须 用 封 口 胶 或 防 水 塑 料 胶 带 密 封, 封 好 口 的 管 子 和 少 量 的 吸 水 性 材 料 如 棉 花 一 起 放 入 大 小 合 适 的 塑 料 袋 中, 塑 料 袋 也 必 须 密 封, 可 以 用 塑 封 机 封 口 或 用 防 水 胶 带 封 口 后 置 于 次 级 容 器 中, 次 级 容 器 中 仍 然 要 备 有 吸 水 性 材 料, 以 防 渗 漏 盛 装 同 一 来 源 或 确 信 是 同 一 来 源 分 离 物 的 管 子 可 以 置 于 同 一 个 次 级 容 器 中 不 同 来 源 或 确 信 是 不 同 来 源 分 离 物 的 管 子 必 须 分 别 置 于 不 同 的 次 级 容 器 中 127

137 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 图 10.2 用 冻 存 管 包 装 病 毒 分 离 物 封 口 胶 或 胶 带 吸 收 性 材 料 第 二 层 管 子 ( 无 菌 ) 带 有 螺 旋 盖 的 管 子 ( 无 菌 ) 分 离 物 如 上 述 包 装 好 的 管 子 应 该 放 入 一 个 外 有 一 层 纤 维 板 的 保 温 容 器 ( 聚 苯 乙 烯 ) 中 保 温 容 器 和 纤 维 板 必 须 符 合 IATA 关 于 危 险 物 品 包 装 说 明 602 中 的 规 定, 而 且 两 者 要 配 套 组 装, 这 是 为 了 确 保 包 装 材 料 的 性 能 可 通 过 严 格 的 测 试, 包 括 9 米 坠 落 试 验 和 穿 刺 试 验 很 多 商 家 可 以 提 供 这 样 的 特 殊 材 料, 来 源 于 经 过 认 可 的 厂 家 的 包 装 材 料 盒 上 应 有 如 下 标 记 :( 见 图 10.3) 图 10.3 包 装 标 记 规 范 包 装 标 记 项 目 包 括 : 联 合 国 包 装 标 识 包 装 种 类 "Class 6.2" 的 文 字 内 容 包 装 生 产 年 份 的 最 后 两 位 数 字 国 家 认 证 厂 商 代 码 包 装 上 如 果 没 有 以 上 标 识 就 不 符 合 IATA 要 求, 有 可 能 会 被 承 运 方 拒 绝 接 收 此 外, 不 要 在 一 个 包 装 中 使 用 不 同 厂 家 的 组 件 样 品 运 输 盒 和 冰 包 在 用 清 水 和 / 或 次 氯 酸 液 彻 底 清 洗 干 净 后 可 以 重 复 使 用 装 了 样 品 的 套 管 ( 即 已 完 成 了 两 层 包 装 的 样 品 ) 要 放 入 保 温 ( 隔 热 ) 的 聚 苯 乙 128

138 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 烯 容 器 中 ( 第 三 层 容 器 ), 最 好 在 放 入 管 子 之 前, 先 将 容 器 放 入 冰 柜 或 者 装 上 干 冰, 至 少 6 个 小 时 后 再 使 用 法 律 规 定, 如 果 通 过 客 机 托 运, 每 个 单 独 的 包 装 中 感 染 性 材 料 不 能 超 过 50ml 或 50g, 若 通 过 货 机 托 运, 则 不 超 过 4L 或 4kg 即 可, 由 于 病 毒 分 离 物 通 常 是 1ml 左 右, 所 以 上 述 限 制 不 会 带 来 什 么 问 题 次 级 容 器 周 围 的 空 隙 要 用 干 冰 填 满, 保 温 容 器 盖 子 盖 到 容 器 的 顶 部 为 了 便 于 二 氧 化 碳 的 释 放, 保 温 容 器 口 不 能 封 死 使 用 干 冰 需 要 遵 守 有 关 9 级 危 险 物 品 编 号 为 UN 1845 的 危 险 物 的 有 关 声 明 ( 见 图 10.4), 而 且 必 须 符 合 包 装 说 明 904 中 的 要 求 这 里 介 绍 的 包 装 方 法 均 符 合 这 些 规 定 写 有 所 包 装 的 病 毒 样 品 的 详 细 清 单, 用 信 封 装 好 后 贴 在 保 温 容 器 的 盖 子 顶 部 外 层 纤 维 板 包 装 的 里 面 外 包 装 上 必 须 做 好 如 下 标 记 ( 见 图 10.4): * 托 运 人 姓 名, 地 址 和 联 系 电 话 / 传 真 号 * UN 分 类 编 号 和 专 用 的 运 输 名 称 例 如 : UN 2814 INFECTIOUS SUBSTANCES AFFECTING HUMANS UN 2814 影 响 人 类 健 康 的 感 染 性 物 质 [ENTEROVIRUS] [ 肠 道 病 毒 ] UN 1845 DRY ICE UN 1845 干 冰 * 交 付 运 输 时 包 装 中 的 干 冰 重 量 * 收 件 人 姓 名 地 址 和 联 系 电 话 / 传 真 号 * 感 染 性 材 料 标 签 表 明 是 第 6 类 危 险 品 * 多 色 标 签 表 明 是 第 9 类 危 险 品 ( 表 明 使 用 了 干 冰 ) 129

139 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 图 10.4 感 染 性 材 料 运 输 的 外 包 装 和 标 签 示 意 图 注 : 托 运 人 的 姓 名 地 址 和 联 系 电 Shipper s Name, Address and contact phone / fax numbers: 病 毒 分 离 株 清 话 / 传 真 号 单, 附 在 次 级 容 器 上 UN 2814 影 响 人 类 健 康 的 感 染 性 物 质 肠 道 病 毒 UN 1845 干 冰 重 量 : 公 斤 1 寄 件 人 关 于 危 险 品 的 声 明 2 进 口 许 可 证 ( 如 果 需 要 ) 3 海 关 声 明 4 寄 件 人 关 于 干 冰 的 声 明 ( 如 果 需 要 ) 收 件 人 的 姓 名 地 址 和 联 系 电 话 / 传 真 号 码 感 染 性 物 质 第 六 类 危 险 品 标 签 第 9 类 危 险 品 的 多 色 标 签 如 果 再 额 外 做 一 个 标 签 Refrigerate package where possible( 请 尽 量 冷 藏 ) 就 更 好 了 包 装 盒 用 宽 胶 带 密 封, 但 要 注 意 不 要 遮 盖 住 盒 上 的 标 记, 也 不 要 忘 了 留 一 个 小 口, 以 便 于 二 氧 化 碳 释 放 所 有 感 染 性 材 料 运 输 必 须 要 有 托 运 人 关 于 危 险 品 的 声 明, 如 果 使 用 了 干 冰 也 必 须 声 明 ( 见 图 10.5A 和 图 10.5B) 图 10.5A 运 输 人 关 于 感 染 性 材 料 运 输 的 声 明 ( 图 片 不 清 晰, 略 ) 图 10.5B 运 输 人 关 于 感 染 性 材 料 运 输 的 声 明 ( 使 用 干 冰 ) ( 图 片 不 清 晰, 略 ) 生 物 制 品 全 球 脊 灰 网 络 实 验 室 有 时 会 运 输 划 分 到 生 物 制 品 类 的 细 胞 株 和 抗 血 清, 但 是 由 于 它 们 不 含 有 常 规 的 感 染 性 物 质, 所 以 运 输 上 没 有 特 殊 的 规 定 通 常, 只 有 在 所 运 输 的 生 物 制 品 中 含 有 人 或 动 物 致 病 因 子 时 才 会 有 专 门 的 要 求, 这 种 情 况 下, 要 先 将 拟 运 输 的 材 料 划 分 到 一 个 适 当 的 类 别 ( 比 如 分 类 编 号 为 UN2814 或 UN2900), 并 按 照 上 文 所 述 的 感 染 性 材 料 的 运 输 方 式 进 行 运 输 诊 断 标 本 130

140 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 全 球 脊 灰 网 络 实 验 室 经 常 要 运 送 诊 断 标 本, 如 果 标 本 已 知 或 有 理 由 认 为 其 中 含 有 属 于 危 险 组 2, 组 3, 组 4 的 病 原 体 要 按 上 面 6.2 部 分 的 说 明 进 行 分 类, 并 且 按 感 染 性 材 料 (UN2814) 来 包 装 和 运 输 如 果 标 本 中 含 危 险 组 2 和 组 3 病 原 体 的 可 能 性 相 当 小, 而 且 只 是 为 了 初 步 诊 断 目 的 而 运 输 或 者 只 是 用 于 常 规 筛 检 试 验, 这 种 情 况 下 认 为 它 们 不 属 于 感 染 性 材 料, 应 该 按 如 下 方 式 进 行 包 装 按 照 惯 例 是 严 禁 在 国 际 航 空 运 输 过 程 中 由 运 输 人 以 手 提 方 式 携 带 感 染 性 材 料, 如 包 装 在 塑 胶 封 袋 中 携 带 原 始 粪 便 标 本 必 须 存 放 于 大 小 合 适 且 带 有 外 螺 旋 盖 的 管 子 中 ( 第 一 层 包 装 ), 例 如 1.8ml 的 冻 存 管 盖 紧 盖 子 后 用 封 口 胶 或 防 水 塑 料 胶 带 密 封 密 封 好 的 管 子 和 少 量 吸 收 性 材 料 如 棉 花 放 入 一 个 大 小 合 适 的 塑 料 袋 中 塑 料 袋 也 需 要 密 封, 可 以 用 塑 封 机 封 口 或 防 水 胶 带 密 封 所 有 的 标 本 必 须 要 双 层 袋 子 密 封 包 装, 来 源 于 一 个 病 人 的 两 份 或 两 份 以 上 标 本 可 以 放 入 一 个 更 大 的 塑 料 袋 并 且 密 封 来 源 于 不 同 病 人 的 标 本 绝 不 能 放 入 同 一 个 密 封 袋 中 ( 见 图 10.6) 图 10.6 运 输 标 本 的 准 备 工 作 密 封 的 塑 料 袋 封 口 胶 或 胶 带 带 螺 旋 盖 的 冻 存 管 标 本 吸 收 性 材 料 密 封 的 塑 料 袋 来 源 于 一 个 病 人 的 标 本 含 有 标 本 的 密 封 袋 放 入 带 有 螺 旋 盖 的 塑 料 容 器 ( 第 二 层 包 装 ) 来 源 于 不 同 病 人 且 各 自 分 别 放 入 了 双 层 密 封 袋 的 标 本 可 以 放 入 同 一 个 塑 料 容 器 内, 注 意 在 塑 料 容 器 内 还 要 放 入 吸 收 性 材 料 以 防 任 何 可 能 的 泄 漏 塑 料 容 器 可 以 放 入 的 标 本 量 由 第 一 层 包 装 管 的 大 小 和 其 它 材 料 ( 如 塑 料 袋 和 吸 收 性 材 料 ) 的 体 积 而 定, 但 是 要 控 制 在 6-10 个 之 间 131

141 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 图 10.7 运 输 多 个 标 本 的 准 备 工 作 密 封 胶 带 带 螺 旋 盖 的 塑 料 瓶 标 本 详 细 清 单 和 寄 件 人 信 息 的 文 件 装 入 塑 料 袋 后 密 封, 附 在 塑 料 容 器 外 密 封 的 标 本 包 装 吸 收 性 材 料 标 本 的 详 细 资 料 任 何 关 于 标 本 的 信 函 或 其 它 补 充 信 息 托 运 人 和 接 收 人 信 息 应 当 装 入 密 封 的 塑 料 袋 并 且 附 在 塑 料 容 器 外 ( 见 图 10.8) 密 封 塑 料 容 器 应 装 入 外 面 有 一 层 纤 维 板 的 保 温 容 器 ( 聚 苯 乙 烯 )( 第 三 层 包 装 ) 中, 保 温 容 器 和 纤 维 板 必 须 符 合 IATA 关 于 危 险 物 品 包 装 说 明 602 中 的 规 定, 这 是 为 了 确 保 包 装 材 料 能 通 过 严 格 的 测 试, 包 括 IATA 规 定 的 坠 落 试 验 同 时 还 需 要 配 备 冰 袋 或 其 它 的 装 有 冰 块 的 塑 料 袋 冰 袋 必 须 能 防 渗 露 并 且 再 外 套 一 层 包 装 以 防 冰 块 融 化 后 泄 漏 如 果 没 有 合 适 的 包 装,EPI 疫 苗 运 输 包 可 以 作 为 一 个 选 择, 但 是 仅 限 于 在 国 内 的 陆 路 和 铁 路 运 输, 而 且 一 旦 疫 苗 运 输 包 用 于 标 本 运 输 以 后 严 禁 再 用 于 疫 苗 运 输 所 有 用 于 冷 却 脊 灰 标 本 的 材 料 和 器 材 都 有 可 能 被 病 毒 污 染, 因 此 每 次 用 后 都 必 须 销 毁 或 消 毒 处 理 EPI 疫 苗 运 输 包 不 符 合 IATA 的 相 关 规 定, 因 此 不 能 用 于 国 内 和 国 际 的 航 空 运 输 当 标 本 容 器 放 入 运 输 盒 后, 在 标 本 容 器 周 围 尽 可 能 塞 满 冻 好 的 冰 袋, 如 果 可 能, 再 放 入 一 个 冷 链 温 度 计 如 果 冷 却 剂 使 用 干 冰, 包 装 还 需 要 注 明 有 第 9 类 危 险 品, 编 号 为 UN1845, 而 且 要 按 904 中 的 要 求 正 确 包 装 下 面 的 这 些 说 明 是 符 合 要 求 的 : 标 本 运 输 盒 和 冰 包 只 有 经 过 水 和 / 或 次 氯 酸 液 彻 底 清 洗 后 才 能 再 次 使 用 ; 航 运 时 单 个 包 装 允 许 的 最 大 量 是 : 客 机 500ml, 货 运 机 4L 因 为 每 份 粪 便 标 本 大 约 是 1~2ml, 所 以 500ml 的 限 制 不 会 带 来 什 么 问 题 ; 保 温 容 器 内 要 再 塞 入 一 些 材 料 以 免 运 输 过 程 中 塑 料 容 器 移 动 132

142 脊 灰 实 验 室 手 册 第 四 版 标 本 和 分 离 物 的 运 输 外 层 包 装 须 做 如 下 标 记 ( 见 图 10.8): 托 运 人 姓 名 地 址 和 联 系 电 话 传 真 号 接 收 人 姓 名 地 址 和 联 系 电 话 传 真 号 Diagnostic Specimens NOT RESTRICTED 诊 断 标 本, 不 受 限 制 Packed in compliance with IATA packing instruction 650 符 合 IATA 中 650 之 包 装 规 定 如 果 使 用 了 干 冰, 需 要 标 记 上 : Packed in compliance with IATA packing instruction 650 符 合 IATA 中 650 包 装 要 求 以 及 交 付 运 输 时 干 冰 的 重 量 和 托 运 人 关 于 危 险 品 的 相 关 声 明 ( 见 图 10.5) 图 10.8 诊 断 标 本 运 输 的 标 记 和 外 层 包 装 托 运 人 姓 名 和 地 址 联 系 电 话 / 传 真 号 1 进 口 许 可 ( 如 果 要 求 ) 2 海 关 声 明 ( 如 果 要 求 ) 诊 断 标 本 - 不 受 限 制 UN 1845 干 冰 重 量 : 公 斤 接 收 人 姓 名 和 地 址 联 系 电 话 / 传 真 号 3 寄 件 人 关 于 干 冰 的 声 明 ( 如 果 要 求 ) 符 合 IATA 中 650 之 包 装 规 定 9 级 危 险 品 的 多 色 标 签 如 果 能 额 外 做 一 个 标 签 Refrigerate package where possible( 请 尽 量 冷 藏 ) 就 更 好 了 包 装 盒 用 宽 胶 带 密 封, 但 要 注 意 不 要 遮 盖 盒 上 的 标 记 如 果 图 10.8 所 示 的 外 包 装 又 装 进 了 另 一 个 包 装 ( 例 如 一 个 额 外 包 装 ), 那 么 图 10.8 所 示 的 标 记 信 息 要 同 时 注 明 在 外 包 装 和 额 外 包 装 上 此 外, 额 外 包 装 必 须 标 明 inner packages comply with prescribed specifications( 内 层 包 装 符 合 要 求 ) 这 样 包 装 的 标 本 不 用 象 要 求 感 染 性 材 料 一 样 声 明 是 危 险 品, 但 是 航 空 单 上 必 须 注 明 以 下 内 容 : Diagnostic specimens packed in compliance with IATA packing instruction 650.( 诊 断 标 本, 符 合 IATA 中 650 条 例 之 包 装 规 定 ) 遗 传 修 饰 的 微 生 物 和 生 物 133