1028 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 收 集 小 鼠 血 清, 取 小 鼠 肺 组 织 称 重 后, 左 侧 肺 用 于 组 织 蛋 白 和 mrna 鉴 定 ; 右 肺 置 于 10% 中 性 福

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1 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1027 基 础 医 学 研 究 白 介 素 33 在 百 草 枯 诱 导 小 鼠 急 性 肺 损 伤 中 的 作 用 机 制 研 究 刘 晨 风 1,2, 吴 小 红 2, 曾 扬 2, 高 同 同 2, 于 虹 2, 郭 彦 2, 孙 世 惠 2 1,2, 周 育 森 摘 要 目 的 探 讨 白 介 素 33(IL 33) 在 百 草 枯 (PQ) 染 毒 小 鼠 急 性 肺 损 伤 (ALI) 模 型 中 的 表 达 及 作 用 方 法 25 只 SPF 级 雌 性 BALB/c 小 鼠 平 均 分 为 正 常 对 照 组,PQ 损 伤 h 组 腹 腔 注 射 PQ(30mg/kg) 建 立 小 鼠 ALI 模 型 并 于 各 时 间 点 处 死 取 材 评 价 肺 组 织 病 理 变 化 和 炎 症 细 胞 浸 润 ; 观 察 血 清 白 介 素 1β(IL 1β) IL 2 IL 6 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α) 和 肺 组 织 髓 过 氧 化 物 酶 (MPO) 水 平 变 化 ;RT PCR 免 疫 组 化 和 Westernblot 分 别 检 测 组 织 中 IL 33mRNA 和 蛋 白 表 达 水 平 变 化 分 析 IL 33 与 病 理 损 伤 和 炎 症 指 标 关 联 性 以 明 确 IL 33 在 调 解 内 源 性 细 胞 因 子 及 在 ALI 中 的 作 用 结 果 与 正 常 对 照 组 相 比,PQ 损 伤 后 小 鼠 肺 组 织 弥 漫 性 损 伤 伴 有 严 重 水 肿 及 大 量 炎 症 细 胞 浸 润, 促 炎 细 胞 因 子 IL 1β IL 6 TNF α MPO 明 显 升 高, 抑 炎 细 胞 因 子 IL 2 明 显 下 调 (P<0 05);PQ 损 伤 后 IL 33 在 mrna 和 蛋 白 表 达 水 平 均 显 著 下 调 (P<0 05) 关 联 性 分 析 显 示 IL 33 与 病 理 损 伤 指 标,IL 1β IL 6 TNF α MPO 均 呈 明 显 负 相 关 (P<0 05), 与 IL 2 呈 正 相 关 趋 势, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 结 论 IL 33 在 PQ 诱 导 小 鼠 ALI 中 表 达 水 平 下 降, 提 示 可 能 在 调 解 内 源 性 炎 症 因 子 平 衡 中 发 挥 重 要 作 用, 可 为 临 床 干 预 和 治 疗 ALI 的 新 靶 点 关 键 词 中 图 分 类 号 白 介 素 33; 百 草 枯 ; 急 性 肺 损 伤 ; 炎 症 S482.4;R363.1;R392.7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 急 性 肺 损 伤 (acutelunginjury,ali) 发 展 到 严 重 阶 段 称 为 急 性 呼 吸 窘 迫 综 合 征 (acuterespiratorydis tressyndrome,ards), 最 终 因 形 成 全 身 炎 症 反 应 综 合 征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) 和 多 器 官 功 能 障 碍 综 合 征 (multipleorgandys 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ); 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 (973)( 编 号 :2012CB518905) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 北 京 微 生 物 流 行 病 研 究 所, 合 肥 北 京 微 生 物 流 行 病 研 究 所 病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室, 北 京 作 者 简 介 : 刘 晨 风, 男, 硕 士 研 究 生 ; 孙 世 惠, 女, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:sun [email protected]; 周 育 森, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:yszhou@ bmi.ac.cn functionsyndrome,mods) 而 导 致 死 亡 [1] 由 于 ALI 的 发 病 机 制 较 为 复 杂, 目 前 尚 不 清 楚 其 中 由 化 学 强 毒 除 草 剂 百 草 枯 (paraquat,pq) 中 毒 所 致 的 ARDS, 已 导 致 数 千 人 中 毒 死 亡, 病 死 率 高 达 70% [2] 白 介 素 33(interleukin 33,IL 33) 是 IL 1 家 族 的 新 成 员, 在 慢 性 炎 症 心 血 管 疾 病 和 变 态 反 应 性 等 疾 病 中 发 挥 重 要 作 用 [3-6] [3,5] 研 究 显 示 IL 33 既 能 作 为 促 炎 因 子 活 化 炎 症, 加 重 组 织 损 伤, 也 可 作 为 染 色 质 相 关 核 因 子 起 转 录 抑 制 作 用, 辅 助 抑 制 前 炎 症 基 因 表 达 [7] 但 目 前 鲜 有 报 道 评 价 IL 33 在 急 性 炎 症 中 的 作 用 为 此, 该 实 验 使 用 PQ 建 立 小 鼠 ALI 模 型, 系 统 研 究 了 IL 33 表 达 与 ALI 小 鼠 的 病 理 和 炎 症 细 胞 因 子 之 间 的 动 态 变 化 关 系, 阐 述 了 IL 33 在 化 学 毒 物 造 成 的 ALI 中 的 重 要 调 节 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 PQ 购 自 上 海 先 正 达 有 限 公 司 ; Goatanti mouseil 33 抗 体 购 自 美 国 R&D 公 司 ; 中 性 粒 细 胞 抗 体 购 自 美 国 SantaCruz 公 司 ;Rabbitanti GAPDH 抗 体 Rabbitanti goatigg(hrp 标 记 ) 和 AntirabbitIgG(HRP 标 记 ) 均 购 自 美 国 CelSigna ling 公 司 ;IL 1β IL 2 IL 6 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α (tumornecrosisfactor α,tnf α)elisa 预 包 被 试 剂 盒 均 购 自 北 京 达 科 为 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 髓 过 氧 化 物 酶 (myeloperoxidase,mpo)elisa 试 剂 盒 购 自 荷 兰 Hycultbiotechnology 公 司 ; 总 RNA 提 取 试 剂 盒 购 自 德 国 Qiagen 公 司 ;RNA 反 转 录 cdna 试 剂 盒 购 自 北 京 全 式 金 生 物 技 术 公 司 ; 实 时 荧 光 定 量 PCR (SYBRGreen) 试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 蛋 白 酶 抑 制 剂 混 合 物 购 自 北 京 普 利 莱 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯, 由 国 药 ( 北 京 ) 化 工 集 团 提 供 1.2 动 物 模 型 建 立 及 分 组 25 只 SPF 级 雌 性 BALB/c 小 鼠,6~8 周 龄, 体 重 (20±1)g, 购 自 军 事 医 学 科 学 院 实 验 动 物 中 心 小 鼠 随 机 平 均 分 为 5 组, 依 次 为 正 常 对 照 组,PQ 注 射 后 h 取 材 组 (PQ h) 腹 腔 注 射 PQ(30mg/kg) 建 立 小 鼠 ALI 模 型, 分 别 于 相 应 时 间 段 称 重 后 处 死

2 1028 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 收 集 小 鼠 血 清, 取 小 鼠 肺 组 织 称 重 后, 左 侧 肺 用 于 组 织 蛋 白 和 mrna 鉴 定 ; 右 肺 置 于 10% 中 性 福 尔 马 林 溶 液, 正 常 对 照 组 作 相 同 处 理 1.3 方 法 肺 组 织 病 理 学 检 测 首 先 评 价 相 对 肺 组 织 重 量 变 化, 计 算 公 式 为 相 对 肺 组 织 重 量 变 化 =[ 小 鼠 肺 组 织 (mg)/ 小 鼠 总 重 量 (g)]; 其 次 对 右 肺 固 定 72h 后, 常 规 梯 度 乙 醇 脱 水 二 甲 苯 透 明, 石 蜡 包 埋, 连 续 切 片, 切 片 厚 度 为 4μm, 苏 木 精 - 伊 红 (HE) 染 色, 光 镜 下 观 察 肺 组 织 病 理 变 化, 使 用 病 理 评 分 方 法 进 行 肺 组 织 损 伤 半 定 量 分 析 [8] 免 疫 组 织 化 学 检 测 使 用 肺 组 织 石 蜡 切 片 进 行 IL 33 和 中 性 粒 细 胞 免 疫 组 织 化 学 检 测, 二 甲 苯 脱 蜡, 梯 度 乙 醇 水 化, 枸 橼 酸 钠 及 微 波 进 行 抗 原 修 复, 晾 至 室 温 后,PBS 洗 3 遍 (5min/ 次, 下 同 ) 后, 加 入 0 3% 过 氧 化 氢 封 闭 内 源 性 过 氧 化 氢 酶,PBS 洗 3 遍 后 进 行 血 清 封 闭, 封 闭 后 分 别 滴 加 兔 抗 IL 33 (1 80) 和 大 鼠 抗 中 性 粒 细 胞 表 面 标 记 (1 50) 抗 体,4 孵 育 过 夜 次 日,PBS 洗 3 遍 后, 分 别 加 入 HRP 标 记 的 抗 山 羊 二 抗 和 抗 大 鼠 二 抗,37 孵 育 40min,PBS 洗 3 遍 后,DAB 显 色, 苏 木 精 衬 染, 盐 酸 酒 精 分 化,PBS 返 蓝, 梯 度 乙 醇 依 次 脱 水, 二 甲 苯 透 明, 中 性 树 胶 封 片 光 镜 下 观 察 棕 黄 色 颗 粒 为 阳 性 结 果 炎 症 细 胞 因 子 检 测 MPO 检 测 使 用 肺 组 织 匀 浆 液, 组 织 匀 浆 液 的 制 备 过 程 参 考 Hycult 说 明 书 ; 收 集 小 鼠 血 液,3500r/min 离 心 20min 后 收 集 血 清 保 存 备 用 炎 症 因 子 IL 1β IL 2 IL 10 TNF α 和 MPO 检 测 及 浓 度 计 算 参 考 试 剂 盒 说 明 书 总 RNA 提 取 逆 转 录 及 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 提 取 小 鼠 肺 组 织 总 RNA 用 于 检 测 小 鼠 肺 组 织 中 IL 33 表 达, 使 用 总 RNA 提 取 试 剂 盒 提 取 RNA, 具 体 操 作 步 骤 参 考 说 明 书 ; 逆 转 录 PCR 使 用 mrna 逆 转 录 cdna 试 剂 盒, 具 体 操 作 方 法 及 反 应 体 系 参 考 说 明 书 ;IL 33PCR 反 应 检 测 使 用 SYBR GreenRealmasterMix, 具 体 反 应 体 系 请 参 考 说 明 书, 以 GAPDH 作 为 持 家 基 因 对 照, 分 析 在 ALI 不 同 时 间 点 IL 33 的 表 达 水 平 变 化 实 时 荧 光 定 量 PCR 引 物 分 别 为 :IL 33 F:GACACATTGAGCATCCAAGG,IL 33 R:AACAGATTGGTCATTGTATGTACTCAG;GAP DH F:CTCTGACTTCAACAGCGACAC, GAPDH R: CGTTGTCATACCAGGAAATGA 反 应 条 件 为 : 预 变 性 :95 2min; 变 性 95 15s, 退 火 55 15s, 延 伸 68 20s,35 次 循 环, 荧 光 实 时 定 量 PCR 使 用 EppendorfrealplexPCR 仪 器 Westernblot 检 测 提 取 小 鼠 肺 组 织 总 蛋 白 用 于 肺 组 织 中 IL 33 和 GAPDH 表 达 检 测 取 30mg 肺 组 织 于 500μlRIPA 中 匀 浆, 并 加 入 5μlPMSF 和 蛋 白 酶 抑 制 剂 混 合 物,0 条 件 下 匀 浆 20min, 匀 浆 后 14000r/min 离 心 15min 处 理, 取 400μl 上 清 液 备 用 Westernblot 实 验 按 常 规 方 法 进 行 抗 IL 33 抗 体 工 作 稀 释 度 为 1 500, 抗 GAPDH 为 ; 二 抗 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 IgG 二 抗 为 使 用 软 件 计 算 IL 33 灰 度 值 比 1.4 统 计 学 处 理 采 用 GraphPadPrism5 软 件 进 行 统 计 分 析, 指 标 关 联 分 析 使 用 Stata 软 件, 多 组 均 数 比 较 采 用 方 差 分 析 2 结 果 2.1 PQ 染 毒 后 小 鼠 ALI 观 察 正 常 对 照 组 小 鼠 肺 泡 上 皮 细 胞 形 态 结 构 正 常, 见 图 1A; 相 比 于 正 常 对 照 组,PQ 染 毒 后 可 见 肺 组 织 随 时 间 进 程 损 伤 加 重 染 毒 后 6 12h 仅 主 要 表 现 为 脉 管 周 围 肺 泡 间 隔 轻 度 增 宽, 以 及 少 量 炎 性 细 胞 浸 润, 见 图 1B PQ 染 毒 24h 特 别 是 损 伤 48h 后, 小 鼠 肺 组 织 出 现 弥 漫 性 损 伤 和 明 显 水 肿, 肺 泡 组 织 明 显 塌 陷, 间 隔 增 宽, 肺 泡 上 皮 细 胞 大 量 坏 死, 以 及 伴 有 大 量 的 炎 症 细 胞 浸 润, 见 图 1C D 组 织 病 理 学 分 析 显 示 PQ 染 毒 6h 后 损 伤 评 分 均 明 显 高 于 正 常 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=75 11,P<0 01), 见 图 1E; 为 了 进 一 步 评 价 肺 组 织 水 肿 情 况, 结 果 显 示 与 正 常 对 照 组 相 比, PQ 损 伤 后 肺 相 对 重 量 增 加, 在 损 伤 24h 后 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=34 75,P<0 01) 见 图 1F 2.2 PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 中 性 粒 细 胞 结 果 显 示, 正 常 对 照 组 没 有 或 极 少 有 中 性 粒 细 胞, 见 图 2A PQ 损 伤 后 中 性 粒 细 胞 逐 渐 增 多, 在 PQ6h 中 性 粒 细 胞 主 要 聚 集 于 气 管 腔 和 血 管 腔 固 有 层 周 围 ( 数 据 未 显 示 ), 但 随 着 损 伤 加 重, 在 PQ12h 后, 中 性 粒 细 胞 通 过 肺 毛 细 血 管 微 循 环 系 统 逐 步 释 放 到 肺 组 织, 见 图 2B 在 PQ 损 伤 24h 和 48h 后, 中 性 粒 细 胞 浸 润 到 肺 间 质 中, 并 在 损 伤 严 重 部 位 呈 弥 散 性 分 布, 见 图 2C D 光 镜 下 观 察 并 统 计 20 倍 镜 下 9 个 视 野 的 中 性 粒 细 胞 平 均 个 数 发 现 中 性 粒 细 胞 随 损 伤 时 间 延 长 逐 步 增 多, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=134 70,P< 0 01), 见 图 2E 在 PQ 诱 导 的 ALI 中,MPO 的 表 达 明 显 上 调, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=84 09,P< 0 01), 见 图 2F 2.3 PQ 染 毒 后 小 鼠 炎 症 因 子 紊 乱 与 对 照 组 相

3 １２９ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ B C D ** 80 % & ' ( ) * + 20 E A ** ** F 6 12!" h MPO( pg / ml ) ** ** ** 12!" h 图 １ ＰＱ染毒小鼠肺组织各时间点病理变化 ＨＥ ２ Ａ 正常对照组 Ｂ ＰＱ染毒 １ ２ｈ组 Ｃ ＰＱ染毒 ２ ４ｈ组 Ｄ ＰＱ染 图 ２ ＰＱ染毒小鼠后不同时间点中性粒细胞浸润 毒４ ８ｈ组 Ｅ 肺组织病理评分 Ｆ 肺组织相对比重 与正常对照组 及 ＭＰＯ水平变化 Ｉ ＨＣ ２ １ ｈ 比较 Ｐ Ａ 正常对照组 Ｂ ＰＱ染毒 １ ２ｈ组 Ｃ ＰＱ染毒 ２４ｈ组 Ｄ ＰＱ染 毒后 ４８ｈ组 Ｅ 肺组织 ２ 视野下中性粒细胞个数 Ｆ 肺组织匀浆 比 在 ＰＱ损伤６ｈ后 Ｉ Ｌ １β表达水平明显增高 并 液中 ＭＰＯ表达水平变化 与正常对照组 ｈ 比较 Ｐ １ 在损伤后 １２ｈ和 ２４ｈ时达到顶峰 差异均有统计学 意义 Ｆ ５ ５ ７４ Ｐ １ 见图 ３Ａ ＰＱ损伤 ６ｈ 持较高水平 差异均有统计学意义 Ｆ ２８ ９３ Ｐ 后 Ｉ Ｌ ２有上升趋势 但是在 １ ２ｈ后即观察到 Ｉ Ｌ ２ １ 见图 ３Ｃ ＴＮＦ α在 ＰＱ损伤 ６ｈ后同样增高 明显下降 并随时间延长呈下降依赖趋势 在 ４ ８ｈ 明显 并在 ２４ｈ前持续增高并呈现时间依赖趋势 时达到最低值 差异有统计学意义 Ｆ １６ ８８ Ｐ 在 ＰＱ损伤 ４ ８ｈ后 ＴＮＦ α较 ２４ｈ有所降低 但是依 ５ 见图 ３Ｂ Ｉ Ｌ ６在 ＰＱ损伤 ６ｈ即显著增高 并 然明显高于正常对照组 差异有统计学意义 Ｆ 随着损伤时间延长继续增高 在１ ２ ４８ｈ时持续保 ７ ９ Ｐ １ 见图 ３Ｄ

4 1030 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2.4 PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 中 IL 33mRNA 水 平 与 正 常 对 照 组 相 比,PQ 损 伤 6h 后 IL 33 表 达 水 平 明 显 降 低 (P<0 05), 并 在 24h 之 内 呈 下 降 趋 势 (P<0 05,F=127 5), 尽 管 PQ 损 伤 48h 时,IL 33 表 达 相 对 于 24h 明 显 增 高, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P <0 01), 但 依 然 低 于 正 常 对 照 组, 见 图 4E 2.5 PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 IL 33 蛋 白 水 平 免 疫 组 化 显 示,IL 33 在 肺 组 织 中 广 泛 表 达, 特 别 集 中 于 肺 泡 上 皮 细 胞 中 Westernblot 法 显 示, 在 PQ 损 伤 后, 能 够 观 察 到 IL 33 蛋 白 表 达 下 调, 并 在 损 伤 24h 前 具 有 时 间 依 赖 趋 势 (F=315 7,P<0 01) 但 是 在 PQ 损 伤 48h 后, 两 种 方 法 均 显 示 IL 33 的 表 达 水 平 有 上 调 趋 势, 推 测 与 IL 33 在 炎 症 反 应 中 的 促 炎 / 抑 炎 双 重 作 用 有 关, 见 图 4(A~D,F) 2.6 IL 33 与 各 项 指 标 关 联 分 析 IL 33 的 水 平 变 化 与 肺 病 理 损 伤 评 分, 肺 组 织 相 对 重 量,IL 1β IL 6 TNF α 以 及 MPO 的 表 达 水 平 变 化 都 呈 负 相 关 联, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01), 尽 管 IL 33 与 IL 2 有 正 相 关 趋 势, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 以 上 结 果 提 示 IL 33 在 PQ 诱 导 的 小 鼠 ALI 中 具 有 重 要 的 作 用, 在 病 理 损 伤 以 及 炎 症 因 子 紊 乱 中,IL 33 可 能 处 于 较 重 要 的 位 置, 在 平 衡 细 胞 因 子 紊 乱 中 可 能 发 挥 着 重 要 的 作 用, 见 表 1 表 1 IL 33mRNA 与 其 他 指 标 关 联 性 分 析 关 联 分 析 R 值 P 值 IL 33mRNA + 肺 组 织 损 伤 评 分 IL 33mRNA + 肺 相 对 重 量 IL 33mRNA +IL 1β IL 33mRNA +IL IL 33mRNA +IL IL 33mRNA +TNF α IL 33mRNA +MPO R 为 关 联 分 析 3 讨 论 引 起 ALI 的 因 素 包 括 SARS MERS 病 毒 以 及 高 图 3 PQ 染 毒 小 鼠 后 血 清 炎 症 因 子 变 化 与 正 常 对 照 组 (0h) 比 较 : P<0.05, P<0.01

5 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1031 图 4 PQ 染 毒 后 肺 组 织 IL 33 表 达 变 化 IHC 200 A: 正 常 对 照 组 ;B:PQ 染 毒 12h 组 ;C:PQ 染 毒 24h 组 ;D:PQ 染 毒 48h 组 ;E:PQ 染 毒 后 肺 组 织 IL 33mRNA 表 达 变 化 ;F:PQ 染 毒 后 肺 组 织 IL 33 蛋 白 水 平 变 化 ; 与 正 常 对 照 组 (0h) 比 较 : P<0 01; 与 PQ24h 比 较 : ## P<0.01 致 病 性 H5N1 病 毒 [8] 内 毒 素 [9] PQ 等 化 学 毒 质 [10] 及 缺 血 再 灌 注 胃 酸 反 流 等 本 实 验 使 用 PQ 染 毒 小 鼠 建 立 ALI 模 型 用 以 阐 述 ALI 的 致 病 机 制 及 免 疫 反 应 等 结 果 表 明 PQ 染 毒 后 期 小 鼠 肺 组 织 充 血 水 肿, 肺 部 实 质 性 病 变 目 前 仅 有 报 道 [11-12] ALI 与 毒 物 富 集 炎 症 爆 发 氧 化 损 伤 等 因 素 有 关, 但 依 然 缺 乏 详 实 研 究 研 [13] 究 显 示, 中 性 粒 细 胞 积 聚 在 ALI 中 具 有 重 要 作 用 : 一 方 面 堵 塞 肺 毛 细 血 管 引 起 微 循 环 紊 乱 ; 另 一 方 面 中 性 粒 细 胞 释 放 大 量 炎 症 因 子 引 起 组 织 损 伤 本 研 究 显 示 PQ 损 伤 早 期 积 聚 于 气 管 腔 和 血 管 腔 固 有 层, 晚 期 浸 润 到 肺 泡 腔 内 呈 现 弥 漫 性 分 布, 提 示 PQ 染 毒 后 诱 发 机 体 产 生 强 烈 的 炎 症 反 应 进 一 步 检 测 到 PQ 染 毒 后 促 炎 因 子 的 上 调 抑 炎 因 子 的 下 调 等, 这 些 炎 症 因 子 相 互 作 用, 级 联 放 大, 共 同 介 导 炎 症 因 子 风 暴 的 发 生, 这 种 过 激 的 免 疫 反 应 对 组 织 造 成 二 次 损 伤, 促 进 ALI 的 发 展 成 ARDS 及 MODS 而 导 致 机 体 死 亡 Hongetal [14] 发 现 IL 33 与 其 受 体 ST2 的 活 化 参 与 哮 喘 中 Th2 介 导 的 肺 部 免 疫 应 答 及 参 与 过 敏 原 诱 导 的 肥 大 细 胞 激 活, 提 示 IL 33 在 慢 性 炎 症 中 发 挥 促 炎 作 用 另 一 方 面 IL 33 也 可 作 为 高 内 皮 小 静 脉 核 因 子 起 转 录 抑 制 作 用, 辅 助 抑 制 前 炎 症 基 因 表 达, 具 有 抗 炎 作 用 Hazletetal [15] 报 道 IL 33 在 细 菌 感 染 中 通 过 上 调 Th2 类 细 胞 因 子, 抑 制 Th1 类 细 胞 因 子 清 除 细 菌 从 而 对 机 体 起 保 护 作 用, 外 源 性 应 用 重 组 IL 33 可 以 减 轻 感 染 铜 绿 假 单 胞 菌 引 起 的 角 膜 炎 症 Walzletal [16] 研 究 发 现 用 抗 ST2(IL 33 受 体 ) 单 克 隆 抗 体 给 小 鼠 静 脉 注 射 后 会 减 弱 Th2 类 细 胞 因 子 相 关 的 嗜 酸 性 呼 吸 道 炎 症 的 形 成 但 是 目 前 鲜 有 报 道 IL 33 在 急 性 炎 症 中 的 具 体 作 用 和 功 能 评 价 本 文 研 究 显 示,PQ 染 毒 后 小 鼠 肺 组 织 中 IL 33 在 mrna 和 蛋 白 表 达 水 平 明 显 下 调, 提 示 IL 33 在 化 学 毒 物 PQ 诱 导 ALI 中 可 能 发 挥 保 护 作 用, 这 可 能 与 IL 33 转 录 抑 制 调 控 介 导 的 抑 炎 作 用 有 关 而 在 PQ 损 伤 48h 后,IL 33mRNA 和 蛋 白 水 平 呈 现 升 高 趋 势, 提 示 IL 33 在 抑 制 炎 症 和 促 进 炎 症 的 角 色 转 换, 推 测 ALI 模 型 中 IL 33 也 可 能 转 化 为 促 炎 因 子 以 发 挥 作 用 而 关 联 分 析 结 果 显 示,IL 33 与 IL 1β IL 6 TNF α 及 MPO 呈 现 显 著 相 关 性, 提 示 IL 33 在 PQ 诱 导 ALI 中 发 挥 重 要 作 用, 并 且 在 化 学 毒 物 诱 导 急 性 内 源 性 炎 症 细 胞 因 子 的 紊 乱 中,IL 33 可 能 在 早 期 发 挥 核 转 录 抑 制 作 用, 缓 解 了 促 炎 因 子 的 积 聚 和 爆 发, 推 测 IL 33 在 急 性 炎 症 中 早 期 发 挥 重 要 的 调 控 作 用, 提 示 在 机 体 受 到 外 界 急 性 刺 激 后, 有 可 能 通 过 干 预 IL 33 表 达 变 化, 以 达 到 调 控 机 体 自

6 1032 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 身 炎 症 因 子 紊 乱 作 用 参 考 文 献 [1] WareLB,MathayM A.Theacuterespiratorydistressyndrome [J].NEnglJMed,2000,342(18): [2] OnyeamaHP,OehmeFW.Aliteraturereviewofparaquattoxici ty[j].vethumtoxicol,1984,26(6): [3] ObokiK,OhnoT,KajiwaraN,etal.IL 33andIL 33receptors inhostdefenseanddiseases[j].alergolint,2010,59(2): [4] XuD,JiangHR,KewinP,etal.IL 33exacerbatesantigenin ducedarthritisbyactivatingmastcels[j].procnatlacadsciu SA,2008,105(31): [5] MilerAM.RoleofIL 33ininflammationanddisease[J].JIn flam(lond),2011,8(1):22. [6] SchmitzJ,OwyangA,OldhamE,etal.IL 33,aninterleukin 1 likecytokinethatsignalsviatheil 1receptorrelatedproteinST2 andinducesthelpertype2 asociatedcytokines[j].immunity, 2005,23(5): [7] CariereV,RouselL,OrtegaN,etal.IL 33,theIL 1 likecyto kineligandforst2receptor,isachromatin asociatednuclear factorinvivo[j].procnatlacadsciusa,2007,104(1): [8] SunSH,ZhaoGY,LiuCF,etal.Inhibitionofcomplementac tivationaleviatesacutelunginjuryinducedbyhighlypathogenica vianinfluenzah5n1virusinfection[j].am JRespirCelMol Biol,2013,49(2): [9] RitirschD,FlierlM A,DayDE,etal.Acutelunginjuryin ducedbylipopolysaccharideisindependentofcomplementactiva tion[j].jimmunol,2008,180(11): [10]SunSH,WangHB,ZhaoGY,etal.ComplementInhibitional leviatesparaquat inducedacutelunginjury[j].amjrespircel MolBiol,2011,45(4): [11] ImaiY,KubaK,NeelyGG,etal.Identificationofoxidative stresandtol likereceptor4signalingasakeypathwayofacute lunginjury[j].cel,2008,133(2): [12]DolinayT,KimYS,HowrylakJ,etal.Inflammasome regulated cytokinesarecriticalmediatorsofacutelunginjury[j].amjre spircritcaremed,2012,185(11): [13] MantovaniA,CasatelaMA,CostantiniC,etal.Neutrophilsin theactivationandregulationofinnateandadaptiveimmunity[j]. NatRevImmunol,2011,11(8): [14]HongYS,MoonSJ,JooYB,etal.Measurementofinterleukin 33(IL 33)andIL 33receptors(sST2andST2L)inpatientswith rheumatoidarthritis[j].jkoreanmedsci,2011,26(9): [15]HazletLD,McClelanSA,BaretRP,etal.IL 33shiftsmac rophagepolarization,promotingresistanceagainstpseudomonas aeruginosakeratitis[j].investophthalmolvissci,2010,51 (3): [16]WalzlG,MathewsS,KendalS,etal.InhibitionofT1/ST2dur ingrespiratorysyncytialvirusinfectionpreventsthelperceltype2 (Th2)butnotTh1 drivenimmunopathology[j].jexpmed, 2001,193(7): Roleofinterleukin 33inparaquat inducedacutelunginjury LiuChenfeng 1,2,WuXiaohong 2,ZengYang 2,etal ( 1 BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 StateKey LaboratoryofPathogenandBiosecurity,BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing ) Abstract Objective Toevaluateroleofinterleukin33(IL 33)inparaquat(PQ) inducedacutelunginjury (ALI).Methods 25femaleBALB/cmicewererandomlydividedintofivegroup:controlgroup(injectionwith physiologicalsaline),pq6hgroup[6hafterparaquatpoisoning(30mg/kg)],pq12hgroup,pq24hgroup andpq48hgroup.almicewerekiledatindicatedtimeafterpqpoisoning.thelungtisuewasweightedbythe ratioof(lung/mouse)weight,andlunginjuryandneutrophilinfiltrationwereobservedbyhematoxylin eosinstai ningandimmunohistochemistryrespectively.besides,interleukin 1β(IL 1β),IL 2,IL 6,tumornecrosisfactor α(tnf α)inserumandmyeloperoxidase(mpo)inlungtisueweredeterminedbyrelevantelisakits.further more,theil 33mRNAinlungtisuewasdetectedbyquantitativerealtimePCR,whiletheIL 33proteinwasde tectedusingimmunohistochemistryandwesternblotasay.spearman srankcorelationbetweenil 33andother variablesorseverityoflungimpairmentwereanalyzedsimultaneously.results Thereweremarkedhistologicalle sionsandneutrophilsinfiltrationinlungtisueandasignificantincreaseofil 1β,IL 6,TNF αandmpoinserum afterpqpoisoningatindicatedtime,whilealowerlevelofil 33andIL 2werefoundinserumcomparewithcon trolgroup(p<0 05).TherewasanegativecorelationbetweenIL 33andlungdamagescores,relativelung weight,il 1β,IL 6,TNF αandmpo(p<0 05).NosignificantcorelationwasfoundbetweenIL 33andIL 2. Conclusion OurstudyindicatesthatendogenousIL 33fluctuationplaysacrucialroleinPQ inducedacutelung injury,whichrepresentsapotentialtargetforclinicalinterventionduringpq inducedali. Keywords interleukin33;paraquat;acutelunginjury;inflammation

7 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1033 利 用 高 通 量 测 序 快 速 检 测 H7N9 禽 流 感 病 毒 及 基 因 组 序 列 分 析 裴 广 倩 1,2, 范 航 2, 安 小 平 2, 王 伟 2, 徐 晓 蒙 2, 史 套 兴 2 2, 童 贻 刚 摘 要 目 的 探 索 用 高 通 量 测 序 技 术 检 测 咽 拭 子 样 本 中 H7N9 禽 流 感 病 毒 的 方 法 方 法 分 别 提 取 编 号 为 及 0243 份 样 本 RNA, 反 转 录,cDNA 扩 增, 用 IonTorent 进 行 高 通 量 测 序, 对 测 序 结 果 进 行 生 物 信 息 学 分 析 结 果 3 个 咽 拭 子 样 本 的 测 序 结 果 中 均 能 检 测 出 禽 流 感 病 毒, 拼 接 出 的 基 因 组 序 列 可 以 进 行 生 物 信 息 学 分 析 结 论 利 用 高 通 量 测 序 技 术 可 以 快 速 地 检 测 H7N9 禽 流 感 病 毒, 并 可 用 生 物 信 息 学 软 件 拼 接 基 因 组 序 列 及 进 行 序 列 分 析 关 键 词 中 图 分 类 号 高 通 量 测 序 ;H7N9 禽 流 感 病 毒 ; 生 物 信 息 学 分 析 R373.19;Q7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 禽 流 感 病 毒 是 一 种 引 起 禽 类 部 分 哺 乳 动 物 及 人 类 传 染 性 疾 病 的 甲 型 流 感 病 毒, 两 个 宿 主 相 同 的 甲 型 流 感 病 毒 之 间 的 8 个 RNA 片 段 经 常 发 生 重 配 [1], 而 且 其 依 赖 于 RNA 的 RNA 聚 合 酶 缺 少 校 对 功 能, 导 致 其 在 复 制 过 程 中 基 因 组 的 高 突 变 率, 这 2 个 特 性 使 得 甲 型 流 感 病 毒 不 断 进 化, 引 起 人 类 感 染, 有 时 发 生 大 爆 发, 感 染 人 的 禽 流 感 病 毒 亚 型 主 要 为 H5N1 [2-3] H9N2 H7N7 在 2013 年 以 前,H7N9 仅 感 染 禽 类, 并 未 发 现 过 感 染 人 的 情 况 [4], 然 而, 自 2013 年 2 月 19 日 开 始, 我 国 的 上 海 安 徽 等 东 南 省 市, 陆 续 新 发 现 了 由 H7N9 禽 流 感 病 毒 引 起 人 感 染 病 例, 患 者 均 出 现 严 重 的 肺 炎 和 急 性 呼 吸 窘 迫 综 合 接 收 基 金 项 目 : 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 863 计 划 ( 编 号 :2012AA ); 艾 滋 病 和 病 毒 性 肝 炎 等 重 大 传 染 病 防 治 科 技 重 大 专 项 十 二 五 实 施 计 划 ( 编 号 :2013ZX ZX ZX ZX ); 重 大 新 药 创 制 科 技 重 大 专 项 十 二 五 实 施 计 划 ( 编 号 : 2011ZX ); 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ); 病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室 开 放 课 题 ( 编 号 :SKLPBS1113) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学, 合 肥 军 事 医 学 科 学 院 微 生 物 流 行 病 研 究 所, 病 原 微 生 物 生 物 安 全 国 家 重 点 实 验 室, 北 京 作 者 简 介 : 裴 广 倩, 女, 硕 士 研 究 生 ; 史 套 兴, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E 童 贻 刚, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:tong.yi [email protected] 征 (acuterespiratorydistressyndrom,ards) [5-6] H7N9 禽 流 感 病 毒 是 H7 亚 型 与 H9N2 亚 型 基 因 重 配 产 生 的 新 病 毒, 病 毒 的 一 些 关 键 位 点 发 生 改 变 导 致 该 病 毒 感 染 人 类 [7] 随 着 技 术 的 发 展 与 研 究 的 深 入, 高 通 量 测 序 技 术 成 为 快 速 获 得 病 原 体 基 因 组 序 列 的 重 要 手 段 之 一 该 研 究 利 用 美 国 LifeTech nologies 公 司 IonPGM 高 通 量 测 序 仪 检 测 3 个 咽 拭 子 样 本, 获 得 了 基 因 组 序 列 并 进 行 了 生 物 信 息 学 分 析 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 编 号 为 及 0243 份 样 本 均 来 自 于 鸡 咽 拭 子 :106 号 样 本 进 行 鸡 胚 培 养 ;089 号 样 本 经 过 禽 流 感 病 毒 通 用 引 物 荧 光 定 量 RT PCR 检 测,CT 值 为 16 2;024 号 样 本 经 过 禽 流 感 病 毒 通 用 引 物 荧 光 定 量 RT PCR 检 测,CT 值 为 主 要 试 剂 引 物 合 成 于 明 琛 志 远 生 物 技 术 有 限 公 司 ;MagMAX TM ViralRNAIsolationKit 反 转 录 试 剂 盒 SuperScript Ⅲ One StepRT PCRSystem with Platinum TaqDNA Polymerase 均 购 自 于 美 国 In vitrogen 公 司 ;DNAPolymerase2XPCRMasterMix 购 自 于 博 迈 德 公 司 ;PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 购 自 于 德 国 Qiagen 公 司 ;NEBNext FastDNALibraryPrepSetfor IonTorent TM 购 自 于 NewEnglandBiolabs 公 司 ;Ion ShearTM PlusReagentsKit IonOneTouch TM 200Tem platekitv2dl IonPGM TM Sequencing300Kit 及 Ion Torent 测 序 仪 均 购 自 于 美 国 LifeTechnologies 1.3 方 法 引 物 合 成 用 于 流 感 病 毒 的 通 用 反 转 录 引 物 序 列 为 Uni12(M):AGCRAAAGCAGG, 通 用 引 物 [8] 序 列 分 别 为 :MBTuni 12:5 ACGCGTGATCAG CAAAAGCAGG 3 ;MBTuni 13:5 ACGCGTGATCAG TAGAAACAAGG 3 用 于 扩 增 流 感 病 毒 的 8 对 全 [9] 长 引 物 序 列 见 表 1, 为 了 扩 增 低 浓 度 样 本 中 的 H7N9, 以 A/Anhui/1/2013(H7N9) 基 因 组 为 参 考 序 列, 设 计 合 成 35 对 小 片 段 引 物 序 列, 见 表 RNA 提 取 按 照 MagMAX TM ViralRNAIso lationkit 说 明 书 操 作 : 取 400μl 咽 拭 子 样 品, 加 入 802μl 裂 解 液 (400μlLysis/BindingSoln.Concen

8 1034 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 流 感 病 毒 8 对 全 长 引 物 序 列 引 物 名 称 序 列 (5 3 ) 目 的 长 度 片 段 (bp) PB 2 1 AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTCA PB PB R AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTA PB 1 1 AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAATG PB PB R AGTAGAAACAAGGCATTTTTTCATGAA PA 1 AGCRAAAGCAGGTACTGATYCGAAATG PA 2233 PA 2233R AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACA HA 1 AGCAAAAGCAGGGGAAAATA HA 1778 HA 1778R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT NP 1 AGCAAAAGCAGGGTAGATAA NP 1565 NP 1565R AGTAGAAACAAGGGTATTTTT NA 1 AGCAAAAGCAGGAGTGAAAA NA 1413 NA 1413R AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT M 1 AGCAAAAGCAGGTAGATATT M 1027 M 1027R AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT NS 1 AGCAAAAGCAGGGTGACAAA NS 890 NS 890R AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 表 2 35 对 小 片 段 引 物 引 物 名 称 序 列 (5 3 ) 目 的 长 度 片 段 (bp) PB 2 1 F:ATGTCACAGTCTCGCACTCG PB R:CCCTGCGGCGTATTTTAACC PB 2 2 F:ATGGACCAACGACAAGCACA PB R:TGGCACATCTCCAAAAGCGA PB 2 3 F:ATTTGACCCAAGGGACCTGC PB R:GGATTTAGCCGCTGGTTTGC PB 2 4 F:CCGAGGCAATCATAGTGGCA PB R:TCCGGACCATTGATCTCCCA PB 2 5 F:TCCAGCACTGAGAGAGTGGT PB R:CGGAACCCCTCACATTCACA PB 2 6 F:GCGTGACGTACTGGGAACAT PB R:CCGAATCCTTTTGGTCGCTG PB 1 1 F:AAGTGCCAGTGCAAAATGCT PB R:GCTGTCAGGCCATTCGATCT PB 1 2 F:GCCAGACCTATGACTGGACG PB R:GGAGGCCAGATTGCTCAAGT PB 1 3 F:TGCTGAAAGAGGCAAGCTGA PB R:TTCCGCTGGTACTTGTGTCC PB 1 4 F:AACCCCCGGATGTTTCTAGC PB R:TCCAAAACTGGGCAACTCCA PB 1 5 F:GGACGGACTCCAATCCTCAG PB R:GGTTTGGCCCTCCATCTGAA PB 1 6 F:GACCAGCAACAGCTCAAATG PB R:TCGTCCTCAAGAATCCCCCT PB 1 7 F:GGTTTCAGATGGAGGGCCAA PB R:TTTGCCGTCTGAGCTCTTCA PA 1 F:GTGCGACAGTGCTTCAATCC PA R:TGCCCTGCTTTCTTCGTCAA PA 2 F:TTGGAGTGACGAGGAGGGAA PA R:GCTCGGGTCCTCAATGCTTA PA 3 F:GTGAACGCCAGAATTGAGCC PA R:GTCAGTCAGTTCACACGCCT PA 4 F:GAGAACATGGCACCGGAGAA PA R:CCAACCTTGGGTCGGTAAGG PA 5 F:TACAGCAGAGGTGTCCCACT PA R:AAGGTTCTGCACACCTTCCC PA 6 F:ATGGAAATGAGACGCTGCCT PA 续 表 2 引 物 名 称 序 列 (5 3 ) 目 的 长 度 片 段 (bp) R:AGTGCATGTGTGAGGAAGGAG HA 1 F:CTGGGGACAATCACTGGACC HA R:AACTTGTGGTCTCGCTCCTG HA 2 F:CAGGAGCGAGACCACAAGTT HA R:CCCTGTGCATTCTGGTGTCT HA 3 F:ACACCAGAATGCACAGGGAG HA R:GTGCACCGCATGTTTCCATT NP 1 F:AATGGTTAGCGGCATTGGGA NP R:CGGGGATCCATTCCAGTACG NP 2 F:GAGGATGCAACTGCTGGTCT NP R:GGCTGTTTTGAAGCAGACGG NP 3 F:CCTGCTTGTGTGTACGGACT NP R:AGATGCCCTCTGTTGGTTGG NP 4 F:TGGTCCCAAGAGGACAGCTA NP R:GGTTCGTTGCCTTTTCGTCC NA 1 F:AGTATCGCGCCCTGATAAGC NA R:CCTGTTCGTTCCCCGTAACA NA 2 F:ATGCCCAGTAGTGTTCACCG NA R:AGCCAAGTGTTAGCCCCATC NA 3 F:GATGGGGCTAACACTTGGCT NA R:TTGCTGGTCCACCACACTTT NA 4 F:GAAGGGGACTGCTATCGAGC NA R:CCCATCAGGCCAGTTCCATT M 1 F:TTGCAGGGAAGAACGCAGAT M R:CATAGCCTGCACCATTTGCC M 2 F:TGTGCCACTTGTGAGCAGAT M R:AGGCCCTCTTTTCAAACCGT M 3 F:AGGCAAATGGTGCAGGCTAT M R:CAGCATTCTGCTGTTCCTGC NS 1 F:ACTGTGTCAAGCTTCCAGGT NS R:TCGCCTACAATTGCTCCTTCT NS 2 F:TGCCAGCTCCACGCTATCTA NS R:TCTCTTGCTCCACTTCAAGC trate,2μlcarierrna,400μl100% Isopropanol), 20μl 磁 珠 混 合 液 (10μlRNABindingBeads,10μl Lysis/BindingEnhancer), 震 荡 4min, 使 其 充 分 裂 解 并 吸 附 核 酸, 放 在 磁 力 架 上, 溶 液 变 澄 清 后 弃 掉 上 清 液, 然 后 加 入 300μlWashSolution1( 加 入 100% 异 丙 醇 ) 洗 涤 2 次,450μlWashSolution2( 加 入 100% 乙 醇 ) 洗 涤 2 次, 风 干 乙 醇 2min, 最 后 用 20μlRNA freewater 洗 脱 逆 转 录 及 cdna 扩 增 取 1μl106 号 样 品 RNA 进 行 一 步 法 扩 增, 加 入 25μl2 ReactionMix, 1μl10μmol/LMBTuni 12,1μl10μmol/LMBTuni 13,2μlSuperScript Ⅲ RT/Platinum TaqMix,20 μlddh 2 O, 混 匀, 放 在 PCR 仪 上, 设 置 程 序 为 :55 30min;94 2min;40 个 循 环 (94 15s;55 30s;68 2min);68 5min

9 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1035 取 8μl089 号 样 品 RNA, 加 入 1μl10mmol/L dntpmix,1μl10μmol/luni12(m),65 温 育 5 min, 冰 上 放 置 2min, 然 后 加 入 2μl10 RTbufer,4 μl25mmol/l MgCl 2,2μl0 1mol/L DTT,1 μl RNaseOUT(40U/μl),1μlSuperScriptⅢ RT(200 U/μl), 放 在 PCR 仪 上, 设 置 程 序 为 25 10min,50 50min,85 5min, 冰 上 2min, 最 后 加 入 1μl RNaseH,37 放 置 20min,cDNA 合 成, 之 后 用 8 对 全 长 引 物 进 行 PCR 扩 增 089 样 品 的 扩 增 条 件 见 表 3 基 因 表 样 品 的 扩 增 条 件 PCR 条 件 PB 2 PB 1 PA 94,4min;35 循 环 (94,35s;58,30s;72,7min);72,7min HA NP M NA 94,4min;35 循 环 (94,20s;43,30s;72,7min);72,7min NS 94,4min;35 循 环 (94,20s;58,30s;72,7min);72,7min 取 8μl024 号 样 品 RNA 进 行 反 转 录, 反 转 录 用 35 对 小 片 段 引 物 +8 对 全 长 引 物, 扩 增 时 用 35 对 小 片 段 引 物,PCR 条 件 设 置 为 :94 5min;35 循 环 (94 15s;55 30s;72 2min);72 7min 3 个 样 本 全 部 扩 增 完 后 进 行 电 泳 鉴 定 并 分 别 把 扩 增 产 物 混 合, 用 PCR 纯 化 试 剂 盒 进 行 纯 化 IonTorent 测 序 分 别 取 100ng 纯 化 产 物, 用 IonShear TM PlusReagentsKit 酶 法 打 断 7min, 加 入 1.8 倍 体 积 AMPureXPBeads 纯 化, 末 端 补 平, 两 端 加 接 头, 加 入 1.8 倍 体 积 AMPureXPBeads 纯 化, E Gel 胶 选 择 片 段 ( 约 390bp),PCR 扩 增, 加 入 1 倍 体 积 AMPureXPBeads 纯 化,2100 鉴 定 库 的 片 段 大 小 及 质 量, 文 库 构 建 成 功 以 后, 取 20μl 终 浓 度 为 300ng/L 的 工 作 库 进 行 油 包 水 PCR, 随 后 用 碱 法 将 双 链 DNA 变 单 链, 制 备 模 板, 最 后 将 带 有 模 板 的 微 粒 溶 液 离 心 使 其 进 入 到 318C 芯 片 的 微 孔 中, 上 机 测 序 生 物 信 息 学 分 析 上 机 测 序 后 经 测 序 仪 自 动 运 行 得 到 测 序 结 果, 测 序 原 始 结 果 以 图 片 形 式 保 存, 测 序 服 务 器 将 图 片 形 式 结 果 解 析 为 sf 格 式 的 原 始 文 件 和 fastq 格 式 的 测 序 序 列 数 据 对 fastq 格 式 的 测 序 序 列 进 行 过 滤 低 质 量 序 列 过 短 序 列 以 及 错 误 序 列 等 处 理 选 取 目 前 流 行 的 H7N9 禽 流 感 病 毒 序 列 以 及 部 分 其 他 亚 型 的 禽 流 感 病 毒 序 列 作 为 参 考 序 列, 将 测 序 数 据 使 用 CLCGenomicWorkbench 软 件 比 对 到 参 考 序 列 中, 通 过 覆 盖 参 考 序 列 的 序 列 数 量 比 例 以 及 参 考 序 列 被 覆 盖 的 长 度 判 断 样 品 中 是 否 有 对 应 的 病 毒, 拼 接 基 因 组 序 列, 并 且 分 析 其 进 化, 构 建 系 统 发 育 树 2 结 果 2.1 逆 转 录 后 PCR 扩 增 电 泳 鉴 定 分 别 取 5μl 106 号 样 本 089 号 样 本 的 8 个 全 长 扩 增 产 物 及 024 号 样 本 的 任 意 8 个 小 片 段 扩 增 产 物 进 行 电 泳 鉴 定, 见 图 1~3 106 号 样 本 经 过 凝 胶 电 泳 后 可 观 察 到 明 显 的 8 条 片 段 相 应 大 小 的 条 带,089 号 样 本 M 片 段 没 有 条 带,024 号 样 本 扩 增 出 的 条 带 很 少 图 号 样 本 片 段 扩 增 1:BM2000DNAMarker;2:PB 2 ;3:PB 1 ;4:PA;5:HA;6:NA;7: NP;8:M;9:NS;10: 阴 性 对 照 - 水 图 号 样 本 片 段 扩 增 1:PB 2 ;2:PB 1 ;3:PA;4:NS;5:BM2000DNAMarker;6:M ;7: HA;8:NA;9:NP;10: 阴 性 对 照 - 水 图 号 样 本 片 段 扩 增 1:BM2000DNAMarker;2:PB 2 2;3:PB 1 6;4:PA 3;5:HA 3; 6:NP 2;7:NA 1;8:M 1;9:NS 2;10: 阴 性 对 照 - 水

10 １３６ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ ２ ２ 文库的 ２１ 鉴定 分别取 １μｌ稀释相应倍 ｂｐ 浓度为 ５２３ ｎｇ Ｌ ８９号样本稀释 ２倍后片 数 ５ ５ｎ ｇ Ｌ 的 ３个样本文库 加入到 ２ １ 芯 段大小为 ３ ８３ｂ ｐ 浓度为 ３６９ｎ ｇ Ｌ ２４号样本稀 片中 对 ＤＮＡ库进行片段大小鉴定及浓度测定 见 释５ 倍后片段大小为 ３６ｂｐ 浓度为 １７２ ｎｇ Ｌ ６号样本稀释 １倍后片段大小为 ３ ６ ６ 图 ４ ６ １ 从图中可以 看 出３个 库 大 小 及 浓 度 都 符 合 上 机 要 图 ４ １６号样本稀释 １ 倍后的鉴定 图 ５ ８９号样本稀释 ２ 倍后的鉴定 图 ６ ２４号样本稀释 ５ 倍后的鉴定

11 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １３７ 求 文库构建成功 ２ ３ Ｉ ｏｎｔｏ ｒ ｒ ｎ测序 不同 ＣＴ值的样本用高通 量测序都能检测到禽流感病毒 并且病毒含量低的 样本测序结果中流感病毒对应的序列较少 相比之 下病毒含量较高和培养的样本流感病毒占测序结果 ６号样本测得 ３ ８６１ １ ４条 ｒ ａ ｄｓ 匹 的比例较大 １ 配ｒ ａ ｄｓ数为 ３ ７９１２８ ８ ９号样本测得 １８ １９ ２ ６条 ｒ ａ ｄ ｓ 匹 配 ｒ ａ ｄ ｓ数 为 １ ７４１３ ２ ４号 样 本 测 得 图 ８ ２４号样本的 Ｈ９基因系统发育树 ７ ２６９６条 ｒ ａ ｄ ｓ 匹配 ｒ ａ ｄ ｓ数为 １７ ８１ ２ ４ 生 物 信 息 学 分 析 以 Ａ Ａｎ ｈｕ １ ２ １３ Ｈ７Ｎ９ 基因组为主要参考序列 辅助部分 Ｈ９Ｎ２的 基因组序列 将测序数据使用 ＣＬＣＧ ｎ ｏ ｍ ｃｗｏ ｒ ｋ ｂ ｎ ｃ ｈ软件比对到参考序列中 结果显示 ３个样本 的 ８个片段都可以检测出并且可以判断其类型 １ ６ 号样本为 Ｈ９Ｎ２禽流感病毒 ８ ９样本及 ２ ４样本均 为 Ｈ９Ｎ２与 Ｈ７Ｎ９混合型 其中 １ ６号样本的 ｍａ ｐ 图 ９ ２４号样本的 Ｈ７基因系统发育树 ｐ ｎ ｇ结果如图 ７所示 将 ３个样本的 ＨＡ ＮＡ基因 序列分别经过 Ｂｌ ａ ｓ 选取与之同源性较高的几个毒 株构建系统发育树 分析之间的亲缘关系 其中 ２ ４ ３ 讨论 号样本的 ＨＡ基因进化树如图 ８ ９所示 结果显示 ２４号样本的 Ｈ９基因与选取的几个毒株不在一个 传统的检测流感病毒 获取基因组序列的方法 分支上 亲缘关系较远 而 Ｈ７基因与其他几个毒株 是以基因特异引物扩增 ８个基因片段 进行克隆 选 在一个分支上 亲缘关系较近 择阳性克 隆 进 行 Ｓ ａ ｎｇ ｒ测 序 然 后 进 行 序 列 的 拼 接 构建病毒基因组 该方法操作比较繁琐 费时 费 力 自从 ２５年高通量测序仪问世以来 高通量测 序技术不断的迅速发展 从通量到读长得到了极大 的改善 具有标准化流水作业的文库构建流程 避免 了常规实验中的细菌转化 培养以及单克隆的挑选 等 而且短时间可以获得大量有效的数据 这对于快 速获取病原体的全部遗传信息具有重要意义 Ｉ ｏ ｎ Ｔｏ ｒ ｒ ｎ 高通 量 测 序 技 术 基 于 半 导 体 技 术 具 有 简 单 快速 准确 灵活和低成本等显著优势 是中等规 １ ２ １２年 Ｂｏ ｗｍａ ｎ ａ ｌ 利 模测序项目的最佳选择 ｏ ｎｔｏ ｒ ｒ ｎ高通量测序技术分 析 了 Ｈ３Ｎ２基 因 用Ｉ 组 １ ６号样本经过鸡胚培养 浓度较高 采用一步 法扩增 几乎能获得病毒基因组全长序列 ８９号 样本 浓度相对较低 采用上述方法 很难获得病毒 基因组全长序列 ８个片段中有些片段扩增效率较 高 就会获得很高的覆盖度 而扩增效率低的某些片 段将无法获得理想的结果 所以 对于浓度较低的 样品采用分布扩增法 即反转录后分别用特异性引 图 ７ １ ６号样本 ＣＬＣ的 ｍａｐｐ ｎｇ图 ２４号样本 由 物扩增 ８个片段 对于浓度极低的

12 1038 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 于 样 本 中 模 板 浓 度 很 低, 并 且 病 毒 核 酸 不 完 整, 用 Uni12(M) 扩 增 只 能 获 得 靠 近 3 端 的 大 量 产 物, 很 难 扩 增 出 片 段 的 全 长 因 此 根 据 H7N9 的 8 个 片 段 设 计 35 对 小 片 段 引 物, 在 反 转 录 过 程 中 加 入 35 对 小 片 段 引 物 和 8 对 全 长 引 物, 使 断 裂 的 vrna, 也 能 被 转 录 成 cdna, 随 后 用 35 对 小 片 段 引 物 进 行 扩 增, PCR 产 物 长 度 主 要 在 400~500bp, 相 对 容 易 得 到 基 因 组 全 长 序 列 高 通 量 测 序 数 据 结 果 验 证 了 这 3 种 方 法 的 可 行 性 综 上 所 述, 本 研 究 建 立 了 用 高 通 量 测 序 技 术 检 测 咽 拭 子 标 本 中 H7N9 禽 流 感 病 毒 的 方 法, 无 论 在 样 本 中 的 病 毒 含 量 高 或 者 低, 都 能 有 充 分 的 数 据 用 于 检 出 并 判 段 其 型 别 相 对 来 说, 高 病 毒 含 量 的 样 本 更 容 易 对 已 知 病 原 体 做 出 检 验 参 考 文 献 [1] LiC,HataM,WatanabeS,etal.Compatibilityamongpolymerase subunitproteinsisarestrictingfactorinreasortmentbetweene quineh7n7andhumanh3n2influenzaviruses[j].jvirol, 2008,82(23): [2] PeirisJM,deJongM D,GuanY.Avianinfluenzavirus (H5N1):athreattohumanhealth[J].ClinMicrobiolRev, 2007,20(2): [3] GambotoA,Barat BoyesSM,deJongMD,etal.Humaninfec tionwithhighlypathogenich5n1influenzavirus[j].thelancet, 2008,371(9622): [4] 朱 闻 斐, 高 荣 保, 王 大 燕, 等.H7 亚 型 禽 流 感 病 毒 概 述 [J]. 病 毒 学 报,2013,29(003): [5] GaoR,CaoB,HuY,etal.Humaninfectionwithanovelavian origininfluenzaa(h7n9)virus[j].nengljmed,2013,368 (20): [6] WenYM,KlenkHD.H7N9avianinfluenzavirus searchandre search[j].emergingmicrobes&infections,2013,2(4):e18. [7] KageyamaT,FujisakiS,TakashitaE,etal.Geneticanalysisof novelaviana(h7n9)influenzavirusesisolatedfrompatientsin China,FebruarytoApril2013[J].EuroSurveil,2013,18 (15): [8] ZhouB,DonnelyM E,ScholesDT,etal.Single reactionge nomicamplificationacceleratessequencingandvaccineproduction forclasicalandswineoriginhumaninfluenzaaviruses[j].jvir ol,2009,83(19): [9] ChanCH,LinKL,ChanY,etal.Amplificationoftheentire genomeofinfluenzaavirush1n1andh3n2subtypesbyreverse transcriptionpolymerasechainreaction[j].jvirolmethods, 2006,136(1-2): [10] BowmanAS,SreevatsanS,KilianM L,etal.Molecularevi denceforinterspeciestransmisionofh3n2pm/h3n2vinfluenza AvirusesatanOhioagriculturalfair,July2012[J].Emerging Microbes&Infections,2012,1(10):e33. DetectionofavianinfluenzaA(H7N9)virusbyhigh throughput sequencingandgenomicsequenceanalysis PeiGuangqian 1,2,FanHang 2,AnXiaoping 2,etal ( 1 AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity, BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing ) Abstract Objective Toexplorethemethodsofhigh throughputsequencingforavianinfluenzaa(h7n9)virus detectionfromthroatswabs.methods RNAwasextractedfromthreethroatswabspecimens,folowedbyreverse transcription,amplificationofthecdna,andthenthecdnaampliconsweresequencedwithiontorent.finaly thesequencingdatawereanalyzedusingbioinformaticssoftware.results AvianinfluenzaA(H7N9)viruscould bedetectedfromthroatswabspecimensbydirectsequencingthecdnaampliconusingnext generationsequencing technique,andthegenomesequencescouldberapidlydetermined.conclusion High throughputsequencingisa powerfultoolfordetectionofavianinfluenzaa(h7n9)virusandthegenomesequencescanbeanalyzedusing bioinformaticssoftware. Keywords high throughputsequencing;avianinfluenzaa(h7n9)virus;bioinformaticsanalysis

13 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1039 环 氧 化 酶 2 表 达 在 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 化 疗 耐 药 中 的 作 用 及 其 机 制 研 究 王 亚 民, 顾 康 生 摘 要 目 的 探 讨 环 氧 化 酶 2(COX 2) 的 表 达 导 致 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 细 胞 株 化 疗 耐 药 的 可 能 机 制 方 法 MTS 法 检 测 表 阿 霉 素 COX 2 抑 制 剂 塞 来 昔 布 及 Akt 信 号 通 路 抑 制 剂 LY 对 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 的 生 长 影 响 Western blot 检 测 表 阿 霉 素 作 用 后 COX 2 的 表 达 情 况, 高 表 达 COX 2 YTS 细 胞 分 成 表 阿 霉 素 组 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 组 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 联 合 LY294002(25μmol/L) 组 进 行 比 较,Westernblot 检 测 Akt p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 表 达 情 况,MTS 检 测 细 胞 存 活 率, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 的 凋 亡 变 化 结 果 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 LY 对 YTS 的 生 长 均 具 有 细 胞 毒 作 用, 并 呈 剂 量 依 赖 性 表 阿 霉 素 可 以 诱 导 YTSCOX 2 的 高 表 达, 且 呈 剂 量 依 赖 性 与 未 被 诱 导 细 胞 相 比,COX 2 高 表 达 的 细 胞 株 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 提 高,Westernblot 结 果 显 示 Bcl 2 Mcl 1 和 p Akt 蛋 白 表 达 升 高,Bax 蛋 白 表 达 降 低 COX 2 高 表 达 YTS 细 胞 分 成 表 阿 霉 素 组 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 组 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 (20 μmol/l) 联 合 LY294002(25μmol/L) 组 进 行 比 较, 细 胞 存 活 率 依 次 降 低 ; 凋 亡 率 依 次 升 高 ;Bax 表 达 依 次 升 高 ;p Akt Bcl 2 Mcl 1 表 达 依 次 降 低 结 论 表 阿 霉 素 可 诱 导 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTSCOX 2 表 达, 高 表 达 COX 2 细 胞 株 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 关 键 词 环 氧 化 酶 2; 凋 亡 ;Akt; 表 阿 霉 素 ;NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 中 图 分 类 号 R733.4 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 环 氧 化 酶 2(Cyclooxygenase 2,COX 2) 是 前 列 [1] 腺 素 合 成 过 程 中 的 一 个 重 要 限 速 酶, 研 究 表 明 在 鼻 型 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 患 者 中,COX 2 表 达 可 以 作 为 治 疗 反 应 不 佳 的 预 后 因 子, 提 示 COX 2 在 该 类 型 淋 巴 瘤 肿 瘤 对 化 疗 的 耐 受 性 方 面 发 挥 重 要 作 用 ; 而 化 疗 耐 药 的 一 个 重 要 原 因 是 肿 瘤 对 凋 亡 诱 导 的 耐 受, 其 中 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 / 蛋 白 激 酶 B(phosphati dylinositol3 kinase/akt,pi3k/akt) 信 号 通 路 的 激 活 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2011Z164) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 科, 合 肥 作 者 简 介 : 王 亚 民, 男, 硕 士 研 究 生 ; 顾 康 生, 男, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:ks63@ tom.com. 被 认 为 是 肿 瘤 细 胞 抗 凋 亡 的 主 要 机 制 之 一, 影 响 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 的 敏 感 性 为 探 讨 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 耐 药 的 机 制, 该 研 究 拟 采 用 化 疗 药 物 表 阿 霉 素 诱 导 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS, 获 得 高 表 达 COX 2 细 胞 株 并 进 行 分 组 研 究, 检 测 p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 表 达 和 细 胞 存 活 率 ; 探 讨 p Akt 信 号 通 路 和 细 胞 凋 亡 途 径 在 COX 2 高 表 达 的 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 化 疗 耐 药 中 的 作 用 及 可 能 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 人 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 由 郑 州 大 学 第 一 附 属 医 院 张 明 智 教 授 馈 赠 ;1640 培 养 基 购 自 赛 默 飞 世 尔 生 物 化 学 制 品 ( 北 京 ) 有 限 公 司 ; 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 购 自 美 国 辉 瑞 公 司 ;LY 购 自 美 国 Sigma 公 司 ;COX 2 单 抗 和 Bax Bcl 2 Mcl 1 Akt p Akt 单 抗 购 自 美 国 BioworldTechnology 公 司 ;β ac tin 鼠 / 兔 二 抗 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ;Marker 和 发 光 剂 购 自 美 国 ThermoScientific 公 司 ;BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 购 自 原 平 皓 生 物 技 术 有 限 公 司 1.2 方 法 细 胞 培 养 人 NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 接 种 于 含 10% 胎 牛 血 清,1% 非 必 须 氨 基 的 1640 培 养 基 中,37 5% CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 常 规 培 养,3 ~4d 传 代 不 同 剂 量 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 /ml), 每 孔 90μl 接 种 96 孔 板, 分 别 加 入 含 表 阿 霉 素 ( mg/L) 培 养 液, 终 液 量 100μl/ 孔, 并 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 450nm 波 长 处 的 吸 光 值 (A) 不 同 剂 量 塞 来 昔 布 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板 将 含 塞 来 昔 布 ( μmol/L) 的 培 养 液 加 入 接 种 于 96 孔 板 的 YTS 细 胞 终 液 量 100μl/ 孔, 并 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值

14 1040 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 不 同 剂 量 LY 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板 将 含 LY294002( μmol/L) 的 培 养 液 加 入 接 种 于 96 孔 板 的 YTS 细 胞 终 液 量 100μl/ 孔, 并 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值 每 组 设 定 5 个 复 孔, 取 其 平 均 值, 实 验 重 复 3 次 细 胞 存 活 率 =( 实 验 组 A 值 / 对 照 组 A 值 ) 100%, 细 胞 死 亡 率 =1- 细 胞 存 活 率 表 阿 霉 素 对 COX 2 表 达 不 同 的 YTS 细 胞 存 活 率 的 影 响 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板 A 组 为 未 处 理 对 照 组,B 组 直 接 加 入 表 阿 霉 素 3 3mg/L10μl 作 用 24h C 组 每 孔 加 入 表 阿 霉 素 0 33mg/L10 μl 预 作 用 3h 后 再 加 入 表 阿 霉 素 3.3mg/L10μl 作 用 24h 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h 加 入 MTS20 μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值 不 同 干 预 组 作 用 于 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 后 细 胞 存 活 率 变 化 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ( 细 胞 数 为 /ml), 每 孔 90μl 接 种 于 96 孔 板, 每 孔 均 加 入 表 阿 霉 素 0 33mg/L10μl 预 作 用 3h 后 分 组, C 组 每 孔 加 入 表 阿 霉 素 3 3mg/L10μl 作 用 24h,D 组 每 孔 加 入 表 阿 霉 素 3 3mg/L10μl 和 塞 来 昔 布 20μmol/L10μl 作 用 24h,E 组 加 入 表 阿 霉 素 3 3 mg/ml10 μl 和 塞 来 昔 布 20 μmol/l 10 μl 及 LY μmol/L10μl 作 用 24h, 设 等 量 PBS 孔 调 零 培 养 24h, 加 入 MTS20μl, 继 续 培 养 4h, 酶 标 仪 检 测 A 值 流 式 细 胞 术 检 测 凋 亡 率 细 胞 分 组 和 处 理 同 上,A 组 为 对 照 组 作 用 24h 后 收 集 细 胞 先 将 每 孔 上 清 液 吸 取 到 对 应 的 10ml 离 心 管 中, 每 孔 加 1ml 预 冷 PBS 洗 涤 后 同 样 收 集 到 对 应 的 离 心 管 中, 1500r/min 离 心 10min 后 弃 上 清 液 后 同 样 用 预 冷 PBS 离 心 洗 涤 1 次 每 孔 加 750μlPI 溶 液,37 避 光 作 用 20min 以 充 分 消 化 细 胞, 吹 打 后 确 保 将 所 有 细 胞 收 集 到 离 心 管 中, 混 匀 4 避 光 染 色 过 夜 重 悬 收 集 细 胞, 混 匀 后 转 移 到 流 式 管 中, 流 式 细 胞 仪 在 FL3 参 数 即 第 三 荧 光 激 发 波 长 处 对 每 管 细 胞 进 行 DNA 细 胞 周 期 分 析, 并 将 结 果 予 以 保 存 WinM DI2.9 软 件 分 析 亚 二 倍 体 峰 DNA 含 量 所 占 细 胞 周 期 的 百 分 率 即 细 胞 凋 亡 率, 绘 制 量 效 曲 线 图 每 组 实 验 重 复 3 次 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 COX 2 蛋 白 表 达 的 影 响 分 别 收 集 表 阿 霉 素 ( mg/ L) 作 用 3h 的 细 胞, 冰 上 裂 解 30min,4 离 心, 提 取 蛋 白 以 BCA 方 法 进 行 蛋 白 定 量,120 5min 变 性 处 理, 上 样 后 分 别 行 电 泳 100V30min 后 转 150V, 电 泳 至 溴 酚 蓝 刚 出 现 即 可, 终 止 电 泳 进 行 转 膜 按 预 染 Marker 切 取 相 应 分 子 量 凝 胶, 半 干 转 膜, 电 压 100V, 转 膜 1h, 含 5% 脱 脂 牛 奶 TBST 液 封 闭 2h, 孵 育 COX 2 单 抗 4 过 夜,TBST 清 洗 3 次, 每 次 15min 加 入 辣 根 酶 标 记 的 鼠 或 兔 二 抗 孵 育 1h,TBST 清 洗 后, 于 曝 光 仪 中 涂 上 发 光 剂 曝 光, 并 保 存 图 像 目 的 条 带 用 捷 达 801 专 业 数 码 凝 胶 成 像 与 分 析 系 统 进 行 分 析, 以 目 的 条 带 与 β actina 值 的 比 值 作 为 蛋 白 表 达 相 对 含 量 Westernblot 检 测 不 同 处 理 组 的 p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 蛋 白 表 达 分 别 提 取 A B C D E 组 细 胞 的 蛋 白, 按 照 中 方 法 检 测 Bax Bcl 2 Mcl 1 及 p Akt 蛋 白 表 达 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS19 0 统 计 软 件 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 单 变 量 两 组 资 料 间 的 比 较 采 用 t 检 验, 多 组 资 料 间 的 比 较 用 单 因 素 方 差 分 析 2 结 果 2.1 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 不 同 浓 度 的 表 阿 霉 素 对 细 胞 生 长 均 有 抑 制 作 用, 这 种 作 用 呈 剂 量 依 赖 性 见 图 1 图 1 表 阿 霉 素 对 COX 2 表 达 不 同 的 YTS 细 胞 存 活 率 的 影 响 2.2 塞 来 昔 布 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 不 同 浓 度 的 塞 来 昔 布 对 细 胞 生 长 均 有 抑 制 作 用, 呈 剂 量 依 赖 性 见 表 LY 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 不 同 浓 度 的 LY 对 细 胞 生 长 均 有 抑 制 作 用, 呈 剂 量 依 赖 性 见 表 1

15 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1041 表 1 不 同 浓 度 塞 来 昔 布 和 LY 对 YTS 细 胞 生 长 的 影 响 (n=3, x±s) 珋 浓 度 (μmol/l) A 450 YTS 存 活 率 (%) P 1 值 P 2 值 塞 来 昔 布 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± LY ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 率 明 显 降 低 C 组 与 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (D 组 ) 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 联 合 LY294002(E 组 ) 相 比 较, 细 胞 凋 亡 率 依 次 增 高, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P <0 05) 见 表 2 图 3 表 2 不 同 处 理 组 接 受 表 阿 霉 素 作 用 24h 后 YTS 细 胞 凋 亡 的 变 化 (n=3, x±s) 珋 组 别 YTS 细 胞 凋 亡 率 (%) P 1 值 A 0.48±0.02 B 64.8 ± C 28.32± D 38.22± E 49.50± P 1 : 与 前 一 浓 度 组 比 较 P 1 : 与 未 加 药 组 比 较 ;P 2 : 与 前 一 浓 度 组 比 较 2.4 表 阿 霉 素 对 COX 2 表 达 不 同 的 YTS 细 胞 存 活 率 的 影 响 检 测 结 果 显 示 : 高 表 达 COX 2 细 胞 株 与 未 诱 导 细 胞 株 相 比, 在 接 受 相 同 剂 量 的 表 阿 霉 素 作 用 后, 细 胞 存 活 率 明 显 增 加, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P= ,P<0 05) 见 图 不 同 干 预 组 作 用 于 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 后 细 胞 存 活 率 变 化 检 测 结 果 显 示 :COX 2 高 表 达 YTS 细 胞 分 别 加 入 单 药 表 阿 霉 素, 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 者 布, 及 表 阿 霉 素 塞 来 者 布 联 合 LY294002,3 组 进 行 比 较, 细 胞 株 存 活 率 逐 渐 降 低, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P= ,P<0 05) 见 图 2 图 3 不 同 处 理 组 细 胞 凋 亡 率 变 化 A: 空 白 对 照 组 ;B:YTS 细 胞 直 接 加 入 表 阿 霉 素 作 用 24h 组 ;C: 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 加 入 表 阿 霉 素 作 用 24h 组 ;D: 高 表 达 COX 2 YTS 细 胞 加 入 表 阿 霉 素 和 塞 来 昔 布 作 用 24h 组 ;E: 高 表 达 COX 2 YTS 细 胞 加 入 表 阿 霉 素 和 塞 来 昔 布 及 LY 作 用 24h 组 图 2 不 同 干 预 组 作 用 于 高 表 达 COX 2YTS 细 胞 后 细 胞 存 活 率 变 化 2.6 不 同 处 理 组 的 细 胞 凋 亡 率 变 化 检 测 结 果 显 示 : 与 B 组 未 诱 导 细 胞 株 相 比, 在 接 受 相 同 剂 量 的 表 阿 霉 素 作 用 后,C 组 COX 2 高 表 达 细 胞 株 的 凋 亡 2.7 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 COX 2 表 达 的 影 响 Westernblot 结 果 显 示 :YTS 细 胞 COX 2 有 一 定 表 达, 随 着 表 阿 霉 素 ( mg/L) 作 用 剂 量 的 增 加,COX 2 的 表 达 呈 增 高 趋 势 见 图 不 同 处 理 组 的 p Akt Bax Bcl 2 Mcl 1 蛋 白 表 达 Westernblot 结 果 显 示 : 与 B 组 未 诱 导 细 胞

16 1042 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 4 不 同 剂 量 表 阿 霉 素 对 YTS 细 胞 作 用 3h 后 COX 2 蛋 白 表 达 的 影 响 1: 空 白 对 照 组 ;2: 表 阿 霉 素 0.033mg/L 组 ;3: 表 阿 霉 素 mg/l 组 ;4: 表 阿 霉 素 0.33mg/L 组 ; 与 空 白 对 照 组 比 较 : P< 0 01; 与 前 一 浓 度 组 比 较 : # P<0 05 株 相 比,C 组 COX 2 高 表 达 YTS 细 胞 株 在 接 受 表 阿 霉 素 作 用 24h 后,Bcl 2 Mcl 1 和 p Akt 蛋 白 表 达 增 强,Bax 蛋 白 表 达 减 弱 C D E3 组 干 预 组 相 比 较, Bax 蛋 白 表 达 依 次 增 强 ;p Akt Bcl 2 Mcl 1 蛋 白 表 达 依 次 减 弱 见 图 5 3 讨 论 正 常 情 况 下,COX 2 在 绝 大 部 分 组 织 细 胞 中 不 表 达, 细 胞 因 子 某 些 药 物 等 多 种 刺 激 因 子 可 以 诱 导 [2] 其 高 表 达 研 究 显 示 抗 肿 瘤 药 物 可 诱 导 肿 瘤 细 胞 表 达 COX 2 Guetal [3] 研 究 结 果 表 明, 紫 杉 醇 可 诱 导 胃 腺 癌 细 胞 株 SGC 7901 的 COX 2 高 表 达 研 [1] 究 表 明, 在 鼻 型 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤 患 者 中,COX 2 表 达 可 以 作 为 治 疗 反 应 不 佳 的 预 后 因 子, 提 示 COX 2 在 该 类 型 淋 巴 瘤 肿 瘤 对 化 疗 的 耐 受 性 方 面 发 挥 重 要 作 用 对 凋 亡 诱 导 的 耐 受 是 肿 瘤 化 疗 耐 药 的 一 个 重 要 原 因 ; 引 起 细 胞 信 号 凋 亡 通 路 和 凋 亡 相 关 分 子 的 变 化 均 会 导 致 细 胞 凋 亡 耐 受, 多 种 对 细 胞 凋 亡 起 促 进 或 抑 制 作 用 的 基 因 参 与 其 中, 其 中 Bcl 2 家 族 较 受 关 注 Bcl 2 和 Bax Mcl 1 都 属 于 Bcl 2 家 族,Bcl 2,Mcl 1 编 码 蛋 白 抑 制 凋 亡,Bax 编 码 蛋 白 促 进 凋 亡 Chenetal [4] 在 肺 癌 细 胞 中 发 现,COX 2 可 能 通 过 Akt Mcl 1 从 而 介 导 细 胞 对 凋 亡 的 耐 受 图 5 不 同 处 理 组 Bax Bcl 2 Mcl 1 p Akt 表 达 变 化 1:A 组 ;2:B 组 ;3:C 组 ;4:D 组 ;5:E 组 ; 与 B 组 比 较 : P< 0 01; 与 前 一 浓 度 组 比 较 : # P<0.05 PI3K/Akt 信 号 通 路 的 激 活 被 认 为 是 肿 瘤 细 胞 抗 凋 亡 的 主 要 机 制 之 一, 影 响 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 的 敏 感 性 在 胃 癌 细 胞 与 化 疗 药 物 依 托 泊 苷 和 阿 霉 素 化 疗 耐 药 研 究 中 显 示 :PI3K/Akt 信 号 通 路 发 挥 重 要 作 用, 用 PI3K 抑 制 剂 阻 断 PI3K/Akt 信 号 通 路 后, 可 减 弱 胃 癌 细 胞 对 两 种 化 疗 药 物 的 抵 抗 [5] [6-7] 研 究 显 示 许 多 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 可 能 是 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 发 生 Hiletal [8] 发 现, 在 胰 腺 癌 细 胞 中,COX [9] 2 高 表 达 可 以 使 p Akt 活 化 增 强 也 有 文 献 报 道 COX 2 的 抑 制 剂 塞 来 昔 布 可 以 抑 制 Akt 的 磷 酸 化 本 研 究 中, 用 表 阿 霉 素 刺 激 YTS 细 胞 诱 导

17 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1043 COX 2 高 表 达, 获 得 高 表 达 COX 2 细 胞 株 预 实 验 中 发 现, 表 阿 霉 素 浓 度 为 0 33mg/L 作 用 3h 后, COX 2 表 达 最 高, 故 每 次 选 取 这 一 浓 度 来 诱 导 COX 2 高 表 达 塞 来 昔 布 和 LY 对 细 胞 生 长 呈 剂 量 毒 性, 本 研 究 中 选 取 作 用 细 胞 24h 后 无 明 显 细 胞 毒 性 的 浓 度 塞 来 昔 布 选 取 浓 度 为 20μmol/L, LY 选 取 浓 度 为 25μmol/L 在 本 研 究 中,COX 2 高 表 达 细 胞 与 未 诱 导 细 胞 相 比, 在 接 受 相 同 浓 度 表 阿 霉 素 作 用 后, 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 提 高 Westernblot 检 测 显 示,COX 2 高 表 达 细 胞 p Akt 活 化 表 达 升 高,Bcl 2 Mcl 1 抗 凋 亡 蛋 白 表 达 升 高,Bax 促 凋 亡 蛋 白 表 达 降 低, 提 示 高 表 达 COX 2 细 胞 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 为 进 一 步 研 究 高 表 达 COX 2 细 胞 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 的 假 设, 本 研 究 将 COX 2 高 表 达 细 胞 分 成 3 组, 分 别 加 入 表 阿 霉 素 单 药 表 阿 霉 素 联 合 塞 来 昔 布 (20μmol/L) 两 药 及 表 阿 霉 素 塞 来 昔 布 (20μmol/ L) 联 合 LY294002(25μmol/L),3 组 结 果 比 较 显 示, COX 2 的 抑 制 剂 塞 来 昔 布 可 以 抑 制 p Akt 的 表 达, [9] 这 与 有 关 文 献 提 出 COX 2 的 抑 制 剂 塞 来 昔 布 可 以 抑 制 Akt 的 磷 酸 化 说 法 一 致 随 着 p Akt 表 达 的 逐 渐 降 低, 细 胞 存 活 率 不 断 降 低, 凋 亡 率 逐 渐 增 加 Bax 表 达 逐 渐 增 高 ;Bcl 2 Mcl 1 表 达 逐 渐 降 低 这 与 Linetal [10] 在 其 他 肿 瘤 细 胞 中 发 现 COX 2 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 上 调 Mcl 1 的 表 达 而 提 高 肿 瘤 细 胞 存 活 率 的 结 果 是 相 似 的 综 上 所 述,NK/T 淋 巴 瘤 细 胞 株 YTS 可 被 表 阿 霉 素 诱 导 获 得 COX 2 高 表 达 高 表 达 COX 2 细 胞 可 能 通 过 p Akt 信 号 通 路 介 导 细 胞 凋 亡 途 径 提 高 对 表 阿 霉 素 的 耐 受 性 p Akt 可 作 为 新 的 提 高 化 疗 效 果 靶 点 进 行 进 一 步 探 索 和 研 究 参 考 文 献 [1] ShimSJ,YangW I,ShinE,etal.Clinicalsignificanceofcy clooxygenase 2expresioninextranodalnaturalkiler(NK)/T cel lymphoma,nasaltype[j].intjradiatoncolbiolphys,2007,67 (1):31-8. [2] EicheleK,RamerR,HinzB.Decisiveroleofcyclooxygenase 2 andlipocalin typeprostaglandindsynthaseinchemothempeuties inducedapoptosisofhumancervicalcarcinomacels[j].onco gene,2008,27(21): [3] GuKS,ChenY.Mechanism ofp glycoproteinexpresioninthe SGC7901humangastricadenocarcinomacellineinducedbycy clooxygenase 2[J].AsianPacJCancerPrev,2012,13(5): [4] ChenW,BaiL,WangX,etal.AcquiredactivationoftheAkt/cy clooxygenase 2/Mcl 1pathwayrenderslungcancercelsresistant toapoptosis[j].molharmacol,2010,77(3): [5] RodriguezD,Rojas RiveraD,HetzC.Integratingstressignalsat theendoplasmicreticulum:thebcl 2proteinfamilyrheostat[J]. BiochimBiophysActa,2011,1813(4): [6] JiaSS,XiGP,ZhangM,etal.IductionofapoptosisbyD limo neneismediatedbyinactivationofaktinls174thumancolon cancercels[j].oncolrep,2013,29(1): [7] LiuQ,DongHW,SunW G,etal.Apoptosisinitiationofbionone insgc 7901gastriccarcinomacancercelsviaaPI3K AKTpath way[j].archtoxicol,2013,87(3): [8] HilR,LiY,TranLM,etal.CelintrinsicroleofCOX 2in pancreaticcancerdevelopment[j].molcancerther,2012,11 (10): [9] AgarwalS,AchariC,PraveenD,etal.Inhibitionof12 LOXand COX 2reducestheproliferationofhumanepidermoidcarcinoma cels(a431)bymodulatingtheerk andpi3k Aktsignaling pathways[j].expdermatol,2009,18(11): [10]LinM T,LeeRC,YangPC,etal.Cyclooxygenase 2inducing Mcl 1 dependentsurvivalmechanisminhumanlungadenocarcino macl1.0cels.involvementofphosphatidylinositol3 kinase/akt pathway[j].jbiolchem,2001,276(52): Experimentalstudyofcyclooxygenase 2expresioninNK/Tcellymphoma intheroleofchemotherapydrugresistanceanditsmechanism WangYamin,GuKangsheng (DeptofOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022) Abstract Objective Toinvestigatethepotentialmechanismofchemotherapydrugresistanceinducedbycycloox ygenase 2(COX 2)inNK/Tcellymphoma.Methods Theefectsofepirubicinandcelecoxib,aCOX 2selec tiveinhibitor,andly294002,theaktpathwayinhibitorontheviabilityofnk/tcelwasasesedbymtsasay. TheefectofepirubicinonregulatingtheCOX 2expresionwasdetectedbyWesternblot.Thesignificanceof

18 1044 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 褪 黑 素 对 ICSI 周 期 中 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 结 果 的 影 响 高 明 1, 郝 燕 1, 陈 大 蔚 1,2, 纪 冬 梅 1, 陈 蓓 丽 1, 邹 薇 薇 1, 章 志 国 1,2 1,2, 曹 云 霞 摘 要 目 的 探 讨 褪 黑 素 的 应 用 对 卵 胞 浆 内 单 精 子 注 射 (ICSI) 周 期 中 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 (IVM) 受 精 和 胚 胎 发 育 的 影 响 方 法 收 集 的 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 随 机 置 于 含 褪 黑 素 和 不 含 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 中 进 行 IVM 培 养, 记 录 和 分 析 未 成 熟 卵 IVM 以 及 所 获 胚 胎 的 发 育 情 况 结 果 用 含 褪 黑 素 IVM 培 养 液 培 养 的 未 成 熟 卵 母 细 胞 为 褪 黑 素 组 (n=94),ivm 培 养 成 熟 78 枚,ICSI 后 受 精 60 枚, 培 养 后 卵 裂 59 枚, 发 育 至 囊 胚 26 枚, 其 14 枚 为 优 质 囊 胚, 而 非 褪 黑 素 组 (n=73),ivm 培 养 成 熟 60 枚,ICSI 后 受 精 44 枚, 培 养 后 卵 裂 42 枚, 随 后 11 枚 发 育 至 囊 胚, 仅 1 枚 优 质 囊 胚 两 组 间 成 熟 率 受 精 率 卵 裂 率 及 囊 胚 率 差 异 无 统 计 学 意 义 (P >0 05), 但 褪 黑 素 组 的 优 质 囊 胚 率 明 显 高 于 非 褪 黑 素 组 (53 8% vs9 1%), 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,χ 2 = 6 42) 结 论 褪 黑 素 的 应 用 改 善 了 IVM 效 果, 使 人 未 成 熟 接 收 基 金 项 目 : 国 家 重 大 研 究 计 划 ( 编 号 :2012CB944704); 国 家 自 然 青 年 科 学 基 金 培 育 计 划 ( 编 号 :2012KJ06) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 生 殖 医 学 中 心, 合 肥 安 徽 省 生 命 资 源 保 存 与 人 工 器 官 工 程 技 术 研 究 中 心, 合 肥 作 者 简 介 : 高 明, 男, 硕 士 研 究 生 ; 曹 云 霞, 女, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:caoyunx [email protected] 章 志 国, 男, 副 研 究 员, 责 任 作 者,E mail: zg_100@gmail. com 卵 母 细 胞 在 IVM ICSI 及 胚 胎 培 养 后 发 育 更 多 的 优 质 囊 胚 关 键 词 中 图 分 类 号 褪 黑 素 ; 未 成 熟 卵 母 细 胞 ; 体 外 成 熟 ; 发 育 R321;R329 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 年,Veecketal [1] 首 次 报 道 了 利 用 体 外 成 熟 (invitromaturation,ivm) 培 养 获 得 成 熟 卵 母 细 胞 并 生 育 一 正 常 婴 儿 目 前 IVM 已 成 为 辅 助 生 殖 领 [2-3] 域 的 一 项 重 要 技 术, 但 大 量 研 究 结 果 显 示, 未 成 熟 卵 母 细 胞 经 IVM 体 外 受 精 和 胚 胎 体 外 培 养 很 少 能 发 育 至 囊 胚 阶 段 为 了 改 善 IVM 结 果, 研 究 人 员 不 断 对 IVM 过 程 各 个 环 节 进 行 改 进 2013 年,Kim etal [4] 将 褪 黑 素 引 入 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 IVM 培 养 体 系, 在 IVM 培 养 液 中 添 加 10μmol/L 褪 黑 素 获 得 了 60% 的 临 床 妊 娠 率, 显 著 高 于 其 他 报 道 的 IVM 妊 [4] 娠 率 研 究 表 明 卵 泡 液 中 含 有 一 定 浓 度 的 褪 黑 素, 在 卵 母 细 胞 的 生 长 和 成 熟 过 程 中 有 重 要 的 作 用 该 研 究 中 添 加 5~10μmol/L 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 培 养 卵 胞 浆 内 单 精 子 注 射 (intracytoplasmicspermin jection,icsi) 周 期 中 获 得 的 未 成 熟 卵 母 细 胞, 探 讨 褪 黑 素 的 应 用 能 否 改 善 ICSI 周 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 及 所 获 胚 胎 的 发 育, 为 IVM 方 案 的 优 化 和 临 床 应 用 提 供 依 据 chemotherapydrugresistanceincellinesytsthatoverexprescox 2wasanalyzedamongdiferentgroupstreated withepirubicinalone,andwithcelecoxib(20μmol/l)orcombinedwithly294002(25μmol/l).further,wede tectedtheactivationofakt,p Akt,Bax,Bcl 2,Mcl 1bymeansofWesternblot,meanwhile,flowcytometrywas usedtoevaluatecelapoptosisrate.results Itwasshownthatepirubicin,celecoxibandLY294002wereinpos sesionofcytotoxicefectonytscellineactivityinadose dependentmanner.whenthedoseofepirubicinin creased,theexpresionofcox 2showedarisingtrendinYTScelline.Comparedwithcontrolcel,COX 2 over expresingcelsweremoretoleranttoepirubicin,andexpresedhigherexpresionofp Akt,Bcl 2,Mcl 1andles Bax.Over exprescox 2wasanalyzedamongdiferentgroupstreatedwithepirubicinalone,andwithcelecoxib(20 μmol/l)orcombinedwithly294002(25μmol/l).celsurvivalratedecreasedandcelapoptosisrateincreased succesively.atthesametime,expresionofbaxup regulatedandexpresionofbcl 2,Mcl 1,p Aktreduced succesively.conclusion EpirubicinhasacumulativeefectonCOX 2expresioninductioninNK/Tlymphoma cellinesyts.over exprescox 2cellinesmayincreasetoleranceofepirubicinthroughtheapoptosispathway mediatedbyp Aktsignaling. Keywords COX 2;apoptosis;Akt;epirubincin;NK/TlymphomacellineYTS

19 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 材 料 与 方 法 1.1 材 料 卵 母 细 胞 和 精 子 来 源 未 成 熟 卵 母 细 胞 来 自 于 在 本 中 心 就 诊 的 不 孕 症 患 者, 经 超 促 排 卵 行 IC SI 治 疗 且 剥 除 颗 粒 细 胞 后 镜 下 观 察 确 定 为 未 成 熟 卵 母 细 胞 授 精 所 用 精 子 来 自 供 卵 患 者 丈 夫 试 剂 褪 黑 素 透 明 质 酸 酶 雌 激 素 磷 酸 盐 缓 冲 液 无 水 乙 醇 丙 酮 酸 钠 双 抗 TCM199(Sigma, 美 国 );COOK 胚 胎 培 养 液 CultureOil(COOK, 澳 大 利 亚 );PVP(IrvineScientific, 美 国 ); 重 组 促 卵 泡 激 素 ( 雪 兰 诺, 瑞 士 ); 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 ( 丽 珠, 中 国 ); 供 卵 者 自 体 血 清 主 要 器 材 显 微 操 作 1006 皿 中 心 井 3037 培 养 皿 (Falcon, 美 国 ); 巴 斯 德 吸 管 (Hilgenbeng, 德 国 ); 显 微 固 定 针 显 微 注 射 针 (J.Y.LAB, 加 拿 大 ); 细 胞 培 养 皿 (Nunc, 美 国 ) 主 要 仪 器 设 备 体 视 显 微 镜 (Nikon, 日 本 ); 倒 置 显 微 镜 及 显 微 操 作 仪 (Olympus, 日 本 ); 超 声 及 穿 刺 取 卵 系 统 (Toshiba, 日 本 ); 常 规 培 养 箱 (SANYO, 日 本 ); 三 气 培 养 箱 (Galaxy, 英 国 ) IVM 培 养 液 IVM 培 养 液 准 备 :80% TCM g/L 丙 酮 酸 钠 +75IU/L 促 卵 泡 激 素 (foliclestimulatinghormone,fsh)+500iu/l 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (humanchorionicgonadotropin, HCG) +800μg/L 雌 激 素 +5~10μmol/L 褪 黑 素 +6g/L 双 抗 +20% 自 体 血 清, 平 衡 过 夜 备 用 1.2 方 法 卵 母 细 胞 的 获 取 及 分 组 就 诊 于 本 中 心 年 龄 35 岁 以 下 的 不 孕 症 患 者, 予 以 常 规 方 案 降 调 节, 促 性 腺 激 素 促 排 卵, 至 卵 泡 直 径 达 到 成 熟 标 准 后, 肌 内 注 射 HCG,34~36h 内 超 声 引 导 经 阴 道 穿 刺 取 卵 ICSI 前 将 卵 丘 复 合 物 置 于 含 80U/ml 透 明 质 酸 酶 0.2ml 的 3037 皿 中 间 孔, 拆 除 卵 母 细 胞 周 围 的 大 部 分 颗 粒 细 胞, 经 倒 置 显 微 镜 观 察 卵 母 细 胞 的 成 熟 程 度, 未 成 熟 卵 母 细 胞 (GV 期 或 MI 期 ) 供 本 研 究 使 用 本 研 究 共 获 得 未 成 熟 卵 母 细 胞 167 枚 (GV 期 117 枚 和 MI 期 50 枚 ), 褪 黑 素 组 94 枚 在 含 5~ 10μmol/L 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 培 养 (GV 期 78 枚 和 MI16 枚 ), 非 褪 黑 素 组 73 枚 在 不 含 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 培 养 (GV 期 39 枚 和 MI 期 34 枚 ) IVM 培 养 将 未 成 熟 卵 母 细 胞 移 入 IVM 培 养 液, 三 气 培 养 箱 培 养 24h, 培 养 成 熟 的 卵 母 细 胞 进 行 ICSI 授 精 ICSI 和 胚 胎 培 养 通 过 IVM 培 养 成 熟 后 的 卵 母 细 胞 常 规 进 行 ICSI: 利 用 负 压 将 处 理 后 的 精 子 自 尾 部 开 始 吸 入 显 微 注 射 针 内, 调 整 卵 母 细 胞 至 第 一 极 体 位 于 6 点 或 12 点 处 显 微 固 定 针 固 定, 携 带 精 子 的 显 微 注 射 针 自 正 中 3 点 位 置 垂 直 穿 越 透 明 带 和 卵 母 细 胞 胞 浆 膜, 确 认 卵 母 细 胞 膜 破 裂 后, 将 精 子 注 入 卵 细 胞 浆 内 以 完 成 授 精 过 程 ICSI 后 常 规 进 行 分 裂 期 胚 胎 培 养 和 囊 胚 培 养, 并 记 录 胚 胎 发 育 情 况 分 裂 期 胚 胎 及 囊 胚 评 分 标 准 分 裂 期 胚 胎 根 据 形 态 学 分 为 4 级 :Ⅰ 级 胚 胎, 细 胞 大 小 均 匀, 形 态 规 则, 碎 片 <10%;Ⅱ 级 胚 胎, 细 胞 大 小 比 较 均 匀, 胞 质 可 有 颗 粒 现 象, 碎 片 占 卵 胞 浆 体 积 的 10% ~20%;Ⅲ 级 胚 胎, 细 胞 大 小 明 显 不 均, 碎 片 占 卵 胞 浆 体 积 的 21% ~50%;Ⅳ 级 胚 胎, 细 胞 严 重 大 小 不 均, 碎 片 占 卵 胞 浆 体 积 50% 以 上 Ⅰ 和 Ⅱ 级 胚 胎 为 优 质 胚 胎 囊 胚 评 分 及 囊 胚 扩 张 度 评 分 依 据 Gardner 评 分 法 [5] :A 型 内 细 胞 团 (innercelmas,icm) 由 许 多 紧 密 包 裹 的 细 胞 组 成,B 型 ICM 由 包 裹 不 紧 密 细 胞 组 成 A 型 滋 养 层 由 很 多 形 态 均 一 细 胞 形 成 连 续 的 上 皮,B 型 滋 养 层 由 较 少 细 胞 形 成 疏 松 的 上 皮 由 A 型 或 B 型 ICM 和 滋 养 层 组 成 的 囊 胚 称 为 优 质 囊 胚 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS18 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 百 分 率 表 示, 对 结 果 进 行 χ 2 检 验 及 Fisher s 精 确 检 验 2 结 果 2.1 两 组 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 褪 黑 素 组 : 未 成 熟 卵 母 细 胞 94 枚,IVM 培 养 成 熟 78 枚, 受 精 60 枚, 卵 裂 59 枚, 囊 胚 26 枚, 其 中 获 得 14 枚 优 质 囊 胚 ; 非 褪 黑 素 组 : 未 成 熟 卵 母 细 胞 73 枚,IVM 培 养 成 熟 60 枚, 受 精 44 枚, 卵 裂 42 枚, 囊 胚 11 枚, 其 中 1 枚 优 质 囊 胚 两 组 间 比 较 : 成 熟 率 受 精 率 卵 裂 率 及 囊 胚 率 差 异 无 统 计 学 意 义, 但 褪 黑 素 组 的 优 质 囊 胚 率 明 显 高 于 非 褪 黑 素 组 (53.8% vs9 1%), 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,χ 2 =6 42), 见 表 1 未 成 熟 卵 母 细 胞 和 IVM 后 成 熟 卵 母 细 胞 见 图 两 组 GV 期 及 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 褪 黑 素 组 和 非 褪 黑 素 组 均 含 有 GV 期 和 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞, 两 组 GV 期 和 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 情 况, 成 熟 率 卵 裂 率 囊 胚 率 和 优 质 囊 胚 率 比

20 1046 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 较, 差 异 无 统 计 学 意 义, 见 表 GV 期 与 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 褪 黑 素 组 和 非 褪 黑 素 组 共 有 GV 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 117 枚,MI 期 卵 母 细 胞 50 枚,GV 期 和 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 情 况, 成 熟 率 卵 裂 率 囊 胚 率 和 优 质 囊 胚 率 比 较, 差 异 无 统 计 学 意 义, 见 表 囊 胚 情 况 本 研 究 共 获 得 囊 胚 37 枚, 其 中 优 质 囊 胚 15 枚,14 枚 发 育 自 褪 黑 素 组, 另 1 枚 发 育 自 非 褪 黑 素 组 见 图 2 图 1 未 成 熟 卵 母 细 胞 和 IVM 后 成 熟 卵 母 细 胞 代 表 图 200 A:GV 期 卵 母 细 胞 ;B:MI 期 卵 母 细 胞 ;C: 体 外 成 熟 的 MI 期 卵 母 细 胞 图 2 优 质 囊 胚 的 代 表 图 500 A:4AB;B:4BA;C:4AA;D:4AA 表 1 褪 黑 素 组 与 非 褪 黑 素 组 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 比 较 项 目 褪 黑 素 组 非 褪 黑 素 组 所 获 卵 母 细 胞 数 目 (n) IVM 成 熟 率 (%) 78/94(83.0) 60/73(82.2) 受 精 率 (%) 60/78(76.9) 44/60(73.3) 卵 裂 率 (%) 59/60(98.3) 42/44(95.4) 囊 胚 率 (%) 26/59(44.1) 11/42(26.1) 优 质 囊 胚 率 (%) 14/26(53.8) 1/11(9.1) 与 褪 黑 素 组 比 较 : P<0 05 表 2 褪 黑 素 组 与 非 褪 黑 素 组 GV 期 及 MI 期 未 成 熟 卵 发 育 比 较 项 目 褪 黑 素 组 非 褪 黑 素 组 GV MI GV MI 所 获 卵 母 细 胞 数 目 (n) IVM 成 熟 率 (%) 63/78(80.8) 15/16(93.8) 29/39(74.4) 31/34(91.2) 受 精 率 (%) 48/63(76.2) 12/15(80.0) 21/29(72.4) 23/31(74.2) 卵 裂 率 (%) 47/48(97.9)12/12(100.0) 20/21(95.2) 22/23(95.7) 囊 胚 率 (%) 22/47(46.8) 4/12(33.3) 7/20(35.0) 4/22(18.2) 优 质 囊 胚 率 (%) 12/22(54.5) 2/4(50.0) 0/7(0.00) 1/4(25.0) 表 3 GV 期 及 MI 期 未 成 熟 卵 母 细 胞 发 育 比 较 项 目 GV MI 所 获 卵 母 细 胞 数 目 (n) IVM 成 熟 率 (%) 92/117(78.6) 46/50(92.0) 受 精 率 (%) 69/92(75.0) 35/46(76.1) 卵 裂 率 (%) 67/69(97.1) 34/35(97.1) 囊 胚 率 (%) 29/67(43.3) 8/34(23.5) 优 质 囊 胚 率 (%) 12/29(41.4) 3/8(37.5) 3 讨 论 [6] 研 究 表 明 氧 化 应 激 对 卵 母 细 胞 成 熟 起 着 抑 制 作 用, 在 体 内 生 长 的 卵 母 细 胞, 会 受 到 体 内 抗 氧 化 物 质, 如 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxidedismutase, SOD) 和 谷 胱 甘 肽 (glutathione,gsh) 的 保 护 而 免 于 损 伤 褪 黑 素 作 为 体 内 调 节 生 理 节 律 周 期 的 内 源 性 物 质, 能 够 对 抗 氧 化 应 激, 卵 泡 液 中 一 定 浓 度 的 褪 黑 素 直 接 保 护 着 卵 母 细 胞 在 生 长 发 育 过 程 中 免 受 氧 化 应 激 的 损 伤, 卵 泡 液 中 褪 黑 素 的 存 在 影 响 到 卵 母 细 胞 的 质 量 和 其 后 续 的 发 育 潜 能 [7-8] 本 研 究 中 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 在 含 褪 黑 素 的 IVM 培 养 液 中 行 IVM, 体 外 受 精 及 胚 胎 培 养, 褪 黑 素 组 成 熟 率 受 精 率 卵 裂 率 囊 胚 率 及 优 质 囊 胚 率 均 高 于 非 褪 黑 素 组, 其 中 优 质 囊 胚 率 方 面, 组 间 差 异 有 统 计 学 意 义 本 研 究 显 示 褪 黑 素 应 用 于 IVM 培 养 液 能 改 善 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 的 IVM 结 果, 提 高 优 质 囊 胚 形 成 研 究 中 GV 期 和 MI 期 卵 母 细 胞 被 分 开, 同 一 发 育 阶 段 的 卵 母 细 胞 行 共 同 培 养 MI 期 卵 母 细 胞 的 成 熟 率 高 于 GV 期 卵 母 细 胞 ; 受 精 率 与 卵 裂 率 方 面, 两 者 相 当 ; 囊 胚 及 优 质 胚 胎 率 方 面,GV 期 卵 母

21 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1047 细 胞 显 著 高 于 MI 期 卵 母 细 胞, 但 各 指 标 的 组 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 但 本 研 究 样 本 量 有 限, 今 后 仍 需 扩 大 样 本 量, 并 对 褪 黑 素 促 进 人 胚 胎 发 育 的 机 制 及 所 获 胚 胎 的 安 全 性 进 行 研 究 本 研 究 结 果 表 明 IVM 培 养 液 中 低 浓 度 的 褪 黑 素 因 其 自 由 基 清 除 作 用 对 卵 母 细 胞 的 成 熟 和 胚 胎 的 发 育 有 促 进 效 应 ;ICSI 周 期 中 所 获 得 的 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 具 有 很 高 的 利 用 价 值 ICSI 周 期 中 的 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 后 可 以 捐 赠 给 卵 子 库 或 用 于 研 究, 也 可 应 用 于 患 者 自 身, 提 高 累 积 妊 娠 率 [2-3,9] 本 研 究 中 通 过 褪 黑 素 的 应 用 使 体 内 成 熟 失 败 人 卵 母 细 胞 在 IVM ICSI 及 胚 胎 培 养 后 获 得 更 多 的 优 质 囊 胚, 为 IVM 的 优 化 提 供 依 据, 也 为 人 未 成 熟 卵 母 细 胞 再 利 用 的 研 究 提 供 有 益 的 借 鉴 参 考 文 献 [1] VeeckLL,WorthamJW Jr,WitmyerJ,etal.Maturationand fertilizationofmorphologicalyimmaturehumanoocytesinapro gramofinvitrofertilization[j].fertilsteril,1983,39(5): [2] LiuY,CaoYX,ZhangZG,etal.Artificialoocyteactivation andhumanfailed maturedoocytevitrificationfolowedbyinvitro maturation[j].zygote,2013,21(1):71-6. [3] ZhangZG,LiuY,XingQ,etal.Cryopreservationofhuman failed maturedoocytesfolowedbyinvitromaturation:vitrification issuperiortotheslowfreezingmethod[j].reprodbiolendocri nol,2011,9:156. [4] KimM K,ParkEA,KimHJ,etal.Doessupplementationofin vitroculturemediumwithmelatoninimproveivfoutcomeinpcos [J].ReprodBiomedOnline,2013,26(1):22-9. [5] GardnerDK,SchoolcraftW B.Cultureandtransferofhuman blastocysts[j].curopinobstetgynecol,1999,11(3): [6] CombelesCM,CuptaS,AgarwalA.Couldoxidativestresinflu encetheinvitromaturationofoocytes?[j].reprodbiomedon line,2009,18(6): [7] TamuraH,TakasakiA,TaketaniT,etal.Melatoninasafree radicalscavengerintheovarianfolicle[j].endocrj,2013,60 (1):1-13. [8] TamuraH,TakasakiA,TaketaniT,etal.Theroleofmelatonin asanantioxidantinthefolicle[j].jovarianres,2012,5:5. [9] 魏 兆 莲, 周 平, 曹 云 霞, 等. 未 成 熟 卵 体 外 培 养 成 熟 治 疗 难 治 性 多 囊 卵 巢 综 合 征 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2004,39(5): EfectofmelatoninappliedtoIVM medium onivm outcome ofhumanimmatureoocytesretrievedfrom ICSIcycles GaoMing 1,HaoYan 1,ChenDawei 1,2,etal ( 1 ReproductiveMedicineCenter,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 AnhuiProvincialEngineringTechnologyResearchCenterofBiopreservationandArtificialOrgans,Hefei ) Abstract Objective Tostudytheefectofmelatoninappliedtoinvitromaturation(IVM)mediumonIVM,ferti lizationandembryonicdevelopmentinhumanimmatureoocytescolectedfromintracytoplasmicsperminjection(ic SI)cycles.Methods AlofthehumanimmatureoocyteswererandomlyplacedintoIVM medium supplemented withandwithoutmelatoninforivm.results Theoocytescultureinthemedium withmelatoninbelongedtothe groupmelatonin(n=94),inwhich94immatureoocyteswerecolected.inthegroupmelatonin78matured,60 fertilized,59cleaved,andfinaly26developedtoblastocysts,ofwhich,14werehigh qualityblastocysts.inthe groupnon melatonin(n=73),60matured,44fertilizedand42cleaved.afterafurthercultureforblastocyst,11 blastocystswereachievedandonly1high qualityblastocyst.nosignificantdiferencewasfoundinivm,fertiliza tion,cleavageandblastocystratesbetweengroups.butthehigh qualityblastocystrateinthegroupmelatoninwas higherthanthatinthegroupnon melatonin(53.8% vs9.1%),therewasasignificantdiferencebetweengroups (P<0 05,χ 2 =6 42).Conclusion IVM mediumsupplementedwithmelatoninisappliedtoivm humanimma tureoocytesretrievedfromicsicyclesandcanachievetheformationofmorehigh qualityblastocysts. Keywords melatonin;humanimmatureoocyte;invitromaturation;development

22 1048 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) Bcl 2 在 紫 杉 醇 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 中 的 表 达 及 意 义 张 丽, 胡 汪 来, 王 家 钰, 张 旭 东, 张 林 杰 摘 要 目 的 探 讨 凋 亡 抑 制 蛋 白 Bcl 2 在 紫 杉 醇 (TAX) 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 中 的 作 用 方 法 采 用 药 物 浓 度 梯 度 递 增 持 续 作 用 法 建 立 耐 TAXSGC 7901 细 胞 株,PI 单 染 法 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 差 异,MTT 比 色 法 检 测 细 胞 生 存 率 变 化, Westernblot 检 测 TAX 处 理 后 SGC 7901 普 通 细 胞 株 及 耐 药 细 胞 株 Bcl 2 mcl 1 Bax Bcl xl 蛋 白 表 达, 半 定 量 PCR 检 测 Bcl 2mRNA 水 平 变 化, 流 式 细 胞 术 检 测 Bcl 2 基 因 沉 默 后 的 凋 亡 率 变 化,MTT 检 测 细 胞 生 存 率 结 果 TAX 诱 导 胃 腺 癌 细 胞 凋 亡 具 有 时 间 和 剂 量 相 关 性, 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 株 对 TAX 诱 导 的 凋 亡 不 敏 感,TAX 处 理 后 Westernblot 检 测 到 耐 药 细 胞 株 中 Bcl 2 表 达 上 调, 亲 本 细 胞 株 Bcl 2 则 表 达 下 调, 半 定 量 PCR 检 测 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 株 中 Bcl 2mRNA 水 平 亦 上 调 在 耐 药 胃 癌 细 胞 株 中 沉 默 Bcl 2 后,Bcl 2 蛋 白 水 平 下 调, 细 胞 凋 亡 率 明 显 上 升, 细 胞 生 存 率 显 著 下 降 结 论 Bcl 2 的 表 达 上 调 可 能 是 胃 腺 癌 细 胞 对 TAX 耐 药 的 重 要 机 制 关 键 词 中 图 分 类 号 胃 肿 瘤 ; 紫 杉 醇 ; 细 胞 凋 亡 ; 肿 瘤 耐 药 ;Bcl 2 R735.2;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 胃 癌 是 我 国 常 见 的 恶 性 肿 瘤, 化 疗 是 胃 癌 患 者 治 疗 的 主 要 手 段 之 一 紫 杉 醇 (paclitaxel,tax) 作 为 胃 癌 化 疗 的 一 线 药 物, 因 其 在 临 床 初 始 化 疗 缓 解 后 常 产 生 耐 药 性, 严 重 影 响 患 者 治 疗 效 果 [1] 近 年 [2] 来 通 过 建 立 TAX 耐 药 的 肿 瘤 细 胞 株 探 讨 TAX 耐 [3] 药 机 制 的 研 究 表 明 :P 糖 蛋 白 微 管 β 亚 基 和 α 亚 基 表 达 的 改 变, 以 及 凋 亡 途 径 中 相 关 分 子 的 表 达 异 常 均 与 TAX 耐 药 性 有 关 Bcl 2 家 族 中 的 抗 凋 亡 蛋 白 在 TAX 等 化 疗 药 物 耐 药 的 肿 瘤 细 胞 中 发 挥 重 要 作 用 该 研 究 旨 在 探 讨 Bcl 2 蛋 白 在 TAX 耐 药 的 胃 腺 癌 细 胞 中 的 作 用, 了 解 胃 腺 癌 细 胞 耐 药 的 分 子 机 制, 以 期 寻 找 克 服 肿 瘤 细 胞 耐 药 的 有 效 途 径 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 SGC 7901 胃 腺 癌 细 胞 株 购 自 中 国 科 学 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 : KJ2011A167) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 免 疫 学 教 研 室, 合 肥 作 者 简 介 : 张 丽, 女, 硕 士 研 究 生 ; 张 林 杰, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zlj33@ ahmu.edu.cn 院 上 海 细 胞 库 ;RPMI 1640 培 养 基 胰 酶 小 牛 血 清 Opti MEM 购 自 美 国 Gibco 公 司 ; 小 鼠 抗 人 Bcl 2 Bax mcl 1 Bcl xl 单 抗 购 自 美 国 CST 公 司 ; 小 鼠 抗 人 β actin 单 抗 及 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 小 鼠 IgG 抗 体 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ;Bcl 2 小 干 扰 RNA 购 自 上 海 吉 玛 公 司 ; 脂 质 体 Lipofectamine2000 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ;TAX 购 自 美 国 百 时 美 施 贵 宝 公 司 ;β actin 及 Bcl 2 引 物 由 上 海 生 工 生 物 公 司 合 成 1.2 细 胞 培 养 及 药 物 处 理 SGC 7901 胃 癌 细 胞 系 在 含 10% 小 牛 血 清 1% 双 抗 的 RPMI 1640 培 养 基, 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 下 培 养 TAX 溶 于 DMSO 配 成 1mmol/L 储 存 液,-20 保 存, 使 用 前 稀 释 成 所 需 浓 度 细 胞 传 代 后 24h,PBS 洗 涤 2 次, 未 处 理 组 更 换 新 鲜 培 养 液, 药 物 组 加 入 TAX, 不 同 时 间 收 集 备 用 1.3 耐 药 细 胞 系 的 建 立 选 取 对 数 生 长 期 的 SGC 7901 细 胞,TAX 作 用 浓 度 从 0 03μmol/L 开 始,48h 后 弃 去 培 养 液, 加 入 新 鲜 培 养 液 继 续 培 养, 观 察 没 有 明 显 死 亡 细 胞 后, 选 择 对 数 生 长 期 的 细 胞 传 代, 并 增 加 25% ~50%TAX 药 物 浓 度, 反 复 传 代 并 使 之 稳 定, 直 至 该 细 胞 株 能 在 0 3μmol/L 的 TAX 浓 度 下 长 期 培 养 生 长, 命 名 为 SGC 7901/TAX 1.4 PI 单 染 法 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 将 处 于 对 数 生 长 期 的 SGC 7901 与 SGC 7901/TAX 细 胞 接 种 于 24 孔 板 培 养 过 夜, 选 择 不 同 剂 量 的 TAX 及 不 同 时 间 点 分 别 作 用 于 上 述 两 种 细 胞 收 集 24 孔 板 中 上 清 液, 各 孔 再 用 PBS 洗 涤 1 遍,1200r/min 离 心 10min, 弃 上 清 液, 每 孔 加 入 750μlPI 染 液,37 避 光, 作 用 20min 后 收 集 细 胞 4 避 光 过 夜 次 日 上 流 式 仪 检 测 每 组 实 验 重 复 3 次, 结 果 用 WinMDI2.9 软 件 分 析, 具 有 G1 期 DNA 含 量 的 细 胞 比 例 即 细 胞 凋 亡 率 1.5 MTT 比 色 法 检 测 细 胞 生 存 率 将 处 于 对 数 生 长 期 的 SGC 7901 与 SGC 7901/TAX 细 胞 接 种 于 96 孔 板,37 5%CO 2 温 箱 培 养 3d, 分 别 加 TAX 作 用 不 同 时 间 及 浓 度 每 孔 加 MTT 溶 液 20μl, 继 续 孵 育 4h, 终 止 培 养, 小 心 吸 弃 孔 内 培 养 上 清 液, 每 孔 加 150μlDMSO, 振 荡 10min, 使 结 晶 物 充 分 溶 解 选 择 490nm 波 长, 在 酶 联 免 疫 检 测 仪 上 测 定 各 孔 吸 光

23 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1049 值, 记 录 结 果, 以 时 间 为 横 坐 标, 吸 光 值 为 纵 坐 标 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 1.6 Westernblot 收 集 细 胞, 预 冷 PBS 洗 涤 2 遍, 加 入 细 胞 裂 解 液, 冰 上 孵 育 30min, r/ min, 离 心 30min, 吸 取 上 清 液, 即 细 胞 总 蛋 白 用 BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度 将 已 定 量 好 的 细 胞 总 蛋 白 与 2 蛋 白 电 泳 上 样 缓 冲 液 等 量 混 合, 沸 水 煮 3~5 min 备 用 20μg 总 蛋 白 经 SDS PAGE 电 泳, 转 移 至 硝 酸 纤 维 素 膜 上, 转 膜 后 用 5% 脱 脂 牛 奶 /TBST 封 闭 2h, 依 次 加 入 一 抗 (β actin 小 鼠 抗 人 Bax Bcl xl Bcl 2 mcl 1) 稀 释, 室 温 孵 育 2h,TBST 洗 3 次, 每 次 15min, 分 别 加 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 小 鼠 二 抗 ( 稀 释 ) 室 温 孵 育 1h,TBST 洗 3 次, 每 次 15min 用 ECL 试 剂 盒 进 行 显 影 曝 光, 拍 摄 图 像 保 存 1.7 RT PCR 用 TRIzol 法 提 取 TAX 作 用 不 同 时 间 的 SGC 7901/TAX 细 胞 的 总 RNA, 并 进 行 质 量 鉴 定 按 照 逆 转 录 试 剂 盒 说 明, 冰 上 操 作 将 不 同 时 间 点 的 RNA 逆 转 录 成 cdna 再 以 逆 转 录 出 的 cdna 为 模 板 建 立 反 应 体 系 (25μl) β actin 引 物 序 列 : 正 义 链 5 GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT 3, 反 义 链 5 GTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGG 3 Bcl 2 引 物 序 列 : 正 义 链 5 TTCGCCGAGTCCAGGC 3, 反 义 链 5 TCACTTGTGGCCCAGATAGC 3 反 应 的 变 性, 退 火, 延 伸 条 件 为 94 5min;94 30s, 60 45s,72 1min, 共 35 个 循 环 ;72 10min PCR 产 物 在 1 5% 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 1.8 基 因 沉 默 根 据 Bcl 2 基 因 信 息, 分 别 设 计 3 条 针 对 Bcl 2 的 靶 序 列 SiRNA1:5 CATCGCCCT GTGGATGACT 3,SiRNA2:5 GACTCTGCTCAGTIT GGCC 3 ;SiRNA3:5 GTGAAGTCAACATGCCTGC 3 取 对 数 生 长 期 的 SGC 7901/TAX, 以 24 孔 板 为 例, 细 胞 密 度 为 , 接 种 于 24 孔 板, 用 含 10% 小 牛 血 清 的 无 抗 生 素 的 RPMI 1640 培 养 24h 将 SiRNA 与 Opti MEM( 转 染 专 用 培 养 基 ),Lipo fectamine2000 与 Opti MEM 分 别 混 匀 后, 再 混 合 两 种 悬 液, 室 温 作 用 20min 将 SiRNA 脂 质 体 复 合 物 加 入 培 养 孔 中, 转 染 后 6h, 吸 弃 含 SiRNA 脂 质 体 复 合 物 的 培 养 液, 换 为 含 10% 小 牛 血 清 无 抗 生 素 的 RPMI 1640 培 养, 设 空 白 阴 性 对 照 组 1.9 统 计 学 处 理 采 用 SPSS16 0 统 计 软 件 分 析 数 据 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 2 结 果 2.1 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 细 胞 形 态 比 较 显 微 镜 下 观 察 SGC 7901 细 胞 呈 圆 形, 大 小 均 一, 形 态 规 则, 折 光 率 高, 呈 铺 路 石 状 ;SGC 7901/TAX 细 胞 变 形, 部 分 细 胞 体 积 增 大, 大 小 不 均 一, 形 态 不 规 则, 可 见 瘤 巨 细 胞 和 凹 陷, 折 光 率 减 弱 见 图 1 图 1 光 镜 下 SGC 7901 与 SGC 7901/TAX 细 胞 形 态 SP 100 A:SGC 7901;B:SGC 7901/TAX 2.2 TAX 诱 导 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 凋 亡 率 比 较 用 不 同 浓 度 ( μmol/L)TAX 诱 导 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 细 胞 36h, 两 株 细 胞 的 凋 亡 率 分 别 为 (2 11±1 02)% (7 23± 0 71)% (8 13±1 33)% 和 (3 64±0 82)% (19 62±1 04)% (33 72±0 93)%, 在 0 2μmol/ L 时 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 同 时 选 用 0 3μmol/LTAX 作 用 h 凋 亡 率 分 别 为 亲 本 株 (4 03±0 81)% (7 23±1 40)% (33 7± 0 97)%, 耐 药 株 (1 23 ±1 01)% (3 60 ± 0 73)% (33 72±1 34)%, 在 6h 以 后 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 以 上 表 明 耐 药 株 细 胞 较 亲 本 株 细 胞 对 TAX 诱 导 的 凋 亡 明 显 耐 受 2.3 TAX 对 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 的 增 殖 抑 制 作 用 比 较 分 别 采 用 不 同 浓 度 的 TAX( μmol/L) 作 用 于 SGC 7901/TAX 与 SGC 7901 细 胞 36h 后,MTT 法 检 测 细 胞 存 活 率 分 别 为 (96 43±2 52)% (91 97±2 90)% (89 11± 3 52)% 和 (88 54±0 93)% (83 31±2 07)% (69 56±3 20)%, 在 TAX0 1μmol/L 时 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 同 时, 采 用 0 3μmol/LTAX 作 用 两 株 细 胞 h 后,MTT 检 测 存 活 率 耐 药 株 为 (95 17±1 84)% (89 34±2 61)% (84 33 ±3 12)%, 亲 本 细 胞 株 为 (93 42±2 31)% (80 77±3 74)% (69 12±1 93)%,12h 后 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 以 上 表 明 TAX 对 耐 药 株 细 胞 的 增 殖 抑 制 作 用 较 亲 本 株 细 胞 明 显 减 弱 2.4 TAX 作 用 于 SGC 7901 和 SGC 7901/TAX 后

24 1050 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 对 Bcl 2 家 族 蛋 白 表 达 的 影 响 检 测 Bcl 2 蛋 白 家 族 Bcl 2 mcl 1 Bcl xl Bax 在 两 株 细 胞 中 表 达 的 变 化 情 况, 结 果 显 示 Bcl 2 在 亲 本 细 胞 株 中 表 达 下 调, 与 0h 蛋 白 表 达 量 比 较, 在 6h 后 开 始 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 图 2; 同 时 Bcl 2 在 TAX 耐 药 细 胞 株 中 表 达 明 显 上 调, 与 0h 蛋 白 表 达 量 比 较, 在 6h 后 开 始 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0 05), 见 图 3 Bcl 2 在 两 株 细 胞 中 的 表 达 差 异 说 明 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl 2 变 化 可 能 在 TAX 耐 药 机 制 中 起 重 要 作 用 图 3 TAX(0 3μmol/L) 诱 导 SGC 7901/TAX 细 胞 Bcl 2 家 族 蛋 白 的 变 化 与 同 种 蛋 白 0h 比 较 : P<0 05 图 2 TAX(0 3μmol/L) 诱 导 SGC 7901 细 胞 Bcl 2 家 族 蛋 白 的 变 化 与 同 种 蛋 白 0h 比 较 : P<0 05 图 4 TAX(0 3μmol/L) 诱 导 胃 腺 癌 细 胞 耐 药 株 SGC 7901/TAXBcl 2mRNA 的 表 达 M:MarkerDL TAX 诱 导 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 中 Bcl 2mRNA 表 达 水 平 变 化 在 明 确 了 TAX 作 用 于 胃 腺 癌 细 胞 耐 药 株 SGC 7901/TAX 后 Bcl 2 的 蛋 白 水 平 是 上 调 的, 进 一 步 探 讨 mrna 水 平 的 变 化 TAX 处 理 胃 腺 癌 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 后, 提 取 作 用 不 同 时 间 点 的 mrna, 采 用 特 异 性 引 物 通 过 RT PCR 反 应 检 测 Bcl 2mRNA 水 平 也 是 上 调 的, 见 图 4, 与 蛋 白 水 平 变 化 一 致, 说 明 Bcl 2 的 变 化 受 到 转 录 水 平 上 的 调 控 2.6 TAX 作 用 于 沉 默 Bcl 2 的 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 后 凋 亡 率 变 化 情 况 由 于 Bcl 2 在 耐 药 细 胞 株 中 表 达 上 调, 于 是 在 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/ TAX 中 沉 默 Bcl 2 基 因,Westernblot 鉴 定 Bcl 2 蛋 白 表 达 可 见 转 染 小 干 扰 RNA 后,Bcl 2 的 蛋 白 表 达 显 著 下 调, 见 图 5, 说 明 沉 默 基 因 有 效 转 染 24h 后 加 TAX 作 用 36h, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 示 3 条 小 干 扰 RNA 分 别 为 (14 32±0 92)% (18 53± 1 06)% (29 16±0 47)%, 较 空 白 对 照 (7 20± 0 32)% 和 阴 性 对 照 (8 41±0 65)% 明 显 提 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 图 6, 同 时 MTT 比 色 法 检 测 示 转 染 3 条 小 干 扰 RNA 后 细 胞 存 活 率 分 别 为 (79 82±1 34)% (76 11±3 42)% (66 72± 1 53)%, 与 空 白 对 照 (89 12±1 97)% 和 阴 性 对 照 (88 15±2 64)% 相 比 显 著 下 降, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 3 讨 论 TAX 是 从 紫 杉 树 皮 中 分 离 得 到 的 抗 癌 药 物, 其

25 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1051 图 5 Westernblot 检 测 沉 默 Bcl 2 基 因 后 Bcl 2 的 表 达 变 化 1: 空 白 对 照 组 ;2: 阴 性 对 照 组 ;3:Bcl 2 SiRNA1 组 ;4:Bcl 2 SiR NA2 组 ;5:Bcl 2 SiRNA3 组 ; 与 空 白 对 照 组 比 较 : P<0 05 [4] 作 用 机 制 主 要 是 促 进 微 管 双 聚 体 装 配 成 微 管, 抑 制 微 管 的 解 聚, 从 而 影 响 细 胞 的 正 常 分 裂, 使 细 胞 阻 滞 于 G2/M 期 同 时 TAX 与 微 管 蛋 白 结 合 十 分 稳 定, 可 抑 制 细 胞 内 外 某 些 调 控 因 素 对 微 管 系 统 的 作 用, 可 诱 导 细 胞 最 终 以 凋 亡 方 式 死 亡 临 床 应 用 于 治 疗 多 种 肿 瘤 如 胃 癌 食 道 癌 肺 癌 乳 腺 癌 卵 巢 癌 等 但 是, 与 其 他 化 疗 药 物 一 样 TAX 也 面 临 着 肿 瘤 细 胞 的 耐 药 性 问 题 肿 瘤 耐 药 的 机 制 非 常 复 杂 [5], 主 要 可 分 为 4 种 : 1 降 低 药 物 活 性 或 提 高 细 胞 解 毒 能 力 ;2 通 过 转 运 蛋 白 降 低 细 胞 内 或 区 域 内 的 药 物 浓 度 ;3 改 变 药 物 作 用 靶 点 或 提 高 细 胞 对 破 坏 靶 点 的 修 复 能 力 ;4 提 高 细 胞 抗 凋 亡 能 力 这 种 耐 药 可 为 原 发 性 也 可 为 继 发 性, 并 已 成 为 肿 瘤 化 疗 的 一 大 障 碍 本 实 验 采 用 药 物 浓 度 梯 度 递 增 持 续 作 用 法 建 立 了 耐 TAX 的 胃 腺 癌 细 胞 株 SGC 7901/TAX, 光 镜 下 观 察 SGC 7901 细 胞 呈 圆 形 或 椭 圆 形, 大 小 均 一, 形 态 规 则, 边 界 清 晰, 核 大,SGC 7901/TAX 耐 药 细 胞 形 态 不 规 则, 大 小 不 一, 细 胞 体 积 稍 增 大, 边 界 不 清 楚, 细 胞 核 不 规 则, 可 见 较 大 的 凹 陷 和 巨 细 胞 流 式 细 胞 术 检 测 TAX 诱 导 的 两 株 细 胞 随 着 药 物 作 用 浓 度 的 增 加 及 时 间 的 延 长 凋 亡 率 增 加, 并 且 耐 药 细 胞 株 较 亲 本 细 胞 对 TAX 诱 导 的 凋 亡 明 显 耐 受 同 时, MTT 实 验 显 示 TAX 诱 导 后 耐 药 细 胞 株 的 生 存 率 比 亲 本 细 胞 明 显 提 高, 这 些 都 显 示 建 立 了 TAX 耐 药 细 胞 株 SGC 7901/TAX 模 型 成 功 之 后,TAX 分 别 作 用 于 两 株 细 胞,Westernblot 检 测 了 与 凋 亡 密 切 相 关 的 Bcl 2 家 族 相 关 蛋 白 的 表 达 情 况, 结 果 显 示 Bcl 2 在 SGC 7901 细 胞 株 中 蛋 白 表 达 水 平 下 调, 而 在 SGC 7901/TAX 耐 药 细 胞 株 中 的 蛋 白 表 达 却 是 上 调 这 提 示 Bcl 2 作 为 抗 凋 亡 Bcl 2 家 族 中 的 重 要 一 员, 其 在 TAX 诱 导 的 耐 药 胃 腺 癌 细 胞 凋 亡 中 起 抑 制 作 用 为 了 进 一 步 证 实 Bcl 2 在 TAX 耐 药 中 的 作 用, 在 Bcl 2 高 表 达 的 耐 药 细 胞 SGC 7901/TAX 中 沉 默 Bcl 2 基 因 后,TAX 再 作 用 此 沉 默 Bcl 2 基 因 的 耐 药 细 胞 株, 流 式 结 果 显 示 细 胞 凋 亡 率 较 沉 默 基 因 前 明 显 升 高,MTT 也 提 示 沉 默 Bcl 2 基 因 后 耐 药 细 胞 株 生 存 率 较 沉 默 基 因 前 明 显 减 少 由 此 进 一 步 表 明 SGC 7901/TAX 对 TAX 耐 药 与 TAX 诱 导 Bcl 2 的 表 达 增 加 有 关 Bcl 2 基 因 家 族 是 线 粒 体 凋 亡 途 径 中 的 重 要 凋 亡 调 节 蛋 白 [6], 分 为 两 类, 一 类 为 抗 凋 亡 成 员 位 于 内 质 网 线 粒 体 膜 和 核 膜 等 处, 包 括 Bcl 2 Bcl xl mcl 1 均 含 有 3~4 个 BH 结 构 域 ; 另 一 类 为 促 凋 亡 成 员 : 正 常 时 存 在 于 胞 质 或 者 细 胞 骨 架 中, 包 括 Bim Bid Bax Bad 等 Bcl 2 蛋 白 最 早 在 人 类 滤 泡 样 的 B 细 胞 淋 巴 瘤 中 由 染 色 体 [t(14:18)(q32:q21)] 易 位 的 断 裂 点 克 隆 发 现 [7], 已 知 Bcl 2 主 要 通 过 阻 止 凋 亡 而 促 进 细 图 6 沉 默 Bcl 2 基 因 后,TAX 诱 导 SGC 7901/TAX 的 凋 亡 率 A: 空 白 对 照 组 ;B: 阴 性 对 照 组 ;C:Bcl 2 SiRNA1 组 ;D:Bcl 2 SiRNA2 组 ;E:Bcl 2 SiRNA3 组

26 1052 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 胞 存 活 Bcl 2 定 位 于 细 胞 核 膜 内 质 网 和 线 粒 体 外 膜 上 Bcl 2 通 过 BH3 结 构 域 与 同 家 族 的 促 凋 亡 分 [8] 子 如 Bax 形 成 异 源 二 聚 体, 有 研 究 显 示 当 肿 瘤 细 胞 受 到 凋 亡 诱 导 因 子 的 刺 激 后 是 否 存 活 取 决 于 Bcl 2/Bax 的 比 率, 当 Bax 增 加 时, 形 成 Bax/Bax 同 二 聚 体, 加 速 细 胞 凋 亡, 当 Bcl 2 表 达 增 加 时, 形 成 Bcl 2/ Bax 异 二 聚 体, 抑 制 Bax/Bax 同 二 聚 体 诱 导 的 凋 亡, 但 这 些 复 合 物 凋 亡 调 节 的 具 体 机 制 尚 不 清 楚 研 [9] 究 显 示 将 Bcl 2 转 染 到 乳 腺 癌 细 胞 中, 转 染 Bcl 2 的 细 胞 在 相 同 化 疗 药 物 的 作 用 下 凋 亡 率 明 显 减 低 了 Konoplevaetal [10] 将 Bcl 2 反 义 寡 核 苷 酸 导 入 白 血 病 细 胞 中, 抑 制 其 Bcl 2 表 达, 发 现 转 染 后 细 胞 的 凋 亡 率 明 显 减 低, 并 且 对 多 种 化 疗 药 物 的 敏 感 性 升 高 Hanetal [11] 将 Bcl 2 的 小 干 扰 RNA 转 染 入 耐 TAX 的 肺 癌 细 胞 后, 细 胞 凋 亡 率 较 转 染 前 明 显 提 高 了 这 都 与 该 实 验 结 果 相 符 合 因 此, 对 反 义 Bcl 2 寡 核 苷 酸 或 其 反 义 表 达 质 粒 的 体 内 外 抗 肿 瘤 作 用 研 究 有 重 要 意 义, 可 能 成 为 未 来 逆 转 肿 瘤 耐 药 治 疗 的 新 靶 点 新 思 路 参 考 文 献 [2] ChenH,LandenCN,LiY,etal.Epigalocatechingalateand sulforaphanecombinationtreatmentinduceapoptosisinpaclitaxel resistantovariancancercelsthroughhtertandbcl 2down regu lation[j].expcelres,2013,319(5): [4] FangW S,LiangXT.Recentprogresinstructureactivityrela tionshipandmechanisticstudiesoftaxolanalogues[j].minirev MedChem,2005,5(1):1-12. [5] LoHW,Ali OsmanF.Geneticpolymorphismandfunctionofglu tathiones transferasesintumordrugresistance[j].curopin Pharmacol,2007,7(4): [6] ThomasS,QuinnBA,DasSK,etal.TargetingtheBcl 2family forcancertherapy[j].expertopinthertargets,2013,17(1): [7] ZinkelS,GrosA,YangE.Bcl 2familyinDNAdamageandcel cyclecontrol[j].celdeathdifer,2006,13(8): [9] AggarwalH,LubanaPS,JainDK,etal.EstimationofBcl 2 proteinincarcinomaofthebreastanditsclinicalcorelationinlo calyadvancedbreastcancer[j].jcancerresther,2007,3 (4): [10]KonoplevaM,TariAM,EstrovZ,etal.LiposomalBcl 2anti senseoligonueleotidesenhanceproliferation,sensitizeacutemye loidleukemiatocytosine arabinoside,andinduceapoptosisinde pendentofotherantiapoptoticproteins[j].blood,2000,95 (12): [1] GaletiE,MagnaniM,RenzuliM L,etal.Paclitaxelanddo cetaxelresistance:molecularmechanismsanddevelopmentofnew generationtaxanes[j].chem MedChem,2007,2(7): [3] ZhouJ,ZhaoW Y,MaX,etal.Theanticancereficacyofpacli taxelliposomesmodifiedwithmitochondrialtargetingconjugatein resistantlungcancer[j].biomaterials,2013,34(14): [8] HansenPJ,FearJM.Cheatingdeathatthedawnoflife:devel opmentalcontrolofapoptoticrepresioninthepreimplantationem bryo[j].biochembiophysrescommun,2011,413(2): [11]HanZX,WangHM,JiangG,etal.Overcomingpaclitaxelre sistanceinlungcancercelsviadualinhibitionofstathminand bcl 2[J].CancerBiotherRadiopharm,2013,28(5): TheroleofBcl 2inpaclitaxel resistantgastricadenocarcinomacels ZhangLi,HuWanglai,WangJiayu,etal (DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective ToinvestigatetheroleofBcl 2inpaclitaxel resistantgastricadenocarcinomacels.methods Thepaclitaxel resistantcellinesgc 7901/TAXwasestablishedbyincreasingdrugconcentrationgradientand continuinginduction.thediferenceofapoptosisratewasmeasuredbyflowcytometryusingpropidiumiodidestai ning.mttcolorimetricdetectedcelsurvivalrate.theproteinexpresionlevelsofbcl 2,mcl 1,Bax,Bcl xlwere detectedbywesternblot.theexpresionofbcl 2mRNAlevelintheresistantcellinewasmonitoredbyRT PCR. SilencingofgeneBcl 2expresionwasaccomplishedbysmalinterferingRNAtechniques.Results Paclitaxel in ducedapoptosisingastricadenocarcinomacelswasinatimeanddose dependentmanner.drug resistantgastric adenocarcinomacellinewasnotsensitivetopaclitaxelinducedapoptosis.theup regulationofbcl 2proteinlevel wasobviousinthedrug resistantcelline,andbcl 2mRNAlevelwasalsofoundtobeupregulatedbysemi quan titativepcr.inhibitingbcl 2expresionbySiRNAinresistantgastricadenocarcinomacellineincreasedthecel apoptosis.conclusion Bcl 2upregulationplaysanimportantroleingastricadenocarcinomacelsresistanttopa clitaxelinducedapoptosis. Keywords gastricadenocarcinoma;paclitaxel;celapoptosis;tumordrug resistance;bcl 2

27 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1053 细 胞 自 噬 在 褪 黑 素 诱 导 的 肝 癌 细 胞 株 HepG2 死 亡 中 的 作 用 范 文 洁, 贾 振 亚, 曹 静, 徐 癑, 范 璐 璐, 孙 国 平 摘 要 目 的 研 究 褪 黑 素 (MT) 对 人 肝 癌 HepG2 细 胞 自 噬 功 能 的 影 响, 并 初 步 探 讨 自 噬 在 MT 诱 导 细 胞 死 亡 中 的 作 用 方 法 体 外 培 养 肝 癌 细 胞 株 HepG2, 用 不 同 浓 度 的 MT ( mol/l) 作 用 于 HepG2 细 胞,Westernblot 法 检 测 HepG2 细 胞 自 噬 相 关 蛋 白 LC3(LC3 Ⅰ /LC3 Ⅱ) 的 表 达, 并 用 单 丹 磺 酰 尸 胺 (MDC) 染 色 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 HepG2 细 胞 内 自 噬 体 形 成 情 况 ; 在 给 予 MT 的 同 时 使 用 3 甲 基 腺 嘌 呤 (3 MA) 或 氯 喹 (CQ) 对 细 胞 自 噬 进 行 抑 制, 利 用 MTT 和 Westernblot 法 分 别 测 定 HepG2 细 胞 的 细 胞 活 力 和 LC3 蛋 白 的 表 达 变 化 结 果 MT 作 用 后 可 诱 导 HepG2 细 胞 内 自 噬 小 体 形 成, 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 Ⅱ 表 达 增 多 且 呈 剂 量 依 赖 关 系 MT 作 用 后,HepG2 细 胞 生 长 受 到 抑 制, 加 入 3 MA 或 CQ 抑 制 自 噬 后, 细 胞 生 长 受 抑 现 象 更 加 显 著 MT+3 MA 组 LC3 Ⅱ /β actin 比 值 较 MT 单 药 组 明 显 减 小,MT +CQ 组 则 比 值 增 大 结 论 MT 可 激 活 肝 癌 细 胞 HepG2 保 护 性 自 噬 反 应, 通 过 3 MA 或 CQ 阻 断 MT 诱 导 的 自 噬 通 路 可 显 著 增 强 MT 对 HepG2 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用, 提 示 自 噬 可 能 是 肝 癌 细 胞 HepG2 逃 避 MT 肿 瘤 杀 伤 作 用 的 一 种 有 效 机 制 关 键 词 肝 癌 ; 自 噬 ; 褪 黑 素 ; 细 胞 增 殖 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 褪 黑 素 (melatonin,mt) 是 一 种 主 要 由 松 果 腺 合 成 并 分 泌 的 吲 哚 类 化 合 物, 具 有 调 节 生 理 节 奏 抗 氧 化 抗 炎 免 疫 调 节 等 多 种 功 能 [1] [2] 研 究 表 明 MT 还 具 有 抗 肿 瘤 和 化 学 预 防 作 用, 动 物 实 验 及 临 床 试 [3] 验 均 表 明,MT 能 有 效 抑 制 肝 癌 乳 腺 癌 肺 癌 前 列 腺 癌 等 多 种 肿 瘤 增 殖 自 噬 是 细 胞 面 对 饥 饿 等 环 境 压 力 下 的 一 种 生 存 机 制, 目 前 对 于 MT 与 自 噬 的 [4-5] 关 系 尚 不 明 确 多 数 研 究 表 明 MT 可 抑 制 自 噬 通 路 且 这 种 作 用 常 与 其 抗 氧 化 活 性 直 接 相 关 ; 但 Liuetal [6] 则 发 现 在 小 鼠 肝 癌 H22 细 胞 中,MT 可 通 过 减 少 mtor 和 Akt 信 号 蛋 白 表 达 从 而 诱 发 自 噬 过 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 内 科, 合 肥 作 者 简 介 : 范 文 洁, 女, 硕 士 研 究 生 ; 孙 国 平, 男, 教 授, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 程 但 是 在 人 类 肝 癌 细 胞 中,MT 是 否 在 细 胞 自 噬 诱 导 的 肿 瘤 抑 制 机 制 或 细 胞 保 护 机 制 中 发 挥 作 用 尚 不 明 确 因 此, 该 研 究 旨 在 明 确 MT 在 肝 癌 治 疗 中 能 否 诱 导 自 噬 产 生, 并 对 自 噬 在 MT 杀 伤 肿 瘤 细 胞 中 的 作 用 进 行 初 步 探 讨 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 细 胞 株 HepG2 肝 癌 细 胞 株 购 自 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 院 细 胞 库, 培 养 于 含 10% 胎 牛 血 清 DMEM 培 养 液 中, 置 于 37 5% CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养, 隔 天 换 液, 融 合 度 达 80% 时 传 代 主 要 试 剂 MT LC3 兔 抗 多 克 隆 抗 体 3 甲 基 腺 嘌 呤 (3 methyladenine,3 MA) 氯 喹 (chloro quine,cq) 单 丹 磺 酰 尸 胺 (monodansylcadaverin, MDC) 染 料 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 ;β actin 鼠 抗 多 克 隆 抗 体 山 羊 抗 兔 二 抗 山 羊 抗 小 鼠 二 抗 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 1.2 方 法 Westernblot 法 检 测 细 胞 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 的 表 达 取 对 数 生 长 期 的 HepG2 细 胞, 用 0 1% 胰 蛋 白 酶 消 化 以 每 孔 个 细 胞 密 度 接 种 于 6 孔 板 中, 培 养 24h 待 细 胞 贴 壁 后 进 行 药 物 干 预 选 用 不 同 浓 度 梯 度 的 MT 溶 液 ( mol/ L, 生 理 浓 度 约 10-9 mol/l) 作 用 于 HepG2 细 胞, 以 只 加 培 养 液 的 HepG2 细 胞 为 对 照 组 24h 后 收 集 细 胞, 冷 PBS 洗 2 次, 每 孔 加 蛋 白 裂 解 液 150μl, 冰 上 裂 解 30min, 然 后 r/min 离 心 15 min, 取 上 清 液,BCA 法 定 量, 取 20μg 蛋 白 进 行 Westernblot 实 验 :12 5%SDS PAGE 电 泳, 转 膜,5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2h,4 一 抗 孵 育 过 夜, 加 入 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 二 抗, 最 后 加 入 电 化 学 发 光 试 剂 ( 美 国 Pierce 公 司 ), 采 用 ImageQuant TM LAS 4000 型 发 光 成 像 系 统 显 像 MDC 染 色 法 观 察 自 噬 体 的 形 成 细 胞 发 生 自 噬 形 成 的 自 噬 体 为 酸 性, 故 弱 碱 性 的 荧 光 染 料 MDC 被 细 胞 吸 收 后 可 选 择 性 的 浓 聚 于 自 噬 体, 可 用 于 显 示 自 噬 体 的 形 成 及 自 噬 体 的 数 量 [7] 将 预 先 消 毒 的 盖 玻 片 (24mm 24mm) 放 置 于 培 养 皿 内,

28 1054 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 接 种 对 数 生 长 期 的 HepG2 细 胞 于 盖 玻 片 上 制 成 细 胞 爬 片, 待 细 胞 贴 壁 后 进 行 药 物 干 预 实 验 分 为 空 白 组 雷 帕 霉 素 (1μg/ml) 组 ( 阳 性 对 照 ) MT 组 (10-5 mol/l),24h 后 用 0.05mmol/LMDC 于 37 避 光 孵 育 30min 后, 取 出 爬 片 置 于 载 玻 片 上, 立 即 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 进 行 观 察 MTT 法 检 测 自 噬 抑 制 剂 对 MT 抗 肿 瘤 作 用 的 影 响 调 整 细 胞 密 度 为 /ml, 接 种 于 96 孔 板, 每 孔 200μl, 待 细 胞 贴 壁 后 分 别 加 入 自 噬 抑 制 剂 3 MA(2mmol/L) 和 CQ(5μg/ml) 预 处 理 细 胞 1 h, 然 后 加 入 不 同 质 量 浓 度 的 MT( mol/l) 共 同 培 养 24h 后, 进 行 MTT 法 检 测 实 验 分 为 MT 单 药 组 MT+3 MA 联 合 用 药 组 MT+CQ 联 合 用 药 组, 以 只 加 培 养 液 的 孔 为 空 白 组 每 组 设 3 个 复 孔, 加 药 后 培 养 24h, 每 孔 加 入 MTT 溶 液 (5 g/l)20μl,37 继 续 孵 育 4h 后 吸 出 各 孔 培 养 液, 每 孔 加 入 DMSO150μl, 用 酶 标 仪 在 490nm 波 长 下 测 定 各 孔 吸 光 度 (opticaldensity,od) 值, 并 计 算 细 胞 存 活 率 存 活 率 (%)=(OD 实 验 组 -OD 空 白 组 )/ (OD 对 照 组 -OD 空 白 组 ) 100% 自 噬 抑 制 剂 对 LC 3 蛋 白 表 达 的 影 响 HepG2 细 胞 贴 壁 生 长 后, 加 入 药 物 处 理, 实 验 分 为 : MT( mol/l) 单 药 组 MT( mol/l)+3 MA(2mmol/L) 联 合 用 药 组,MT( mol/l)+ CQ(5μg/ml) 联 合 用 药 组, 作 用 24h 后 收 集 细 胞 至 1 5ml 离 心 管 中, 行 Westernblot 检 测, 检 测 方 法 同 统 计 学 处 理 应 用 SPSS13 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 t 检 验, 多 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 图 1 Westernblot 检 测 不 同 浓 度 MT 对 HepG2 细 胞 中 自 噬 相 关 蛋 白 LC3(LC3 Ⅰ 和 LC3 Ⅱ) 表 达 的 影 响 1: 空 白 组 ;2:MT10-7 mol/l 组 ;3:MT10-5 mol/l 组 ;4:MT 10-3 mol/l 组 ; 与 空 白 组 比 较 : P<0.05 与 雷 帕 霉 素 处 理 结 果 相 似, 见 图 2 形 态 学 上 出 现 自 噬 体 的 增 多 是 证 实 自 噬 发 生 的 最 基 本 的 条 件, 因 此 上 述 结 果 提 示,MT 确 实 可 以 诱 导 HepG2 细 胞 自 噬 的 产 生 2 结 果 2.1 MT 对 HepG2 细 胞 自 噬 功 能 的 影 响 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 的 表 达 水 平 Western blot 检 测 显 示, 与 对 照 组 比 较, 经 不 同 浓 度 MT ( mol/l) 处 理 24h 后,HepG2 细 胞 LC3 Ⅱ 蛋 白 表 达 量 均 明 显 增 高,LC3 Ⅱ /β actin 吸 光 度 比 值 随 MT 浓 度 增 加 呈 现 出 递 增 趋 势 (F= ,P<0 05), 见 图 1, 提 示 MT 可 诱 导 HepG2 细 胞 自 噬 体 形 成, 并 呈 现 出 剂 量 依 赖 关 系 MDC 荧 光 染 色 检 测 自 噬 水 平 改 变 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 结 果 显 示, 与 对 照 组 比 较, 经 MT (10-5 mol/l) 处 理 后 有 大 量 绿 色 荧 光 小 点 即 自 噬 小 体 散 在 分 布 于 细 胞 膜 附 近, 且 数 量 明 显 多 于 对 照 组, 图 2 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 检 测 MT 处 理 后 HepG2 细 胞 内 自 噬 发 生 增 多 600 A: 空 白 组 ;B: 雷 帕 霉 素 组 ; C:MT10-5 mol/l 组 2.2 抑 制 细 胞 自 噬 能 增 强 MT 对 HepG2 细 胞 的 生 长 抑 制 MTT 检 测 结 果 显 示, 与 对 照 组 相 比,MT ( 和 10-3 mol/l) 单 药 处 理 HepG2 细 胞 24h 后 的 细 胞 活 力 均 被 抑 制 (F =49 271,P <

29 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) ), 加 入 自 噬 抑 制 剂 3 MA(2mmol/L 预 处 理 1 h) 或 CQ(5μg/ml 预 处 理 1h) 后, 联 合 用 药 组 的 细 胞 存 活 率 均 较 MT 单 药 组 明 显 下 降 (F=39 682,F =68 794,P<0 05), 见 图 3 LC3 -Ⅱ /β-actin LC3-Ⅰ LC3-Ⅱ β-actin * * * 图 3 自 噬 抑 制 剂 3 MA 或 CQ 与 MT 联 合 作 用 对 HepG2 细 胞 存 活 率 的 影 响 与 空 白 组 比 较 : P<0 05; 与 MT 组 比 较 : P< 抑 制 自 噬 后 自 噬 相 关 蛋 白 LC3 的 表 达 水 平 检 测 10-5 mol/lmt 治 疗 组 HepG2 细 胞 LC3 Ⅱ 表 达 量 高 于 对 照 组, 而 2mmol/L3 MA 和 10-5 mol/lmt 联 合 干 预 后 HepG2 细 胞 LC3 Ⅱ 表 达 量 低 于 MT 单 药 组, 而 经 过 10-5 mol/lmt 和 5μg/mlCQ 联 合 干 预 后 LC3 Ⅱ 表 达 量 高 于 MT 单 药 组, 见 图 4 以 上 结 果 提 示,3 MA 可 抑 制 HepG2 细 胞 自 噬 体 的 形 成, CQ 则 可 在 溶 酶 体 水 平 阻 断 HepG2 细 胞 自 噬 体 的 降 解, 这 也 从 另 一 个 方 面 显 示 MT 作 用 下 HepG2 细 胞 自 噬 体 增 多 的 现 象 的 确 是 自 噬 机 制 被 激 活 的 结 果, 而 非 自 噬 降 解 通 路 被 抑 制 所 造 成 的 假 象 3 讨 论 自 噬 是 广 泛 存 在 于 真 核 细 胞 中 的 一 种 生 命 现 象, 是 一 种 高 度 保 守 的 细 胞 行 为, 与 细 胞 的 生 长 增 [8] 殖 及 肿 瘤 的 发 生 过 程 关 系 密 切 研 究 表 明 自 噬 在 肿 瘤 中 具 有 双 重 作 用, 既 可 以 作 为 一 种 防 御 机 制 来 抵 御 环 境 变 化 对 细 胞 造 成 的 损 伤, 同 时 亦 可 作 为 一 种 Ⅱ 型 细 胞 死 亡 程 序 诱 导 细 胞 主 动 性 死 亡, 因 此 不 同 条 件 下 自 噬 在 肿 瘤 中 的 作 用 主 要 取 决 于 细 胞 状 态 以 及 所 处 的 具 体 环 境 LC3 是 哺 乳 动 物 细 胞 中 酵 母 ATG8 基 因 的 同 源 物, 现 已 作 为 自 噬 的 特 异 性 标 志 蛋 白 [9], 自 噬 发 生 时 LC3 由 胞 质 型 ( 即 LC3 Ⅰ) 转 位 到 自 噬 体 膜 (LC3 Ⅱ) 增 加, 因 此 LC3 Ⅰ 向 LC3 Ⅱ 的 转 变 代 表 图 4 抑 制 自 噬 后 自 噬 相 关 蛋 白 LC3(LC3 Ⅰ /LC3 Ⅱ) 的 表 达 水 平 1: 空 白 组 ;2:MT(10-5 mol/l) 组 ;3:3 MA(2mmol/L) 组 ;4: MT(10-5 mol/l)+3 MA(2mmol/L) 组 ;5:CQ(5μg/ml) 组 ;6:MT (10-5 mol/l)+cq(5μg/ml) 组 ; 与 空 白 组 比 较 : P<0 05; 与 MT (10-5 mol/l) 组 比 较 : Δ P<0 05 了 自 噬 的 诱 导, 但 LC3 Ⅰ 相 对 不 稳 定, 易 受 环 境 及 实 验 条 件 等 多 种 因 素 的 影 响, 且 对 抗 体 的 亲 和 力 要 低 于 LC3 Ⅱ, 因 此 多 数 研 究 将 LC3 Ⅱ 作 为 自 噬 检 测 指 标 [10-11] 本 研 究 采 用 Westernblot 检 测 显 示, 经 MT 处 理 后,HepG2 细 胞 的 LC3 Ⅱ /β actin 的 比 值 明 显 增 高, 且 呈 剂 量 依 赖 关 系, 表 明 MT 可 诱 导 HepG2 细 胞 自 噬 发 生 3 MA 是 一 种 核 苷 派 生 物, 能 促 进 溶 酶 体 碱 化, 导 致 自 噬 体 不 能 与 溶 酶 体 融 合 而 抑 制 自 噬 小 体 的 形 成 [12] CQ 则 作 为 一 种 溶 酶 体 抑 制 剂, 可 在 自 噬 性 降 解 通 路 的 下 游 溶 酶 体 水 平 来 抑 制 自 噬 [13] 本 研 究 显 示 将 二 者 分 别 加 入 HepG2 细 胞 均 可 抑 制 MT 引 起 的 自 噬 反 应, 且 可 使 MT 刺 激 后 的 HepG2 细 胞 存 活 率 较 MT 单 独 作 用 明 显 下 降, 提 示 抑 制 自 噬 可 能 会 提 高 肝 癌 细 胞 HepG2 对 MT 的 敏 感 性 由 此 推 测 抗 癌 药 物 治 疗 过 程 中 诱 导 产 生 的 自 噬 体 可 能 是 肝 癌 细 胞 逃 避 化 疗 药 物 环 境 从 而 逃 避 死 亡 的 一 种 有 效 机 制 ; 在 化 疗 过 程 中 加 用 自 噬 抑 制 剂 以 抑 制 自 噬 反 应 可 降 低 肿 瘤 细 胞 对 受 损 细 胞 器 的 清 除 能 力, 从 而 增 加 肿 瘤 细 胞 死 亡 率, 增 强 化 疗 疗 效 但 关 于 自 噬 在 MT 杀 伤 肝 癌 细 胞 中 所 起 的 具 体 作 用 及 分 子 机 制 尚 有 待 进 一 步 研 究 阐 明 参 考 文 献 [1] ReiterRJ,ParedesSD,ManchesterLC,etal.Reducingoxida tive/nitrosativestres:anewly discoveredgenreformelatonin[j]. CritRevBiochemMolBiol,2009,44(4): [2] LenoirV,deJonage CanonicoM B,PerinM H,etal.Preventive

30 1056 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) andcurativeefectofmelatoninonmammarycarcinogenesisin ducedbydimethylbenz[a]anthraceneinthefemalesprague Daw leyrat[j].breastcancerres,2005,7(4):r [3] Leja SzpakA,JaworekJ,PierzchalskiP,etal.Melatonininduces pro apoptoticsignalingpathwayinhumanpancreaticcarcinoma cels(panc 1)[J].JPinealRes,2010,49(3): [4] NopparatC,PorterJE,EbadiM,etal.Themechanism forthe neuroprotectiveefectofmelatoninagainstmethamphetamine in ducedautophagy[j].jpinealres,2010,49(4): [5] KohPO.Melatoninpreventsischemicbraininjurythroughactiva tionofthemtor/p70s6kinasesignalingpathway[j].neurosci Let,2008,444(1):74-8. [6] LiuC,JiaZ,ZhangX,etal.Involvementofmelatonininautoph agy mediatedmousehepatomah22celsurvival[j].intimmuno pharmacol,2012,12(2): [7] BiederbickA,KernH F,Els serh P.Monodansylcadaverine (MDC)isaspecificinvivomarkerforautophagicvacuoles[J]. EurJCelBiol,1995,66(1):3-14. [8] YuYX,GuZL,QinZH,etal.Theroleofautophagyinpharma cologicalactionsofanticancerdrugs[j].chinpharmacolbul, 2006,22(2): [9] SlobodkinM R,ElazarZ.TheAtg8family:multifunctionalubiq uitin likekeyregulatorsofautophagy[j].esaysbiochem,2013, 55: [10] RubinszteinDC,CuervoAM,RavikumarB,etal.Insearchofan autophagomometer [J].Autophagy,2009,5(5): [11] KlionskyDJ,AbdalaFC,AbeliovichH,etal.Guidelinesforthe useandinterpretationofasaysformonitoringautophagyinhigher eukaryotes[j].autophagy,2008,4(2): [12]WuY,WangX,GuoH,etal.Synthesisandscreeningof3 MAde rivativesforautophagyinhibitors[j].autophagy,2013,9(4): [13]EggerME,HuangJS,YinW.Inhibitionofautophagywithchloro quineisefectiveinmelanoma[j].jsurgres,2013,184(1): Theroleofautophagyinhumanhepatocarcinomacel linehepg2inducedbymelatonin FanWenjie,JiaZhenya,CaoJing,etal (DeptofMedicalOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective ToinvestigatethechangeinfunctionofautophagyinhepatocarcinomacellineHepG2in ducedbymelatonin(mt),andtoexploretheroleofautophagyinmt inducedceldeath.methods Hepatocarci nomacancercellinehepg2wastreatedwithdiferentconcentrationsofmt(10-7,10-5,10-3 mol/l).theex presionofautophagy relatedproteinlc3(lc3 Ⅰ /LC3 Ⅱ)duringMT inducedceldeathwasanalysedbywestern blotasay,autophgosomesandautolysosomesinhepg2celsweredetectedbymonodansylcadaverin(mdc)staining underlaserscanningconfocalmicroscope(lscm).theviabilityofhepg2celswasexaminedbymttasayafter treatedeitherwithdiferentconcentrationsofmtaloneorincombinationwiththeautophagyinhibitor3 methylade nine(3 MA)orchloroquine(CQ).TheexpresionofLC3inMT treatedhepg2celswasanalysedbywesternblot asaybeforeandafter3 MAorCQtreatment.Results WesternblotasaydemonstratedthatMTcoulddose de pendentlyincreasedlc3 Ⅱ expresion,andtheformationofautophagosomesinhepg2celsaftermttreatment couldbeobservedunderlscm.comparedwiththecontrolgroup,mttreatmentsignificantlyinhibitedcelgrowth whichwasfurtherenhancedbycombineduseofautolysosomeinhibitor3 MAorCQ,theratioofLC3 Ⅱ /β actin wasdecreasedmarkedlyafter3 MAtreatment,whileafterCQtreatment,theratioofLC3 Ⅱ /β actinwasincreased markedly.conclusion MTcanenhancethefunctionofautophagyinHepG2celsandinduceanincreasedforma tionofautophagosomes.theautolysosomeinhibitor3 MAorCQcansignificantlyenhancetheefectofMT induced proliferativeinhibitioninhepg2celsbyblockingmt inducedautophagypathway,indicatingautophagyislikelyto beamechanismforhepg2celstoavoidmt inducedceldeath. Keywords liverneoplasms;autophagy;melatonin;celproliferation

31 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1057 PPARα 激 活 可 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 大 鼠 肝 损 伤 王 莉, 宋 育 林, 何 雪 摘 要 目 的 观 察 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 α (PPARα) 激 动 剂 (WY14643) 对 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 肝 损 伤 及 其 脂 质 过 氧 化 PPARαmRNA 胆 盐 输 出 泵 (Bsep)mR NA 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α)mrna 表 达 的 影 响 方 法 48 只 SD 雄 性 大 鼠 随 机 分 为 3 组, 每 组 16 只 正 常 对 照 组 : 等 量 溶 剂 空 腹 灌 胃 处 理 ; 模 型 组 : 异 烟 肼 + 利 福 平 各 50mg/ (kg d) 空 腹 灌 胃 处 理 ;WY14643 干 预 组 : 异 烟 肼 + 利 福 平 处 理 同 模 型 组, 同 时 腹 腔 内 注 射 WY146431mg/(kg d) 正 常 对 照 组 和 模 型 组 也 同 时 腹 腔 内 注 射 等 量 溶 剂 于 实 验 2 周 和 4 周 分 批 处 死 大 鼠, 检 测 大 鼠 血 清 肝 生 化 指 标 肝 组 织 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 丙 二 醛 (MDA), 观 察 其 肝 脏 病 理 学 改 变, 并 采 用 RT PCR 法 检 测 PPARα Bsep TNF αmrna 的 表 达 结 果 1 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 血 清 总 胆 汁 酸 (TBA) 总 胆 红 素 (TBIL) 直 接 胆 红 素 (DBIL) 碱 性 磷 酸 酶 (ALP) 升 高, 肝 组 织 MDA 升 高, 肝 组 织 SOD 减 少 (P< 0 05); 肝 组 织 病 理 见 肝 细 胞 变 性 坏 死 及 炎 细 胞 浸 润 ; 肝 PPARα BsepmRNA 表 达 明 显 降 低,TNF αmrna 表 达 明 显 升 高 (P<0 01) 2 与 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 肝 组 织 SOD 增 加,MDA 降 低 (P<0 05), 肝 脏 病 理 学 改 善, 肝 PPARα BsepmRNA 表 达 明 显 升 高,TNF αmrna 表 达 明 显 降 低 (P<0 01) 与 2 周 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 血 清 TBA TBIL DBIL 降 低 (P<0 05), 与 4 周 模 型 组 比 较, WY14643 干 预 组 血 清 TBA 降 低 (P<0 05) 结 论 PPARα 激 活 可 通 过 抗 氧 化 调 节 PPARα Bsep 和 TNF αmrna 表 达, 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 大 鼠 肝 损 伤 关 键 词 TNF α; 大 鼠 PPARα 激 动 剂 ; 肝 损 伤 ; 异 烟 肼 ; 利 福 平 ;Bsep; 中 图 分 类 号 R575.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) [1] 前 期 研 究 显 示, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 可 致 大 鼠 发 生 肝 脂 肪 变 性 炎 细 胞 浸 润 及 胆 汁 淤 积 肝 脂 肪 变 性 胆 汁 淤 积 分 别 与 脂 质 代 谢 紊 乱 胆 盐 输 出 泵 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : MH155) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 消 化 内 科, 安 徽 省 消 化 疾 病 重 点 实 验 室, 合 肥 作 者 简 介 : 王 莉, 女, 硕 士 研 究 生 ; 宋 育 林, 男, 副 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] (bilesaltexportpump,bsep) 的 表 达 量 变 化 及 功 能 缺 失 之 间 关 系 密 切, 而 Bsep 受 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tumor necrosisfactoralpha,tnf α) 的 影 响 [2] 脂 质 代 谢 Bsep TNF α 均 为 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 α (peroxisomeproliferator activatedreceptorα,pparα) 的 作 用 靶 点,PPARα 是 核 激 素 受 体 家 族 中 一 员, 其 与 维 甲 酸 X 受 体 相 互 作 用 而 诱 导 一 系 列 基 因 表 达, 其 中 包 括 脂 肪 酸 运 输 线 粒 体 脂 肪 酸 氧 化 分 解 代 谢 和 炎 症 反 应 等 相 关 基 因 [3], 还 参 与 调 解 胆 汁 酸 的 代 谢 [4] PPARα 在 利 福 平 合 用 异 烟 肼 致 大 鼠 肝 损 伤 中 的 作 用 尚 不 清 楚, 该 研 究 将 探 讨 PPARα 激 动 剂 (WY14643) 对 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 肝 损 伤 的 作 用 及 其 部 分 作 用 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 实 验 动 物 健 康 成 年 SD 大 鼠,SPF 级,48 只, 雄 性,6 周 龄, 体 重 150~180g, 由 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供 药 物 及 试 剂 WY14643 购 自 美 国 Santa CruzBiotechnology 公 司 ( 批 号 C0912); 异 烟 肼 购 自 上 海 信 谊 药 厂 有 限 公 司 ( 批 号 ); 利 福 平 购 自 上 海 延 安 药 业 有 限 公 司 ( 批 号 ); 大 鼠 血 清 生 化 检 测 试 剂 购 自 瑞 士 Roche 公 司 ; 蛋 白 测 定 试 剂 盒 丙 二 醛 (malondialdehyde,mda) 和 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxidedismutase,sod) 测 定 试 剂 盒 均 由 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 生 产 ;TRIzol RT PCR 的 试 剂 盒 DNA Marker Taq 酶 等 均 为 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 所 生 产 仪 器 和 设 备 瑞 士 RocheModularDPP 全 自 动 生 化 分 析 仪 ;SartoriusBS110S 型 电 子 分 析 天 平 ; PCR 反 应 扩 增 仪 (2720 美 国 ABI 公 司 ); 凝 胶 成 像 系 统 (FR 980A 上 海 复 日 科 技 有 限 公 司 ) 1.2 方 法 药 物 制 备 异 烟 肼 和 利 福 平 分 别 制 成 浓 度 为 30g/L 的 灌 胃 液, 异 烟 肼 直 接 溶 于 无 菌 生 理 盐 水, 利 福 平 溶 于 0.5% 羧 甲 基 纤 维 素 钠 制 备 的 混 悬 液, 此 混 悬 液 由 羧 甲 基 纤 维 素 钠 直 接 与 水 混 合 制 备

32 1058 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 而 成 [1] 造 模 及 分 组 按 照 参 考 文 献 将 大 鼠 适 应 性 喂 养 1 周 后 随 机 分 为 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组, 每 组 16 只 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 分 别 给 予 0.9% 氯 化 钠 注 射 液 10ml/(kg d) 异 烟 肼 50mg/(kg d)+ 利 福 平 50 mg/(kg d) 异 烟 肼 50mg/(kg d)+ 利 福 平 50 mg/(kg d), 每 日 1 次 定 时 空 腹 灌 胃 WY14643 干 预 组 给 予 每 日 1 次 腹 腔 注 射 WY146431mg/(kg d), 其 余 两 组 每 日 1 次 腹 腔 注 射 等 量 溶 剂 连 续 用 药 14d 后, 随 机 处 死 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 各 8 只 大 鼠, 其 余 大 鼠 继 续 上 述 处 理 至 第 28 天 标 本 采 集 大 鼠 处 死 前 隔 夜 禁 食 禁 水 12h 处 死 前 称 量 大 鼠 体 重, 水 合 氯 醛 腹 腔 麻 醉, 腹 主 动 脉 取 血, 留 取 血 清 标 本,-20 冻 存 待 测 ; 摘 取 大 鼠 肝 脏 并 称 肝 脏 湿 重, 各 组 切 取 肝 左 叶 相 同 部 位 肝 组 织, 10% 福 尔 马 林 缓 冲 液 固 定, 用 于 观 察 肝 脏 病 理 变 化, 并 留 取 适 量 肝 组 织 于 冻 存 管, 液 氮 中 储 存, 待 肝 组 织 匀 浆 制 备 及 总 RNA 提 取 观 察 指 标 及 测 定 方 法 一 般 情 况 实 验 期 间 每 3d 称 大 鼠 体 重 1 次, 并 观 察 其 生 长 情 况 精 神 状 态 生 活 习 性 变 化 毛 色 大 小 便 食 欲 对 外 界 刺 激 的 反 应 情 况 血 清 生 化 指 标 全 自 动 生 化 分 析 仪 检 测 各 组 大 鼠 血 清 总 胆 汁 酸 (totalbiliaryacid,tba) 总 胆 红 素 (totalbilirubin,tbil) 直 接 胆 红 素 (direct bilirubin,dbil) 谷 草 转 氨 酶 (aspartatetransami nase,ast) 谷 丙 转 氨 酶 (alaninetraminitransperase, ALT) 碱 性 磷 酸 酶 (alkalinephosphatase,alp) 肝 组 织 匀 浆 SOD MDA 的 测 定 采 用 考 马 斯 亮 蓝 法 测 定 肝 组 织 蛋 白 浓 度, 采 用 羟 胺 法 测 定 SOD 活 力, 采 用 硫 代 巴 比 妥 酸 法 测 定 MDA 含 量 具 体 实 验 步 骤 参 考 说 明 书 进 行 肝 脏 病 理 组 织 学 检 查 10% 福 尔 马 林 缓 冲 液 固 定 的 肝 脏 组 织, 常 规 脱 水, 石 蜡 包 埋 切 片 HE 染 色 在 光 学 显 微 镜 下 观 察 肝 组 织 病 理 学 改 变 大 鼠 肝 组 织 PPARα Bsep TNF αmrna 的 测 定 取 50~100mg 组 织 液 氮 研 磨 至 粉 末 状, 置 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 1mlTRIzol 充 分 匀 浆, 氯 仿 提 取, 异 丙 醇 沉 淀, 加 入 适 量 的 无 Rnase 水 溶 解, 电 泳 检 测 RNA 结 果, 将 总 RNA 反 转 录 成 cdna 后 进 行 扩 增 PCR 反 应 条 件 如 下 :95 预 变 性 3min,94 变 性 30s,56 退 火 30s,72 延 伸 90s, 共 35 个 循 环 循 环 结 束, 最 后 72 延 伸 8min, 降 至 4 结 束 反 应, 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成, 引 物 序 列 :β actin: 上 游 5 CGTAAAGACCTCTATGC CAACA 3, 下 游 5 CGGACTCATCGTACTCCTGCT 3 ;PPARα: 上 游 5 AGGCTATCCCAGGCTTTGC 3, 下 游 5 GCGTCTGACTCGGTCTTCTTG 3 ;TNF α: 上 游 5 GTCGTAGCAAACCACCAAGC 3, 下 游 5 TCA CAGAGCAATGACTCCAAAG 3 ;Bsep: 上 游 5 GCA CAGTTGCTGGGATTGG 3, 下 游 5 TTGGCATAGCT CGGAGTATAAGA 3 将 5μl 的 PCR 产 物 在 2% 琼 脂 糖 凝 胶 中 电 泳 后 再 用 凝 胶 成 像 系 统 摄 影 比 较 目 的 基 因 与 β actin 条 带 的 灰 度 值, 分 析 目 的 基 因 的 表 达 水 平 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS16 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示 多 组 间 定 量 资 料 比 较 采 用 方 差 分 析, 组 内 两 两 比 较 采 用 SNK 和 LSD 检 验 2 结 果 2.1 一 般 情 况 正 常 对 照 组 大 鼠 精 神 状 态 食 欲 较 好, 毛 色 光 泽 尚 可, 无 黄 染, 对 外 界 刺 激 反 应 较 灵 敏 模 型 组 大 鼠 精 神 状 态 较 差, 对 外 界 刺 激 反 应 迟 钝, 食 欲 减 退, 毛 色 无 光 泽, 脚 掌 及 尾 部 呈 明 显 橘 红 色, 小 便 及 大 便 颜 色 呈 橘 红 色 WY14643 干 预 组 大 鼠 精 神 状 态 稍 差, 但 较 模 型 组 佳, 食 欲 稍 减 退, 毛 色 光 泽 稍 差, 脚 掌 及 尾 部 呈 橘 红 色, 小 便 及 大 便 颜 色 呈 橘 红 染, 但 颜 色 较 模 型 组 清 亮 2.2 血 清 生 化 指 标 变 化 方 差 分 析 结 果 显 示 2 周 TBA TBIL DBIL ALP ALT AST 水 平 及 4 周 TBA TBIL DBIL ALP ALT AST 水 平 F 值 分 别 为 ; 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 大 鼠 血 清 TBA TBIL DBIL ALP 明 显 升 高 (P<0 05),ALT AST 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 与 2 周 模 型 组 比 较,2 周 WY14643 干 预 组 大 鼠 血 清 TBA TBIL DBIL 明 显 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P<0 05),ALT AST ALP 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05); 与 4 周 模 型 组 比 较,4 周 WY14643 干 预 组 大 鼠 血 清 TBA 明 显 降 低 (P<0 05),TBIL DBIL 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05),ALT AST ALP 差 异 无 统 计 学 意 义 (P >0 05) 见 表 1

33 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1059 表 1 大 鼠 血 清 生 化 指 标 变 化 (n=8, x±s) 珋 项 目 2 周 4 周 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 TBA(μmol/L) 27.45± ± ±9.79 # 21.46± ± ±7.56 # TBIL(μmol/L) 1.60± ± ±0.71 # 0.98± ± ±0.86 DBIL(μmol/L) 0.63± ± ±0.65 ## 0.21± ± ±0.71 ALT(U/L) 28.13± ± ± ± ± ±15.66 AST(U/L) ± ± ± ± ± ±26.02 ALP(U/L) ± ± ± ± ± ±10.84 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.01; 与 模 型 组 比 较 : # P<0.05, ## P<0.01 表 2 大 鼠 肝 组 织 内 MDA 含 量 SOD 活 性 变 化 (n=8, x±s) 珋 项 目 2 周 4 周 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 正 常 对 照 组 模 型 组 WY14643 干 预 组 MDA(nmol/mgprot) 1.65± ± ±0.27 # 1.65± ± ±0.35 # SOD(U/mgprot) 94.93± ± ±10.71 # 92.63± ± ±9.38 # 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.05, P<0 01; 与 模 型 组 比 较 : # P< 肝 组 织 MDA 含 量 及 SOD 活 性 变 化 方 差 分 析 结 果 显 示 2 周 MDA SOD 及 4 周 MDA SOD 的 F 值 分 别 为 ; 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 第 2 周 和 第 4 周 肝 组 织 内 MDA 升 高,SOD 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05); 与 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 第 2 周 和 第 4 周 肝 组 织 内 MDA 降 低,SOD 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0 05) 见 表 肝 脏 形 态 学 变 化 正 常 对 照 组 大 鼠 肝 脏 外 观 色 泽 暗 红, 被 膜 平 滑, 边 缘 锐 利, 切 面 光 整 ; 模 型 组 大 鼠 肝 脏 颜 色 偏 黄, 肝 脏 明 显 肿 大, 被 膜 紧 张, 边 缘 较 钝, 切 面 油 腻 ;WY14643 干 预 组 大 鼠 肝 脏 外 观 接 近 正 常, 颜 色 为 暗 红 稍 偏 黄, 肝 脏 无 明 显 肿 大, 被 膜 较 平 滑, 边 缘 较 锐 利, 切 面 较 光 整 光 镜 下, 正 常 对 照 组 大 鼠 肝 脏 肝 小 叶 结 构 完 整, 见 图 1A; 模 型 组 可 见 肝 细 胞 不 同 程 度 的 空 泡 变 性 脂 肪 变 性 较 明 显, 见 图 1B; 部 分 小 叶 内 可 见 炎 细 胞 浸 润 及 点 状 坏 死, 汇 管 区 炎 症 明 显,4 周 模 型 组 以 肝 细 胞 变 性 坏 死 及 炎 性 细 胞 浸 润 为 主, 见 图 1C;WY14643 干 预 组 大 鼠 肝 细 胞 变 性 坏 死 脂 肪 变 性 及 炎 细 胞 浸 润 与 模 型 组 比 较 均 有 所 减 轻, 见 图 1D 2.5 大 鼠 肝 组 织 PPARα Bsep TNF αmrna 表 达 方 差 分 析 结 果 显 示 2 周 及 4 周 PPARα Bsep TNF αmrna 表 达 水 平 存 在 统 计 学 差 异,F 值 分 别 为 ; 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 PPARα 及 BsepmRNA 表 达 明 显 降 低 (P<0 01) TNF αmrna 表 达 明 显 增 强 (P<0 01); 与 模 型 组 比 较,WY14643 干 预 组 图 1 各 组 大 鼠 肝 脏 病 理 学 改 变 HE 400 A: 正 常 对 照 组 ;B:2 周 模 型 组 ;C:4 周 模 型 组 ;D:4 周 WY14643 组 PPARα 及 BsepmRNA 表 达 明 显 增 强 (P<0 01) TNF αmrna 明 显 降 低 (P<0 01), 见 图 2 3 讨 论 本 实 验 结 果 显 示,SD 大 鼠 给 予 喂 养 异 烟 肼 和 利 福 平 后 表 现 出 肝 细 胞 坏 死 脂 肪 变 性 及 炎 性 细 胞 浸 润, 同 时 伴 有 血 清 TBA TBIL DBIL ALP 升 高 表 明 利 福 平 合 用 异 烟 肼 致 肝 损 伤 的 SD 大 鼠 模 型 建 立 成 功 PPARα 主 要 在 肝 细 胞 表 达, 可 通 过 调 控 相 关 基 因 表 达, 纠 正 肝 脏 脂 质 代 谢 紊 乱, 减 轻 氧 化 应 激 反 应, 抑 制 炎 症 因 子 产 生 和 释 放, 减 轻 或 阻 止 肝 组 织 损 伤 [3], 同 时 参 与 胆 汁 酸 的 合 成 转 运 及 代 谢 [4] 本 研 究 结 果 显 示, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 致 肝 损 伤 的 同 时

34 1060 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 2 各 组 大 鼠 肝 细 胞 中 PPARα Bsep TNF αmrna 的 表 达 M:Marker;1:2 周 正 常 对 照 组 ;2:2 周 模 型 组 ;3:2 周 WY14643 干 预 组 ;4:4 周 正 常 对 照 组 ;5:4 周 模 型 组 ;6:4 周 WY14643 干 预 组 ; 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.01; 与 模 型 组 比 较 : ## P<0.01 伴 有 PPARαmRNA 表 达 下 调, 而 经 过 WY14643 治 疗 激 活 PPARα 之 后, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 减 轻, 主 要 表 现 为 肝 细 胞 坏 死 及 炎 症 减 轻, 脂 肪 变 性 明 显 减 轻, 同 时 血 清 TBA TBIL DBIL ALP 降 低 这 些 结 果 表 明,PPARαmRNA 表 达 下 调 在 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 发 病 机 制 中 起 着 重 要 的 作 用, 激 活 PPARα 可 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 本 研 究 结 果 显 示 : 与 正 常 对 照 组 比 较, 模 型 组 肝 组 织 匀 浆 MDA 含 量 升 高 SOD 含 量 降 低, 与 前 期 研 [1] 究 结 果 一 致 而 给 予 WY14643 治 疗 后 肝 组 织 匀 浆 MDA 含 量 明 显 降 低 SOD 含 量 明 显 升 高, 提 示 WY14643 可 通 过 降 低 肝 组 织 的 氧 化 应 激 作 用 而 减 轻 肝 组 织 损 伤 Bsep 功 能 抑 制 是 药 物 性 肝 损 伤 的 机 制 之 一 [5] Bsep 是 一 种 ATP 结 合 盒 转 运 体, 由 ABCB11 基 因 编 码, 是 肝 细 胞 的 毛 细 胆 管 膜 上 的 胆 汁 酸 外 排 的 主 要 转 运 体, 当 Bsep 功 能 受 损, 使 胆 汁 酸 排 出 障 碍, 从 而 导 致 胆 汁 淤 积 [6-7] [8] 文 献 报 道, 利 福 平 致 肝 内 胆 汁 淤 积 的 机 制 可 能 与 其 导 致 肝 内 胆 汁 酸 转 运 体 Bsep 和 Mrp2 定 位 改 变 有 关 本 研 究 结 果 表 明, 利 福 平 合 用 异 烟 肼 可 致 大 鼠 肝 脏 BsepmRNA 表 达 下 降 Kolouchovaetal [9] 指 出, 普 伐 他 汀 通 过 增 加 BsepmRNA 的 表 达 而 减 少 胆 汁 淤 积 动 物 的 胆 汁 酸 的 血 浆 浓 度, 同 时 可 引 起 PPARαmRNA 表 达 上 调 本 实 验 WY14643 激 活 PPARα 后,BsepmRNA 的 表 达 明 显 增 加, 表 明 WY14643 可 能 通 过 促 进 Bsep mrna 的 表 达 而 改 善 肝 内 胆 汁 淤 积 WY14643 促 进 BsepmRNA 表 达 的 机 制 尚 不 清 楚 Chenetal [10] 发 现 促 炎 因 子 TNF α IL 6 等 的 表 达 可 减 少 肝 组 织 BsepmRNA 的 表 达 本 研 究 结 果 显 示 模 型 组 TNF αmrna 较 正 常 对 照 组 明 显 升 高, 而 BsepmRNA 表 达 明 显 下 降, 而 给 予 WY14643 治 疗 后,TNF α mrna 表 达 明 显 降 低, 同 时 Bsep mrna 表 达 升 高, 提 示 TNF α 在 这 一 过 程 中 可 能 起 到 至 关 重 要 的 作 用 TNF α 是 一 个 重 要 的 促 炎 因 子 和 免 疫 调 节 因 子,TNF α 可 促 进 T 细 胞 产 生 各 种 炎 症 因 子, 从 而 促 进 炎 症 反 应 的 发 生,TNF α 一 方 面 具 有 直 接 的 细 胞 毒 作 用, 引 起 肝 细 胞 坏 死, 另 一 方 面 又 可 引 起 微 循 环 障 碍 导 致 肝 细 胞 坏 死, 同 时, 还 与 其 他 炎 性 因 子 如 IL 6 相 互 激 发, 引 起 级 联 放 大 反 应, 进 一 步 加 重 肝 损 伤 [11] 本 研 究 显 示 给 予 WY14643 处 理 后, 肝 脏 TNF αmrna 的 表 达 明 显 减 少, 提 示 WY14643 可 通 过 降 低 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 引 起 的 炎 性 因 子 的 产 生, 改 善 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤 综 上 所 述,WY14643 可 减 轻 利 福 平 合 用 异 烟 肼 所 致 的 肝 损 伤, 机 制 可 能 是 WY14643 激 活 肝 细 胞 PPARα 而 降 低 肝 组 织 氧 化 应 激 上 调 BsepmRNA 表 达 下 调 TNF αmrna 的 表 达 而 起 作 用, 但 其 确 切 通 路 尚 有 待 进 一 步 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] 杨 慧 媛, 宋 育 林, 许 建 明, 等. 异 烟 肼 利 福 平 合 用 致 大 鼠 肝 损 伤 的 实 验 模 型 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2008,43(2): [2] 白 阳, 冯 义 朝.BSEP 的 调 控 及 其 突 变 与 胆 汁 淤 积 性 肝 病 的 关 系 [J]. 医 学 信 息,2013,26(2): [3] KongL,RenW,LiW,etal.Activationofperoxisomeproliferator activatedreceptoralphaamelioratesethanolinducedsteatohepatitis inmice[j].lipidshealthdis,2011,10:246. [4] ZolnerG,WagnerM,TraunerM.Nuclearreceptorsasdrugtargets incholestasisanddrug inducedhepatotoxicity[j].pharmacolt her,2010,126(3): [5] KisE,IojaE,RajnaiZ,etal.BSEPinhibition:invitroscreensto asescholestaticpotentialofdrugs[j].toxicolinvitro,2012,26 (8): [6] ZhangY,LiF,PatersonAD,etal.Abcbldeficiencyinduces cholestasiscoupledtoimpaired fatyacidoxidationinmice[j].j

35 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1061 BiolChem,2012,287(29): [7] YoshikadoT,TakadaT,YamamotoT,etal.Itraconazole induced cholestasis:involvementoftheinhibitionofbilecanalicularphos pholipidtranslocatormdr3/abcb4[j].molpharmacol,2011,79 (2): [8] 曹 云 海, 陈 熙, 张 程, 等. 利 福 平 对 小 鼠 肝 细 胞 胆 汁 酸 转 运 体 Bsep 和 Mrp2 表 达 与 定 位 的 影 响 [J]. 中 国 药 理 学 通 报, 2010,26(12): [9] KolouchovaG,BrcakovaE,HirsovaP,etal.Pravastatinmodulates liverbileacidandcholesterolhomeostasisinratswithchroniccho lestasis[j].jgastroenterolhepatol,2011,26(10): [10]ChenY,SongX,ValanejadL,etal.Bilesaltexportpumpisdys regulatedwithalteredfarnesoidx receptorisoform expresionin patientswithhepatocelularcarcinoma[j].hepatology,2013,57 (4): [11] 曾 明, 王 金 萍, 丁 媛 媛, 等. 可 舒 胶 囊 对 酒 精 性 肝 损 伤 大 鼠 血 清 中 NF κb 和 TNF α 的 影 响 [J]. 东 南 国 防 医 药,2013,15 (1):21-3. Activationofperoxisomeproliferatoractivatedreceptoralphaameliorates IsoniazidandRifampininducedliverinjuryinrats WangLi,SongYulin,HeXue (DeptofGastroenterology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity, KeyLaboratoryofDigestiveDiseaseofAnhuiProvince,Hefei ) Abstract Objective Toobservetheefectsofperoxisomeproliferator activatedreceptorα(pparα)agonist (WY14643)onIsoniazidandRifampininducedliverinjuryinrats,andexploreitsinfluenceonthelipidperoxida tionandtheexpresionofpparαmrna,bilesaltexportpump(bsep)mrna,tumornecrosisfactoralpha(tnf α)mrna.methods 48maleSDratswererandomlydividedinto3groups,16ratsforeachgroup.Normalcontrol groupwasgivenequivalentsolventoncedaily.modelgroupwasgivenintragastricadministrationofisoniazid50mg/ (kg d) +Rifampin50mg/(kg d).wy14643groupwasgivenisoniazid50mg/(kg d) +Rifampin50mg/ (kg d)byintragastricadministrationandwy146431mg/(kg d)byintraperitonealinjection.theothertwo groupsreceiveddailyintraperitonealinjectionoftheequivalentsolvent.everygroupwassacrificedrespectivelyon day14and28.theserumbiochemicalindexofliver,thehepatictisuesuperoxidedismutase(sod),malondial dehyde(mda)weremeasured.thepathologicalchangesinliverwereobserved.theexpresionofpparα,bsep, TNF αmrnawasdetectedbyrt PCR.Results 1 Comparedwithnormalcontrolgroup,serumtotalbiliaryacid (TBA),totalbilirubin(TBIL),directbilirubin(DBIL),alkalinephosphatase(ALP)inmodelgroupweresignifi cantlyelevated(p<0 05);SODwassignificantlyreduced(P<0 05),MDAwassignificantlyelevated(P< 0 05);hepatocytenecrosis,fatychange,inflammatorycelinfiltrationinratliverofmodelgroupwereobserved; theexpresionofpparα,bsepmrnawassignificantlyreduced(p<0 01),TNF αmrnaexpresionwassignif icantlyelevated(p<0 01).2 Comparedwithmodelgroup,SODwassignificantlyelevated(P<0 05).Hepatic tisuemdawassignificantlyreduced(p<0 05)inWY14643group,theliverhistologicalhadimproved.Theex presionofpparα,bsepmrnawassignificantlyelevated(p<0 01),TNF αmrnaexpresionwassignificantly reduced(p<0 01).Comparedwithmodelgroupofweek2,serum TBA,TBIL,DBILreducedinWY14643 group(p<0 05).Comparedwithmodelgroupofweek4,serum TBAreducedinWY14643group(P<0 05). Conclusion ActivationofPPARαamelioratedIsoniazidandRifampininducedliverinjurythroughantioxidanion andmodulationoftheexpresionofpparα,bsepandtnf αmrna. Keywords PPARαagonist;liverinjury;Isoniazid;Rifampin;Bsep;TNF α;rat

36 1062 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 抑 制 p70s6k 对 HSC T6 增 殖 活 化 的 作 用 研 究 占 书 箱 1,2, 黄 成 1,2, 马 陶 陶 1,2, 陈 培 杰 1,2 1,2, 李 俊 摘 要 目 的 研 究 抑 制 核 糖 体 40S 小 亚 基 S6 蛋 白 激 酶 (p70s6k) 的 表 达 对 大 鼠 肝 星 状 细 胞 株 (HSC T6) 增 殖 活 化 的 影 响 方 法 建 立 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型, 观 察 磷 酸 化 p70s6k 在 纤 维 化 肝 组 织 中 的 表 达 变 化 ; 利 用 雷 帕 霉 素 抑 制 p70s6k 蛋 白 表 达, 及 靶 向 p70s6k 基 因 的 sirna 预 处 理 HSC T6, 再 添 加 重 组 小 鼠 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 (PDGF BB) 诱 导, 观 察 HSC T6 的 增 殖 活 化 情 况 ; 利 用 Westernblot RT PCR 检 测 p70s6k P p70s6k α SMA ColagenI 的 蛋 白 和 基 因 表 达 水 平 结 果 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 组 磷 酸 化 p70s6k 蛋 白 明 显 升 高 ; 雷 帕 霉 素 预 处 理 HSC T6, 明 显 降 低 了 p70s6k 的 磷 酸 化 水 平, 并 抑 制 了 PDGF BB 诱 导 的 细 胞 增 殖 及 α SMA ColagenI 的 表 达 ;sirna 转 染 HSC T6, 在 基 因 和 蛋 白 水 平 抑 制 了 p70s6k 的 表 达, 同 时 减 少 了 PDGF BB 诱 导 的 α SMA ColagenI P p70s6k 的 表 达 结 论 用 sir NA 和 雷 帕 霉 素 阻 断 p70s6k 的 表 达, 在 一 定 程 度 上 可 以 抑 制 HSC T6 的 增 殖 和 活 化, 为 肝 纤 维 化 的 防 治 研 究 提 供 新 的 思 路 和 靶 点 关 键 词 化 中 图 分 类 号 肝 星 状 细 胞 株 ;p70s6k;sirna; 雷 帕 霉 素 ; 肝 纤 维 R322.47;R329.25;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 肝 纤 维 化 是 各 种 病 因 所 致 慢 性 肝 损 伤 后, 实 质 细 胞 再 生 间 质 细 胞 活 化 增 生 和 细 胞 外 基 质 (extra celularmatrix,ecm) 沉 积 的 肝 组 织 修 复 重 建 的 过 程, 是 慢 性 肝 病 共 有 的 病 理 过 程 [1] 在 肝 纤 维 化 的 发 生 发 展 过 程 中, 肝 星 状 细 胞 (hepaticstelatecels, HSC) 的 活 化 和 增 殖 起 关 键 作 用, 活 化 的 HSC 是 过 度 沉 积 的 ECM 的 主 要 来 源 细 胞 [2] 因 此, 深 入 研 究 HSC 活 化 增 殖 的 机 制, 寻 找 抑 制 HSC 活 化 增 殖 的 方 法, 已 受 到 国 内 外 学 者 广 泛 的 关 注 核 糖 体 40S 小 亚 基 S6 蛋 白 激 酶 (p70s6k) 是 哺 乳 动 物 雷 帕 霉 素 靶 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ); 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2010A162); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 ( 编 号 :KJ2012A156) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 药 学 院, 合 肥 安 徽 医 科 大 学 肝 病 研 究 所, 合 肥 作 者 简 介 : 占 书 箱, 男, 硕 士 研 究 生 ; 李 俊, 男, 博 士, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: [email protected] 蛋 白 (mammaliantargetofrapamycin,mtor) 的 下 游 [3] 底 物, 研 究 显 示,p70S6K 在 细 胞 增 殖 生 长 中 起 到 [4] 重 要 的 调 控 作 用 该 实 验 室 前 期 研 究 表 明, 在 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 (plateletderivedgrowthfactor, PDGF) 诱 导 HSC T6 增 殖 活 化 中,p70S6K 的 磷 酸 化 水 平 明 显 增 加, 表 明 p70s6k 可 能 参 与 HSC 的 增 殖 活 化 现 利 用 雷 帕 霉 素 抑 制 p70s6k 的 表 达, 并 通 过 靶 向 p70s6k 的 sirna 抑 制 p70s6k 的 活 化, 探 讨 p70s6k 在 HSC 增 殖 活 化 中 的 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 雄 性 SD 大 鼠 30 只,6~8 周 龄, 体 重 180~220g, 清 洁 级, 购 于 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 1.2 细 胞 株 HSC T6 购 自 中 国 科 学 院 上 海 细 胞 库, 为 永 生 化 大 鼠 HSC 1.3 主 要 材 料 与 试 剂 重 组 小 鼠 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 (PDGF BB) 购 于 英 国 PEPROTECH 公 司 ; 靶 向 p70s6krnai 试 剂 盒 购 于 上 海 吉 玛 公 司 ;Lipo fectamine TM 2000 购 于 美 国 Invitrogen 公 司 ; 雷 帕 霉 素 购 于 Aladdin 公 司 ;RabbitmAbanti P p70s6kinase (T389) 购 于 美 国 CelSignaling 公 司 ;MousemAban ti α SMA 购 于 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ; 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝 (MTT) 购 于 美 国 Amresco 公 司 ; 逆 转 录 试 剂 盒 购 于 日 本 TaKaRa 公 司 ;PCR 试 剂 盒 购 于 Fermentas 公 司 ; 引 物 由 上 海 生 工 公 司 设 计 合 成 ;Op timem DMEM 培 养 液 TRIzolReagentRNA 提 取 试 剂 购 于 美 国 InvitrogenLifeTechnologies 公 司 ; 胎 牛 血 清 购 于 杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ;DM SO 购 于 美 国 Sigma 公 司 1.4 主 要 仪 器 NAPCO 6100 型 细 胞 培 养 箱, 美 国 SHELLAB;SW CJ IF 型 超 净 工 作 台, 江 苏 苏 净 集 团 苏 州 安 泰 空 气 技 术 有 限 公 司 ;PCR 扩 增 仪, 德 国 Eppedorf 公 司 ;Westernblot 设 备, 美 国 Biorad 公 司 ; Sigam3 16K 高 速 离 心 机, 美 国 Sigma 公 司 ; 冷 冻 离 心 机 TGL 18R, 珠 海 黑 马 医 学 仪 器 有 限 公 司 ; 酶 标 仪 MK3, 荷 兰 雷 勃 公 司 ; 荧 光 倒 置 显 微 镜, 日 本 Olym pus 公 司 1.5 方 法

37 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 大 鼠 肝 纤 维 模 型 的 建 立 用 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化, 具 体 方 法 参 见 文 献 [5] HE 和 Mason 染 色 取 大 鼠 肝 脏 右 叶 相 同 位 置 组 织,10% 甲 醛 溶 液 固 定, 石 蜡 包 埋, 切 片,HE 和 Mason 染 色, 光 镜 下 观 察 染 色 结 果 并 拍 照, 分 析 和 评 价 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 损 伤 和 纤 维 化 程 度 HSC T6 细 胞 培 养 和 传 代 HSC T6 细 胞 使 用 含 有 10% 胎 牛 血 清 及 100kU/L 青 霉 素 和 100 mg/l 链 霉 素 的 高 糖 培 养 基, 置 于 37 5%CO 2 培 养 箱 中 培 养 当 细 胞 生 长 融 合 达 到 约 80% 时, 用 0 25% 胰 蛋 白 酶 消 化 传 代 或 按 所 需 浓 度 接 种 培 养 瓶 培 养 板 MTT 检 测 细 胞 增 殖 HSC T6 细 胞 生 长 80% 融 合,0.25% 胰 蛋 白 酶 消 化, 完 全 培 养 基 重 悬, 台 盼 蓝 法 细 胞 计 数, 每 孔 个 细 胞 接 种 于 96 孔 板 待 细 胞 贴 壁 后, 加 入 雷 帕 霉 素, 使 其 终 浓 度 依 次 为 ng/ml [6], 同 时 加 入 等 体 积 溶 媒 DMSO 作 为 对 照, 每 组 6 个 复 孔, 每 孔 均 为 200μl 体 系 置 于 37 5%CO 2 培 养 箱 中 培 养 2h 后, 除 正 常 对 照 孔 外, 再 均 加 入 终 浓 度 为 10ng/ml [4,7] 的 PDGF [7], 放 回 培 养 箱, 继 续 培 养 24h 或 48h 时 间 到 后, 每 孔 加 20μl5mg/mlMTT,37 继 续 培 养 4 h 终 止 培 养,5ml 注 射 器 小 心 吸 尽 各 孔 中 液 体, 加 入 150μlDMSO, 立 即 用 酶 标 仪 于 490nm 波 长 处 检 测 吸 光 度 值 1.6 转 染 靶 向 p70s6k 的 sirna 设 计 与 合 成 上 海 吉 玛 公 司 根 据 p70s6k 全 基 因 序 列 设 计 3 个 sirna 序 列 如 下 :R1:sense 5 GGAAUAUUCUGGAG GAAGUTT 3,antisense5 ACUUCCUCCAGAAUAUU CCTT 3 ;R2:sense5 GGGAUAUUCAUGGAAGAUA TT 3,antisense5 UAUCUUCCAUGAAUAUCCCTT 3 ;R3:sense5 GGCUCCAUCUGUACUUGAATT 3, antisense5 UUCAAGUACAGAUGGAGCCTT 3 另 外,siRNA 阴 性 对 照 序 列 为 :sense5 UUCUC CGAACGUGUCACGUTT 3,antisense 5 ACGUGA CACGUUCGGAGAATT 实 验 分 组 1 空 白 对 照 组, 以 等 体 积 的 Op timem 培 养 液 代 替 转 染 液, 作 为 转 染 前 p70s6k 的 水 平 ;2 阴 性 对 照 组, 用 转 染 scramble RNA 的 细 胞 观 察 p70s6k 表 达 的 变 化 ;3 p70s6k sirna 组 (R1 R2 R3), 转 染 靶 向 p70s6k 的 sirna, 特 异 性 干 扰 目 的 基 因 p70s6k 的 表 达 转 染 HSC T6 细 胞 生 长 融 合 约 80% 时, 用 OptiMEM 培 养 液 分 别 稀 释 Lipofectamine TM 2000 和 sirna 至 所 需 浓 度, 室 温 静 置 5min 将 稀 释 后 的 sirna 与 Lipofectamine TM 2000 小 心 吹 打 混 匀, 室 温 再 静 置 20min 以 形 成 稳 定 的 sirna 脂 质 体 复 合 物 随 后 弃 去 旧 培 养 液, 将 上 述 含 有 复 合 物 的 培 养 液 加 入 待 转 染 细 胞,6h 后 更 换 完 全 培 养 基 DMEM, 并 加 入 PDGF, 使 其 终 浓 度 为 10ng/ml, 继 续 作 用 24h RT PCR 检 测 p70s6k α SMA ColagenⅠ mrna 水 平 收 集 经 雷 帕 霉 素 或 sirna 作 用 过 的 细 胞, 应 用 TRIzol 试 剂 盒 提 取 细 胞 的 总 RNA, 通 过 分 光 光 度 法 测 定 RNA 溶 液 的 吸 光 度 来 测 定 RNA 的 含 量 和 纯 度 (OD 260 /OD 280 >1 8) 采 用 TaKaRa 逆 转 录 试 剂 盒 得 到 cdna, 按 表 1 中 所 列 条 件 进 行 相 应 基 因 的 PCR 反 应 琼 脂 糖 凝 胶 80V 电 泳 PCR 产 物 30min, 图 像 分 析 仪 采 集 图 像, 光 密 度 扫 描, 以 GAP DH 为 基 准 分 析, 即 以 目 的 基 因 与 GAPDH 的 灰 度 比 值 表 示 目 的 基 因 的 相 对 表 达 水 平, 实 验 重 复 3 次 表 1 RT PCR 引 物 序 列 退 火 温 度 及 产 物 大 小 基 因 引 物 序 列 退 火 温 度 产 物 大 小 ( ) (bp) ColagenI F:5 TACAGCACGCTTGTGGATG R:5 TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC 3 α SMA F:5 TGGCCACTGCTGCTTCCTCTTCTT R:5 GGGGCCAGCTTCGTCATACTCCT 3 p70s6k F:5 GAAATCTTGATGATGAGAAGCGGC R:5 CTTGTGTGAGGTAGGGAGGCA 3 GAPDH F:5 CAAGGTGATCCATGACAACTTTG R:5 GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG Westernblot 检 测 P p70s6k p70s6k α SMA 蛋 白 表 达 收 集 经 雷 帕 霉 素 或 sirna 作 用 过 的 细 胞, 加 蛋 白 裂 解 液 RAPI( 含 PMSF), 冰 上 摇 晃 裂 解 30min 4,12000r/min 离 心 30min, 取 上 清 液 用 BCA 法 对 蛋 白 样 品 定 量 后, 加 入 上 样 缓 冲 液,100 加 热 10min 使 蛋 白 变 性 每 孔 加 20μl 或 30μl 总 蛋 白, 进 行 SDS PAGE 电 泳, 采 用 湿 转 法 将 胶 上 蛋 白 转 移 至 PVDF 膜 上, 膜 在 室 温 下 用 5% 脱 脂 奶 粉 (TBST 配 制 ) 封 闭 3h, 膜 用 TBST 清 洗 后, 用 待 检 测 蛋 白 的 一 抗 孵 育,4 次 日, 膜 用 TBST 清 洗 后, 用 与 一 抗 种 属 相 匹 配 的 的 二 抗 室 温 孵 育 2 h,ecl 发 光 试 剂 盒 显 影, 以 β actin 为 内 参,ImageJ 软 件 分 析 条 带 的 灰 度 值 1.8 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 用 One WayANOVA 检 验 各 组 间 差 异 的 显 著 性

38 1064 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2 结 果 2.1 磷 酸 化 p70s6k 在 CCl 4 诱 导 的 大 鼠 肝 纤 维 化 组 织 中 的 蛋 白 表 达 HE 染 色 和 Mason 染 色 结 果 ( 图 1) 显 示, 正 常 组 肝 组 织 结 构 完 整, 肝 细 胞 排 列 整 齐, 无 变 性, 而 模 型 组 肝 组 织 可 见 大 量 胶 原 纤 维 沉 积 并 伴 有 脂 肪 空 泡, 纤 维 间 隔 粗 大, 形 成 假 小 叶, 表 明 CCl 4 成 功 诱 导 了 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 Westernblot 结 果 表 明, 与 正 常 组 比 较, 模 型 组 α SMA 磷 酸 化 p70s6k 蛋 白 明 显 升 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= ,F=13 787;P<0 05) 见 图 2 图 1 CCl 4 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 200 A:HE 染 色 ;B:Mason 染 色 ;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 2.2 雷 帕 霉 素 对 PDGF 诱 导 的 HSC 增 殖 活 化 的 影 响 MTT 结 果 ( 图 3A) 显 示, 雷 帕 霉 素 在 3 种 浓 度 下 ( ng/ml), 均 能 够 明 显 抑 制 PDGF 诱 导 的 HSC 增 殖, 与 模 型 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= ,F=46 151;P<0 05,P<0 01);RT PCR 结 果 ( 图 3B) 显 示, 雷 帕 霉 素 减 少 了 PDGF 诱 导 的 α SMA 和 ColagenI 基 因 表 达, 与 模 型 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= ,F=15 941;P<0 05,P< 0 01);Westernblot 结 果 ( 图 3C) 显 示, 雷 帕 霉 素 明 显 地 抑 制 了 p70s6k 的 磷 酸 化, 减 少 了 α SMA 的 蛋 白 表 达 水 平, 与 模 型 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F= ,F=36 382;P<0 05,P<0 01) 2.3 p70s6k sirna 抑 制 p70s6k 基 因 和 蛋 白 的 表 达 HSC 转 染 p70s6k sirna 后, 分 别 通 过 RT PCR 和 Westernblot 检 测 p70s6k 在 基 因 和 蛋 白 水 平 的 表 达, 两 项 检 测 结 果 均 显 示 (F=38 747;F= 17 35),R1 R2 R3 组 p70s6k 的 基 因 和 蛋 白 表 达 量 均 有 不 同 程 度 的 下 降, 且 与 模 型 组 阴 性 对 照 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (F=38 747,F=17 35;P< 0 05,P<0 01), 提 示 p70s6k sirna 能 够 明 显 抑 制 p70s6k 基 因 和 蛋 白 的 表 达, 脂 质 体 转 染 p70s6k sirna 是 有 效 的 阴 性 对 照 组 与 正 常 组 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 图 p70s6k sirna 作 用 对 PDGF 诱 导 的 HSC 活 化 的 影 响 PCR 结 果 表 明, 转 染 p70s6k sirna(1 2 3)HSC 细 胞 后,PDGF 诱 导 的 α SMA 和 Colagen I 的 基 因 水 平 被 明 显 抑 制, 与 模 型 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=95 668,F=27 91;P<0 05,P< 0 01), 阴 性 对 照 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P >0 05)( 图 5A) Westernblot 结 果 表 明, 转 染 p70s6k sirna(1 2 3)HSC 细 胞 后,PDGF 诱 导 的 α SMA 和 磷 酸 化 p70s6k 的 蛋 白 水 平 被 明 显 抑 制, 与 模 型 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=50 659,F= ;P<0 01), 阴 性 对 照 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 图 5B 3 讨 论 图 2 Westernblot 检 测 P p70s6k 在 大 鼠 肝 纤 维 化 组 织 中 的 表 达 与 正 常 组 比 较 : # P<0 05 p70s6k 是 一 种 核 糖 体 蛋 白 激 酶, 在 各 种 组 织 中 广 泛 存 在, 参 与 细 胞 信 号 转 导 ; 作 为 mtor 的 下 游 作 用 靶 点,p70S6K 活 化 可 促 进 5 TOPmRNA 的 翻 译, 促 进 细 胞 生 长 和 增 殖 [8] [9-10] 研 究 表 明, 在 癌 症 等 疾 病 中,p70S6K 活 化 水 平 明 显 升 高, 抑 制 其 表 达 可 明 显 抑 制 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 [6,11-13] 肝 纤 维 化 是 一 种 以 HSC 活 化 增 殖 介 导 ECM 过 度 沉 积 为 主 要

39 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1065 A bp M p70s6k 169 bp GAPDH 496 bp * ## # # B ku p70s6k 70 β-actin * ## ## # 图 4 p70s6k sirna 对 PDGF 诱 导 的 HSC T6 的 p70s6k 基 因 和 蛋 白 表 达 的 作 用 A:RT PCR 检 测 p70s6k mrna 表 达 ;B:Westernblot 检 测 p70s6k 蛋 白 表 达 ;M:Marker;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 ;3:PDGF+ Scram ble sirna;4:pdgf+p70s6k sirna1, 即 R1 组 ;5:PDGF+p70S6K sirna2, 即 R2 组 ;6:PDGF+p70S6K sirna3, 即 R3 组 ; 与 正 常 组 比 较 : P<0 05; 与 模 型 组 比 较 : # P<0 05, ## P<0 01 图 3 雷 帕 霉 素 对 PDGF 诱 导 的 HSC T6 增 殖 活 化 的 影 响 A:MTT 检 测 HSC T6 增 殖 ;B:RT PCR 检 测 α SMA 和 ColagenI mrna 表 达 ;C:Westernblot 检 测 α SMA 和 P p70s6k 蛋 白 表 达 ;M: Marker;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 ;3:PDGF+2ng/ml 雷 帕 霉 素 ;4:PDGF+ 20ng/ml 雷 帕 霉 素 ;5:PDGF+50ng/ml 雷 帕 霉 素 ;6:PDGF+DMSO; 与 正 常 组 比 较 : P<0 05; 与 模 型 组 比 较 : ## P<0 01, # P<0 05 特 点 的 疾 病, 鉴 于 p70s6k 在 细 胞 增 殖 中 的 重 要 作 用, 首 先 建 立 了 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型, 发 现 肝 纤 维 化 组 织 中 P p70s6k 明 显 增 加, 表 明 p70s6k 可 能 参 与 了 肝 纤 维 化 的 过 程 正 常 情 况 下 HSC 在 肝 组 织 中 处 于 静 止 状 态, 数 目 较 少, 占 肝 脏 细 胞 总 数 的 5% ~8%, 当 肝 脏 受 到 炎 症 或 机 械 刺 激 等 损 伤 时,HSC 被 激 活, 其 表 型 由 静 止 型 转 变 为 激 活 型, 激 活 型 HSC 即 为 肌 成 纤 维 细 胞 (myofibroblasts,mfb), 能 够 产 生 大 量 ECM 在 肝 内 沉 积 因 此,HSC 活 化 是 肝 纤 维 化 发 生 发 展 的 关 键 环 节, 如 何 抑 制 HSC 增 殖 活 化, 以 减 缓 肝 纤 维 化 的 疾 病 进 程, 是 肝 纤 维 化 研 究 的 重 点 本 实 验 室 前 [4] 期 研 究 显 示, 在 PDGF 诱 导 活 化 的 HSC 中 p70s6k 磷 酸 化 水 平 表 达 明 显 升 高, 与 本 实 验 在 大 鼠

40 1066 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 用 3 种 p70s6k sirna 转 染 HSC 靶 向 抑 制 p70s6k, 结 果 显 示,3 种 小 RNA 干 扰 片 段 均 能 够 在 基 因 和 蛋 白 水 平 抑 制 p70s6k 的 表 达, 进 一 步 研 究 显 示, p70s6k sirna 明 显 降 低 了 p70s6k 磷 酸 化 水 平, 并 显 著 抑 制 PDGF 诱 导 的 HSC 中 α SMA 蛋 白 和 基 因 的 表 达 以 及 ColagenI 的 基 因 表 达 ( 注 :p70s6k sir NA1 不 能 抑 制 ColagenI 的 基 因 表 达 ) 综 上 所 述, 降 低 p70s6k 的 活 性 可 以 抑 制 HSC 的 增 殖 活 化, 抑 制 胶 原 的 分 泌, 提 示 p70s6k 有 可 能 作 为 肝 纤 维 化 预 防 治 疗 研 究 的 靶 点 参 考 文 献 图 5 p70s6k sirna 对 PDGF 诱 导 的 HSC T6 活 化 的 影 响 A:RT PCR 检 测 α SMA ColagenⅠ mrna 表 达 ;B:Westernblot 检 测 α SMA P p70s6k 蛋 白 表 达 ;M:Marker;1: 正 常 组 ;2: 模 型 组 ; 3:PDGF+Scramble sirna;4:pdgf+p70s6k sirna1, 即 R1 组 ;5: PDGF+p70S6K sirna2, 即 R2 组 ;6:PDGF+p70S6K sirna3, 即 R3 组 ; 与 正 常 组 比 较 : P<0 05; 与 模 型 组 比 较 : # P<0 05, ## P<0 01 肝 纤 维 化 组 织 中 检 测 到 p70s6k 磷 酸 化 水 平 升 高 的 结 果 一 致, 表 明 p70s6k 可 能 参 与 了 HSC 的 活 化 增 殖 为 进 一 步 明 确 其 在 HSC 中 的 作 用, 本 实 验 利 用 雷 帕 霉 素 抑 制 其 表 达 并 通 过 靶 向 干 扰 p70s6k, 观 察 其 对 HSC 增 殖 及 α SMA 和 ColagenI 表 达 的 影 响 结 果 显 示,3 种 剂 量 的 雷 帕 霉 素 ( ng/ ml) 分 别 作 用 HSC24h 或 48h, 均 能 够 明 显 抑 制 PDGF 诱 导 的 HSC 增 殖, 进 一 步 研 究 显 示, 雷 帕 霉 素 不 仅 降 低 p70s6k 磷 酸 化 水 平, 并 明 显 抑 制 α SMA 蛋 白 和 基 因 的 表 达 以 及 ColagenI 的 基 因 表 达 利 [1] 贾 丽 莎, 黄 成, 张 磊, 等. 脂 质 体 转 染 TRPM7siRNA 对 肝 星 状 细 胞 增 殖 的 影 响 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2011,46(11): [2] Hernandez GeaV,FriedmanSL.Pathogenesisofliverfibrosis [J].AnnuRevPathol,2011,6: [3] ZhengY,ColinsSL,LutzMA,etal.Aroleformammaliantar getofrapamycininregulatingtcelactivationversusanergy[j].j Immunol,2007,178(4): [4] FangL,ZhanS,HuangC,etal.TRPM7channelregulates PDGF BB inducedproliferationofhepaticstelatecelsviapi3k anderkpathways[j].toxicolapplpharmacol,2013,272(3): [5] 张 磊, 李 俊, 朱 鹏 里, 等. 四 氯 化 碳 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 进 展 期 和 恢 复 期 模 型 的 建 立 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2011,27 (12): [6] VelagapudiC,BhandariBS,Abboud WernerS,etal.Thetu berin/mtorpathwaypromotesapoptosisoftubularepithelialcels indiabetes[j].jamsocnephrol,2011,22(2): [7] TaoH,HuangC,YangJJ,etal.MeCP2controlstheexpresion ofrasal1inthehepaticfibrosisinrats[j].toxicology,2011, 290(2-3): [8] BuckM,ChojkierM A.RibosomalS 6kinase mediatedsignalto C/EBP betaiscriticalforthedevelopmentofliverfibrosis[j]. PLoSOne,2007,2(12):e1372. [9] ZhanHX,CongL,ZhaoYP,etal.ActivatedmTOR/P70S6K signalingpathwayisinvolvedininsulinomatumorigenesis[j].j SurgOncol,2012,106(8): [10] LealP,GarciaP,SandovalA,etal.AKT/mTOR substrate P70S6Kisfrequentlyphosphorylatedingalbladdercancertisue andcellines[j].oncotargetsther,2013,6: [11]NawrothR,StelwagenF,SchulzW A,etal.S6K1and4E BP1 areindependentregulatedandcontrolcelulargrowthinbladder cancer[j].plosone,2011,6(11):e [12] YuSY,LiuL,LiP,etal.RapamycininhibitsthemTOR/ p70s6kpathwayandatenuatescardiacfibrosisinadriamycin in duceddilatedcardiomyopathy[j].thoraccardiovascsurg,2013, 61(3): [13] ChuuCP,LinHP,CiaccioM F,etal.Cafeicacidphenethyl estersuppresestheproliferationofhumanprostatecancercels throughinhibitionofp70s6k andaktsignalingnetworks[j]. CancerPrevRes(Phila),2012,5(5):

41 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1067 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 重 组 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 病 毒 样 颗 粒 的 制 备 蒋 桂 云 1, 陈 念 华 2, 付 远 辉 3, 焦 月 盈 3, 徐 青 3 1,3, 何 金 生 摘 要 目 的 采 用 杆 状 病 毒 表 达 系 统 制 备 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 重 组 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 (HBsAg) 病 毒 样 颗 粒 (VLPs) 方 法 将 Aβ42 分 子 的 C 末 端 6 个 氨 基 酸 进 行 3 个 串 联 后, 插 入 到 HBsAg 的 113aa 与 114aa 之 间, 利 用 Bac to Bac 杆 状 病 毒 表 达 系 统, 构 建 表 达 HBsAgAβ37 42 的 重 组 杆 状 病 毒 载 体, 转 染 Sf9 细 胞,Westernblot 鉴 定 目 的 蛋 白 表 达 情 况, 用 氯 化 铯 (CsCl) 密 度 梯 度 超 速 离 心 纯 化, 电 镜 观 察 VLPs 的 形 态 结 果 制 备 并 纯 化 出 HBsAgVLPs 和 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 HBsAgVLPs(HBsAgAβ37 42VLPs) 结 论 制 备 携 带 Aβ 抗 原 表 位 的 重 组 HBsAg 作 为 一 种 阿 尔 茨 海 默 病 (AD) 疫 接 收 基 金 项 目 : 中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 ( 编 号 :2012JBZ003) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 免 疫 学 教 研 室, 合 肥 烟 台 市 第 二 中 学, 烟 台 北 京 交 通 大 学 生 命 科 学 与 生 物 工 程 研 究 院, 北 京 作 者 简 介 : 蒋 桂 云, 女, 硕 士 研 究 生 ; 何 金 生, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:jshhe@ bjtu.edu.cn 苗 具 有 一 定 的 可 行 性, 值 得 进 一 步 探 讨 关 键 词 阿 尔 茨 海 默 病 ; 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 ; 杆 状 病 毒 表 达 系 统 ; 病 毒 样 颗 粒 中 图 分 类 号 R741.16;Q78 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 阿 尔 茨 海 默 病 (Alzheimer sdisease,ad) 是 以 渐 进 性 记 忆 力 减 退 为 主 要 临 床 症 状 的 疾 病 到 目 前 为 止, 世 界 AD 患 者 将 近 3700 万 [1-2] 近 年 来, 以 Aβ42 为 靶 向 的 治 疗 性 AD 疫 苗 引 起 广 泛 关 注, 制 约 AD 疫 苗 研 制 的 因 素 : 首 先 是 Aβ42 为 AD 患 者 的 自 [3] 身 抗 原, 存 在 免 疫 耐 受 问 题 既 往 研 究 表 明 高 密 度 多 价 结 构 的 病 毒 样 颗 粒 (virus likeparticles, VLPs) 一 类 的 抗 原 能 够 诱 导 机 体 产 生 高 滴 度 的 抗 体 反 应, 强 大 的 抗 体 应 答 能 够 突 破 免 疫 耐 受 其 次, 研 [4] 究 人 员 采 用 Aβ42C 末 端 的 6 个 氨 基 酸 免 疫 动 物, 能 够 获 得 识 别 Aβ42, 不 识 别 Aβ40 的 抗 体, 避 免 了 干 扰 Aβ40 的 正 常 功 能 另 外, 作 为 Aβ 治 疗 性 疫 Thestudyontheefectofsilencingp70S6K onthe proliferationandactivationofhsc T6 ZhanShuxiang 1,2,HuangCheng 1,2,MaTaotao 1,2,etal ( 1 SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 InstituteforLiverDiseases ofanhuimedicaluniversity,hefei ) Abstract Objective Toinvestigatetheefectofsuppresingp70S6K(ribosomalproteinS6kinase)expresionon theproliferationandactivationofhepaticstelatecelstrain(hsc T6)invitro.Methods CCl 4 inducedliverfi brosismodelinratsandthenthephosphorylatedp70s6k(p p70s6k)levelwasdeterminedinfibroticlivertisue. AfterpretreatedwithRapamycinorsiRNAtargetingp70S6K,HSC T6wasstimulatedwithPDGFandthenthepro liferationandactivationofitwereobserved.westernblotandrt PCRwereusedtodetecttheproteinandmRNA expresionofp70s6k,p p70s6k,α SMAandColagenI.Results TheP p70s6klevelobviouslyincreasedinrat fibroticlivertisue.therapamycinpretreatmentsignificantlydecreasedthep p70s6klevelandinhibitedpdgf mediatedproliferationandtheexpresionofα SMA,ColagenIinHSC T6.p70S6K sirnadown regulatedtheex presionofp70s6kinmrnaandproteinlevelandmeanwhiledecreasedtheexpresionofα SMA,ColagenⅠ and P p70s6kinducedbypdgfinhsc.conclusion Blockingp70S6KexpresionbyRapamycinandp70S6K sir NAcansupprestheactivationandproliferationofHSCtoacertainextent,maybeprovidingnewideasandtargets forthepreventionandtreatmentofliverfibrosis. Keywords HSC T6;p70S6K;smalinterferingRNA;Rapamycin;hepaticfibrosis

42 1068 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 苗 主 要 免 疫 对 象 的 老 年 人, 存 在 免 疫 衰 老 现 象 [5] 招 募 童 年 时 期 的 记 忆 性 T 淋 巴 细 胞, 是 突 破 免 疫 衰 老 的 一 种 方 法 [6] 本 实 验 将 Aβ42 分 子 的 C 末 端 6 个 氨 基 酸 进 行 3 个 串 联 后, 插 入 到 乙 肝 病 毒 表 面 抗 原 (hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag) 的 113 aa 与 114aa 之 间, 制 备 融 合 有 Aβ37 42 肽 段 的 HB sagvlps(hbsagaβ37 42VLPs), 为 提 高 Aβ42 分 子 的 C 末 端 作 为 疫 苗 抗 原 的 免 疫 原 性 提 供 研 究 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 细 胞 株 载 体 和 感 受 态 杆 状 病 毒 表 达 系 统 ( 包 括 E.coli 菌 株 DH10Bac 质 粒 pfastbac1) 和 草 地 贪 夜 蛾 细 胞 (Sf9) 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ; 载 体 pmd18 T 购 自 日 本 TaKaRa 公 司 ; 菌 株 E.coliDH5α 为 本 室 保 存 1.2 主 要 试 剂 引 物 合 成 及 DNA 测 序 由 华 大 基 因 完 成 ;Aβ37 42 肽 段 的 HBsAg 基 因 (HBsAgAβ37 42) 由 上 海 生 工 合 成 ; 质 粒 小 量 提 取 及 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 美 国 Promega 公 司 ;T4DNA 连 接 酶 ExTaq 聚 合 酶 及 DNA Marker 购 自 日 本 TaKaRa 公 司 ; SF900 培 养 基 购 自 美 国 Gibco 公 司 ; 胎 牛 血 清 (fetal bovineserum,fbs) 购 自 美 国 Hyclone 公 司 ; 核 酸 内 切 酶 及 预 染 蛋 白 Marker 购 自 美 国 NEB 公 司 ;Cel fectin Reagent 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 RIPA 裂 解 液 购 自 碧 云 天 公 司 ;HBsAg 抗 体 阳 性 人 血 清 为 本 室 保 存 ; 鼠 特 异 性 HBsAg 免 疫 血 清 为 本 实 验 室 制 备 ; 兔 抗 Aβ37 42 抗 体 购 自 美 国 Abcam 公 司 ; 兔 抗 人 山 羊 抗 小 鼠 及 山 羊 抗 兔 HRP 标 记 二 抗 购 自 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 购 自 英 国 Amersham 公 司 ;BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 和 ECL 化 学 发 光 试 剂 盒 购 自 美 国 Pierce 公 司 ; 细 胞 培 养 用 耗 材 购 自 美 国 Corning 公 司 1.3 质 粒 pmd18 T HBsAg 的 构 建 分 别 设 计 引 物 F1: 5 GATATCATGGAGAACATCGCATCAG GACTC 3 R1:5 TGGTCCGGTGCTGGTGGTTGAT GATCCTGGAATTAGAGGAC 3 ;F2:5 GTCCTCTA ATTCCAGGATCATCAACCACCAGCACCGGACC 3 和 R2:5 CTCGAGTCAAATGTATACCCAAAGAC 3 ( 下 划 线 处 分 别 为 EcoR V 和 XhoⅠ 酶 切 位 点 ), 以 puc57 HBsAgAβ37 42 为 模 板, 扩 增 HBsAg 基 因, 连 接 至 pmd18 T 载 体 测 序 获 得 质 粒 pmd18 T HBsAg, 并 测 序 1.4 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 及 pfast Bac1 HBsAg 的 构 建 分 别 以 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双 酶 切 puc57 HBsAgAβ37 42 和 pfastbac1, 回 收 片 段 和 载 体, 连 接, 挑 选 重 组 子, 摇 菌, 提 取 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42; 分 别 以 EcoRⅤ 和 XhoⅠ 双 酶 切 测 序 正 确 的 质 粒 pmd18t HBsAg 和 pmtv5 HisA 回 收 片 段 和 载 体 连 接, 挑 选 重 组 子, 摇 菌, 提 取 质 粒 pmtv5 HisA HBsAg; 分 别 以 EcoRⅠ 和 XhoⅠ 双 酶 切 pmtv5 HisA HBsAg 和 pfastbac1, 回 收 片 段 和 载 体 连 接, 挑 选 重 组 子, 摇 菌, 提 取 质 粒 pfastbac1 HB sag 1.5 重 组 杆 状 病 毒 DNA rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAg 的 获 得 分 别 取 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 和 pfastbac1 HBsAg 转 化 DH10Bac 使 之 发 生 转 座, 经 蓝 白 斑 筛 选, 挑 选 白 色 单 菌 落, 扩 大 培 养 并 提 取 重 组 杆 状 病 毒 DNA 分 子 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAg PCR 方 法 鉴 定 后, 以 Celfectine reagent 分 别 转 染 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAg 至 Sf9 细 胞, 于 28 培 养 72h, 待 出 现 细 胞 病 变 效 应 (cytopathicefect, CPE) 后, 离 心 收 获 培 养 上 清 液, 即 为 第 1 代 毒 种, 命 名 为 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg 1.6 蛋 白 的 表 达 与 鉴 定 待 Sf9 细 胞 生 长 汇 合 度 为 90% 时, 按 感 染 复 数 (multiplicityofinfection, MOI)=5 分 别 接 种 P3 代 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg,72h 收 获 细 胞, 裂 解 细 胞, 进 行 SDS PAGE 电 泳, 转 膜, 封 闭, 用 抗 HBsAg 阳 性 人 血 清 或 兔 抗 Aβ37 42 抗 体 4 过 夜 孵 育, 洗 膜 3 次 后, 用 HRP 羊 抗 人 或 羊 抗 兔 为 二 抗 进 行 Westernblot 检 测 1.7 HBsAgAβ37 42 和 HBsAgVLPs 的 纯 化 待 Sf9 细 胞 生 长 汇 合 度 为 90% 时, 将 培 养 液 换 成 无 血 清 培 养 液, 按 MOI=5 分 别 接 种 P3 代 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg,72h 收 获 细 胞, 超 声 裂 解, 收 集 上 清 液 采 用 氯 化 铯 (CsCl) 密 度 梯 度 离 心 (1.1~1 4g/cm 3 ), 收 集 VLPs, 进 行 Westernblot 检 测 和 电 镜 观 察 1.8 BCA 法 测 定 样 品 中 蛋 白 浓 度 按 照 BCA 法 蛋 白 定 量 试 剂 盒 说 明, 采 用 酶 标 96 孔 板 的 方 法, 测 定 纯 化 后 蛋 白 的 浓 度 1.9 SDS PAGE 检 测 蛋 白 的 纯 度 使 用 12% 聚 丙 烯 酰 胺 进 行 SDS PAGE, 考 马 斯 亮 蓝 染 色 1~2h, 然 后 脱 色 1~2h, 观 察 结 果 1.10 透 射 电 镜 观 察 VLPs 形 态 纯 化 后 VLPs 少

43 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1069 许, 磷 钨 酸 负 染 后 在 透 射 电 子 显 微 镜 ( 荷 兰 Philips 公 司,EM410) 下 观 察 VLPs 形 态 2 结 果 2.1 质 粒 pmd18t HBsAg 的 构 建 及 鉴 定 质 粒 pmd18t HBsAg 经 EcoRⅤ 和 XhoⅠ 双 酶 切 鉴 定, 产 生 一 条 2692bp 和 一 条 693bp 条 带, 与 预 期 条 带 大 小 一 致, 见 图 1, 并 通 过 测 序, 序 列 也 与 标 准 序 列 一 致 图 3 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HBsAgPCR 鉴 定 结 果 1: 质 粒 rbacmid HBsAgAβ37 42;2:DL15000Marker;3: 质 粒 rbacmid HBsAg 图 1 质 粒 pmd18t HBsAg 的 酶 切 鉴 定 1: 质 粒 pmd18 T HBsAg;2:DL2000Marker;3:DL15000Marker 2.4 HBsAgAβ37 42VLPs 和 HBsAgVLPs 纯 化 及 鉴 定 分 别 用 P3 代 的 重 组 杆 状 病 毒 rbac HBsAgAβ37 42 和 rbac HBsAg 感 染 Sf9 细 胞 72h 后, 收 获 细 胞 裂 解, 并 将 细 胞 裂 解 液 进 行 CsCl 密 度 梯 度 超 速 离 心 后, 分 离 出 目 的 条 带 层 ( 约 1 19g/cm 3 ), 分 别 用 HBsAg 抗 体 阳 性 人 血 清 ( 或 鼠 特 异 性 HBsAg 免 疫 血 清 ) 和 兔 抗 Aβ37 42 抗 体 作 为 一 抗, 进 行 Westernblot 鉴 定, 可 见 目 的 条 带 HBsAg 约 25ku 和 HBsAgAβ37 42 约 27ku, 见 图 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 及 pfastbac1 HB sag 质 粒 的 构 建 及 鉴 定 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 及 pfastbac1 HBsAg 经 EcoRⅠ Xho Ⅰ 双 酶 切 后 分 别 应 产 生 bp 和 bp 的 条 带, 与 预 期 条 带 相 符, 见 图 2, 酶 切 鉴 定 正 确 图 4 Westernblot 分 析 HBsAg 蛋 白 的 表 达 1:Sf9 细 胞 感 染 rbac HBsAgAβ37 42;2:Sf9 细 胞 感 染 rbac HB sag;3:sf9 细 胞 图 5 Westernblot 分 析 Aβ37 42 肽 段 的 表 达 1:Sf9 细 胞 感 染 rbac HBsAgAβ37 42;2:Sf9 细 胞 感 染 rbac HBsAg 图 2 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42 和 pfastbac1 HBsAg 的 酶 切 鉴 定 1:DL15000Marker;2:DL2000 Marker;3: 质 粒 pfastbac1 HBsAgAβ37 42;4: 质 粒 pfastbac1 HBsAg 2.3 重 组 杆 状 病 毒 DNA 的 获 得 及 PCR 鉴 定 转 座 后, 获 得 表 达 HBsAgAβ37 42 和 HBsAg 的 重 组 杆 状 病 毒 载 体 rbacmid HBsAgAβ37 42 和 rbacmid HB sag, 经 PCR 扩 增 出 的 片 段 大 小 和 预 期 相 符, 见 图 纯 化 后 蛋 白 浓 度 的 测 定 BCA 法 蛋 白 定 量 结 果 显 示,CsCl 密 度 梯 度 离 心 纯 化 所 得 HBsAgAβ37 42 蛋 白 浓 度 为 3 492mg/ml,HBsAg 蛋 白 浓 度 为 3 589mg/ml 2.6 纯 化 后 蛋 白 纯 度 的 检 测 使 用 CsCl 密 度 梯 度 离 心 纯 化 蛋 白, 通 过 SDS PAGE 考 马 斯 亮 蓝 染 色 检 测 纯 化 后 的 蛋 白, 见 图 6, 可 见 纯 化 后 样 品 在 泳 道 上 有 25ku 左 右 的 条 带

44 1070 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 6 SDS PAGE 电 泳 检 测 纯 化 后 蛋 白 1:Marker;2: 纯 化 的 HBsAgAβ37 42;3: 纯 化 HBsAg;4: 未 纯 化 HBsAgAβ37 42;5: 未 纯 化 HBsAg 2.7 HBsAgAβ37 42VLPs 和 HBsAgVLPs 电 镜 观 察 取 CsCl 密 度 梯 度 超 速 离 心 后 的 HBsAgAβ37 42VLPs 和 HBsAgVLPs 进 行 2 倍 稀 释 后 负 染, 透 射 电 镜 观 察, 见 约 22nm 的 VLPs, 见 图 7 图 7 VLPs 透 射 电 镜 观 察 结 果 (1% 磷 钨 酸,pH6.8 负 染,TECNAI 12000) A: 纯 化 的 HBsAgAβ37 42VLPs;B: 纯 化 的 HBsAgVLPs 3 讨 论 HBsAg 是 半 糖 基 化 的 蛋 白, 由 226 个 氨 基 酸 组 成, 在 内 质 网 合 成 并 在 腔 膜 上 形 成 约 22nm 的 VLPs, 每 个 VLP 由 100~150 个 多 肽 组 成, 其 构 型 复 杂, 外 部 含 有 一 个 能 高 效 产 生 免 疫 原 性 的 区 域, 这 个 区 域 曾 被 多 个 团 队 引 用 并 已 成 为 携 带 外 源 表 位 的 一 个 平 台, 插 入 外 源 性 基 因 序 列 或 表 位 并 不 影 响 颗 粒 的 形 成 和 它 的 免 疫 原 性 [7-9] Smithetal [10] 首 先 报 道 以 首 蓿 尺 蠖 核 型 多 角 体 病 毒 (autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvi rus,acnpv) 转 移 载 体 表 达 β 干 扰 素 以 来, 包 括 HBV 在 内 的 许 多 外 源 基 因 都 已 在 杆 状 病 毒 载 体 表 达 系 统 中 得 到 高 水 平 表 达 选 用 杆 状 病 毒 表 达 系 统 来 表 达 HBsAg 及 HBsAgAβ37 42 具 有 以 下 优 势 :1 蛋 白 表 达 量 高 且 不 影 响 杆 状 病 毒 DNA 的 复 制 和 子 代 病 毒 的 形 成 ;2 表 达 产 物 具 有 生 物 活 性 ;3 对 人 畜 无 害, 其 生 产 相 当 安 全 [11-12] 本 实 验 获 得 表 达 HBsAg 和 HBsAgAβ37 42 的 重 组 杆 状 病 毒, 在 昆 虫 细 胞 中 合 成 并 组 装 成 VLPs, 但 是 不 能 有 效 地 分 泌 出 来, 这 与 Lanfordetal [13] 报 道 的 在 杆 状 病 毒 表 达 系 统 中 表 达 的 HBsAg 蛋 白 主 要 集 中 在 细 胞 内 相 符 合, 但 在 哺 乳 动 物 细 胞, 如 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 (Chinesehamsterovary,CHO) 细 胞 中 HBsAg 的 表 达 是 可 以 分 泌 的, 这 可 能 是 由 于 在 杆 状 病 毒 表 达 系 统 中 HBsAg 蛋 白 表 达 量 高, 且 形 成 的 VLPs 多 本 实 验 利 用 Westernblot 鉴 定 HBsAg 蛋 白 表 达 时, 可 见 图 中 有 两 条 带, 分 析 可 能 是 部 分 蛋 白 糖 基 化 的 结 果, 于 是 产 生 了 非 糖 基 化 25ku 和 糖 基 化 29ku 左 右 的 两 条 带, 进 一 步 鉴 定 发 现 感 染 后 72h 蛋 白 表 达 量 相 对 较 高 在 鉴 定 Aβ37 42 短 肽 时, 起 初 在 加 样 孔 附 近 检 测 到 条 带, 在 其 正 确 分 子 量 对 应 的 位 置 (27ku) 却 没 有 特 异 性 条 带 出 现, 由 此 推 测 加 样 孔 附 近 的 条 带 可 能 是 蛋 白 发 生 了 聚 集 形 成 了 多 聚 体 所 导 致 为 了 避 免 此 类 现 象 的 发 生, 将 处 理 蛋 白 的 温 度 从 100 5min 改 为 50 12min, 结 果 检 测 到 目 的 蛋 白 分 子 量 大 小 的 条 带 在 分 析 影 响 此 实 验 的 各 种 因 素 中, 除 了 蛋 白 鉴 定 时 的 处 理 温 度 外, 以 下 几 个 方 面 也 值 得 关 注 : 首 先 转 染 时 质 粒 的 量 要 足 够 ; 另 外 在 以 超 速 离 心 纯 化 VLPs 时, 垫 层 上 加 入 样 品 时, 应 注 意 样 品 的 浓 度, 如 果 浓 度 过 高, 会 导 致 离 心 后 分 层 不 明 显 且 分 不 开, 影 响 样 品 的 纯 度 通 过 本 实 验, 制 备 出 了 携 带 Aβ37 42 肽 段 的 重 组 HBsAgVLPs, 在 后 续 的 实 验 中 将 主 要 从 免 疫 效 果 的 评 价 和 体 内 功 能 实 验 进 行 研 究 总 之,HBsAg Aβ37 42VLPs 的 获 得, 为 后 续 动 物 实 验 提 高 Aβ42 分 子 的 C 末 端 作 为 疫 苗 抗 原 的 免 疫 原 性 以 及 提 高 老 年 人 对 疫 苗 的 反 应 性 等 奠 定 了 研 究 基 础 参 考 文 献 [1] FengG,WangW,QianY,etal.Anti Aβantibodiesinducedby Aβ HBcvirus likeparticlespreventaβ aggregationandprotect PC12celsagainsttoxicityofAβ1 40[J].JNeurosciMethods, 2013,218(1): [2] FuHJ,LiuB,FrostJL,etal.Amyloid βimmunotherapyfor

45 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1071 Alzheimer sdisease[j].cnsneuroldisorddrugtargets,2010, 9(2): [3] ChackerianB.Virus likeparticlebasedvaccinesforalzheimer disease[j].humvaccin,2010,6(11): [4] AxelsenTV,HolmA,ChristiansenG,etal.Identificationofthe shortestaβ peptidegeneratinghighlyspecificantibodiesagainst thec terminalendofamyloid β42[j].vaccine,2011,29(17): [5] MadeoJ,FrieriM.Alzheimer sdiseaseandimmunotherapy[j]. AgingDis,2013,4(4): [6] OlkhanudPB,MughalM,AyukawaK,etal.DNAimmunization withhbsag basedparticlesexpresingabcelepitopeofamyloid beta peptideatenuatesdiseaseprogresionandprolongssurvivalin amousemodelofalzheimer sdisease[j].vaccine,2012,30 (9): [7] VietheerPT,BooI,DrummerH E,etal.Immunizationswith chimerichepatitisbvirus likeparticles(vlps)toinducepoten tialanti hepatitisc virus(hcv) neutralizingantibodies[j]. AntivirTher,2007,12(4): [8] WooW P,DoanT,HerdKA,etal.HepatitisBsurfaceantigen vectordeliversprotectivecytotoxict lymphocyteresponsestodis ease relevantforeignepitopes[j].jvirol,2006,80(8): [9] KotiwM,JohnsonM,PandeyM,etal.Immunologicalresponseto parentalvaccinationwithrecombinanthepatitisbvirussurfacean tigen virus like particles expresing Helicobacter pylorikata epitopesinamurineh.pylorichalengemode[j].clinvaccine Immunol,2012,19(2): [10] SmithGE,SummersM D,FraserM.etal.Productionofhuman betainterferonininsectcelsinfectedwithabaculovirusexpresion vector[j].molcelbiol,1983,3(12): [11]WangX,GaoL,DengF,etal.High levelproductionofafunc tionalrecombinanthepatitisbviruspolymeraseininsectcelswith abaculovirusexpresionsystem[j].jhuazhongunivscitechn ologmedsci,2007,27(3): [12] 苗 季, 从 旭, 谭 文 杰, 等. 利 用 穿 梭 质 粒 快 速 构 建 乙 型 肝 炎 病 毒 表 面 抗 原 (HBsAg) 基 因 的 重 组 杆 状 病 毒 [J]. 中 华 实 验 和 临 床 病 毒 学 杂 志,1998,12(3): [13] LanfordRE,LuckowV,KennedyRC,etal.Expresionand characterizationofhepatitisbvirussurfaceantigenpolypeptidesin insectcelswithabaculovirusexpresionsystem[j].jvirol, 1989,63(4): PreparationofarecombinanthepatitisBvirussurface antigenvirus likeparticlesexpresingaβ37 42 JiangGuiyun 1,ChenNianhua 2,FuYuanhui 3,etal ( 1 DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 YantaiNo.2MiddleSchool, Yantai ; 3 ColegeofLifeSciencesandBioenginering,BeijingJiaotongUniversity,Beijing ) Abstract Objective TopreparearecombinanthepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg)virus likeparticles (VLPs)whichcariedthepeptidesofAβ37 42byusingbaculovirusexpresionsystem.Methods Forconstructed anexpresinghbsagaβ37 42recombinantbacmid,theencodingsequenceofsixaminoacidshortpeptidefromthe carboxyterminusofaβ42peptideintriplicatewereinsertedintohbsagbetween113aaand114aa.whenthere combinantbacmidcontainedthegeneofinterestwasconfirmed,itwastransfectedtosf9celsforproducingrecom binantbaculovirusandamplifyingthebaculoviralstock.therecombinantproteinwasidentifiedbywesternblot. ThepaternsoftheVLPswereobservedbytransmisionelectronmicroscopyaftertherecombinantproteinwaspuri fiedbyusingcscldensitygradientcentrifugation.results HBsAgVLPsandHBsAgVLPsexpresingAβ37 42 (HBsAgAβ37 42VLPs)weresuccesfulyconstructedandpurified.Conclusion TheexpresionofAβantigen epitopebyhbsagvlpsissuccesfulandtheresultisapplicableforfurtherinvivoinvestigationasacandidatevac cineofalzheimer sdisease(ad). Keywords Alzheimer sdisease;hepatitisbvirussurfaceantigen;baculouvirusexpresionsystem;virus like particles

46 1072 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 小 鼠 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 基 本 电 生 理 特 性 的 比 较 分 析 张 玉 松 1, 祝 延 1,2, 郭 呈 斌 1, 解 敏 1, 王 烈 成 1 3, 张 晨 摘 要 目 的 制 备 急 性 小 鼠 海 马 脑 片, 观 察 并 分 析 海 马 脑 片 CA1 和 CA3 神 经 元 的 电 生 理 特 性 方 法 将 急 性 制 备 的 小 鼠 海 马 脑 片, 应 用 红 外 微 分 干 涉 相 差 技 术 结 合 电 荷 耦 合 成 像 系 统 和 脑 片 膜 片 钳 技 术, 对 小 鼠 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 结 构 特 点 和 电 生 理 特 性 进 行 观 察 和 检 测 结 果 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 立 体 结 构 清 晰, 胞 体 突 起 明 显, 细 胞 死 亡 少 且 容 易 封 接 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 自 发 放 电 电 流 和 动 作 电 位 的 幅 度 频 率, 静 息 膜 电 位 和 峰 峰 间 距, 二 者 之 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 ; 去 极 化 脉 冲 电 压 与 钠 和 钾 离 子 通 道 电 流 密 度, 步 阶 脉 冲 电 流 与 动 作 电 位 发 放 数 二 者 之 间 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 结 论 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 的 一 些 基 本 电 生 理 特 性 存 在 异 同, 这 结 果 为 记 忆 和 神 经 疾 病 等 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基 础 关 键 词 膜 片 钳 技 术 ; 小 鼠 ; 脑 片 ; 海 马 神 经 元 ; 电 生 理 中 图 分 类 号 R338.8 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 海 马 是 大 脑 中 被 广 泛 研 究 的 热 点 脑 区 之 一, 海 马 CA1 和 CA3 神 经 元 是 实 验 研 究 中 常 用 的 两 类 神 经 元 且 均 匀 的 位 于 清 晰 易 见 的 细 胞 带 上, 与 一 些 生 理 行 为 学 和 神 经 系 统 疾 病 研 究 相 关 联 [1-2] CA1 神 经 元 具 有 明 显 的 海 马 信 号 输 出 环 路, 在 长 时 程 记 忆 和 相 对 空 间 任 务 及 行 为 学 上 有 重 要 作 用 CA3 神 经 元 位 于 大 脑 颞 叶 海 马 里, 被 各 种 抑 制 性 神 经 元 所 调 节,CA3 神 经 元 从 齿 状 回 神 经 元 接 收 信 息 与 CA1 神 经 元 有 雪 佛 侧 枝 相 连 接, 也 被 应 用 于 记 忆 方 面 的 研 究 另 外,CA1 和 CA3 神 经 元 异 常 放 电 亦 与 癫 痫 等 神 经 系 统 疾 病 有 关 该 实 验 制 作 急 性 海 马 脑 片, 比 较 分 析 CA1 和 CA3 神 经 元 基 本 电 生 理 特 性, 为 记 忆 和 神 经 疾 病 等 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基 础 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ); 安 徽 医 科 大 学 校 科 研 基 金 ( 编 号 :2013xkj002) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 基 础 医 学 院 生 理 学 教 研 室, 合 肥 蚌 埠 医 学 院 生 理 学 教 研 室, 蚌 埠 北 京 大 学 生 命 科 学 学 院 神 经 疾 病 与 神 经 网 络 实 验 室, 北 京 作 者 简 介 : 张 玉 松, 男, 硕 士 研 究 生 ; 祝 延, 男, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 C57/BL6 型 小 鼠 10 只, 出 生 约 14 d, 体 重 约 30g, 清 洁 级, 由 北 京 维 通 利 华 公 司 提 供, 雌 雄 不 限 1.2 仪 器 与 试 剂 主 要 仪 器 LeicaVT1200 型 振 动 切 片 机 (LeicaBiosystemsNuslochGmbH, 德 国 ); 电 极 拉 制 仪 (P 98, 美 国 ); 膜 片 钳 系 统 (HEKA, 德 国 ); 相 差 红 外 微 分 干 涉 显 微 镜 (Olympus, 日 本 ) 主 要 试 剂 实 验 试 剂 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 解 剖 液 (mmol/l):sucrose213 Glucose10 KCl 3 NaH 2 PO 4 1 CaCl MgCl 2 5 NaHCO 3 26, 用 NaOH 或 HCl 调 ph 至 7.30~7.40, 渗 透 压 约 为 310 mosm 人 工 脑 脊 液 (mmol/l):glucose10 NaCl 125 KCl5 NaH 2 PO CaCl MgCl NaHCO 3 26, 调 ph 至 7.30~7.40 电 极 内 液 (mmol/l):kcl145 NaCl5 HEPES10 EGTA 5 MgATP4 Na 2 GTP0.3, 调 ph 值 至 7.30~7.40, 渗 透 压 约 为 310mOsm 1.3 制 备 小 鼠 海 马 脑 片 取 约 14d 的 小 鼠, 用 1% 戊 巴 比 妥 钠 腹 腔 注 射 麻 醉 [3] 麻 醉 昏 迷 后 迅 速 移 除 大 脑, 固 定 头 部 用 手 术 剪 刀 分 别 沿 着 颅 骨 中 线 和 颅 底 两 侧 方 向 剪 开 头 颅 骨, 同 时 不 断 地 用 约 0 解 剖 液 冲 洗 大 脑 ( 解 剖 液 预 先 充 含 95% O 2 +5% CO 2 混 合 气 体 30min), 然 后 把 整 个 大 脑 置 于 有 约 0 解 剖 液 的 圆 盘 中, 用 手 术 刀 和 弯 镊 子 剔 除 嗅 球 小 脑, 沿 颅 中 线 分 开 两 大 脑 半 球 并 除 去 海 马 周 围 白 纸 和 皮 质, 修 整 脑 块 后 在 底 座 上 点 少 量 α 氰 基 丙 烯 酸 乙 酯 胶 水 以 便 海 马 组 织 牢 固 站 立, 迅 速 将 底 座 放 在 盛 有 约 0 解 剖 液 的 切 片 机 槽 里 并 不 断 充 以 混 合 气 体, 沿 矢 状 位 切 成 400μm 厚 的 脑 片, 把 脑 片 放 在 盛 有 人 工 脑 脊 液 ( 预 先 充 混 合 气 体 30min) 的 玻 璃 杯 中 室 温 下 孵 育 1~2h 后 备 用 [4] 1.4 固 定 及 灌 流 脑 片 应 用 盖 网 固 定 法, 即 铂 金 丝 制 作 U 型 框 架 周 围 绕 以 尼 龙 线 绳 并 胶 粘 固 定 把 U 型 网 框 架 轻 放 于 脑 片 上, 用 蠕 动 泵 向 脑 片 恒 速 灌 流 混 合 气 体 饱 和 的 人 工 脑 脊 液, 流 速 1~2ml/min, 使 脑 片 浸 泡 在 液 面 下 2mm [5]

47 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 神 经 元 形 态 学 观 察 及 电 生 理 记 录 应 用 红 外 显 微 镜 结 合 电 荷 耦 合 摄 像 系 统 观 察 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 结 构 特 点 电 压 钳 下, 钳 制 电 位 在 -60 mv, 记 录 神 经 元 自 发 放 电 电 流, 给 予 步 阶 脉 冲 刺 激 记 录 不 同 离 子 通 道 电 流 并 作 电 流 电 压 曲 线 ; 电 流 钳 下, 记 录 海 马 神 经 元 的 静 息 膜 电 位 值 和 动 作 电 位 变 化 情 况 这 些 获 得 的 信 号 通 过 放 大 器 放 大 后 输 出, 应 用 IGOR 软 件 分 析 作 图 1.6 统 计 学 处 理 采 用 GraphpadPrism5.0 软 件 进 行 统 计 分 析 数 据 以 x±s 珋 表 示, 两 组 间 比 较 采 用 t 检 验, 多 组 间 比 较 用 方 差 分 析 (Two WayANOVA) 2 结 果 2.1 脑 片 神 经 元 的 选 择 和 形 态 学 观 察 10 倍 镜 下 沿 着 脑 片 锥 体 细 胞 线 找 到 海 马 CA1 与 CA3 区 域, 然 后 换 成 40 倍 镜 观 察 细 胞, 通 过 红 外 微 分 干 涉 显 微 镜 结 合 电 荷 耦 合 摄 像 系 统 可 以 看 到 CA1 与 CA3 神 经 元 立 体 结 构 清 晰, 胞 体 与 突 起 明 显, 胞 体 呈 锥 形 或 椭 圆 形, 死 亡 细 胞 少,CA1 神 经 元 胞 体 相 对 CA3 神 经 元 胞 体 较 小, 选 择 这 两 个 区 域 的 神 经 元 进 行 膜 片 钳 电 生 理 记 录, 高 阻 封 接 顺 利, 见 图 1 ms, 可 以 记 录 到 全 细 胞 跨 膜 总 电 流 变 化 图 形, 外 向 电 流 为 钾 离 子 通 道 电 流, 内 向 电 流 为 钠 离 子 通 道 电 流, 见 图 3 以 去 极 化 电 压 为 横 轴, 以 神 经 元 在 该 刺 激 电 压 时 产 生 的 离 子 电 流 幅 值 为 纵 轴 绘 制 出 离 子 通 道 的 电 流 电 压 (I V) 曲 线, 用 电 流 密 度 代 替 电 流 幅 值 ( 电 流 密 度 = 离 子 电 流 幅 值 / 膜 电 容, 单 位 为 PA/ PF) 计 算 [6] 从 图 4 可 知,CA1 与 CA3 神 经 元 钾 离 子 通 道 激 活 电 压 约 在 -50mV, 随 着 去 极 化 脉 冲 电 压 的 增 加, 电 流 密 度 也 随 着 增 加,CA1 与 CA3 神 经 元 钾 离 子 通 道 电 流 密 度 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (F=4 41,P=0 05), 给 予 不 同 去 极 化 脉 冲 电 压 与 钾 离 子 通 道 电 流 密 度 二 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05);CA1 与 CA3 神 经 元 钠 离 子 通 道 电 流 密 度 约 在 -50mV 激 活 去 极 化,-40mV 后 逐 渐 变 小, 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (F=3 04,P=0 09), 给 予 不 同 去 极 化 脉 冲 电 压 与 钠 离 子 通 道 电 流 密 度 二 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 图 1 红 外 干 涉 显 微 镜 下 观 察 海 马 脑 片 神 经 元 形 态 结 构 特 点 40 A:CA1 神 经 元 ;B:CA3 神 经 元 图 2 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 自 发 性 突 触 后 电 流 和 电 流 的 幅 度 及 频 率 A:CA1 神 经 元 自 发 性 突 触 后 电 流 ;B:CA3 神 经 元 自 发 性 突 触 后 电 流 2.2 全 细 胞 膜 片 钳 记 录 电 压 钳 模 式 钳 制 电 位 在 -60mV, 记 录 海 马 CA1 神 经 元 的 自 发 性 突 触 后 电 流 和 CA3 神 经 元 的 自 发 性 突 触 后 电 流, 见 图 2 分 析 其 电 流 的 幅 度 和 频 率,CA1 和 CA3 神 经 元 突 触 后 电 流 幅 度 和 频 率 分 别 为 [(531 10±88 03)PA,n=9],[(305 00± 90 03)PA,n=6] 和 [(0 74±0 15)Hz,n=9], [(1 08±0 12)Hz,n=6], 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (t=1 72,P=0 10;t=1 60,P=0 13) 钳 制 电 位 置 于 -60mV, 从 -60mV 开 始 给 予 20mV 步 阶 脉 冲 去 极 化 刺 激 至 80mV, 每 个 刺 激 时 间 为 200 图 3 在 同 一 神 经 元 上 给 予 不 同 步 阶 脉 冲 刺 激 所 记 录 的 电 流 变 化 左 上 图 : 全 细 胞 电 压 钳 记 录 结 果 ; 右 下 图 : 脉 冲 刺 激 方 波

48 1074 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 无 统 计 学 意 义 (F=3 57,P=0 06), 见 图 6C 图 5 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 的 动 作 电 位 记 录 及 其 幅 度 和 频 率 A:CA1 神 经 元 动 作 电 位 发 放 ;B:CA3 神 经 元 动 作 电 位 发 放 图 4 海 马 脑 片 CA1 和 CA3 神 经 元 钾 离 子 和 钠 离 子 通 道 电 流 的 I-V 曲 线 A: 钾 离 子 通 道 电 流 的 I-V 曲 线 ;B: 钠 离 子 通 道 电 流 的 I-V 曲 线 电 流 钳 模 式 全 细 胞 电 流 钳 模 式 下 记 录 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 的 动 作 电 位 放 电 情 况 见 图 5 分 析 CA1 与 CA3 神 经 元 的 动 作 电 位 幅 度 和 频 率, 结 果 显 示 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 的 幅 度 和 频 率 分 别 为 [(93 19±4 08) mv,n=12], [(101 10±4 42)mV,n=10] 和 [(0 96±0 33) Hz,n=12],[(0 95±0 34)Hz,n=10], 二 者 之 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (t=1 30,P =0 20;t=0 02,P =0 97) 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 静 息 膜 电 位 分 别 为 [(-60 07±0 43)mV,n=12],[(-60 44± 1 39)mV,n=10]; 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 峰 峰 间 距 分 别 为 [( ± )ms,n= 12)],[( ± )ms,n=10], 二 者 之 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 (t=0 27,P =0 78;t= 0 29,P=0 77) 钳 制 电 位 置 于 -60mV, 以 50PA 步 阶 脉 冲 电 流 从 -650PA 至 50PA, 可 记 录 到 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 发 放, 见 图 6A B 取 步 阶 脉 冲 电 流 从 -300PA 到 -50PA 的 动 作 电 位 发 放 数 作 统 计, 结 果 显 示 步 阶 脉 冲 电 流 与 动 作 电 位 发 放 数 二 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 海 马 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 发 放 数 二 者 之 间 差 异 图 6 诱 发 海 马 脑 片 CA1 与 CA3 神 经 元 动 作 电 位 及 其 发 放 数 A:CA1 神 经 元 动 作 电 位 及 其 发 放 ;B:CA3 神 经 元 动 作 电 位 及 其 发 放 ;C: 动 作 电 位 发 放 数 统 计 结 果 (CA1:n=19;CA3:n=13) 3 讨 论 细 胞 培 养 或 急 性 分 离 的 细 胞 可 以 用 于 多 项 实 验 技 术 的 研 究, 却 难 以 运 用 于 膜 片 钳 记 录 研 究 所 需 电

49 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1075 流, 且 对 神 经 细 胞 离 子 通 道 有 不 同 程 度 的 损 伤, 过 程 复 杂 [7] 离 体 海 马 脑 片 具 有 有 序 排 列 的 神 经 元 和 神 经 纤 维 完 整 的 神 经 解 剖 通 路 定 位 明 显 的 胞 体 突 起 稳 定 的 离 子 通 道 性 质 等 特 点, 易 于 进 行 电 生 理 记 录 操 作, 已 成 为 研 究 神 经 系 统 突 触 可 塑 性 和 神 经 系 统 疾 病 的 良 好 标 本 [8] [9] 研 究 显 示, 离 子 通 道 广 泛 存 在 于 神 经 系 统 中, 与 神 经 系 统 疾 病 ( 如 脑 缺 血 脊 髓 缺 血 癫 痫 及 抑 郁 等 ) 密 切 相 关, 且 有 些 离 子 通 道 在 脑 缺 血 和 癫 痫 的 治 疗 中 发 挥 重 要 的 保 护 作 用 ; 同 时 离 子 通 道 受 体 也 是 一 些 药 物 作 用 的 靶 点 急 性 离 体 脑 片 培 养 是 近 年 发 展 起 来 的 一 种 器 官 培 养 方 法, 相 比 于 传 统 的 体 外 培 养 的 神 经 元, 离 体 脑 片 既 保 留 了 细 胞 的 组 织 结 构, 还 保 留 了 细 胞 与 细 胞 的 内 在 联 系 [10] 更 重 要 的 是, 脑 片 培 养 可 以 模 拟 在 体 生 理 环 境 排 除 了 实 验 中 ph 值 温 度 离 子 浓 度 等 不 利 因 素 的 影 响, 为 研 究 离 子 通 道 的 生 理 特 性 和 药 理 特 性 等 提 供 了 理 想 的 模 型 需 求 [11] 本 实 验 结 果 显 示, 海 马 脑 片 能 够 清 晰 的 观 察 CA1 与 CA3 神 经 元 的 结 构 特 征 和 电 生 理 特 性 结 构 上,CA1 与 CA3 神 经 元 立 体 结 构 清 晰, 树 突 胞 体 明 显 ; 与 CA3 神 经 元 相 比,CA1 神 经 元 顶 树 突 较 长, 树 突 分 支 较 多 形 成 一 个 树 突 树, 胞 体 直 径 较 小 ; 这 些 结 构 特 征 在 急 性 培 养 的 神 经 元 很 难 观 察 到 另 外, CA1 神 经 元 与 CA3 神 经 元 结 构 上 的 异 同 源 于 单 个 神 经 元 内 部 特 性 还 是 区 域 环 路 因 素, 目 前 还 未 完 全 清 楚 [12] 从 本 实 验 结 果 显 示,CA1 与 CA3 神 经 元 自 发 突 触 后 电 流 的 幅 度 达 几 百 甚 至 上 千 PA, 发 放 频 率 约 在 1.0Hz CA1 与 CA3 神 经 元 静 息 膜 电 位 值 均 约 在 -60mV, 未 注 射 去 极 化 电 流 时, 动 作 电 位 的 幅 度 大 约 100mV, 发 放 频 率 在 1~10Hz; 在 给 予 注 射 去 极 化 电 流 时, 动 作 电 位 的 阈 电 位 约 在 -50mV, [13] 这 些 电 生 理 特 性 与 以 往 的 文 献 报 道 相 一 致 钾 离 子 电 流 对 调 节 神 经 元 的 兴 奋 性 至 关 重 要,CA1 与 CA3 神 经 元 钾 离 子 通 道 表 达 特 性 的 不 同 也 许 能 够 解 释 其 放 电 形 式 的 不 同, 这 也 帮 助 理 解 为 什 么 CA1 神 经 元 参 与 癫 痫 样 放 电 事 件 的 发 生 比 CA3 神 经 元 多 综 上 所 述, 制 备 急 性 离 体 海 马 脑 片 能 够 模 拟 在 体 环 境 使 离 子 通 道 性 质 保 持 稳 定,CA1 与 CA3 神 经 元 结 构 及 电 生 理 特 性 的 异 同, 决 定 了 具 有 类 似 而 又 不 同 的 功 能, 为 进 一 步 研 究 与 CA1 和 CA3 神 经 元 相 关 的 神 经 系 统 疾 病 等 提 供 了 理 论 基 础 参 考 文 献 [1] 林 毅 勇, 邵 福 源, 孙 刚, 等. 急 性 缺 氧 对 大 鼠 海 马 神 经 元 N 甲 基 D 天 门 冬 氨 酸 诱 发 电 流 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 康 复, 2004,8(4): [2] NewrzelaD,PahlavanPS,KrugerC,etal.Thefunctiongenome ofca1andca3neuronsundernativeconditionsandinresponse toischemia[j].bmcgenomic,2007,8:370. [3] 杨 李 果, 曾 庆 文, 张 旭 亮, 等.NR1 基 因 敲 除 对 小 鼠 前 额 叶 脑 区 LTP 的 影 响 [J]. 华 东 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),2012,47 (1): [4] MohajeraniMH,SivakumaranS,ZacchiP,etal.Corelatednet workactivityenhancessynapticeficacyviabdnfandtheerk pathwayatimmatureca1 CA3connectionsinthehippocampus [J].PNAS,2007,104(32): [5] 雷 革 胜, 万 业 宏, 王 玉 英, 等. 应 用 红 外 可 视 脑 片 膜 片 钳 技 术 研 究 大 鼠 海 马 CA1 神 经 元 电 生 理 特 性 [J]. 第 四 军 医 大 学 学 报, 2004,25(13): [6] 张 晓 芸, 王 越, 张 健, 等. 蝎 毒 耐 热 蛋 白 对 大 鼠 海 马 神 经 元 钠 通 道 的 抑 制 作 用 [J]. 生 理 学 报,2007,59(2): [7] KayAR,KrupaDJ.Acuteisolationofneuronsfromthemature mammaliancentralnervoussystem[j].curprotocneurosci, 2001:Chapter6. [8] 刘 振 伟, 李 立 君, 刘 传 缋. 海 马 脑 片 盲 法 膜 片 钳 全 细 胞 记 录 技 术 [J]. 生 理 学 报,2001,53(5): [9] 孙 晖, 李 国 超, 谢 敏, 等.P2 受 体 介 导 对 大 鼠 三 叉 神 经 节 神 经 元 电 压 门 控 性 钙 离 子 通 道 的 作 用 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2013,48(3): [10] 杨 丽 君, 崔 红, 杨 爱 军, 等. 大 鼠 全 脑 脑 片 培 养 及 缺 氧 缺 糖 模 型 的 建 立 [J]. 实 验 动 物 与 比 较 医 学,2009,29(5): [11] 黄 文 先, 彭 碧 文, 何 小 华. 脑 片 模 型 在 癫 痫 实 验 中 的 应 用 [J]. 武 汉 大 学 学 报 ( 医 学 版 ),2012,33(3): [12]MizusekiK,RoyerS,DibaK,etal.Activitydynamicsandbe havioralcorelatesofca3andca1hippocampalpyramidalneu rons[j].hippocampus,2012,22(8): [13] AndersenP,MorisR,AmaralD,etal.TheHippocampusBook [M].NewYork:OxfordUniversityPres,2007: Comparativeanalysisofbasicelectrophysiologicalcharacteristics ofhippocampalca1andca3neuronsinmice ZhangYusong 1,ZhuYan 1,2,GuoChengbin 1,etal ( 1 DeptofPhysiology,ColegeofBasicMedicine,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofPhysiology,BengbuMedicalColege,Bengbu ) Abstract Objective Acutemousehippocampalsliceswerepreparedforpatchclamprecordinginordertoobserve

50 1076 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 兔 MSCs 对 韧 带 移 植 物 骨 道 内 愈 合 影 响 的 光 镜 观 察 刘 靖, 徐 斌, 徐 洪 港, 王 瑞, 涂 俊 摘 要 目 的 探 讨 兔 自 体 外 周 血 间 充 质 干 细 胞 (MSCs) 对 韧 带 移 植 物 在 骨 道 内 愈 合 的 影 响 方 法 8 只 新 西 兰 白 兔 随 机 均 分 为 实 验 组 和 对 照 组 粒 细 胞 刺 激 因 子 动 员 各 组 兔 后, 抽 取 外 周 血 分 离 纯 化 培 养 干 细 胞 实 验 组 移 植 入 MSCs 和 生 物 蛋 白 胶 混 合 物 ; 对 照 组 移 植 入 生 物 蛋 白 胶 分 别 于 周 4 个 时 间 点 每 组 各 处 死 1 只 兔 行 形 态 学 观 察, 术 后 4 个 时 间 点 对 两 组 标 本 进 行 高 倍 镜 下 成 纤 维 细 胞 计 数, 采 用 单 向 方 差 分 析 及 SNK 法 检 验, 比 较 韧 带 重 建 术 后 移 植 肌 腱 与 骨 道 愈 合 情 况 结 果 术 后 8 周 实 验 组 移 植 肌 腱 与 骨 道 界 面 连 接 紧 密, 出 现 Sharpey 纤 维 及 软 骨 移 行 带, 术 后 12 周 对 照 组 出 现 Sharpey 纤 维, 但 连 接 组 织 中 胶 原 排 列 紊 乱 实 验 组 与 对 照 组 在 4 个 时 间 点 高 倍 镜 下 成 纤 维 细 胞 计 数 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 结 论 MSCs 能 促 进 韧 带 重 建 术 后 移 植 肌 腱 在 骨 道 内 愈 合 关 键 词 间 充 质 干 细 胞 ; 膝 关 节 ; 韧 带 ; 移 植 物 ; 愈 合 中 图 分 类 号 R686 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 随 着 国 民 健 身 意 识 不 断 加 强, 交 叉 韧 带 损 伤 越 来 越 多 见 交 叉 韧 带 是 膝 关 节 重 要 的 静 力 稳 定 结 构, 损 伤 后 难 以 自 愈 且 治 疗 难 度 较 大, 如 不 及 时 治 疗 或 治 疗 不 当, 随 之 出 现 膝 关 节 不 稳, 关 节 其 他 韧 带 松 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : MH157) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 科 四 病 区, 合 肥 作 者 简 介 : 刘 靖, 男, 硕 士 研 究 生 ; 徐 斌, 男, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: [email protected] 弛, 半 月 板 损 伤, 关 节 软 骨 退 变 等 并 发 症, 导 致 膝 关 节 退 变 及 骨 性 关 节 病 的 早 期 发 生 [1-3] 目 前 主 要 手 术 方 式 为 膝 关 节 镜 下 自 体 软 组 织 移 植 物 ( 绳 肌 半 腱 肌 股 薄 肌 等 ) 前 交 叉 韧 带 重 建 术 随 着 微 创 [4] 技 术 的 不 断 发 展, 该 手 术 方 式 日 益 成 熟, 但 文 献 报 道, 其 失 败 率 仍 为 0 7% ~10 0%, 骨 道 内 愈 合 不 良 是 导 致 失 败 的 重 要 原 因 之 一 目 前, 关 于 移 植 肌 腱 在 骨 道 内 愈 合 的 研 究 愈 来 愈 多, 包 括 物 理 干 扰 生 理 机 械 刺 激 骨 替 代 材 料 填 充 骨 膜 移 植 物 生 长 因 子 和 基 因 治 疗 组 织 工 程 技 术 及 干 细 胞 移 植 等 [5] 随 着 组 织 工 程 技 术 的 日 益 成 熟, 间 充 质 干 细 胞 (mes enchymalstem cels,mscs) 促 进 骨 道 内 愈 合 的 研 究 尤 为 突 出 1 材 料 与 方 法 1.1 MSCs 的 分 离 培 养 及 鉴 定 粒 细 胞 刺 激 因 子 动 员 后, 抽 取 兔 外 周 血 5ml, 采 用 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 细 胞 接 种 到 5ml 完 全 培 养 基 中,37 5%CO 2 恒 温 箱 中 培 养,48~72h 后, 首 次 换 液, 以 后 每 72h 换 液 1 次, 观 察 细 胞 形 态 及 生 长 情 况, 待 细 胞 呈 涡 旋 状 生 长 并 达 90% 时 进 行 传 代 培 养 取 第 3 代 生 长 旺 盛 细 胞 行 MSCs 表 面 抗 原 CD11b CD34 CD29 CD90 检 测 1.2 动 物 模 型 的 建 立 及 分 组 8 只 兔 随 机 均 分 为 实 验 组 和 对 照 组 麻 醉 消 毒 铺 巾 后 取 出 趾 长 屈 肌 腱, 将 肌 腱 对 折, 对 折 后 其 直 径 为 (2 5±0 3)mm, thebasicelectrophysiologicalpropertiesofhippocampalca1andca3neurons.methods Thestructureproperties andbasicelectrophysiologicalpropertiesofmousehippocampalsliceswereobservedandrecordedbyinfrareddifer entialinterferencecontrasttechniqueandpatchclamp,respectively.results Thehippocampalslicestructurewas observedclearlywithhealthyglosandfewdeadneurons,andthehippocampalneuronsweresealedeasilywith patchclamptechnique.thespontaneousdischargecurentandactionpotentialbetweenca1andca3neuronsdid notshowsignificantdiferencesinamplitude,frequency,interspike intervalsandrestingmembranepotentials.the curentdensityofsodium andpotasium ionwheninjectingpulsestimulationsandtheactionpotentialnumbers wheninjectingstepcurentsshowedsignificantdiferencesinca1andca3neurons(p<0 05).Conclusion SomebasicelectrophysiologicalpropertiesofhippocampalCA1andCA3neuronsprovidecertaintheoreticalbasisfor memoryandnervediseasesresearch. Keywords patchclamp;mouse;brainslices;hippocampalneurons;electrophysiology

51 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1077 长 度 为 (6 2±0 3)mm, 对 折 肌 腱 两 游 离 端 用 无 菌 1 0 缝 线 缝 合, 折 叠 处 用 0 25mm 钢 丝 穿 过 后 备 用 再 从 髌 旁 内 侧 入 路, 以 髌 骨 为 中 心, 作 长 约 2 5cm 的 切 口, 依 次 切 开 皮 肤, 筋 膜, 关 节 囊 及 内 侧 支 持 带, 将 髌 骨 外 翻 脱 位, 切 除 脂 肪 垫, 显 露 前 交 叉 韧 带 切 除 前 交 叉 韧 带 (anteriorcruciateligament,acl) 股 骨 及 胫 骨 上 下 止 点 并 作 标 记, 用 与 肌 腱 直 径 相 匹 配 的 手 摇 钻 (2.5mm 克 氏 针 ) 于 标 记 处 分 别 钻 取 胫 骨 及 股 骨 隧 道, 将 移 植 物 通 过 两 端 的 牵 引 钢 丝 及 缝 线 引 入 骨 隧 道, 在 股 骨 隧 道 终 点 外 侧 以 1.0mm 克 氏 针 从 外 向 内 钻 两 个 间 隔 0.3cm 单 皮 质 骨 道, 将 钢 丝 两 端 穿 过 骨 道 后 固 定 于 股 骨 内 侧, 再 用 1.0mm 克 氏 针 在 胫 骨 结 节 稍 偏 下 的 皮 质 骨 上 钻 孔, 将 缝 线 穿 孔 而 过 后 屈 膝 30 拉 紧 韧 带 固 定 反 复 冲 洗 股 骨 道 内 残 留 的 血 迹, 在 股 骨 隧 道 外 口 附 近, 按 照 分 组 设 计 注 入 胶 体 ( 实 验 组 移 植 入 MSCs 和 生 物 蛋 白 胶 混 合 物, 对 照 组 移 植 入 生 物 蛋 白 胶 ), 逐 层 缝 合 切 口 屈 膝 30 位 石 膏 固 定 术 肢, 术 后 预 防 感 染 1.3 标 本 处 理 及 组 织 学 观 察 分 别 于 术 后 周 各 组 处 死 1 只 兔, 解 剖 膝 关 节 并 于 膝 关 节 上 下 各 2.0cm 离 断 完 整 保 留 膝 关 节 标 本 固 定 脱 钙 后 制 成 石 蜡 切 片,HE 染 色 后 行 形 态 学 观 察 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 比 较 ACL 重 建 术 后 4 个 时 间 点 高 倍 镜 下 腱 - 骨 界 面 成 纤 维 细 胞 计 数 2 结 果 2.1 MSCs 的 生 物 学 特 性 原 代 细 胞 在 开 始 培 养 时 没 有 贴 壁, 散 在 分 布 于 培 养 瓶 瓶 底, 细 胞 呈 圆 形, 没 有 突 起, 胞 体 透 亮, 折 光 性 好, 核 呈 卵 圆 性 随 着 培 养 时 间 的 延 长, 细 胞 慢 慢 开 始 贴 壁, 少 部 分 呈 集 落 生 长, 细 胞 有 少 量 突 起, 胞 质 内 颗 粒 增 多, 折 光 性 差, 核 较 大 且 不 清 楚, 呈 扁 圆 形 培 养 48~72h 后, 贴 壁 细 胞 两 端 伸 出 伪 足, 绝 大 部 分 呈 形 态 均 一 的 短 梭 形 首 次 换 液 后 细 胞 贴 壁 及 增 生 速 度 加 快, 后 可 见 明 显 集 落 形 成, 细 胞 克 隆 样 生 长, 细 胞 形 态 均 一, 呈 长 梭 形, 融 合 排 列 成 漩 涡 状 待 培 养 11~14d 细 胞 已 基 本 贴 满 瓶 底 就 可 以 传 代 了, 胰 酶 消 化 的 细 胞 呈 圆 形 且 胞 体 透 亮, 折 光 性 好, 传 代 接 种 后 细 胞 贴 壁 及 克 隆 样 增 生 更 加 迅 速, 形 态 更 加 均 一, 均 呈 成 纤 维 长 梭 形 外 观 2.2 组 织 标 本 观 察 膝 关 节 标 本 大 体 观 察 每 组 分 别 于 术 后 周 处 死 1 只 兔, 兔 膝 关 节 切 口 愈 合 良 好, 无 感 染, 有 明 显 关 节 腔 积 液, 滑 膜 大 量 增 生, 软 骨 无 明 显 损 伤 移 植 肌 腱 结 构 完 整, 色 泽 较 正 常 肌 腱 暗 淡, 呈 淡 红 色, 张 力 可, 无 松 弛, 无 坏 死 及 断 裂, 移 植 肌 腱 两 端 与 骨 隧 道 愈 合 良 好 2 周 时 股 骨 隧 道 外 口 间 隙 仍 可 见 少 量 胶 体,4 周 时 股 骨 隧 道 外 口 间 隙 无 胶 体, 股 骨 隧 道 内 口 可 见 少 量 瘢 痕 组 织 及 骨 组 织,8 周 时 股 骨 隧 道 外 口 出 现 少 量 骨 样 组 织, 内 口 出 现 大 量 瘢 痕 组 织,12 周 时 骨 道 外 口 可 见 较 多 骨 样 组 织, 移 植 肌 腱 与 隧 道 壁 粘 连 石 蜡 切 片 HE 染 色 1 术 后 2 周 : 对 照 组 : 骨 道 内 界 面 区 连 接 疏 松, 间 隙 清 晰 可 辩 界 面 区 可 见 由 少 量 血 管, 成 纤 维 细 胞 和 炎 性 细 胞 组 成 的 新 生 肉 芽 组 织 ( 图 1A2); 实 验 组 : 界 面 区 结 合 亦 不 紧 密, 填 充 组 织 仍 为 血 管, 成 纤 维 细 胞 和 炎 性 细 胞 组 成, 但 出 现 排 列 不 规 整 且 不 成 熟 的 类 软 骨 细 胞 ( 图 1A1) 2 术 后 4 周 : 对 照 组 : 界 面 区 连 接 相 对 较 紧 密, 填 充 组 织 血 管 含 量 少, 成 纤 维 细 胞 和 炎 性 细 胞 增 多, 并 出 现 稀 疏 不 成 熟 类 软 骨 细 胞 ( 图 1B2); 实 验 组 : 界 面 区 连 接 紧 密, 已 无 明 显 界 限, 可 见 炎 性 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 及 排 列 不 规 整 类 软 骨 细 胞, 新 生 骨 质 向 肌 腱 长 入, 已 出 现 软 骨 化 骨 过 程 ( 图 1B1) 3 术 后 8 周 : 对 照 组 : 界 面 区 连 接 紧 密, 炎 性 细 胞 减 少, 成 纤 维 细 胞 增 生, 胶 原 纤 维 合 成 增 多, 排 列 方 向 不 规 整 ( 图 1C2); 实 验 组 : 界 面 区 连 接 紧 密, 类 软 骨 细 胞 逐 渐 成 熟, 排 列 较 规 整, 胶 原 纤 维 大 量 合 成, 出 现 与 骨 隧 道 轴 向 垂 直 的 Sharpey 纤 维 及 软 骨 移 行 带 ( 图 1C1) 4 术 后 12 周 : 对 照 组 : 界 面 区 出 现 Sharpey 纤 维, 但 连 接 组 织 中 胶 原 排 列 紊 乱 ( 图 1D2); 实 验 组 : 界 面 区 可 见 到 大 量 排 列 有 序 的 Sharpey 纤 维 及 规 整 排 列 的 类 软 骨 细 胞 ( 图 1D1) 2.3 腱 骨 界 面 成 纤 维 细 胞 计 数 术 后 4 个 时 间 点 对 两 组 标 本 进 行 腱 - 骨 界 面 高 倍 镜 下 (HE 染 色 ) 成 纤 维 细 胞 计 数, 见 表 1, 每 个 标 本 取 3 个 高 倍 镜 视 野, 每 组 4 个 时 间 点 各 12 个 高 倍 镜 视 野 方 差 分 析 结 果 显 示 两 组 在 4 个 时 间 点 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=30 91,P<0 05) 3 讨 论 3.1 界 面 愈 合 的 止 点 结 构 特 点 及 组 织 学 转 归 移 植 物 在 关 节 腔 里 经 历 了 缺 血 坏 死 再 血 管 化 细 胞 增 殖 和 塑 形 韧 带 化 等 过 程 移 植 物 在 骨 道 内 愈 合 分 为 两 种 方 式, 即 直 接 止 点 和 间 接 止 点 [6] 直 接 止 点, 类 似 于 正 常 交 叉 韧 带 的 过 渡 形 式, 其 特 征 性 结 构 是 移 行 的 纤 维 软 骨 带, 从 韧 带 向 止 点 分 别 是 韧 带 纤

52 １７８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 图 １ 术后 ４个时间点腱 骨界面区 ＨＥ １ １ 实验组 ２ 对照组 Ａ ２周 Ｂ ４周 Ｃ ８周 Ｄ １ ２周 组别 实验 对照 表 １ 术后两组标本 ＨＥ染色界面区成纤维细胞计数 于外源基因的转染及表达调控等特点使其成为理想 珋±ｓ 的比较 ｎ ８ 个 ｘ 的组织工程种子细胞而用于骨道内肌腱移植物愈合 时间 ２周 ４周 ８周 １２周 １２ ５８±１ ６５ １５ ３５±２ １２ １８ ６２±３ ４６ １４ ６８±２ ５２ ３ ４９±１ ５６ ５ ６５±１ ５８ ７ ３２±１ ２８ ４ ９５±１ ６８ 研究中 Ｌ ｍ ａ ｌ １８ 使用 绳肌自体移植物行兔 ｓ被植入生物蛋白胶 双侧 ＡＣＬ重建 实验组 ｂｍｃｓ 对照组中则为空白纤维蛋白胶 结果显示 ｂｍｃｓ ｓ改 善了愈合过程并促进了生物性能的提高 本实验考 与对照组比较 Ｐ ５ 虑到 ＭＳＣｓ是多种间充质细胞的前体细胞 在体内 维软骨 钙化软骨及骨 在钙化软骨和纤维软骨之间 ７ ８ 或体外特定的诱导条件下 可分化为脂肪 骨 软骨 其止点的特有的四层移行结 肌肉 肌腱 韧带 神经 肝 心肌 内皮等多种组织细 构决定了其传递 缓冲应力 降低负荷 还在移植物 胞 理论上可以促进骨 肌腱结合部多种细胞的增 有 潮线 相隔 的生长塑形中的重要作用 ９ １ １ 间接止点其特点 生 从而促进界面愈合 为肌腱与骨组织间形成的穿透性的胶原纤维 走向 参考文献 通常与骨隧道轴向垂直 这种胶原纤维为 Ｓｈａ ｒ ｐ ｙ 样纤维 是肌腱与骨形成连接的一个重要标志 理 想的韧带重建愈合止点应为直接止点 而交叉韧带 重建术后愈合多为间接愈合 但众多学者观点不一 １ ２ Ｒｏ ｄ ｏ ａ ｌ 在狗趾长伸肌的上止点移植到胫骨近 １ Ｐｒ ｏ ｃ ｈ ｏ ｐｄｊ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗｓ ｒ ｏ ｍａ ｌｃ ｌ ｌａ ｓｓ ｍｃ ｌ ｌ ｓｆ ｏ ｒｎ ｏ ｎ ｈ ｍａ ｏ ｐ ｃ ｓ ｓ ｕ Ｊ Ｓｃ ｎ ｃ １ ９ ９ ７ ２ ７ ６ ５ ３ ９ ７ １ ４ ２ Ｐ ｎ ｇ Ｍ Ｆ Ｍａ ｃ ｋａ ｙａｍ Ｂ ｋｓｃ ａ ｌ Ｍｕｌ ｌ ｎ ａ ｇ ｐ ｏ ｎ ａ ｌ ｏ ｆａ ｄｕ ｌ ｈ ｕｍａ ｎｍ ｓ ｎｃ ｈ ｙ ｍａ ｌｓ ｍｃ ｌ ｌ ｓ Ｊ Ｓｃ ｎ ｃ １９ ９ ９ ２８ ４ ５ ４ １ １ １ ４ ３ ７ 端的骨隧道研究中 发现愈合界面为间接止点 而 ３ Ｄａ ｖ ｓｐｙ Ｆｒ ａ ｚ ｒｃｒ Ｓ ｈａ ｐ ｒ ｏｊｒ ａ ｌ Ａｇ ｒ ａ ｌ ａ ｄｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｎ １ ３ Ｐａ ｎｎ ａ ｌ 在兔自体骨 髌腱 骨重建兔 ＡＣＬ中 ｆ ｆ ｃ ｓｏ ｆ ｎ ｓ ｕ ｌ ｎｌ ｋ ｇ ｒ ｏ ｗ ｈｆ ａ ｃ ｏ ｒｏ ｎｈ ｕｍａ ｎｏ ｓ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｌ ｋ ｃ ｌ ｌ ｓ Ｊ Ｂ ｏ ｃ ｈ ｍｊ １９ ９ ７ ３ ２ ４ ３ ７ ５ ３ ６ 发现愈合界面为直接接止点 ３ ２ ＭＳＣｓ对骨道内移植肌腱愈合的影响 近年 来 国内外学者 １４ １５ 发现多种因素可促进界面区愈 合 陈鸿辉 等 １４ 发现低强度超声及功能性电刺激 可使骨 软骨等多种细胞增生 从而促进纤维软骨带 １ ５ 重建及新骨形成 Ｐａ ｎ ａ ｌ 发现带有 ＢＭＰ的注 射用磷酸钙对兔 ＡＣＬ重建后骨道内肌腱移植物愈 合有促进作用 国外研究者 １６ １７ 发现软骨可能增 ４ 王俊良 ＢＭＰ ２和 ＨＧＦ基因修饰的自体 ＭＳ Ｃｓ促进腱骨愈合 的研究 Ｄ 中国人民解放军军医进修学院 ２ １ ２ ５ 蒋略韬 李永刚 关于促进前交叉韧带重建术后腱骨愈合的研 现代医学 ２ １ ３ ４ １ ８ ５８ ４ ９ 究进展 Ｊ ６ Ｆｒ ｄｍａ ｎｋｂ Ｄ Ａｍａ ｏｍ Ｊ Ｎ ｄ ｆ ｆｄｄ ａ ｌ Ａｒ ｈ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｃａ ｎ ａａ ｎａ ｌ ｙ ｓ ｓｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｎ ｇ ｒ ｏ ｒｃ ｒ ｕｃ ａ ｌ ｇ ａ ｍ ｎ ｒ ｃ ｏ ｎ ｓ ｒ ｕｃ ｏ ｎ ａｍ ｐａ ｌ ｌ ａ ｒ ｎ ｄｏ ｎａ ｎ ｄｈａ ｍｓ ｒ ｎ ｇ ｎ ｄｏ ｎａ ｕ ｏ ｇ ｒ ａ ｆ ｓ Ｊ Ａｍ ＪＳ ｐ ｏ ｒ ｓ Ｍ ｄ ２ ３ ３ １ １ ２ １ １ ７ Ｄｏ ｂｓ ｏ ｎｋｒ Ｒ ａ ｄ ｎ ｇｌ Ｈａ ｂ ｒ ｙｍ ａ ｌ Ｃ ｎ ｒ ｆ ｕ ｇ ａ ｌ ｓ ｏ ｌ ａ ｏ ｎｏ ｆ 强骨 肌腱结合部移行区的再生 ＭＳＣｓ因具有强 ｂｏ ｎ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗｆ ｒ ｏ ｍｂｏ ｎ ａ ｎ ｍｐｒ ｏ ｖ ｄｍ ｈ ｏ ｄｆ ｏ ｒ ｈ ｒ ｃ ｏ ｖ ｒ ｙａ ｎ ｄ 大的增殖能力 多向分化潜能 取材方便 损伤小 便 ｑｕ ａ ｎ ａ ｏ ｎｏ ｆｂ ｏ ｎ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗｏ ｓ ｏ ｇ ｎ ｏ ｒｃ ｌ ｌ ｓｆ ｒ ｏ ｍｒ ａ ｂ ａ ａ ｎ ｄ

53 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1079 femurae[j].calciftisueint,1999,65(5): [8] ColterDC,ClasR,DicirolaroCM,etal.Rapidexpansionof recyclingstemcelsinculturesofplastic adherentcelsfrom hu manbonemarow[j].procnatlacadsciusa,2000,97(7): [9] BolnoPB,MorganD,WechslerA.Chemokineinducedmigration ofhumanmesenchymalstemcels:astrategyfordirectingcardiac repair[j].cardiothoracicsurgeryi,2004,199(3s):s33. [10] JagerM,WildA,FusM,etal.Advantagesofbiomatricesinchon drogenesisofpluripotentmesenchymalstem cels[j].zorthop IhreGrenzgeb,2002,140(6): [11] 李 景 红, 杜 江, 黄 金 中. 软 骨 组 织 工 程 种 子 细 胞 来 源 的 最 新 研 究 进 展 [J]. 中 国 临 床 康 复,2003,7(23): [12] RodeoSA,ArnoczkySP,TorzililiPA.Tendon healinginabone tunnel.abiomechanicalandhistologicalstudyinthedog[j].j BoneJointSurgAm,1993,75(12): [13] PanniAS,MilanoG,LucaniaL,etal.Grafthealingafteranterior cruciateligamentreconstructioninrabbits[j].clinorthop,1997, 343(10): [14] 陈 鸿 辉, 杨 小 红, 王 文, 等. 物 理 疗 法 促 进 髌 骨 - 髌 腱 结 合 部 损 伤 早 期 恢 复 的 实 验 研 究 [J]. 中 华 物 理 医 学 与 康 复 杂 志, 2006,28(5): [15]PanW,WeiY,ZhouL,etal.Comparativeinvivostudyofinject ablebiomaterialscombinedwithbmpforenhancingtendongraft osteointegrationforanteriorcruciateligamentreconstruction[j].j OrthopRes,2011,29(7): [16] WongMW,QinL,LeeKM,etal.Healingofbonetendonjunction inabonetrough:agoatpartialpatelectomymodel[j].clinor thoprelatres,2003,8(413): [17]WongMW,QinL.Engineeredalogeneicchondrocytepeletforre constructionoffibrocartilagezoneatbonetendonjunctionaprelim inaryhistologicalobservation[j].jbiomedmaterresbapplbio mater,2004,70(2): [18]LimJK,HuiJ,LiL,etal.Enhancementoftendongraftosteointe grationusingmesenchymalstemcelsinababbitmodelofanterior cruciateligamentreconstruction[j].arthroscopy,2004,20(9): ThemorphologyofefectsofMSCsforhealingofthe graftofligamentinthebonetunnel LiuJing,XuBin,XuHonggang,etal (DeptofOrthopaedicsSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toinvestigatewhetherautogenousperipheralbloodmesenchymalstem celsgelcouldpro motethehealingofthegraftofligamentinthebonetunnel.methods 8NewZealandwhiterabbitswererandomly dividedintoexperimentalandcontrolgroup.aftermobilizeingwithgranulocytecolony stimulating,autogenouspe ripheralbloodmesenchymalstemcelswereisolatedandculturedinvitro.fortheexperimentalgroup,autogenous peripheralbloodmesenchymalstemcelsgelwasinjectedintothethefemurroadtipclearanceoftheaclrecon structionmodel;forthecontrolgroup,onlyfibringluewaswereinjectedinto.respectively,in2ndweek,4thweek, 8thweek,12thweek,onerabbitofeachgroupwassacrificedformorphologyandthenumberoffibroblastswas countedattendon boneinterfacewithhestainingunderhighmagnificationmicroscopetoinvestigatewhetherautog enousperipheralbloodmesenchymalstemcelsgelcouldpromotethehealingoftendon boneinterfaceafterligament reconstruction.results Fortheexperimentalgroup,in8thweek,tendon boneinterfaceconnectionwastight,the interfacialregionshowedalargeorderlyarangementofsharpeyfibersandchondrocyte likecels,forthecontrol group,in12thweek,sharpeyfiberscouldbefound,butthecolagenfiberwasdisorder.thenumberoffibroblasts wascountedattendon boneinterface,weadoptedone wayanovaandsnktesttoanalyzethenumberoffibro blasts,thediferencebetweenexperimentalandcontrolgroupwasconsideredsignificant(p<0 05).Conclusion Autogenousperipheralbloodmesenchymalstemcelsgelcanpromotethehealingoftendon boneinterfaceafterliga mentreconstruction. Keywords mesenchymalstemcels;knee;ligament;graft;healing

54 1080 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 高 三 尖 杉 酯 碱 对 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 SHI 1 细 胞 株 诱 导 凋 亡 机 制 的 研 究 赵 雨 辰, 杨 明 珍 摘 要 目 的 研 究 高 三 尖 杉 酯 碱 (HHT) 作 用 于 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 (AML M5)SHI 1 细 胞 株 的 机 制, 是 否 可 抑 制 SHI 1 细 胞 的 增 殖 诱 导 细 胞 凋 亡 ; 了 解 HHT 对 AML M5SHI 1 细 胞 膜 电 位 的 影 响, 即 其 诱 导 的 细 胞 凋 亡 是 否 通 过 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 实 现 方 法 将 不 同 浓 度 ( μg/L) 的 HHT 作 用 SHI 1 细 胞, 瑞 氏 染 色 观 察 细 胞 镜 下 形 态 学 改 变 流 式 细 胞 术 AnnexinV FITC/PI 法 检 测 细 胞 凋 亡 CCK 8 法 测 细 胞 增 殖 抑 制 作 用 线 粒 体 膜 电 位 试 剂 盒 ( 线 粒 体 染 料 JC 1 活 细 胞 染 色 ) 检 测 线 粒 体 跨 膜 膜 电 位 (Δψm) 变 化 结 果 HHT 能 有 效 抑 制 SHI 1 细 胞 的 增 殖 诱 导 其 凋 亡, 随 着 药 物 浓 度 的 增 高, 细 胞 凋 亡 率 增 殖 抑 制 率 明 显 增 加 (P<0 05) 流 式 细 胞 仪 线 粒 体 膜 电 位 结 果 表 明,HHT 作 用 后 存 在 明 显 荧 光 变 化, 细 胞 线 粒 体 膜 电 位 下 降, 并 呈 浓 度 相 关 性 结 论 HHT 可 抑 制 AML M5SHI 1 细 胞 株 的 增 殖 诱 导 其 凋 亡, 其 诱 导 细 胞 凋 亡 可 能 是 通 过 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 实 现 关 键 词 高 三 尖 杉 酯 碱 ;SHI 1 细 胞 ; 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 ; 细 胞 增 殖 ; 细 胞 凋 亡 中 图 分 类 号 R733.71;R ;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 急 性 髓 系 白 血 病 (acutemyeloidleukemia,aml) 是 血 液 系 统 的 克 隆 性 恶 性 疾 病, 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 (acutemonocyticleukemia,aml M5) 是 AML 中 预 后 较 差 的 亚 型 复 发 难 治 低 增 生 及 老 年 AML M5 患 者 并 发 症 多 缓 解 率 低 对 化 疗 耐 受 差 或 不 敏 感, 是 血 液 科 治 疗 的 重 点 及 难 点 [1] 高 三 尖 杉 酯 碱 (ho moharingtonine,hht) 是 从 我 国 海 南 植 物 粗 榧 中 提 取 出 的 生 物 碱, 是 我 国 在 世 界 上 首 先 用 于 治 疗 急 性 非 淋 巴 细 胞 白 血 病 (acutenon lymphocyticleukemia, ANLL) 的 药 物, 并 获 得 显 著 疗 效 [2], 早 在 上 世 纪 70 年 代 已 用 于 AML 等 的 治 疗, 临 床 上 常 用 于 治 疗 难 治 [1] 复 发 白 血 病, 研 究 表 明 其 作 用 机 制 与 诱 导 多 种 细 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 重 点 项 目 ( 编 号 : KJ2011A164) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 血 液 内 科, 合 肥 作 者 简 介 : 赵 雨 辰, 女, 硕 士 研 究 生 ; 杨 明 珍, 男, 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] [3] 胞 凋 亡 抑 制 DNA 合 成 等 有 关 体 外 实 验 显 示, HHT 对 AML M5SHI 1 细 胞 系 有 明 显 促 凋 亡 作 用 常 规 剂 量 或 浓 度 时, 可 抑 制 真 核 细 胞 蛋 白 质 合 成, 肿 瘤 细 胞 分 裂 指 数 减 少, 瘤 组 织 核 酸 含 量 下 降 [4] 前 [5] 期 体 外 实 验 结 果 显 示,HHT 能 够 抑 制 白 血 病 NB4 细 胞 的 增 殖, 诱 导 凋 亡 该 实 验 拟 对 HHT 促 SHI 1 细 胞 凋 亡 作 用 机 制 作 一 探 讨, 为 HHT 治 疗 难 治 复 发 急 性 白 血 病 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 细 胞 株 SHI 1 细 胞 为 AML M5 细 胞 株, 由 苏 州 大 学 医 学 院 第 一 附 属 医 院 血 液 科 实 验 室 惠 赠 主 要 试 剂 HHT 购 自 杭 州 民 生 药 业 集 团 有 限 公 司 ; 胎 牛 血 清 购 自 杭 州 四 季 青 公 司 ;RPMI1640 培 养 液 购 自 美 国 Gibco 公 司 ;AnnexinV FITC/PI 试 剂 盒 购 自 南 京 凯 基 生 物 科 技 发 展 有 限 公 司 ;CCK 8 试 剂 盒 线 粒 体 膜 电 位 试 剂 盒 ( 线 粒 体 染 料 JC 1 活 细 胞 染 色 ) 均 购 自 上 海 贝 博 公 司 1.2 方 法 细 胞 培 养 AML M5SHI 1 细 胞 置 于 含 青 霉 素 (100U/ml) 和 链 霉 素 (100g/ml) 及 15% 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 液 中, 于 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 中 培 养,2~3d 传 代 1 次, 细 胞 接 种 后, 每 日 计 数 细 胞 数, 连 续 观 察 7~10d, 在 对 数 坐 标 纸 上 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 当 细 胞 形 态 逐 渐 浑 圆, 透 亮, 大 小 均 一, 排 列 整 齐, 确 定 曲 线 基 本 呈 水 平 的 部 分 即 为 指 数 生 长 期 取 处 于 指 数 生 长 期 细 胞 进 行 实 验 瑞 氏 染 色 细 胞 形 态 学 观 察 取 对 数 生 长 期 的 SHI 1 细 胞, 将 浓 度 为 500μg/L 的 HHT 加 入 培 养 体 系, 置 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 培 养 箱 培 养 20 h, 普 通 光 镜 下 观 察 对 比 正 常 细 胞 与 药 物 处 理 后 细 胞 形 态 学 变 化 无 菌 操 作 下 收 集 药 物 处 理 后 的 细 胞 ( 密 度 约 为 个 /ml),1000r/min, 离 心 2min, 弃 净 上 清 液, 加 入 约 10μl 胎 牛 血 清, 涂 片, 常 规 瑞 氏 染 色 后 光 镜 下 观 察 细 胞 形 态 学 改 变 并 摄 片 AnnexinV FITC/PI 流 式 细 胞 仪 分 析 取 对 数 生 长 期 SHI 1 细 胞 进 行 实 验 调 整 细 胞 至 适 宜 浓

55 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1081 度 ( 约 为 /ml) 后, 分 别 用 μg/lhht 处 理 SHI 1 细 胞, 以 相 同 条 件 下 不 加 药 物 为 对 照 组, 接 种 于 6 孔 板 内, 置 于 37 5%CO 2 饱 和 湿 度 孵 箱 孵 育,20h 后 收 集 细 胞 ( /L),PBS 洗 2 次, 加 490μl 结 合 缓 冲 液, 混 匀 后 加 5μlAn nexin V FITC 和 5μlPI 液, 避 光 孵 育 15min, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 情 况 CCK 8 法 检 测 增 殖 能 力 取 对 数 生 长 期 的 SHI 1 细 胞, 浓 度 调 整 为 /ml, 用 μg/L 不 同 浓 度 HHT 作 用 于 细 胞, 设 对 照 组 ( 不 加 药 ) 和 空 白 对 照 组 ( 只 加 培 养 液, 无 细 胞 ), 每 组 另 设 3 个 复 组, 用 CCK 8 法 ( 具 体 操 作 参 照 试 剂 盒 说 明 书 ) 测 出 相 应 450nm 处 吸 光 度 (A 450 ) 值 实 验 重 复 3 次, 取 平 均 值, 根 据 公 式 : 细 胞 活 力 (%) =A( 加 药 )-A( 空 白 )/A( 对 照 )-A( 空 白 ) 100%, 计 算 细 胞 活 力 线 粒 体 跨 膜 电 位 (Δψm) 检 测 用 100μg/L HHT( 此 浓 度 接 近 24hIC 50 值 ) 及 500μg/L 处 理 SHI 1 细 胞, 无 菌 操 作 下 收 集 药 物 处 理 前 后 细 胞 ( 密 度 约 为 个 /ml), 细 胞 用 JC 1 液 37 孵 育 15 min, 依 照 线 粒 体 膜 电 位 试 剂 盒 说 明 书 步 骤 测 线 粒 体 跨 膜 电 位, 上 流 式 细 胞 仪 用 PI 和 FITC 荧 光 通 道 检 测 1.3 统 计 学 处 理 采 用 GraphPadPrism5 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 两 组 间 比 较 用 非 配 对 t 检 验 进 行 结 果 分 析 2 结 果 2.1 HHT 处 理 前 后 瑞 氏 染 色 细 胞 形 态 学 观 察 光 镜 下 未 经 药 物 作 用 的 SHI 1 细 胞 生 长 状 态 良 好, 呈 中 等 大 小, 排 列 整 齐, 细 胞 呈 圆 型, 胞 质 透 明, 核 圆, 规 则, 胞 质 量 中 等 至 丰 富, 染 灰 蓝 色, 部 分 细 胞 胞 质 中 可 见 少 量 淡 紫 红 色 颗 粒, 细 胞 密 度 较 大 而 经 HHT 作 用 后 的 细 胞 形 态 出 现 不 规 则 胞 质 皱 缩 核 浓 缩 染 色 体 凝 集, 细 胞 破 裂, 细 胞 密 度 明 显 减 少 见 图 1 图 1 药 物 处 理 前 后 细 胞 形 态 学 改 变 瑞 氏 染 色 1000 A: 未 经 药 物 处 理 ;B:500μg/LHHT 处 理 2.2 HHT 对 SHI 1 细 胞 凋 亡 的 影 响 Annexin V FITC/PI 法 实 验 结 果 示 : 浓 度 为 5~500μg/L 的 HHT 处 理 SHI 1 细 胞 20h 后, 与 不 加 药 对 照 组 相 比, 药 物 处 理 后 的 SHI 1 细 胞 凋 亡 率 明 显 升 高, 当 HHT 药 物 浓 度 μg/L 时, 统 计 得 细 胞 凋 亡 率 (%) 分 别 为 :(9 12±0 780) (11 23± 0 956) (14 60±0 867) (30 29±1 335) (42 61± 1 393)[ 不 加 药 对 照 组 细 胞 凋 亡 率 (4 11±0 863)], 且 随 药 物 浓 度 的 升 高, 细 胞 凋 亡 率 增 加, 表 现 为 一 定 的 剂 量 依 懒 性 (P<0 05) 见 表 1 图 2 图 2 不 同 浓 度 HHT 作 用 SHI 1 细 胞 20h 凋 亡 情 况 A: 不 加 药 对 照 组 ;B:HHT5μg/L 组 ;C:HHT10μg/L 组 ;D:HHT50μg/L 组 ;E:HHT100μg/L 组 ;F:HHT500μg/L 组

56 1082 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2.3 HHT 对 SHI 1 细 胞 的 增 殖 抑 制 当 HHT 药 物 浓 度 分 别 为 μg/L 时, 酶 标 仪 测 得 450nm 处 平 均 吸 光 值 分 别 为 : , 空 白 对 照 组 平 均 吸 光 值 为 0 312, 不 加 药 对 照 组 平 均 吸 光 值 为 0 817, 根 据 公 式 计 算 细 胞 活 力 (%) 分 别 为 :(34 18±0 662), (32 92±0 991),(30 90 ±0 633),(10 10 ± 0 654),(2 87±0 550)[ 不 加 药 对 照 组 细 胞 活 力 为 (57 52±0 680)] 提 示 药 物 作 用 后 细 胞 活 力 下 降, 且 在 药 物 浓 度 为 100μg/L(IC 50 值 ) 及 更 高 浓 度 时 开 始 出 现 明 显 下 降 见 表 1 图 3 图 3 不 同 浓 度 (5~500μg/L)HHT 作 用 20h 后 细 胞 活 力 表 1 不 同 浓 度 HHT 作 用 SHI 1 细 胞 20h 的 凋 亡 率 和 增 殖 抑 制 (%, x±s) 珋 组 别 凋 亡 率 (n=5) 增 殖 抑 制 ( 细 胞 活 力,n=6) 不 加 药 对 照 4.11± ±0.680 HHT 处 理 (μg/l) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.550 与 不 加 药 对 照 组 比 较 : P< HHT 作 用 细 胞 后 线 粒 体 膜 电 位 变 化 流 式 细 胞 仪 结 果 示,HHT 药 物 作 用 后 出 现 明 显 荧 光 变 化, 细 胞 线 粒 体 膜 电 位 下 降 当 HHT 浓 度 为 μg/l 时, 线 粒 体 膜 电 位 降 低, 早 期 细 胞 凋 亡 率 分 别 为 18 12% 及 30 77%, 较 不 加 药 对 照 组 细 胞 ( 凋 亡 率 0 73%) 明 显 升 高 细 胞 凋 亡 的 百 分 率, 即 An nexin VFITC/PI 阳 性 和 线 粒 体 膜 电 位 下 降 的 细 胞 百 分 率 是 相 近 的, 提 示 HHT 诱 导 细 胞 凋 亡 可 能 与 线 粒 体 膜 电 位 下 降 有 关 见 图 4 3 讨 论 AML 是 造 血 干 祖 细 胞 的 恶 性 克 隆 性 疾 病, 发 病 时 骨 髓 中 异 常 的 原 始 及 幼 稚 细 胞 ( 白 血 病 细 胞 ) 大 量 增 殖, 抑 制 正 常 造 血, 并 广 泛 浸 润 肝 脏 脾 脏 淋 巴 结 细 胞 增 殖 失 控 分 化 障 碍 和 凋 亡 受 阻 是 白 血 病 细 胞 的 基 本 特 征, 诱 导 分 化 和 凋 亡 疗 法 已 成 为 白 血 病 的 两 个 治 疗 策 略 [5] 细 胞 凋 亡 是 细 胞 的 一 种 生 理 性 死 亡 过 程, 凋 亡 的 发 生 是 通 过 一 系 列 复 杂 的 信 号 传 导 通 路 和 基 因 的 调 控 多 种 刺 激 因 素 共 同 作 用 的, 多 种 抗 肿 瘤 药 物 都 能 诱 导 细 胞 的 凋 亡 [1] 线 粒 体 是 细 胞 凋 亡 调 控 网 络 中 重 要 的 细 胞 器, 是 早 期 细 胞 凋 亡 的 标 志 [6] 大 多 数 凋 亡 信 号 通 过 诱 导 线 粒 体 膜 通 透 性 转 运 通 道 (mitochondrialpermeability transitionpore,mpt) 的 开 放 或 线 粒 体 肿 胀 导 致 线 粒 体 膜 电 位 下 降, 允 许 线 粒 体 呼 吸 链 蛋 白 细 胞 素 C 凋 亡 诱 导 因 子 (apoptosis inducingfactor,aif) 从 线 粒 体 释 放 到 胞 质 [7] HHT 能 够 抑 制 G 1 和 G 2 蛋 白 的 合 成, 诱 导 细 胞 分 化, 促 进 细 胞 凋 亡 [8] 刘 佳 宁 等 [9] [10] 任 艳 玲 等 研 究 发 现,HHT 的 作 用 机 制 与 诱 导 多 种 细 胞 凋 亡 抑 制 DNA 合 成 等 有 关 亦 有 [11] 实 验 显 示,HHT 单 药 即 可 以 一 种 剂 量 依 赖 的 方 式 抑 制 THP 1 细 胞 及 Kasumi 细 胞 的 生 长, 诱 导 上 述 细 胞 的 凋 亡 HHT 能 够 显 著 下 调 PI3K 基 因 的 表 图 4 JC 1 活 细 胞 染 色 线 粒 体 膜 电 位 A: 不 加 药 对 照 组 ;B:HHT100μg/L 组 ;C:HHT500μg/L 组

57 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1083 [12-14] 达 研 究 显 示, 许 多 BCL 2 家 族 成 员 和 AKT 及 JAK/STAT 信 号 通 路 在 HHT 介 导 的 抗 白 血 病 细 [3] 胞 过 程 中 起 着 一 定 的 作 用 苏 州 大 学 陈 苏 宁 等 通 过 对 1 例 AML M5b 患 者 的 骨 髓 细 胞 进 行 体 外 传 代 培 养, 建 立 了 国 内 第 1 个 人 单 核 细 胞 白 血 病 细 胞 系, 该 细 胞 倍 增 时 间 约 为 36h, 以 t(6;l1)(q27; q23) MLL AF6 融 合 基 因 及 del(17)(p11) 和 p53 基 因 异 常 为 主 要 特 征, 命 名 为 SHI 1 本 实 验 研 究 显 示,HHT 在 5~500μg/L 范 围 内 可 有 效 抑 制 AML M5 细 胞 株 SHI 1 细 胞 的 增 殖,5μg/L 的 HHT 即 可 特 异 诱 导 SHI 1 细 胞 凋 亡 随 着 药 物 浓 度 的 增 加, 细 胞 早 期 凋 亡 率 相 应 增 高, 细 胞 活 力 明 显 下 降, 呈 现 较 好 的 剂 量 效 应 关 系 细 胞 凋 亡 形 态 在 电 镜 下 表 现 为 细 胞 核 皱 缩, 核 染 色 质 浓 缩 呈 块 状 边 聚 于 核 膜 下, 核 仁 消 失 而 在 细 胞 凋 亡 的 过 程 中, 亦 检 测 出 线 粒 体 膜 电 位 的 平 行 下 降, 表 明 SHI 1 细 胞 的 凋 亡 和 增 殖 抑 制 与 线 粒 体 膜 电 位 有 关 以 上 实 验 结 果 初 步 表 明,HHT 诱 导 的 细 胞 凋 亡 很 可 能 是 通 过 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 实 现 的, 线 粒 体 介 导 的 细 胞 凋 亡 途 径 可 能 是 HHT 诱 导 AML M5SHI 1 细 胞 凋 亡 的 机 制 之 一 该 结 果 为 HHT 治 疗 难 治 复 发 急 性 白 血 病 提 供 了 一 定 的 理 论 依 据, 此 后 的 相 关 信 号 通 路 及 基 因 水 平 的 研 究 尚 需 进 一 步 实 验 探 讨 参 考 文 献 [1] 吉 宇 莹, 张 王 刚, 陈 银 霞.GHA 预 激 方 案 治 疗 急 性 单 核 细 胞 白 血 病 的 机 制 及 临 床 研 究 [J]. 中 国 实 验 血 液 学 杂 志,2010,18 (1): [2] 蔡 真, 林 茂 芳,ChristanW, 等. 线 粒 体 膜 电 位 在 高 三 尖 杉 酯 碱 诱 导 T 淋 巴 细 胞 白 血 病 细 胞 Molt3 凋 亡 中 的 作 用 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,2001,22(5): [3] 陈 苏 宁, 薛 永 权, 张 学 光, 等. 一 株 伴 有 t(6;l1)(q27;q23) 和 p53 基 因 异 常 的 人 单 核 细 胞 白 血 病 细 胞 系 SHI 1 的 建 立 及 鉴 定 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,2005,26(2):94-9. [4] LiuJ,BiG,WenP,etal.Down regulationofcd44contributesto thediferentiationofhl 60celsinducedbyATRAorHMBA[J]. Celular&MolecularImmunology,2007,4(1): [5] 张 小 雨, 杨 明 珍. 高 三 尖 杉 酯 碱 对 急 性 白 血 病 NB4 细 胞 凋 亡 机 制 的 影 响 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2011,46(9): [6] 陈 苏 宁, 薛 永 权, 吴 亚 芳, 等. 人 单 核 细 胞 白 血 病 细 胞 系 SHI 1 的 诱 导 分 化 和 凋 亡 [J]. 白 血 病 淋 巴 瘤,2006,15(6): [7] HildemanDA,MitchelT,TeagueTK,etal.Reactiveoxygen speciesregulateactivation inducedt celapoptosis[j].immunity, 1999,10(6): [8] LiP,NijhawanD,BudihardjoI,etal.CytochromeCanddATP dependentformationofapa f1/caspase9complexinitiatesanapop toticproteasecascade[j].cel,1997,91(4): [9] 刘 佳 宁, 毕 高 峰, 林 汝 湘, 等.HL 60 细 胞 高 三 尖 杉 酯 碱 诱 导 后 CD44 表 达 变 化 及 机 制 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008, 15(18): [10] 任 艳 玲, 佟 红 艳. 高 三 尖 杉 酯 碱 联 合 AG490 对 HEL 细 胞 JAK2 STAT5 相 关 信 号 通 路 的 影 响 [J]. 中 国 实 验 血 液 学 杂 志,2011, 19(5): [11]ChenR,GuoL,ChenY,etal.HomoharingtoninereducedMcl 1 expresionandinducedapoptosisinchroniclymphocyticleukemia [J].Blood,2011,117(1): [12]WangL,YouLS,NiW M,etal.β CateninandAKTareprom isingtargetsforcombinationtherapyinacutemyeloidleukemia [J].LeukRes,2013,37(10): [13] TongH,RenY,ZhangF,etal.Homoharingtonineafectsthe JAK2 STAT5signalpathwaythroughalterationofproteintyrosine kinasephosphorylationinacutemyeloidleukemiacels[j].eurj Haematol,2008,81(4): [14]YinS,WangR,ZhouF,etal.Bcl xlisadominantantiapoptotic proteinthatinhibitshomoharingtonine inducedapoptosisinleuke miacels[j].molpharmacol,2011,79(6): Inducing apoptosisefectofhomoharringtonineonacutemonocytic leukemiacellineshi 1anditsrelevantmechanism ZhaoYuchen,YangMingzhen (DeptofHematology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toexploretheefectofhomoharingtonine(HHT)onproliferationandinduceapoptosisof acutemonocyticleukemiacellineshi 1,andwhethertheinductionofapoptosisismediatedbymitochondrialap optosispathway.methods Experimentsweredividedintocontrolandtestgroups(5,10,50,100,500μg/L).The growthinhibitoryrateofshi 1celswasdetectedusingCelCountingKit 8(CCK 8)method,whilethecelapop toticratewasmeasuredbyannexinv FITC/PIusingflowcytometry.Mitochondrialmembranepotentialacrosthe membrane(δψm)wasdeterminedbymitochondrialmembranepotentialasaykitwithjc 1.Results HHTinhibi tedthegrowthofshi 1celsandinducedapoptosisinconcentration dependentmanners(p<0 05).Mitochondrial

58 1084 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 不 同 浓 度 葡 萄 糖 对 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 表 达 的 影 响 金 程 1, 束 军 1, 娄 志 霞 1 2, 沈 继 龙 摘 要 目 的 观 察 不 同 浓 度 葡 萄 糖 对 肺 腺 癌 细 胞 株 A549 中 色 素 上 皮 衍 生 因 子 (PEDF) 表 达 的 影 响 方 法 在 基 础 培 养 液 中, 根 据 加 入 的 葡 萄 糖 浓 度 分 为 : 对 照 组 (5.6mmol/L 葡 萄 糖 ) 甘 露 醇 组 (5 6mmol/L 葡 萄 糖 +25mmol/L 甘 露 醇 ) 高 糖 A 组 (10mmol/L 葡 萄 糖 ) 高 糖 B 组 (20mmol/L 葡 萄 糖 ) 高 糖 C 组 (30mmol/L 葡 萄 糖 ), 进 行 A549 细 胞 培 养, 分 别 于 h 后 取 样 : 采 用 半 定 量 RT PCR 法 检 测 不 同 时 间 点 含 不 同 浓 度 葡 萄 糖 组 细 胞 PEDFmRNA 水 平, 用 ELISA 法 检 测 细 胞 培 养 上 清 液 中 和 胞 内 PEDF 蛋 白, 比 较 不 同 组 间 PEDF 表 达 水 平 差 异 结 果 与 对 照 组 相 比, 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加, 各 组 A549 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 有 明 显 下 降 趋 势 (P<0 05), 呈 剂 量 依 赖 性 改 变 ; 随 着 葡 萄 糖 作 用 时 间 的 延 长, 除 RT PCR 检 测 中 的 高 糖 C 组, 及 ELISA 检 测 中 的 高 糖 B 组 外, 各 组 A549 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 有 明 显 下 降 趋 势 (P<0 05), 呈 时 间 依 赖 性 改 变 结 论 高 浓 度 葡 萄 糖 较 长 时 间 作 用 可 能 降 低 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 关 键 词 肺 腺 癌 ; 色 素 上 皮 衍 生 因 子 ; 葡 萄 糖 ; 浓 度 ; 影 响 中 图 分 类 号 R734.2 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 色 素 上 皮 衍 生 因 子 (pigmentepithelium derived factor,pedf) 是 目 前 已 知 最 强 的 内 源 性 血 管 形 成 抑 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( 编 号 : MH141); 安 徽 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 重 点 项 目 ( 编 号 : KJ2011A173); 安 徽 医 科 大 学 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 : 2010xkj115); 安 徽 医 科 大 学 第 四 附 属 医 院 引 进 人 才 科 研 启 动 基 金 资 助 项 目 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 四 附 属 医 院 呼 吸 内 科, 合 肥 安 徽 病 原 生 物 学 省 级 实 验 室 和 人 兽 共 患 病 安 徽 省 重 点 实 验 室, 安 徽 医 科 大 学 基 础 医 学 院 病 原 生 物 学 教 研 室, 合 肥 作 者 简 介 : 金 程, 男, 硕 士 研 究 生 ; 束 军, 男, 医 学 博 士, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:j. [email protected] [1] 制 剂 研 究 表 明,PEDF 在 各 种 类 型 的 肺 癌 细 胞 [2] 株 中 均 有 表 达 ; 有 报 道 称,PEDF 在 糖 尿 病 性 肾 病 中 分 泌 降 低, 并 且 高 血 糖 是 其 分 泌 下 降 的 直 接 原 因 ; [3] 另 有 报 道 称, 糖 尿 病 患 者 中 肺 癌 的 发 病 率 远 高 于 普 通 人 群 由 此 推 测 较 高 血 糖 浓 度 可 能 对 肺 癌 细 胞 的 发 生 发 展 产 生 影 响, 但 相 关 研 究 尚 未 见 报 道 该 实 验 拟 通 过 体 外 条 件 下 改 变 细 胞 培 养 液 中 葡 萄 糖 的 浓 度, 观 察 不 同 浓 度 的 葡 萄 糖 对 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 表 达 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 细 胞 系 A549 细 胞 株 由 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 检 验 科 实 验 室 惠 赠 主 要 试 剂 及 仪 器 检 测 PEDFmRNA 的 RT PCR 引 物 购 于 生 工 生 物 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ;TRIzol 购 于 美 国 Invitrogen 公 司 ;RT PCR 第 一 链 cdna 合 成 试 剂 盒 购 于 德 国 ThermoScientific 公 司 ;ELISA 试 剂 盒 购 于 上 海 原 叶 公 司 ; 无 糖 型 1640 培 养 液 胎 牛 血 清 购 于 美 国 Gibco 公 司 ; 葡 萄 糖 购 于 美 国 Sigma 公 司 ;DNAMarker(DL2000) 购 于 日 本 TaKaRa 公 司 电 热 恒 温 水 浴 锅 购 于 上 海 天 平 仪 器 厂 ; 超 速 离 心 机 购 于 德 国 Beckman 公 司 ; 超 净 工 作 台 购 于 苏 州 安 泰 空 气 技 术 有 限 公 司 ; IEF 电 泳 仪 购 于 美 国 Bio Rad 公 司 ;D 801 凝 胶 成 像 分 析 系 统 购 于 江 苏 捷 达 科 技 发 展 有 限 公 司 1.2 方 法 细 胞 培 养 复 苏 A549 细 胞, 用 含 100ml/L 胎 牛 血 清 2mmol/L 谷 氨 酰 胺 5 6mmol/L 葡 萄 糖 的 1640 培 养 液 培 养 于 5%CO 2 37 细 胞 培 养 箱, 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 用 于 实 验 实 验 分 组 将 无 糖 型 1640 培 养 液 作 为 细 胞 membranepotentialacrosthemembraneanalysisshowedthatshi 1celssignificantlyshowedanalterationoffluor esenceaftertreatingwithhhtfor20hours,ascomparedwithcontrolgroup.conclusion HHTisabletoinhibit proliferationandinduceapoptosisofshi 1cels,themechanismmaybeasociatedwiththemediationbymitochon drialapoptosispathway. Keywords homoharingtonine;shi 1cel;acutemonocyticleukemia;celproliferation;celapoptosis

59 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1085 培 养 基 础 液, 按 照 实 验 设 计 分 别 加 入 不 同 浓 度 的 葡 萄 糖 后 分 为 以 下 5 组 :1 对 照 组 : 加 入 5 6mmol/L 葡 萄 糖 ;2 甘 露 醇 组 : 加 入 5.6mmol/L 葡 萄 糖 +25 mmol/l 甘 露 醇 ( 甘 露 醇 作 为 渗 透 压 对 照 );3 高 糖 A 组 : 加 入 10mmol/L 葡 萄 糖 ;4 高 糖 B 组 : 加 入 20 mmol/l 葡 萄 糖 ;5 高 糖 C 组 : 加 入 30mmol/L 葡 萄 糖 分 别 培 养 h 后 取 样, 行 后 续 实 验 检 测 细 胞 总 RNA 提 取 及 RT PCR 法 检 测 细 胞 PEDFmRNA 取 细 胞,PBS 洗 2 遍, 消 化 后 800r/ min 离 心 5min, 去 上 清 液, 加 1mlTRIzol, 按 照 TR Izol 法 提 取 总 RNA 逆 转 录 合 成 cdna, 步 骤 依 据 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作, 最 后 产 物 总 体 积 为 20μl GAPDH 上 游 引 物 序 列 : 5 GATTGTTGCCAT CAACGACC 3, 下 游 引 物 序 列 :5 GTGCAGGATG CATTGCTGAC 3,370bp;PEDF 上 游 引 物 序 列 :5 CTCCTGTCTCCTCTCAGTGTGG 3, 下 游 引 物 序 列 : 5 CGGTCCTCTCTTCATCCAAGTA 3,481bp 扩 增 条 件 为 95 2min,94 30s, s,72 40s,72 10min,35 个 循 环 循 环 结 束 后,1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 紫 外 透 射 灯 下 观 察 实 验 结 果, 运 用 凝 胶 图 像 扫 描 分 析 系 统, 以 目 的 基 因 片 段 与 GAPDH 片 段 的 条 带 灰 度 值 比 值 作 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 分 析 ELISA 法 检 测 细 胞 内 及 上 清 液 中 PEDF 蛋 白 含 量 取 生 长 状 态 良 好 的 A549 细 胞, 接 种 于 6 孔 板 中 培 养, 按 说 明 书 操 作,ELISA 法 测 定 细 胞 内 和 上 清 液 中 PEDF 蛋 白 的 含 量 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS19 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 计 量 资 料 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 数 据 两 两 比 较 采 用 SNK 检 验 2 结 果 2.1 RT PCR 检 测 对 照 组 与 甘 露 醇 组 中 A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 均 较 高, 两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05); 与 对 照 组 或 甘 露 醇 组 相 比, 高 糖 A B C 组 任 一 组 中 A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 均 较 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 相 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 间 相 比,A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 递 减 (P<0 05), 提 示 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加,A549 细 胞 PEDF 表 达 呈 剂 量 依 赖 性 下 降 不 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 内 相 比 提 示 : 在 高 糖 A 组 和 高 糖 B 组 中, 随 着 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 呈 时 间 依 赖 性 下 降, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05); 在 高 糖 C 组 中, 随 着 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDF 表 达 亦 呈 时 间 依 赖 性 下 降, 但 48h 和 96h 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 图 1~4 bp M 图 1 不 同 浓 度 葡 萄 糖 作 用 24h 后 A549 细 胞 中 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 PEDF GAPDH M:Marker;1: 对 照 组 ;2: 甘 露 醇 组 ;3: 高 糖 A 组 ;4: 高 糖 B 组 ;5: 高 糖 C 组 bp M 图 2 不 同 浓 度 葡 萄 糖 作 用 48h 后 A549 细 胞 中 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 PEDF GAPDH M:Marker;1: 对 照 组 ;2: 甘 露 醇 组 ;3: 高 糖 A 组 ;4: 高 糖 B 组 ;5: 高 糖 C 组 bp M 图 3 不 同 浓 度 葡 萄 糖 作 用 96h 后 A549 细 胞 中 PEDFmRNA 的 相 对 含 量 PEDF GAPDH M:Marker;1: 对 照 组 ;2: 甘 露 醇 组 ;3: 高 糖 A 组 ;4: 高 糖 B 组 ;5: 高 糖 C 组 2.2 ELISA 检 测 不 同 组 A549 细 胞 培 养 上 清 液 中 和 细 胞 内 PEDF 蛋 白 浓 度 见 表 1 无 论 细 胞 培 养 上 清 液 还 是 细 胞 内 PEDF 蛋 白, 在 对 照 组 与 甘 露 醇 组 中 均 有 较 高 表 达, 两 组 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P> 0 05); 与 对 照 组 或 甘 露 醇 组 相 比, 高 糖 A B C 组 任 一 组 中 A549 细 胞 PEDF 蛋 白 浓 度 均 较 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 相 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 间 相 比,A549 细 胞 PEDF 蛋 白 浓 度 递 减 (P< 0 05), 亦 提 示 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加,A549 细 胞 PEDF 表 达 呈 剂 量 依 赖 性 下 降 ( 上 清 液 蛋 白 F 24h =

60 1086 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 不 同 组 A549 细 胞 培 养 上 清 液 中 和 细 胞 内 PEDF 蛋 白 浓 度 (n=3, x±s) 珋 组 别 上 清 液 PEDF(ng/L) 细 胞 内 PEDF(ng/L) 24h 48h 96h 24h 48h 96h 对 照 ± ± ± ± ± ± 甘 露 醇 ± ± ± ± ± ±6.132 高 糖 A ± ab ± abe ± abef ± ab ± abe ± abef 高 糖 B ± abc ± abc ± abcef ± abc ± abce ±9.598 abcef 高 糖 C ± abcd ± abcde ± abcdef ± abcd ±7.440 abcde ± abcdef 相 同 时 间 点 : 与 对 照 组 比 较 : a P<0 05; 与 甘 露 醇 组 比 较 : b P<0 05; 与 高 糖 A 组 比 较 : c P<0 05; 与 高 糖 B 组 比 较 : d P<0 05; 不 同 时 间 组 内 比 较 : 与 作 用 24h 比 较 : e P<0.05; 与 作 用 48h 比 较 : f P<0 05 图 4 各 组 PEDFmRNA 相 对 含 量 平 均 值 比 较 相 同 时 间 点 : 与 对 照 组 比 较 : a P<0.05; 与 甘 露 醇 组 比 较 : b P< 0 05; 与 高 糖 A 组 比 较 : c P<0.05; 与 高 糖 B 组 比 较 : d P<0 05; 不 同 时 间 点 组 内 比 较 : 与 作 用 24h 比 较 : e P<0 05; 与 作 用 48h 比 较 : f P < ,F 48h = ,F 96h = ,P<0 05; 细 胞 内 蛋 白 F 24h = ,F 48h = ,F 96h = ,P<0 05) 不 同 时 间 点, 高 糖 A B C 组 组 内 相 比 提 示 : 除 了 高 糖 B 组 上 清 液 中 PEDF 蛋 白 浓 度 24h 和 48h 间 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 外, 无 论 细 胞 培 养 上 清 液 还 是 细 胞 内 PEDF 蛋 白, 随 着 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDF 蛋 白 浓 度 均 呈 时 间 依 赖 性 下 降, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 3 讨 论 PEDF 是 目 前 已 知 最 强 的 抑 制 血 管 形 成 的 内 源 性 生 物 活 性 因 子, 在 全 身 广 泛 表 达, 其 抑 制 血 管 形 成 的 效 果 是 血 管 他 丁 的 2 倍 内 皮 他 丁 的 7 倍 多 PEDF 与 乳 腺 癌 前 列 腺 癌 骨 肉 瘤 胰 腺 癌 等 肿 瘤 有 密 切 的 关 联 [2] 敲 除 PEDF 基 因, 可 以 促 进 内 皮 细 胞 和 肺 癌 细 胞 A549 的 生 长 ;PEDF 低 表 达 与 肺 癌 较 差 的 预 后 及 淋 巴 转 移 相 关 [4-5] [6] 研 究 提 示, PEDF 蛋 白 可 抑 制 肺 癌 的 生 长 以 及 肿 瘤 血 管 形 成, 因 而 可 能 成 为 治 疗 肺 癌 的 新 策 略 PEDF 表 达 水 平 与 血 糖 浓 度 高 低 也 可 能 存 在 着 一 定 的 联 系 : 在 49 例 健 康 对 照 和 132 例 2 型 糖 尿 病 患 者 中, 用 ELISA 法 检 测 血 清 PEDF 水 平, 结 果 显 示 患 者 血 清 PEDF 水 平 显 著 低 于 健 康 对 照 组 [7] 在 糖 尿 病 性 视 网 膜 病 变 中,PEDF 明 显 减 低 而 血 管 内 皮 生 长 因 子 则 明 显 升 高 [8], 在 糖 尿 病 大 鼠 肾 脏 中, [2] PEDFmRNA 和 蛋 白 质 含 量 均 下 降 体 外 研 究 表 明, 高 血 糖 是 肾 脏 分 泌 PEDF 减 少 的 直 接 原 因 之 一 [9] 研 究 报 道 称, 在 体 外 培 养 人 视 网 膜 色 素 上 皮 细 胞, 通 过 氧 气 含 量 和 葡 萄 糖 浓 度 变 化 检 测 PEDF 表 达 情 况, 结 果 显 示 高 浓 度 葡 萄 糖 直 接 下 调 PEDF 的 表 达 在 2 型 糖 尿 病 患 者 中, 发 生 各 种 恶 性 肿 瘤 的 危 险 性 比 正 常 人 群 增 加 [10] ; 肺 癌 在 2 型 糖 尿 病 患 者 恶 性 肿 瘤 的 发 病 中 居 前 3 位 在 日 本, 糖 尿 病 合 并 肺 癌 发 病 率 为 4 98% [11], 英 国 糖 尿 病 患 者 肺 癌 发 病 率 为 1.63/(1000 人 / 年 ) [12] 但 较 高 浓 度 葡 萄 糖 对 于 肺 癌 的 发 生 发 展 究 竟 有 何 影 响 及 其 可 能 机 制 如 何, 如 高 糖 是 否 可 能 通 过 抑 制 肺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 而 促 进 肿 瘤 发 展, 有 待 实 验 观 察 探 讨 鉴 于 肺 腺 癌 在 肺 癌 中 约 占 40%, 较 其 他 类 型 肺 癌 ( 肺 鳞 癌 25%, 小 细 胞 癌 24%, 大 细 胞 癌 9%) 更 为 常 见, 本 实 验 研 究 在 体 外 首 选 肺 腺 癌 细 胞 株 为 研 究 对 象 实 验 分 组 时 参 照 正 常 者 的 血 糖 浓 度, 以 5 6mmol/L 葡 萄 糖 组 为 对 照 组, 逐 渐 增 加 每 组 的 葡 萄 糖 含 量 本 实 验 观 察 结 果 提 示 : 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 逐 渐 上 升, 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 逐 渐 下 降 ; 且 随 着 较 高 浓 度 葡 萄 糖 作 用 时 间 的 延 长,PEDF 表 达 呈 时 间 依 赖 性 下 降 此 外, 甘 露 醇 对 PEDF 的 表 达 未 见 明 显 影 响 总 之, 与 对 照 组 相 比, 除 RT PCR 检 测 中 的 高 糖 C 组, 及 ELISA 检 测 中 的 高 糖 B 组 外, 各 组 随 着 葡 萄 糖 浓 度 的 增 加 和 葡 萄 糖 作 用 时 间 的 延 长,A549 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 有 明 显 下 降 趋 势, 呈 剂 量 时 间 依 赖 性 改 变 因 此, 高 浓 度 葡 萄 糖 较 长 时 间 作 用 可 能 降 低 肺 腺 癌 细 胞 PEDF 的 表 达 水 平 由 于 PEDF 可 能 抑 制 肺 癌 细 胞 的 生 长 与 运

61 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1087 动 [5], 高 浓 度 葡 萄 糖 较 长 时 间 作 用 可 能 有 利 于 肺 癌 的 发 生 发 展, 包 括 其 他 类 型 细 胞 株 及 在 体 实 验 的 实 验 研 究 有 待 于 进 一 步 开 展 参 考 文 献 [1] 王 莉 苹, 束 军. 不 同 类 型 非 小 细 胞 癌 细 胞 株 中 PEDF 的 表 达 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2013,48(8): [2] WangJJ,ZhangSX,LuK,etal.Decreasedexpresionofpig mentepithelium derivedfactorisinvolvedinthepathogenesisof diabeticnephropathy[j].diabetes,2005,54(1): [3] 陈 思 敏, 柳 广 南.2 型 糖 尿 病 合 并 肺 癌 的 流 行 病 学 危 险 因 素 及 发 病 机 制 的 研 究 进 展 [J]. 广 西 医 科 大 学 学 报,2011,28 (6):967. [4] ZhangL,ChenJ,KeY,etal.Down regulationofpedfexpres sionbyribozymetransgeneinendothelialandlungcancercelsand itsimpactonangiogenesisinvitro[j].oncolrep,2005,14 (6): [5] ChenJ,YeL,ZhangL,etal.Themolecularimpactofpigment epithelium derivedfactor,pedf,onlungcancercelsandthe clinicalsignificance[j].intjoncol,2009,35(1): [6] 陈 晋 峰, 赵 威, 张 建 芝, 等. 色 素 上 皮 衍 生 因 子 基 因 的 克 隆 以 及 与 肺 癌 细 胞 生 长 和 肿 瘤 新 生 血 管 形 成 影 响 的 研 究 [J]. 中 华 医 学 杂 志,2009,89(7): [7] 陈 海 冰, 贾 伟 平, 陈 俊 茜, 等.2 型 糖 尿 病 肾 病 患 者 血 清 色 素 上 皮 源 因 子 水 平 的 变 化 及 意 义 [J]. 中 华 医 学 杂 志,2007,87 (18): [8] MohanN,MonickarajF,BalasubramanyamM,etal.Imbalanced levelsofangiogenicandangiostaticfactorsinvitreous,plasmaand postmortemretinaltisueofpatientswithproliferativediabeticreti nopathy[j].jdiabetescomplications,2012,26(5): [9] 姚 毅, 关 明, 赵 秀 琴, 等. 缺 氧 和 高 浓 度 葡 萄 糖 对 体 外 培 养 人 视 网 膜 色 素 上 皮 衍 生 因 子 表 达 的 影 响 [J]. 中 华 医 学 杂 志, 2003,83(22): [10] HemminkiK,LiX,SundquistJ,etal.Riskofcancerfolowing hospitalizationfortype2diabetes[j].oncologist,2010,15(6): [11] KurikiK,HiroseK,TajimaK.Diabetesandcancerriskforal andspecificsitesamongjapanesemenandwomen[j].eurj CancerPrev,2007,6(1):83-9. [12] HalGC,RobertsCM,BoulisM,etal.Diabetesandtheriskof lungcancer[j].diabetescare,2005,28(3): Efectsofglucoseofdiferentconcentrationsontheexpresionof PEDFinlungadenocarcinomacels JinCheng,ShuJun,LouZhixia,etal (DeptofRespiratoryMedicine,TheFourthAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toobservetheefectsofglucoseofdiferentconcentrationsontheexpresionofpigmentepi thelium derivedfactor(pedf)inlungadenocarcinomacellinea549.methods Accordingtotheconcentration ofglucoseintheculturemedium,a549celsweredividedinto5groups:normalgroup(5.6mmol/lglucose), mannitolgroup(5.6mmol/lglucose+25mmol/lmannitol),groupa(10mmol/lglucose),groupb(20mmol/ Lglucose),groupC(30mmol/Lglucose).ThelevelsofPEDFinA549celsatdiferenttimepointswithdiferent concentrationsofglucosewasexaminedbyasemi quantitativert PCRandELISAasay,andthencomparedwith eachother.results Comparedwiththecontrolgroup,theexpresionlevelofPEDFwasremarkablydecreasedin aglucosedosedependentmanner;whilethea549celswereexposedtodiferentconcentrationsofglucose(p< 0 05).ExcepttheRT PCRdetectionofgroupC,andtheELISAdetectionofgroupB,theexpresionlevelof PEDFwasremarkablydecreasedinaactiontimedependentmanner;whiletheA549celswereexposedtodiferent durations(p<0 05).Conclusion Highconcentrationofglucosewithlongerdurationsmayreducethelevelof PEDFinlungadenocarcinomacels. Keywords lungadenocarcinoma;pigmentepitheliumderivedfactor;glucose;concentrations;efects

62 1088 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白 的 表 达 及 初 步 鉴 定 程 海 燕 1, 高 闻 达 2, 任 翠 平 1, 刁 玉 洁 1, 杨 菲 1, 平 春 光 1, 李 冬 冬 3 1, 沈 际 佳 摘 要 目 的 构 建 以 及 表 达 鼠 白 介 素 6(IL 6) 受 体 融 合 蛋 白 方 法 采 用 基 因 重 组 技 术 将 鼠 IL 6 受 体 融 合 基 因 克 隆 到 杆 状 病 毒 质 粒 Bacmid 上, 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 在 脂 质 体 的 介 导 下 转 染 昆 虫 细 胞 Sf9, 转 染 后 收 集 重 组 杆 状 病 毒, 采 用 空 斑 实 验 检 测 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 的 滴 度, 并 通 过 Western blot 来 确 定 目 的 蛋 白 的 表 达 结 果 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 在 DH10Bac 大 肠 杆 菌 中 包 装 成 功, 并 转 染 Sf9 细 胞 后 得 到 重 组 杆 状 病 毒, 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 的 滴 度 为 pfu/ml, Westernblot 表 明 目 的 蛋 白 在 Sf9 细 胞 中 表 达 结 论 成 功 表 达 了 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白, 为 进 一 步 研 究 IL 6 在 炎 症 性 疾 病 中 的 作 用 奠 定 了 实 验 基 础 关 键 词 IL 6 受 体 ; 杆 状 病 毒 ; 蛋 白 表 达 中 图 分 类 号 R392.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 白 介 素 6(interleukin6,IL 6) 是 一 种 作 用 非 常 广 泛 的 细 胞 因 子, 由 成 纤 维 细 胞 内 皮 细 胞 巨 噬 细 胞 以 及 淋 巴 细 胞 等 多 种 细 胞 分 泌, 可 以 促 进 细 胞 生 长, 参 与 免 疫 应 答 [1], 与 多 种 慢 性 炎 性 疾 病 [2] 癌 症 相 关 [3-4] IL 6 受 体 有 IL 6 受 体 α 及 gp130 两 种 亚 型 [5], 本 研 究 根 据 IL 6 受 体 结 构 特 点 构 建 并 表 达 出 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白 (mouseil 6receptorfusion protein,mil 6RFP), 其 通 过 结 合 IL 6 而 竞 争 性 抑 制 IL 6 通 路, 为 进 一 步 研 究 IL 6 在 炎 症 性 疾 病 中 作 用 奠 定 实 验 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 主 要 试 剂 限 制 性 内 切 酶 连 接 酶 PCR 试 剂 盒 购 自 大 连 宝 生 物 技 术 有 限 公 司 ;SphI StuI BCA 蛋 白 浓 度 检 测 试 剂 盒 全 蛋 白 提 取 试 剂 盒 购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 ;OMEGA E.Z.N.A BAC/PAC 质 粒 提 取 试 剂 盒 购 自 北 京 美 科 美 生 物 技 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 病 原 生 物 学 教 研 室 3 生 命 科 学 学 院, 合 肥 美 国 安 泰 吉 生 物 技 术 与 制 药 有 限 公 司, 波 士 顿 作 者 简 介 : 程 海 燕, 女, 硕 士 研 究 生 ; 沈 际 佳, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E 术 开 发 有 限 公 司 ; 细 胞 培 养 基 1 Sf900Ⅱ 细 胞 培 养 基 Grace 转 染 试 剂 celfectin 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ; 兔 抗 鼠 IL 6R 抗 体 (50280 RP01) 购 自 北 京 义 翘 神 州 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 兔 抗 鼠 β actin 抗 体 购 自 北 京 博 奥 森 生 物 技 术 公 司 ; 山 羊 抗 兔 IgG/ 辣 根 酶 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 质 粒 菌 株 细 胞 株 载 体 pcdna3.1 携 带 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白 质 粒 (mil 6RFP pcdna3.1) 由 美 国 波 士 顿 安 泰 吉 生 物 技 术 与 制 药 有 限 公 司 高 闻 达 教 授 惠 赠 ; 菌 株 DH10Bac DH5α 由 本 实 验 室 保 存 ;Sf9 细 胞 由 北 京 交 通 大 学 生 命 科 学 与 生 物 工 程 研 究 院 何 金 生 教 授 惠 赠 1.2 方 法 重 组 Bacmid 的 获 得 和 鉴 定 用 SphI 和 Stu I 双 酶 切 mil 6RFP pcdna3.1 和 pfastbachta 后 胶 回 收 并 连 接, 转 化 DH5α 大 肠 杆 菌, 经 氨 苄 霉 素 筛 选 后 的 阳 性 菌 落, 扩 大 培 养 后 提 取 质 粒, 命 名 为 mil 6RFP pfastbachta mil 6RFP pfastbachta 经 测 序 鉴 定 正 确 后 转 化 含 有 杆 状 病 毒 质 粒 的 DH10Bac 大 肠 杆 菌, 经 四 环 素 卡 那 霉 素 氨 苄 霉 素 IPTG 和 X gal 重 复 两 次 筛 选 阳 性 菌 落, 经 扩 大 培 养 后 提 取 重 组 杆 状 病 毒 质 粒, 经 PCR 鉴 定 正 确 后 命 名 为 重 组 Bacmid, 重 组 Bacmid 的 PCR 引 物 为 puc/m13: 正 向 5 CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3 ; 反 向 5 AGCGGATAACAATTTCACACAGG 重 组 Bacmid 转 染 昆 虫 细 胞 昆 虫 细 胞 完 全 培 养 基 为 含 100U/ml 青 霉 素,100μg/ml 链 霉 素, 10%FBS 的 Sf900Ⅱ 在 转 染 前 1d 换 成 无 抗 生 素 无 血 清 的 Sf900Ⅱ, 转 染 当 天 细 胞 处 于 对 数 生 长 期, 吹 打 成 单 细 胞 悬 液 后 接 种 6 孔 板, 接 种 密 度 为 /ml, 每 孔 接 种 2ml,27 孵 育 1h 后 更 换 为 新 鲜 的 无 抗 生 素 无 血 清 Sf900Ⅱ 孵 育 期 间 用 无 抗 生 素 无 血 清 无 添 加 物 的 培 养 基 Grace 稀 释 重 组 Bacmid 及 转 染 试 剂 celfectin, 将 二 者 混 匀 后 逐 滴 加 到 细 胞 上,27 孵 育 4.5h 后 更 换 成 Sf900Ⅱ 完 全 培 养 基, 27 孵 育, 第 5 天 观 察 细 胞 病 变 大 量 重 组 杆 状 病 毒 的 获 得 转 染 后 观 察 到 细 胞 病 变 后 收 集 上 清 液, 离 心 4,1611r/min,

63 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) min, 上 清 液 为 第 1 代 重 组 杆 状 病 毒 命 名 为 P1, 添 加 2%FBS,4 避 光 保 存 T75 型 细 胞 培 养 瓶 80% 满 时 感 染 P1, 在 第 5 天 出 现 明 显 病 变 后, 收 集 上 清 液 离 心 为 第 2 代 重 组 杆 状 病 毒 命 名 为 P2, 按 同 样 的 方 法 得 到 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 P3, 添 加 2%FBS,- 80 分 装 避 光 保 存 重 组 杆 状 病 毒 滴 度 测 定 空 斑 试 验 测 定 P3 病 毒 滴 度 Sf9 处 于 对 数 生 长 期, 稀 释 成 单 细 胞 悬 液 /ml, 按 2ml/ 孔 接 种 6 孔 板, 贴 壁 1h 后 用 Sf900Ⅱ 梯 度 稀 释 P3:10-2, 细 胞 贴 壁 1h 后 轻 轻 弃 去 细 胞 培 养 基 后 轻 轻 加 入 不 同 稀 释 度 的 重 组 杆 状 病 毒 病 毒 1ml, 每 个 稀 释 度 2 个 复 孔 室 温 摇 床 摇 晃 60 次 /min 使 病 毒 吸 附,1h 后 轻 轻 彻 底 去 掉 病 毒 液, 按 2ml/ 孔 轻 轻 加 入 低 熔 点 琼 脂 糖 与 培 养 基 的 混 合 物 ( 将 含 2%FBS 的 1 Sf900Ⅱ 和 4% 低 熔 点 琼 脂 糖 按 比 例 混 合 成 含 0 8% 低 熔 点 琼 脂 糖 的 混 合 物 ), 超 净 台 内 静 置 1h 使 低 熔 点 琼 脂 糖 凝 固 后 置 于 27 孵 育, 第 14 天 观 察 空 斑 取 能 使 细 胞 产 生 约 20 个 空 斑 数 的 病 毒 稀 释 度, 进 行 空 斑 计 数 后 计 算 滴 度, 病 毒 滴 度 (pfu/ml) = 平 均 空 斑 数 稀 释 倍 数 每 孔 病 毒 液 Westernblot 检 测 mil 6RFP 的 表 达 取 第 2 代 病 毒 P2 感 染 细 胞 后 收 集 细 胞, 用 预 冷 的 PBS 漂 洗 后 离 心,4,1000r/min,10min, 共 2 次 按 全 蛋 白 提 取 试 剂 盒 操 作 提 取 细 胞 总 蛋 白,BCA 法 定 量 Westernblot 蛋 白 上 样 30μg/ 孔 电 泳, 半 干 法 转 膜 后 用 5% 脱 脂 牛 奶 室 温 封 闭 2h, 兔 抗 鼠 IL 6R 抗 体 (1 2000) 和 兔 抗 鼠 β actin 抗 体 (1 2000)4 孵 育 过 夜, 室 温 孵 育 HRP 山 羊 抗 兔 IgG( ) 1h 后 ECL 发 光 液 检 测 发 光 信 号 2 结 果 2.1 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 的 获 得 和 鉴 定 挑 取 DH5α 大 肠 杆 菌 抗 生 素 筛 选 阳 性 菌 落 扩 大 培 养, 提 取 重 组 质 粒 mil 6RFP pfastbachta, 经 SphI 和 Stu I 双 酶 切 鉴 定, 电 泳 显 示 插 入 片 段 为 2088bp 与 预 期 大 小 一 致,mIL 6RFP pfastbachta 测 序 显 示 仅 1717 位 发 生 突 变, 使 甘 氨 酸 突 变 为 天 冬 氨 酸, 不 影 响 蛋 白 表 达 挑 取 DH10Bac 大 肠 杆 菌 抗 生 素 及 蓝 白 斑 筛 选 白 色 的 阳 性 菌 落 提 取 重 组 杆 状 病 毒 质 粒 命 名 为 重 组 Bacmid, 经 puc/m13 引 物 PCR 鉴 定, 电 泳 显 示 在 5000bp 与 3000bp 之 间 有 条 带, 与 预 期 大 小 一 致, 见 图 重 组 杆 状 病 毒 的 获 得 扩 增 重 组 Bacmid 感 图 1 重 组 Bacmid 及 PCR 鉴 定 M:DNAMarkerDL5000;1: 重 组 Bacmid;2: 重 组 Bacmid 的 PCR 鉴 定, 引 物 为 puc/m13 染 昆 虫 细 胞 Sf9 后 第 5 天, 显 微 镜 下 观 察 到 细 胞 变 圆 变 大 呈 气 球 样 细 胞 病 变, 见 图 2 P1 经 连 续 扩 毒 2 次, 获 得 40ml 第 3 代 重 组 杆 状 病 毒 P3, 病 毒 分 装 避 光 保 存 于 -80 待 用 图 2 Sf9 正 常 细 胞 和 病 变 细 胞 100 A: 正 常 Sf9 细 胞 ;B: 病 变 Sf9 细 胞 2.3 重 组 病 毒 的 滴 度 测 定 Sf9 细 胞 在 感 染 后 15d 可 见 明 显 空 斑, 见 图 3 将 B E 两 孔 的 平 均 空 斑 数 代 入 公 式 计 算, 得 到 P3 的 滴 度 为 pfu/ml 2.4 重 组 目 标 蛋 白 mil 6RFP 的 鉴 定 Western blot 检 测 目 标 蛋 白 的 表 达, 结 果 显 示 感 染 重 组 杆 状 病 毒 后 的 Sf9 总 蛋 白 在 94ku 左 右 有 条 带, 而 正 常 Sf9 细 胞 蛋 白 在 该 特 定 区 域 无 反 应, 见 图 4 3 讨 论 多 种 疾 病 如 哮 喘 多 发 性 硬 化 慢 性 类 风 湿 性 关 节 炎, 炎 症 性 肠 炎 等 伴 有 IL 6 水 平 异 常 增 高, 而 阻 [6] 断 IL 6 后 疾 病 严 重 程 度 减 轻 研 究 显 示 哮 喘 时 IL 6 水 平 升 高, 而 当 哮 喘 模 型 小 鼠 用 IL 6 单 克 隆 抗

64 1090 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 3 Sf9 在 6 孔 板 空 斑 形 成 A D: 病 毒 稀 释 度 10-5 ;B E: 病 毒 稀 释 度 10-6 ;C F: 病 毒 稀 释 度 10-7 聚 化 从 而 引 起 下 游 基 因 的 表 达, 而 可 溶 型 IL 6Rα 与 可 溶 型 gp130 结 合 后 可 以 竞 争 性 抑 制 IL 6 信 号 通 路 [11] 细 胞 因 子 受 体 融 合 蛋 白 可 以 竞 争 性 抑 制 细 胞 因 子 通 路 在 IL 1 [12] 已 有 研 究 本 研 究 构 建 的 mil 6RFP 用 肽 段 连 接 鼠 IL 6 受 体 α 和 gp130 上 的 配 体 结 合 域 形 成 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白, 可 以 与 IL 6 结 合 从 而 竞 争 性 抑 制 IL 6, 发 挥 抑 制 IL 6 参 与 自 身 免 疫 性 疾 病 的 作 用 本 研 究 采 用 Bac to Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系 统, 获 得 重 组 杆 状 病 毒 及 重 组 目 的 蛋 白, 昆 虫 细 胞 具 有 翻 译 和 翻 译 后 蛋 白 修 饰 的 能 力, 包 括 糖 基 化 磷 酸 化 和 其 他 后 加 工 等, 并 能 定 位, 保 持 生 物 的 高 活 性 [13] 该 研 究 成 功 表 达 了 鼠 IL 6 受 体 融 合 蛋 白, 为 进 一 步 研 究 IL 6 在 炎 性 疾 病 中 的 作 用 奠 定 了 实 验 基 础 参 考 文 献 图 4 mil 6RFP 的 Westernblot 鉴 定 1: 正 常 Sf9 细 胞 总 蛋 白 ;2: 感 染 病 毒 后 Sf9 细 胞 总 蛋 白 体 中 和 IL 6 后, 气 道 纤 维 化 减 轻, 表 明 IL 6 在 哮 喘 中 可 能 发 挥 了 促 炎 功 能 多 发 性 硬 化 是 以 中 枢 神 经 系 统 白 质 炎 性 脱 髓 鞘 病 变 为 主 的 自 身 免 疫 性 疾 病, 在 多 发 性 硬 化 的 动 物 模 型 实 验 性 自 身 反 应 性 脑 脊 髓 炎 (EAE) 中,IL 6 的 单 克 隆 抗 体 能 减 缓 EAE 进 展 ; 敲 除 IL 6 基 因 后, 小 鼠 不 易 形 成 髓 鞘 少 突 胶 质 细 胞 糖 蛋 白 诱 导 的 EAE, 且 中 枢 神 经 系 统 中 炎 症 细 胞 浸 润 减 少 [7] 在 类 风 湿 性 关 节 炎 (RA) 急 性 期 血 清 以 及 关 节 的 滑 液 中 IL 6 水 平 升 高, 与 骨 和 软 骨 破 坏 严 重 程 度 明 显 相 关, 抗 IL 6 受 体 抗 体 可 以 减 轻 RA 的 严 重 程 度 [8] IL 6 在 炎 症 性 肠 病 发 病 过 程 中 也 发 挥 重 要 作 用 IL 6 使 信 号 传 导 与 转 录 激 活 因 子 3 磷 酸 化, 进 而 可 诱 导 抗 凋 亡 因 子 bcl 2 和 bcl xl 表 达, 引 起 T 细 胞 抗 凋 亡 后 不 断 累 积, 最 终 导 致 慢 性 炎 症 在 炎 症 性 肠 病 实 验 动 物 模 型 中, 发 现 抗 IL 6 受 体 抗 体 可 以 抑 制 T 细 胞 抗 凋 亡 从 而 减 轻 肠 炎 [9] IL 6 的 受 体 分 为 IL 6 受 体 α 和 gp130 这 两 种 亚 型,IL 6 受 体 α 主 要 局 限 于 肝 细 胞, 巨 噬 细 胞 等 细 胞 膜 上, 但 是 在 整 合 素 样 金 属 蛋 白 酶 17 或 12 的 作 用 下 可 以 变 为 可 溶 型 受 体,gp130 几 乎 表 达 于 所 有 细 胞 膜 上, 同 时 也 存 在 可 溶 型 gp130 [10] IL 6 与 膜 型 IL 6Rα 或 者 可 溶 型 IL 6Rα 结 合 引 起 gp130 二 [1] YaoX,HuangJ,Zhong,etal.Targetinginterleukin 6ininflamma toryautoimmunediseasesandcancers[j].pharmacolther,2014, 141(2):: [2] Rose JohnS.IL 6trans signalingviathesolubleil 6receptor: importanceforthepro inflammatoryactivitiesofil 6[J].IntJBi olsci,2012,8(9): [3] GuoY,XuF,LuT,etal.Interleukin 6signalingpathwayintarge tedtherapyforcancer[j].cancertreatrev,2012,38(7): [4] Ataie KachoieP,PourgholamiM H,MorisDL.Inhibitionofthe IL 6signalingpathway:astrategytocombatchronicinflammatory diseasesandcancer[j].cytokinegrowthfactorrev,2013,24 (2): [5] MurakamiM,HiranoT.Thepathologicalandphysiologicalrolesof IL 6amplifieractivation[J].IntJBiolSci,2012,8(9): [6] AmmitAJ,MoirLM,OliverBG,etal.EfectofIL 6trans sig nalingonthepro remodelingphenotypeofairwaysmoothmuscle [J].AmJPhysiolLungCelMolPhysiol,2007,292(1): [7] SeradaS,FujimotoM,MiharaM,etal.IL 6blockadeinhibitsthe inductionofmyelinntigen specificth17celsandth1celsinex perimentalautoimmuneencephalomyelitis[j].pnas,2008,105 (26): [8] NishimotoN.Clinicalbenefitsofanti humanil 6receptoranti bodytherapy[j].clincalcium,2007,17(4): [9] MudterJ,NeurathM F.IL 6signalingininflammatoryboweldis easepatho physiologicalroleandclinicalrelevance[j].inflamm BowelDis,2007,13(8): [10]MiharaM,HashizumeM,YoshidaH,etal.IL 6/IL 6receptorsys temanditsroleinphysiologicalandpathologicalconditions[j]. ClinSci(Lond),2012,122(4):

65 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1091 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 对 甲 减 大 鼠 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 和 synaptotagmin 1 表 达 的 影 响 吴 洋 1, 蔡 瑶 俊 2 2, 朱 德 发 摘 要 目 的 探 讨 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 对 成 年 期 甲 状 腺 功 能 减 退 模 型 SD 大 鼠 的 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 及 乙 酰 胆 碱 含 量 和 突 触 结 合 蛋 白 (Syt 1) 表 达 的 影 响 方 法 将 成 年 SD 大 鼠 随 机 分 为 正 常 对 照 组 甲 状 腺 功 能 减 退 组 ( 甲 减 组 ) 单 独 甲 状 腺 素 治 疗 组 和 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 组 ( 联 合 治 疗 组 ), 每 组 10 只 采 用 色 度 法 测 定 各 组 大 鼠 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量, 并 应 用 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 大 鼠 海 马 不 同 亚 层 Syt 1 表 达 结 果 与 正 常 对 照 组 相 比, 甲 减 组 大 鼠 海 马 CA1 CA3 和 齿 状 回 区 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 及 Syt 1 表 达 显 著 降 低 (P<0 05) 单 独 甲 状 腺 素 治 疗 组 大 鼠 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 恢 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 药 学 部 2 干 部 内 分 泌 科, 合 肥 作 者 简 介 : 吴 洋, 男, 主 管 药 师 ; 朱 德 发, 男, 博 士, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 复 正 常, 但 Syt 1 蛋 白 表 达 未 恢 复 联 合 治 疗 组 大 鼠 海 马 乙 酰 胆 碱 含 量 和 Syt 1 表 达 均 恢 复 至 正 常 结 论 甲 减 可 引 起 脑 内 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 及 Syt 1 表 达 下 降, 甲 状 腺 激 素 单 独 治 疗 对 上 述 损 伤 有 改 善 作 用, 但 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 效 果 可 能 更 好 关 键 词 甲 状 腺 功 能 减 退 ; 海 马 ; 甲 状 腺 素 ; 多 奈 哌 齐 ;syn aptotagmin 1 中 图 分 类 号 R581.2;R ;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 甲 状 腺 激 素 在 中 枢 神 经 系 统 的 发 育 和 功 能 成 熟 中 发 挥 重 要 的 作 用 [1] [2] 有 研 究 显 示 成 年 期 甲 状 腺 功 能 减 退 ( 甲 减 ) 可 致 广 泛 的 中 枢 神 经 系 统 结 构 损 伤 和 功 能 紊 乱 然 而, 关 于 甲 状 腺 素 替 代 治 疗 是 否 能 恢 复 这 些 结 构 和 功 能 的 改 变 的 研 究 结 论 并 不 一 致 [3-4] 成 年 期 甲 减 主 要 表 现 为 认 知 功 能 损 伤, 其 神 经 机 制 可 能 涉 及 神 经 元 突 触 可 塑 性 乙 酰 胆 碱 是 广 泛 存 在 脑 内 的 与 学 习 和 记 忆 功 能 相 关 的 重 要 神 经 [11]Müler NewenG,KüsterA,HemmannU,etal.SolubleIL 6recep torpotentiatestheantagonisticactivityofsolublegp130onil 6re sponses[j].jimmunol,1998,161(11): [12] RydgrenT,OsterE,SandbergM,etal.AdministrationofIL 1pro longssurvivaloftransplantedpancreaticisletstotype1diabetic NODmice[J].Cytokine,2013,63(2): [13] LamsonDR,HouseAJ,DanshinaPV,etal.Recombinanthuman sperm specificglyceraldehyde 3 phosphatedehydrogenase(gap DHS)isexpresedathighyieldasanactivehomotetramerinbacu lovirus infectedinsectcels[j].proteinexprpurif,2011,75(1): ExpresionandidentificationofmouseIL 6receptorfusionprotein ChengHaiyan 1,GaoWenda 2,RenCuiping 1,etal ( 1 DeptofMicrobiologyandParasitology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 AntagenPharmaceuticals,Inc.,Boston 02118) Abstract Objective ToconstructandexpresmouseIL 6receptorfusionprotein.Methods MouseIL 6recep torfusiongenewasclonedonthebaculovirusplasmidbacmidbyrecombinanttechnology.recombinantbaculovirus transfectedinsectcelsf9wasmediatedbyliposome,thenthetiterofrecombinantbaculoviruswascalculatedby plaqueasay,andtheexpresionofmouseil 6receptorfusionproteinwasidentifiedbyWesternblot.Results RecombinantbaculoviruswasobtainedfromDH10Bac,thethirdgenerationrecombinantbaculovirustiterwas pfu/ml,westernblotshowedthatmouseil 6receptorfusionproteinexpresedininfectedcels.Conclusion WesuccesfulyexpresedmouseIL 6receptorfusionprotein,laysthefoundationforfurtherstudyontheroleofIL 6ininflammatorydiseases. Keywords IL 6receptors;baculovirus;proteinexpresion

66 1092 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 递 质 [5-6] [7-9] 研 究 显 示 甲 状 腺 素 与 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 关 系 密 切, 成 年 期 甲 减 可 以 引 起 脑 [10] 内 胆 碱 能 系 统 功 能 紊 乱, 前 期 研 究 也 显 示 甲 减 大 鼠 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 降 低 并 与 学 习 记 忆 减 退 有 关 然 而, 关 于 成 年 期 甲 减 导 致 特 定 脑 区 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 变 化 及 甲 状 腺 素 替 代 治 疗 对 这 些 指 标 影 响 的 报 道 甚 少 突 触 结 合 蛋 白 (synapto tagmin,syt) 属 于 突 触 前 囊 泡 蛋 白, 是 涉 及 神 经 递 质 释 放 过 程 的 关 键 蛋 白 之 一, 其 中 Syt 1 是 Syt 家 族 中 脑 特 异 性 亚 型, 高 度 表 达 于 海 马 神 经 元 目 前 研 [11-12] 究 显 示 Syt 1 可 能 与 学 习 和 记 忆 有 关, 如 阿 尔 茨 海 默 病 (Alzheimerdisease,AD) 患 者 脑 内 Syt 水 平 显 著 降 低 自 然 衰 老 小 鼠 海 马 Syt 1 表 达 存 在 年 龄 相 关 性 改 变 且 与 学 习 记 忆 减 退 有 关 等 该 研 究 选 用 SD 大 鼠 作 为 研 究 对 象, 探 讨 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 对 成 年 期 甲 减 大 鼠 的 海 马 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 及 乙 酰 胆 碱 含 量 和 Syt 1 表 达 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 3 月 龄 SD 大 鼠 40 只, 雄 性, 清 洁 级, 体 重 (170±20)g, 购 自 北 京 维 通 利 华 实 验 动 物 公 司 常 规 条 件 下 喂 养 ( 温 度 21~23, 湿 度 50% ~60%, 明 暗 周 期 为 12h), 所 有 大 鼠 接 受 标 准 啮 齿 类 食 物, 并 自 由 进 水, 适 应 性 喂 养 1 周 1.2 模 型 制 作 将 40 只 SD 大 鼠 随 机 均 分 为 4 组 : 正 常 对 照 组 甲 减 组 单 独 甲 状 腺 素 治 疗 组 ( 单 独 治 疗 组 ) 和 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 组 ( 联 合 治 疗 组 ) 除 正 常 对 照 组 外 每 组 大 鼠 于 每 日 饮 水 中 给 予 丙 基 硫 氧 嘧 啶 (PTU,0.05%,Sigma 公 司 ),4 周 后 甲 减 组 继 续 予 以 PTU 处 理, 而 单 独 治 疗 组 开 始 腹 腔 注 射 左 旋 甲 状 腺 素 [6μg/100(g d),sigma 公 司 ], 联 合 治 疗 组 在 单 独 治 疗 基 础 上 饮 水 中 加 入 浓 度 为 0.005% 的 多 奈 哌 齐 正 常 对 照 组 大 鼠 饮 用 正 常 自 来 水,4 周 后 腹 腔 内 注 射 相 同 体 积 生 理 盐 水, 造 模 时 间 共 6 周 1.3 标 本 制 备 血 清 制 备 : 造 模 结 束 后 称 取 大 鼠 体 重, 予 7% 水 合 氯 醛 (350mg/kg) 麻 醉 后 打 开 胸 腔, 腹 主 动 脉 取 血, 离 心 后 取 血 清 置 于 4 冰 箱 保 存 待 测 总 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸 (Triodothyronine,T3) 总 甲 状 腺 素 (Tyroxine,T4) 和 促 甲 状 腺 激 素 (thyrotropin, TSH) 脑 标 本 制 备 : 取 血 后 将 大 鼠 断 头 处 死, 冰 上 迅 速 开 颅 取 脑, 右 大 脑 半 球 置 于 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 固 定, 流 水 冲 洗, 修 块, 脱 水, 透 明, 浸 蜡,HE 染 色 定 位,4 μm 连 续 冠 状 切 片 ( 德 国 Leica 公 司,RM2235 型 ), 进 行 免 疫 组 织 化 学 染 色 检 测 Syt 1 蛋 白 的 表 达 左 大 脑 半 球 在 冰 上 分 离 出 海 马, 用 于 比 色 法 检 测 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 1.4 甲 状 腺 水 平 测 定 采 用 放 射 免 疫 法 根 据 试 剂 盒 指 示 测 定 血 清 T3 T4 和 TSH 水 平 1.5 比 色 法 检 测 将 左 侧 半 球 的 海 马, 按 照 重 量 和 体 积 比 1 9 的 比 例, 加 入 预 冷 的 生 理 盐 水, 在 冰 浴 中 制 成 10% 的 组 织 匀 浆,4 离 心 分 离 上 清 液 (3500r/min,10min), 按 试 剂 盒 说 明 书 测 定 乙 酰 胆 碱 酯 酶 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 1.6 免 疫 组 织 化 学 染 色 免 疫 组 化 采 用 超 敏 SP 法 一 抗 为 重 组 单 克 隆 Syt 1 蛋 白 抗 体 ( 美 国 Sigma 公 司 );SP 二 抗 超 敏 试 剂 盒 (SP 9001, 生 物 素 标 记 羊 抗 兔 / 小 鼠 IgG) 和 DAB 显 色 试 剂 盒 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 科 技 有 限 公 司 倍 显 微 镜 (O lympus, 日 本 ) 下 对 背 海 马 齿 状 回 (DG 区 : 颗 粒 细 胞 层 分 子 层 ) CA1 区 ( 起 层 放 射 层 腔 隙 层 ) 和 CA3 区 ( 起 层 透 明 层 放 射 层 ) 观 察 照 相 图 像 以 TIFF 格 式 保 存, 用 ImageProPlus6.0 图 像 分 析 系 统 ( 美 国 MediaCygernetics 公 司 ) 分 析 亚 区 各 层 的 Syt 1 含 量 用 免 疫 反 应 产 物 光 密 度 值 (opticaldensity,od) 代 表 由 于 每 个 标 本 各 层 选 取 的 形 状 大 小 有 异, 故 以 平 均 OD( 累 积 OD 与 选 取 面 积 的 比 值 ) 进 入 统 计 学 分 析 1.7 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示 采 用 单 因 数 方 差 分 析 (one way ANOVA), 进 一 步 用 LSD 法 进 行 多 重 比 较 2 结 果 2.1 大 鼠 血 清 甲 状 腺 激 素 水 平 与 正 常 对 照 组 相 比, 甲 减 组 大 鼠 血 清 T3 T4 水 平 明 显 减 低 (P< 0 05),TSH 显 著 增 高 (P<0 01), 而 单 独 治 疗 组 和 联 合 治 疗 组 大 鼠 血 T3 T4 明 显 升 高 (P<0 05), TSH 接 近 正 常 水 平, 见 表 1 表 1 各 组 大 鼠 血 清 T3 T4 和 TSH 水 平 (n=10, 珋 x±s) 组 别 T3(nmol/L) T4(nmol/L) TSH(μIU/ml) 正 常 对 照 0.81± ± ±0.28 甲 减 0.62± ± ±9.79 单 独 治 疗 0.81±0.05 # 52.40±5.86 # 1.23±1.21 联 合 治 疗 0.76±0.06 # 52.75±2.02 # 1.08±0.13 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.05; 与 甲 减 组 比 较 : # P<0 05

67 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １９３ ２ ２ 大鼠海马乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱含量 ２ ３ 大鼠海马各区 Ｓｙ １蛋白表达的变化 光镜 的变化 与正常对照组大鼠相比 甲减组大鼠海马 下观察各组大鼠海马不同亚区结构 见图 １ 可见 乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱含量明显降低 Ｐ Ｓｙ １在海马所有亚区各层均有表达 阳性着色呈棕 ５ 单独甲状腺素治疗后 大鼠乙酰胆碱酯酶 红色 甲减组和单独治疗组 尤其是甲减组 大鼠 活性和乙酰胆碱含量升至正常水平 Ｐ ５ 甲 海马 ＤＧ分子层 ＣＡ１起层和放射层及 ＣＡ３透明层 状腺素联合多奈哌齐治疗后 大鼠乙酰胆碱酯酶活 和放射层的 Ｓｙ １较正常对照组呈低表达 而联合治 性明显降低 Ｐ ５ 而乙酰胆碱含量恢复至正 疗组和正常对照组 Ｓ ｙ １在海马不同亚区的表达基 ５ 见表 ２ 常水平 Ｐ 本相似 珋±ｓ 表 ２ 大鼠海马乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱含量 ｎ １ ｘ 乙酰胆碱酯酶活性 乙酰胆碱含量 ｍｇ μｇ ３ ２ ４ ２ ７±２２ １２ μｇ ｍｇ ２ ２７±３ ８２ 单独治疗 ２ ３ ２ ７±２ ８７ ２ ９ ２ ７±２１ ５３ １４ ８±２ ２ ４ ２１ ９８±４ ８８ 联合治疗 ２ ２ ２ ７±１９ ４１ ２２ ２７±３ ４ ５ 组别 正常对照 甲减 ５ 与正常对照组比较 Ｐ 以 Ｉ ｍａ ｇ Ｐｒ ｏｐｌ ｕｓ６ 图像分析系统对海马不 同亚区 Ｓｙ １的免疫产物进行平均光密度值分析 结 果显示 与正常对照组相比 甲减组大鼠海马 ＤＧ分 子层 ＣＡ１起层和放射层及 ＣＡ３透明层和放射层的 Ｓｙ １表达显著降低 Ｐ １ 而 ＤＧ颗粒细胞层 ＣＡ１腔隙层及 ＣＡ３起层的Ｓｙ １表达未见明显改变 １免疫反应 Ｐ ５ 单独甲状腺素治疗后Ｓｙ 图 １ 各组大鼠海马不同亚层的 Ｓｙ １的免疫反应物的表达 ４ Ｃ 正常对照组 Ｈｙ ｐ ｏ 甲减组 Ｔ４ 单独治疗组 Ｔ４ ＤＯＮ 联合治疗组 ＳＯ 起层 Ｓ Ｒ 放射层 Ｓ ＬＭ 腔隙层 Ｓ Ｌ 透明层 ＭＬ 分子层 ＰＬ 颗 粒细胞层

68 1094 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 3 大 鼠 海 马 Syt 1 蛋 白 水 平 ( 珋 x±s,od) 亚 区 分 层 正 常 对 照 组 甲 减 组 单 独 治 疗 组 联 合 治 疗 组 DG 分 子 层 4.75± ± ± ±0.05 颗 粒 细 胞 层 3.76± ± ± ±0.06 CA1 起 层 5.06± ± ± ±0.16 放 射 层 4.75± ± ± ±0.28 腔 隙 层 4.31± ± ± ±0.09 CA3 起 层 5.01± ± ± ±0.14 透 明 层 4.85± ± ± ±0.08 放 射 层 4.94± ± ± ±0.06 与 正 常 对 照 组 比 较 : P<0.01 产 物 分 布 及 细 胞 内 表 达 与 甲 减 大 鼠 相 似, 但 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 后 大 鼠 Syt 1 阳 性 免 疫 反 应 物 在 海 马 各 层 均 恢 复 至 正 常 对 照 组 大 鼠 水 平, 两 者 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 表 3 3 讨 论 甲 状 腺 功 能 减 退 症 是 一 种 常 见 的 内 分 泌 疾 病, 目 前 建 立 甲 减 的 动 物 模 型 的 方 法 较 成 熟, 其 中 科 研 上 最 常 用 的 方 法 之 一 是 利 用 抗 甲 状 腺 药 物 诱 导 甲 减 模 型, 其 主 要 优 点 为 实 验 方 法 操 作 简 单, 成 功 率 高, 重 复 性 好, 便 于 观 察 等 本 实 验 采 用 PTU 饮 水 ( 浓 度 为 0.05%)6 周 进 行 造 模, 并 检 测 血 清 T3 T4 水 平, 结 果 显 示 甲 减 组 大 鼠 血 清 T3 T4 明 显 低 于 正 常 对 照 组, 提 示 甲 减 模 型 制 备 成 功 此 外, 甲 状 腺 单 独 和 联 合 治 疗 后 T3 T4 明 显 升 高, 说 明 甲 状 腺 素 治 疗 可 使 甲 状 腺 相 关 指 标 恢 复 至 正 常 与 既 往 的 研 [13] 究 结 果 基 本 一 致 目 前 认 为 突 触 联 络 的 完 整 性 遭 到 破 坏 可 能 是 成 年 期 后 认 知 功 能 减 退 ( 包 括 甲 减 ) 的 原 因 [14] 突 触 蛋 白 由 于 参 与 化 学 突 触 传 递 的 全 过 程 正 受 到 广 泛 的 关 注,Syt 1 是 一 种 含 有 两 个 Ca 2+ 结 合 的 C2 结 构 域 的 突 触 囊 泡 整 合 膜 蛋 白, 介 导 快 速 同 步 神 经 递 质 释 放, 参 与 调 节 突 触 囊 泡 循 环 的 锚 定 融 合 和 再 利 用, 进 而 在 神 经 递 质 释 放 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 Syt 1 广 泛 分 布 与 神 经 及 神 经 内 分 泌 组 织 中, 在 生 物 体 内 主 要 集 中 于 大 脑 皮 质 和 海 马 的 小 突 触 囊 泡 和 大 致 密 核 [11-12] 心 囊 泡 表 面 近 期 研 究 显 示 Syt 1 可 能 与 自 然 衰 老 状 态 和 病 理 性 状 态 ( 如 AD 甲 减 ) 相 关 学 习 记 [15] 忆 减 退 有 关, 之 前 的 研 究 显 示 成 年 期 甲 减 大 鼠 海 马 CA1 CA3 和 DG 区 Syt 1 的 表 达 明 显 降 低, 且 单 独 甲 状 腺 素 替 代 治 疗 并 不 能 使 Syt 1 在 海 马 中 的 表 [15] 达 恢 复 至 正 常 本 研 究 与 既 往 研 究 结 果 基 本 一 致 脑 内 胆 碱 能 神 经 元 对 甲 状 腺 激 素 非 常 敏 感, 在 脑 发 育 关 键 期, 甲 状 腺 激 素 缺 乏 会 导 致 大 脑 皮 层 海 马 及 前 脑 基 底 部 胆 碱 能 神 经 元 相 关 酶 的 活 性 明 显 降 低, 造 成 中 枢 胆 碱 能 神 经 发 育 障 碍 然 而, 对 成 年 期 甲 减 对 脑 内 ( 尤 其 是 特 定 脑 区 ) 胆 碱 能 神 经 元 研 究 [10] 较 少 本 课 题 组 先 前 的 研 究 显 示 甲 减 大 鼠 额 叶 乙 酰 胆 碱 含 量 显 著 减 少, 而 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 降 低 可 能 是 甲 减 引 起 学 习 记 忆 能 力 减 退 的 原 因 之 一 海 马 位 于 颞 叶 内 侧 面 的 基 底 部, 是 内 侧 颞 叶 记 忆 系 统 的 重 要 组 成 部 分, 主 要 参 与 空 间 记 忆 和 事 件 记 忆 的 形 成 [16] [17] 研 究 显 示 海 马 在 自 然 衰 老 和 AD 更 容 易 受 损, 且 与 其 相 关 认 知 功 能 减 退 密 切 相 关 因 此, 海 马 是 研 究 学 习 记 忆 改 变 机 制 的 理 想 目 标 脑 区 本 研 究 显 示 甲 减 大 鼠 海 马 CA1 CA3 和 齿 状 回 区 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 和 乙 酰 胆 碱 含 量 明 显 降 低, 与 额 叶 部 位 的 研 究 结 果 相 似 [10] 多 奈 哌 齐 是 乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑 制 剂, 可 以 提 高 突 [15] 触 间 隙 乙 酰 胆 碱 含 量, 研 究 显 示 多 奈 哌 齐 可 以 改 善 甲 减 大 鼠 的 认 知 功 能, 但 具 体 机 制 不 明 确, 可 能 与 某 些 突 触 相 关 蛋 白 有 关 本 实 验 采 用 甲 状 腺 激 素 联 合 多 奈 哌 齐 干 预 成 年 甲 减 大 鼠, 发 现 海 马 内 乙 酰 胆 碱 含 量 和 Syt 1 均 可 恢 复 至 正 常 范 围, 提 示 甲 状 腺 素 联 合 多 奈 哌 齐 可 能 用 于 治 疗 甲 减 引 起 的 脑 功 能 损 伤 综 上 所 述, 血 清 甲 状 腺 素 可 引 起 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 的 变 化, 因 此, 甲 减 脑 功 能 受 损 可 能 与 海 马 内 乙 酰 胆 碱 含 量 异 常 有 关 然 而, 甲 减 导 致 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 降 低 的 确 切 原 因 未 明, 可 能 与 甲 减 引 起 脑 内 突 触 相 关 蛋 白 表 达 异 常 和 ( 或 ) 血 清 甲 状 腺 素 水 平 改 变 直 接 影 响 脑 内 乙 酰 胆 碱 含 量 有 关 总 之, 甲 减 可 引 起 脑 内 乙 酰 胆 碱 酯 酶 活 性 乙 酰 胆 碱 含 量 及 Syt 1 表 达 降 低, 甲 状 腺 激 素 单 独 治 疗 对 上 述 损 伤 有 改 善 作 用, 但 联 合 多 奈 哌 齐 治 疗 效 果 可 能 更 好, 提 示 多 奈 哌 齐 对 甲 减 的 认 知 功 能 恢 复 可 能 更 有 价 值 参 考 文 献 [1] DiLiegroI.Thyroidhormonesandthecentralnervoussystem of mammals(review)[j].molmedrep,2008,1(3): [2] KoromilasC,LiapiC,SchulpisKH,etal.Structuralandfunc tionalalterationsinthehippocampusduetohypothyroidism [J]. MetabBrainDis,2010,25(3): [3] AmbroginiP,CuppiniR,FeriP,etal.Thyroidhormonesafect neurogenesisinthedentategyrusofadultrat[j].neuroendocri nology,2005,81(4):

69 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1095 [4] AlzoubiKH,GergesNZ,AlkadhiKA.Levothyroxinrestores hypothyroidism inducedimpairmentofltpofhippocampalca1: electrophysiologicaland molecularstudies[j]. Exp Neurol, 2005,195(2): [5] DeNicolaAF,LabombardaF,DeniseleM C,etal.Progester oneneuroprotectionintraumaticcnsinjuryandmotoneuronde generation[j].frontneuroendocrinol,2009,30(2): [6] DjebailiM,GuoQ,PetusEH,etal.Theneurosteroidsproges teroneandalopregnanolonereduceceldeath,gliosis,andfunc tionaldeficitsaftertraumaticbraininjuryinrats[j].jneurotrau ma,2005,22(1): [7] SmithJW,EvansAT,CostalB,etal.Thyroidhormones,brain functionandcognition:abriefreview[j].neuroscibiobehav Rev,2002,26(1): [8] SarkarPK,RayAK.InvolvementofL triodothyronineinacetyl cholinemetabolisminadultratcerebrocorticalsynaptosomes[j]. HormMetabRes,2001,33(5): [9] 李 永 军, 王 群, 陆 兵 勤. 成 年 甲 减 大 鼠 认 知 行 为 及 其 机 制 研 究 [J]. 中 华 现 代 内 科 学 杂 志,2008,5(7): [10] 刘 俊 霞, 朱 德 发, 王 芬, 等. 甲 状 腺 激 素 对 大 鼠 额 叶 乙 酰 胆 碱 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 保 健 杂 志,2011,14(6): [11]MasliahE,MaloryM,AlfordM,etal.Alteredexpresionofsyn apticproteinsoccursearlyduringprogresionofalzheimer sdis ease[j].neurology,2001,56(1): [12]ChenGH,WangYJ,QinS,etal.Age relatedspatialcognitive impairmentiscorelatedwithincreaseinsynaptotagmin1indorsal hippocampusinsamp8mice[j].neurobiolaging,2007,28 (4): [13] AlmandozJP,GharibH.Hypothyroidism:etiology,diagnosis, andmanagement[j].medclinnortham,2012,96(2): [14] orisonjh,baxterm G.Theageingcorticalsynapse:halmarks andimplicationsforcognitivedecline[j].natrevneurosci, 2012,13(4): [15]ZhuY,NingD,WangF,etal.Efectofthyroxineonmunc 18 andsyntaxin 1expresionindorsalhippocampusofadult onsethy pothyroidrats[j].eurjhistochem,2012,56(2):e22. [16]VannSD,AlbaserM M.Hippocampusandneocortex:recogni tionandspatialmemory[j].curopinneurobiol,2011,21 (3): [17] BurkeSN,BarnesCA.Neuralplasticityintheageingbrain [J].NatRevNeurosci,2006,7(1): Efectsofthyroxineanddonepezilonacetylcholinecontent,acetylcholinesterase activityandsynaptotagmin 1expresioninhypothyroidrats WuYang 1,CaiYaojun 2,ZhuDefa 2 ( 1 DeptofPharmacy, 2 DeptofEndocrinology,TheFirstAfiliatedHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toinvestigatetheefectsofthyroxineanddonepeziltreatmentonthehypothyroidism in ducedalterationsofacetylcholine(ach)contentandacetycholinesterase(ache)activityandsynaptotagmin 1 (Syt 1)expresioninthehippocampusofadultrats.Methods AdultmaleSDratswererandomlydividedinto threegroups:blankcontrolgroup,hypothyroidismgroup,thyroxinetreatmentgroup,thyroxineanddonepeziltreat mentgroup.concentrationofachandtheactivityofacheweredeterminedcolorimetricaly,andproteinlevelof Syt 1wasdeterminedbyimmunohistochemistry.Results Compairedtothecontrols,thehypothyroidismratshad significantdecrementsofachlevels,acheactivityandsyt 1expresioninthehippocampus(P<0 05).Thyrox ine,achlevelsandacheactivitywererestoredbythyroxineadministration,whileexpresionofsyt 1didnot reachthecontrollevel.co administrationofthyroxineanddonepezilledtonormalizationofthyroxine,achlevels aswelasthesyt 1expresion.Conclusion HypothyroidismcanleadtothedeclineofAChlevels,AChEactivity andsyt 1expresioninthehippocampus,andthyroidreplacementalonemayreducesomeofthesedamages,but thyroidcombinedwithdonepeziltreatmentcanbebeterinthehypothyroidismadultrats. Keywords hypothyroidism;hippocampus;thyroxine;donepezil;synaptotagmin 1

70 1096 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) SDF 1α 复 合 PluronicF 127 的 构 建 及 其 对 BMSCs 的 体 外 生 物 效 应 研 究 田 甜 1, 程 继 光 2 1, 周 健 摘 要 目 的 构 建 装 载 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1α(SDF 1α) 的 PluronicF 127 新 型 复 合 材 料, 并 研 究 其 对 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (BMSCs) 的 体 外 生 物 效 应 方 法 构 建 装 载 不 同 浓 度 SDF 1α(200 50ng/ml) 的 PluronicF 127 复 合 水 凝 胶, 采 用 Transwel 小 室 进 行 复 合 水 凝 胶 对 BMSCs 的 体 外 趋 化 实 验 将 BMSCs 与 复 合 材 料 均 匀 混 合, 加 成 骨 细 胞 诱 导 液 进 行 培 养, 并 对 其 行 碱 性 磷 酸 酶 (AKP) 活 性 测 定 及 茜 素 红 染 色, 由 结 果 可 观 察 到 BMSCs 的 成 骨 诱 导 分 化 情 况, 并 用 MTT 法 检 测 复 合 培 养 后 细 胞 的 活 性 状 况 结 果 趋 化 实 验 结 果 显 示, 含 SDF 1α 浓 度 为 200ng/ml 的 复 合 水 凝 胶 对 BMSCs 的 募 集 效 果 显 著 (P<0 05) MTT 法 证 实 了 PluronicF 127 对 细 胞 增 殖 不 产 生 影 响 (P>0 05) BMSCs 复 合 材 料 单 纯 BMSCs 在 成 骨 诱 导 培 养 条 件 下, 两 组 细 胞 的 AKP 表 达 量 均 明 显 增 高, 并 且 都 高 于 非 成 骨 诱 导 组 (P<0 05), 同 时 诱 导 组 镜 下 可 见 明 显 的 钙 结 节 形 成 结 论 成 功 构 建 装 载 SDF 1α 的 PluronicF 127 新 型 复 合 材 料, 其 在 体 外 对 BMSCs 有 明 显 的 趋 化 作 用, 在 细 胞 材 料 复 合 培 养 的 三 维 支 架 中,BMSCs 能 够 存 活 并 被 成 功 诱 导 分 化 为 成 骨 细 胞 关 键 词 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1α;PluronicF 127 水 凝 胶 ; 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ; 成 骨 诱 导 分 化 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (bonemesenchymalstem cels,bmscs) 具 有 多 向 分 化 能 力, 被 认 为 是 最 具 潜 能 的 种 子 细 胞 [1] 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1α(stromal celderivedfactor 1α,SDF 1α) 可 通 过 其 受 体 CX CR4 对 BMSCs 起 活 化 迁 移 的 作 用, 在 众 多 的 细 胞 因 子 / 趋 化 因 子 中,SDF 1α 对 BMSCs 的 归 巢 和 定 位 尤 为 重 要 [2-3] SDF 1α/CXCR4 轴 对 BMSCs 迁 移 至 骨 折 部 位 起 着 关 键 作 用, 并 且 募 集 到 骨 折 部 位 的 细 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 口 腔 医 学 院, 安 徽 医 科 大 学 附 属 口 腔 医 院, 安 徽 省 口 腔 疾 病 研 究 中 心 实 验 室, 合 肥 安 徽 医 科 大 学 口 腔 医 学 院, 安 徽 医 科 大 学 附 属 口 腔 医 院, 口 腔 颌 面 外 科, 合 肥 作 者 简 介 : 田 甜, 女, 硕 士 研 究 生 ; 周 健, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:zj@ah mu.edu.cn 胞 可 积 极 地 参 与 软 骨 内 的 骨 修 复 [4] 然 而, 骨 缺 损 处 相 对 较 低 的 骨 再 生 能 力 限 制 了 骨 的 再 生 数 量 [5], 并 且 骨 的 再 生 修 复 主 要 取 决 于 其 募 集 的 干 细 胞 数 量 因 此, 增 加 骨 损 处 SDF 1α 的 表 达 对 其 募 集 BMSCs 以 及 骨 损 修 复 都 起 着 关 键 作 用 现 通 过 构 建 复 合 SDF 1α 的 PluronicF 127 水 凝 胶, 探 讨 其 在 体 外 条 件 下 对 BMSCs 的 募 集 能 力 和 促 成 骨 作 用, 以 期 为 应 用 细 胞 复 合 材 料 进 行 骨 缺 损 的 组 织 工 程 修 复 研 究 提 供 新 的 途 径 和 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 实 验 动 物 SD 大 鼠, 清 洁 级,4~6 周 龄, 体 重 60~80g, 雌 雄 不 限, 由 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供 仪 器 与 试 剂 恒 温 CO 2 培 养 箱 ( 美 国 Ther moforma 公 司 ); 自 动 酶 标 仪 ( 美 国 Bio tek 公 司 ); 荧 光 倒 置 显 微 镜 ( 德 国 Leica 公 司 ); 大 鼠 SDF 1α ( 以 色 列 ProSpecbio 公 司 ); 低 糖 型 DMEM 培 养 基 胎 牛 血 清 (FBS) 和 胰 蛋 白 酶 ( 美 国 Hyclone 公 司 ); β 甘 油 磷 酸 钠 地 塞 米 松 维 生 素 C MTT 和 Pluronic F 127( 美 国 Sigma 公 司 );Transwel 小 室 ( 美 国 Cost ar 公 司 );BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 ( 北 京 原 平 皓 生 物 技 术 有 限 公 司 ); 碱 性 磷 酸 酶 试 剂 盒 ( 南 京 建 成 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 茜 素 红 ( 上 海 三 爱 思 试 剂 公 司 ) 1.2 方 法 大 鼠 BMSCs 的 分 离 和 培 养 取 4~6 周 龄, 体 重 约 80g 的 SD 大 鼠 无 菌 条 件 下 剥 离 双 侧 股 骨 和 胫 骨, 冲 出 骨 髓, 采 用 全 骨 髓 贴 壁 培 养 法, 分 离 培 养 BMSCs 至 第 3 代, 并 对 其 进 行 PI/AO 染 色 以 观 察 细 胞 的 活 性 状 况 和 形 态 PluronicF 127 水 凝 胶 的 配 制 及 其 与 SDF 1α 的 复 合 将 PluronicF 127 粉 末 与 低 糖 DMEM 不 完 全 培 养 基 以 质 量 分 数 为 25% 的 比 例 混 合 配 制, 置 于 4 冰 箱 内, 至 絮 状 白 色 颗 粒 完 全 消 失 之 后 经 0 22 μm 的 滤 器 过 滤 于 4 保 存 冰 浴 下, 将 不 等 量 的 SDF 1α 分 别 滴 入 PluronicF 127 溶 液 中 混 匀, 使 配 制 的 复 合 液 中 SDF 1α 浓 度 分 别 为 ng/ml, 以 2.5

71 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1097 ml 注 射 器 抽 取 复 合 液 置 于 4 保 存 备 用 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 对 BMSCs 的 体 外 趋 化 作 用 采 用 Transwel 小 室 趋 化 实 验, 检 测 体 外 条 件 下, 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 对 大 鼠 BMSCs 的 趋 化 作 用 实 验 组 分 两 组, 在 其 中 一 组 的 趋 化 体 系 下 层 放 入 0 1ml 含 SDF 1α 浓 度 为 200ng/ml 的 复 合 水 凝 胶, 另 一 组 则 放 入 0.1ml 含 SDF 1α 浓 度 为 50ng/ml 的 复 合 水 凝 胶, 两 组 体 系 下 层 均 添 加 0.4ml 含 10% FBS 的 培 养 基, 对 照 组 体 系 下 层 为 单 纯 0.5ml 含 10% FBS 的 培 养 基, 各 组 均 覆 以 孔 径 8μm 的 微 孔 聚 碳 酸 酯 滤 膜, 各 组 体 系 上 层 均 加 入 0.2ml 含 10% FBS 的 培 养 基, 其 中 BMSCs 浓 度 约 /ml, 每 组 3 孔, 置 于 37 5% CO 2 培 养 箱 中,10h 后 取 出 滤 膜 并 刮 去 上 层 表 面 细 胞,PBS 冲 洗 3 次,4% 多 聚 甲 醛 固 定, 结 晶 紫 染 色, 倒 置 显 微 镜 ( 400 倍 ) 下 选 6 个 随 机 视 野 观 察 计 数, 将 结 果 进 行 统 计 学 分 析 PluronicF 127 凝 胶 的 细 胞 毒 性 检 测 将 第 3 代 BMSCs 消 化 1000r/min 离 心 3min 实 验 组 : 细 胞 与 PluronicF 127 溶 液 复 合, 细 胞 浓 度 调 至 /ml, 每 孔 200μl 接 种 于 48 孔 板, 放 于 37 培 养 箱, 待 凝 胶 形 成 对 照 组 : 取 200μlBMSCs 接 种 于 48 孔 板, 密 度 与 实 验 组 相 同 两 组 均 加 10% FBS 的 培 养 基 培 养, 分 别 于 接 种 后 的 第 天 各 取 6 孔 采 用 MTT 法 检 测 其 吸 光 值 (opticaldensity, OD) 复 合 水 凝 胶 三 维 培 养 BMSCs 并 诱 导 成 骨 分 化 取 第 3 代 BMSCs 消 化 1000r/min 离 心 3min 实 验 A 组 : 冰 浴 下, 将 细 胞 重 悬 于 含 SDF 1α 浓 度 为 200ng/ml 的 复 合 水 凝 胶, 吹 打 混 匀 使 细 胞 较 均 匀 分 布 于 复 合 材 料 中, 调 节 细 胞 浓 度 约 为 /ml, 将 BMSCs 复 合 材 料 混 合 液 加 入 24 孔 板, 每 孔 300μl, 置 于 CO 2 培 养 箱 中, 待 凝 胶 形 成, 每 孔 加 700μl 含 10% FBS 的 培 养 基 实 验 B 组 : 细 胞 浓 度 为 /ml, 每 孔 300μl 接 种 于 24 孔 板, 并 加 700μl 含 10% FBS 的 培 养 基 两 组 均 培 养 24h 后, 更 换 成 骨 细 胞 诱 导 液 ( 含 10mmol/L 的 β 甘 油 磷 酸 钠 100 mmol/l 的 地 塞 米 松 0.05g/L 的 维 生 素 C 10% FBS 低 糖 DMEM) 进 行 培 养 对 照 组 情 况 同 实 验 B 组, 培 养 基 选 用 含 10% FBS 的 培 养 基, 不 加 成 骨 诱 导 液 分 别 于 成 骨 诱 导 后 的 第 7 14 天,3 组 各 取 3 孔 内 细 胞 进 行 碱 性 磷 酸 酶 (alkalinephosphatase, AKP) 检 测, 用 BCA 法 测 定 出 各 样 本 中 的 蛋 白 浓 度, 按 AKP 试 剂 盒 说 明 书 计 算 出 样 本 产 生 AKP 的 量 并 于 诱 导 后 14d 进 行 茜 素 红 染 色 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17.0 统 计 软 件 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 将 各 组 样 本 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 检 验 水 准 取 α= 结 果 2.1 BMSCs 的 体 外 培 养 BMSCs 分 离 培 养,24h 后 半 换 液, 倒 置 显 微 镜 下 显 示 已 有 细 胞 贴 壁,3~5d 后 细 胞 形 态 呈 现 多 样 : 如 纺 锤 形 多 角 形 梭 形 约 14d 细 胞 融 合 达 约 90%, 可 进 行 传 代, 传 代 后 细 胞 形 态 逐 渐 趋 向 一 致, 主 要 为 大 而 扁 的 梭 形 PI/AO 染 色 结 果 显 示 细 胞 呈 现 明 亮 的 绿 色 荧 光, 胞 核 清 晰, 细 胞 形 态 多 为 梭 形, 见 图 1 图 1 倒 置 相 差 显 微 镜 下 BM SCs 形 态 100 A:BMSCs 原 代 培 养 3d;B: BMSCs 第 3 代 ;C:BMSCs 的 PI/ AO 荧 光 染 色 2.2 含 不 同 浓 度 SDF 1α 的 复 合 水 凝 胶 对 BMSCs 的 趋 化 测 定 将 实 验 组 和 对 照 组 迁 移 的 BMSCs 统 计 结 果 进 行 方 差 分 析 (n=18, x±s), 珋 结 果 显 示 :3 组 的 细 胞 迁 移 数 分 别 为 :30 333± ± ±3 735, 组 间 F=49 536, 根 据 分 析 结 果 LSD 可 知, 相 比 含 SDF 1α50ng/ml 复 合 水 凝 胶 组 和 对 照 组, 含 SDF 1α200ng/ml 复 合 水 凝 胶 组 对 BMSCs 有 明 显 的 趋 化 效 果 (P<0 05), 在 两 实 验 组 中, 又 以 含 SDF 1α200ng/ml 复 合 水 凝 胶 组 趋 化 效 果 较 佳 (P<0 05), 见 图 MTT 法 测 定 细 胞 在 PluronicF 127 凝 胶 中 的 增 殖 随 着 时 间 的 延 长, 两 组 细 胞 测 定 的 OD 值 均 逐 渐 增 高, 在 7d 时 达 到 最 大 在 d 各 时 间 点, 将 两 组 的 OD 值 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 结 果 显 示 :F 值 分 别 为 , 由 分 析 结 果 LSD 得 出 各 时 间 点 两 组 OD 值 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 表 BMSCs 在 复 合 水 凝 胶 中 诱 导 成 骨 分 化 的 AKP 检 测 结 果 显 示, 实 验 组 与 对 照 组 的 AKP 在

72 １９８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ B A 图 ２ Ｔｒ ａｎｓ ｗ ｌ ｌ迁 移 细 胞 的 结 图 ３ 倒置相差显微镜下茜素红 晶紫染色 １ 染色 ４ Ａ 含 Ｓ ＤＦ １α２ｎｇ ｍｌ复 Ａ 实验 Ａ组 Ｂ 实验 Ｂ组 合 水 凝 胶 组 Ｂ 含 ＳＤＦ １α ５ Ｃ 对照组 ｎｇ ｍｌ复合水凝胶组 Ｃ 对照组 C 珋±ｓ 表 １ ＭＴＴ法检测 ＢＭＳＣｓ在 Ｐｌ ｕｒ ｏｎ ｃｆ １２ ７中的增殖 ｎ ６ ｘ 组别 １ ３ 损位点的骨再生 为了达到这个目的 通过物理吸附 的作用 不同浓度的 ＳＤＦ １α可被装载到水凝胶中 接种后培养时间 ｄ ５ ７ 实验 ２１７± １２４ ４９２± １１７ ６８６± １３１ ９４± １７２ 对照 ２１６± ６２ ５４８± １ ７１８± １９７ ９５６± １５ 从而使获得的复合材料在体外可对 ＳＤＦ １α进行缓 释并对 ＢＭＳＣｓ募集增加 随后可进行体外材料细胞 共同培养的实验 本研究显示 Ｐｌ ｕ ｒ ｏ ｎ ｃｆ １ ２７可作 诱导过程中的表达均逐渐增高 １４ｄ内呈增高 趋 为 ＳＤＦ １α的有效载体 提供一个可控制 ＳＤＦ １α释 势 将各组 ＡＫＰ数值进行组间单因素方差分析 在 放的空间 此外 装载 ＳＤＦ １α的 Ｐｌ ｕｒ ｏ ｎ ｃｆ １２ ７在 诱导 ７ｄ时 组间 Ｆ １ ２１ １８ ８ ＬＳＤ结果显示实验 体外能明显引起 ＢＭＳＣｓ的募集 其对 ＢＭＳＣｓ的募 Ａ Ｂ两组的 ＡＫＰ表达在 ７ｄ时差异无统计学意义 集由实验结果看与装载 Ｓ ＤＦ １α浓度相关 但是否 Ｐ ５ 在 １４ｄ时组间 Ｆ ２ ５ ８１ ＬＳ Ｄ结果显 存在剂量依赖性 则依赖进一步研究明确 示 Ａ组 ＡＫＰ表达高于 Ｂ组 Ｐ ５ 实验 Ａ Ｂ Ｓ ＤＦ １按照其氨基酸序列可归为趋化因子 ＣＸＣ 两组 ＡＫＰ的表达在 ７ １４ｄ均明显高于未加诱导液 亚家族成员 又称为 ＣＸＣＬ１２ 包括 ＳＤＦ １α和 Ｓ ＤＦ ５ 见表 ２ 的对照组 Ｐ １β两种 ＳＤＦ １β比 ＳＤＦ １α多了 ４个氨基酸 人源 性 ＳＤＦ １基因位于 １号染色体长臂 其种群间保守 珋 表２ 实验 Ａ Ｂ组与对照组 ＡＫＰ的表达比较 Ｕ ｇ ｐ ｒ ｏ ｎ ６ ｘ±ｓ 受体 ＣＸＣＲ４特异性结合形成 Ｓ ＤＦ １ ＣＸＣＲ４轴 从 接种后培养时间 ｄ 组别 性极强 可在心 脑 肝 骨骼肌等组织中表达 与其 ７ １４ 而发挥生物学效应 ＣＸＣＲ４是一种 ７次跨膜的 Ｇ 实验 Ａ ７ ８ ６ ６± ７ ９ ６ １７ ９９±３ ８３４ 实验 Ｂ ７ ４ ７± ２ ２ ３ ３ ８ ８ ３± １４ ６ １ ９ １５± ３８３ ７ ９９３± ４７ ７ 蛋白藕连受体 广泛表达于 ＣＤ３４ 细胞及炎症细胞 对照 与对照组比较 Ｐ ５ 与实验 Ｂ组比较 Ｐ ５ 表面 Ｓ ＤＦ １ ＣＸＣＲ４轴可对 ＣＤ３ ４ 细胞及循环淋巴 细胞进行定向性诱导迁移 对造血 神经系统发育及 ２ ５ 矿化结节茜素红染色 诱导培养 １４ｄ后 进 干细胞运动 肿瘤发生等产生重要的生物学作用 行茜素红染色 显微镜下 实验 Ａ Ｂ组的细胞均可 不仅 如 此 ＳＤＦ １ ＣＸＣＲ４轴 还 与 血 管 再 生 关 系 密 见橘红色钙结节团块 其形态 大小不等 而未加成 切 其可募集骨髓源性的干 祖细胞并能诱导细胞分 骨诱导液的对照组则未见钙结节的形成 见图 ３ 泌血管生成因子 从而促进血管新生 ６ 此外 Ｓ ＤＦ ３ 讨论 １还可与内皮祖细胞膜表面受体 ＣＸＣＲ４结合 诱导 成熟或不成熟的祖细胞动员 参与血管的生成 ７ 本研究的目的在于构建一种可释放 ＳＤＦ １α的 Ｐｌ ｕ ｒ ｏ ｎ ｃｆ １ ２７是一种非离子表面活性共聚物 复合水凝胶 作为有生物活性的支架材料 并评价其 ＰＥＯ ＰＰＯ ＰＥＯ 由 聚 氧 乙 烯 ＰＥＯ 与 聚 氧 丙 烯 对 ＢＭＳＣｓ的募集和促分化作用 假定装载 ＳＤＦ １α ＰＰＯ 组成 具有温度依赖性变化的物理特性并可 的水凝胶可诱导 ＢＭＳＣｓ的募集 并因此增强了骨缺 重复发生 在体内约 ６周可完全降解吸收 无明显的

73 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1099 免 疫 排 斥 反 应 等 特 点 作 为 细 胞 支 架,PluronicF 127 在 组 织 工 程 中 已 广 泛 应 用 于 软 骨 皮 肤 等 的 构 建 本 实 验 表 明 PluronicF 127 与 BMSCs 之 间 的 生 物 相 容 性 良 好,BMSCs 在 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 三 维 支 架 中 的 生 长 增 殖 也 较 为 稳 定, 在 此 基 础 上 本 实 验 将 BMSCs 成 功 诱 导 分 化 为 成 骨 细 胞, 由 此, 可 设 想 为 干 细 胞 工 程 治 疗 骨 损 的 研 究 提 供 新 的 思 路 和 方 法 但 在 同 时, 本 研 究 显 示 PluronicF 127 强 度 较 差, 降 解 速 度 较 快, 这 给 体 外 实 验 的 进 行 增 加 了 较 大 的 难 度, 这 些 不 足 在 一 定 程 度 上 限 制 了 其 作 为 骨 修 复 材 料 的 使 用 本 研 究 表 明 装 载 SDF 1α 的 PluronicF 127 新 型 复 合 材 料, 对 MBSCs 具 有 募 集 和 诱 导 成 骨 分 化 的 能 力, 通 过 改 善 骨 创 部 位 的 微 环 境, 来 促 进 内 源 性 BM SCs 在 损 伤 部 位 的 募 集, 参 与 骨 缺 损 修 复, 为 新 型 颌 面 骨 修 复 材 料 的 制 备 提 供 实 验 依 据, 最 终 达 到 治 疗 骨 软 骨 缺 损 的 目 的 然 而, 复 合 SDF 1α 水 凝 胶 对 SDF 1α 的 释 放 规 律 以 及 细 胞 复 合 凝 胶 共 同 培 养 的 具 体 机 制 并 不 明 确, 还 需 进 一 步 的 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] FongELS,ChanCK,GoodmanSB.Stemcelhominginmus culoskeletalinjury[j].biomaterials,2011,32(2): [2] HonczarenkoM,LeYI,SwierkowskiM,etal.Humanbonemar rowstromalcelsexpresadistinctsetofbiologicalyfunctional chemokinereceptors[j].stemcels,2006,24(4): [3] PeledA,PetitI,KoletO,etal.Dependenceofhumanstemcel engraftmentandrepopulationofnod/scidmiceoncxcr4[j]. Science,1999,283(5403): [4] KitaoriT,ItoH,SchwarzEM,etal.Stromalcel derivedfactor 1/CXCR4signalingiscriticalfortherecruitmentofmesenchymal stemcelstothefracturesiteduringskeletalrepairinamouse model[j].arthritis&rheumatism,2009,60(3): [5] SculeanA,NikolidakisD,SchwarzF.Regenerationofperiodontal tisues:combinationsofbariermembranesandgraftingmaterials biologicalfoundationandpreclinicalevidence:asystematicreview [J].JClinPeriodontol,2008,35(s8): [6] TakahashiM.RoleoftheSDF 1/CXCR4systeminmyocardialin farction[j].circj,2010,74(3): [7] PetitI,JinD,RafiS.TheSDF 1 CXCR4signalingpathway:a molecularhubmodulatingneo angiogenesis[j].trendsimmunol, 2007,28(7): IncorporationofSDF 1αinPluronicF 127hydrogeland itsbiologicalefectonbmscsinvitro TianTian 1,ChengJiguang 2,ZhouJian 1 ( 1 StomatologicHospitalColege,AnhuiMedicalUniversity,KeyLab.ofOralDiseasesResearchof AnhuiProvince,Hefei ; 2 StomatologicHospitalColege,AnhuiMedicalUniversity, DeptofOralandMaxilofacialSurgery,Hefei ) Abstract Objective TodetecttheefectofPluronicF 127hydrogelcombinedwithstromalcelderivedfactor 1α (SDF 1α)onbonemesenchymalstemcels(BMSCs) biologicalefectinvitro.methods Transwelchamberwas usedtodetecttheefectofpluronicf 127hydrogelcombinedwithvariousconcentrationofSDF 1α(200,50ng/ ml)onbmscs migration.thebmscswereosteogenesisculturedin3 dimensionalscafoldsdf 1α PluronicF 127hydrogel,thenalkalinephosphatase(AKP)activityandalizarinredwasevaluated,andMTTwasusedtoex plorethecytoactiveofbmscsafterculturedinsdf 1α gel.results Theresultofchemotaxisdisplayedthatthe concentrationofsdf 1α200ng/mlinhydrogelhadobviousefectonmigrationofBMSCs(P<0 05).MTTcon firmedpluronicf 127hadnoefectoncelproliferation(P>0 05).Comparedwithcontrolgroup,BMSCs gel groupandpurebmscsgroup sakphadsignificantlyincreasedinthecircumstancesofosteogenesisinduction(p< 0 05),andcalcium nodulecouldbefoundintheinductiongroup.conclusion ThecompositematerialF 127 loadedwithsdf 1αsignificantlypromoteschemotacticmigrationofBMSCsinvitro,BMSCscansurviveandbein duceddiferentiationintoosteoblastinthe3 dimensionalscafoldsdf 1α gel. Keywords stromalcelderivedfactor 1α;PluronicF 127hydrogel;bonemesenchymalstemcels;osteogenicdif ferentiation

74 1100 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 预 防 医 学 研 究 安 徽 省 长 丰 县 农 村 已 婚 妇 女 焦 虑 现 况 及 其 影 响 因 素 研 究 周 洋 洋 1, 苏 虹 1, 宋 健 1, 郭 亮 亮 1, 程 健 1, 王 旭 1, 金 鎏 1, 孙 业 桓 1 2, 陈 明 春 摘 要 目 的 探 讨 农 村 留 守 妇 女 焦 虑 现 况 及 其 影 响 因 素, 为 开 展 有 针 对 性 的 干 预 提 供 信 息 方 法 采 用 多 阶 段 抽 样 的 方 法 抽 取 长 丰 县 2036 名 农 村 已 婚 妇 女, 运 用 焦 虑 自 评 量 表 (SAS) 匹 兹 堡 睡 眠 质 量 指 数 量 表 (PSQI) 自 编 一 般 情 况 问 卷 进 行 现 场 调 查 结 果 2036 名 农 村 已 婚 妇 女 中 留 守 妇 女 672 名, 占 总 数 的 33 0%; 其 中 40 6% 的 留 守 妇 女 出 现 焦 虑 症 状, 高 于 非 留 守 妇 女 焦 虑 症 状 的 患 病 率 27 5%, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (χ 2 =35 78,P<0 01) 在 不 同 年 龄 段 上 比 较, 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 障 碍 患 病 率 均 高 于 非 留 守 妇 女, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01) 对 留 守 妇 女 焦 虑 进 行 多 因 素 回 归 分 析, 结 果 显 示 : 健 康 较 差 (OR=2 862,95%CI=1 361 ~34 718) 睡 眠 障 碍 (OR =1 780,95% CI=1 305~ 2 188) 经 常 感 到 孤 独 (OR=1 452,95% CI=1 142~ 1 855) 年 龄 41 岁 (OR =2 419,95% CI=1 636~ 5 031) 留 守 时 间 3 年 (OR=2 013,95% CI=1 269~ 3 625) 是 影 响 留 守 妇 女 焦 虑 的 危 险 因 素 ; 经 常 联 系 (OR= 0 503,95%CI=0 291~0 834) 家 庭 月 收 入 3001 元 (OR =0 481,95%CI=0 063~0 946) 是 影 响 留 守 妇 女 焦 虑 的 保 护 性 因 素 结 论 留 守 妇 女 出 现 焦 虑 症 状 较 为 普 遍, 其 发 生 可 能 是 多 种 因 素 共 同 作 用 的 结 果 在 制 定 干 预 措 施 时, 应 综 合 考 虑 留 守 时 间 夫 妻 联 系 频 率 睡 眠 质 量 等 因 素 关 键 词 中 图 分 类 号 农 村 留 守 妇 女 ; 焦 虑 ; 影 响 因 素 R173 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 留 守 妇 女 是 指 丈 夫 长 期 ( 通 常 指 半 年 及 半 年 以 上 ) 离 家 进 城 务 工 经 商 或 从 事 其 他 生 产 经 营 活 动 的 农 民 群 体 的 妻 子 [1] 安 徽 是 劳 务 输 出 大 省, 根 据 2007 年 安 徽 统 计 年 鉴 显 示, 全 省 有 农 村 留 守 妇 女 483 万, 约 占 总 人 口 的 10% [2] 由 于 丈 夫 长 年 在 外 务 工, 留 守 妇 女 成 为 农 业 生 产 家 庭 生 活 的 主 体, 加 之 与 丈 夫 的 情 感 交 流 减 少, 导 致 留 守 妇 女 较 易 出 现 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 流 行 病 与 卫 生 统 计 学 系, 合 肥 合 肥 市 长 丰 县 疾 病 控 制 中 心, 合 肥 作 者 简 介 : 周 洋 洋, 男, 硕 士 研 究 生 ; 苏 虹, 女, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:su hong5151@ sina.com 一 些 心 身 疾 病 和 不 良 情 绪 [3], 然 而 目 前 尚 无 有 关 留 [4] 守 妇 女 焦 虑 的 研 究 根 据 文 献 报 道, 焦 虑 可 增 加 患 冠 心 病 和 心 脏 病 的 机 率, 也 是 女 性 多 囊 卵 巢 综 合 征 的 一 个 独 立 危 险 因 素 [5] 因 此, 该 研 究 以 合 肥 市 长 丰 县 地 区 农 村 留 守 妇 女 为 研 究 对 象, 探 讨 该 特 殊 人 群 焦 虑 的 现 状 及 其 影 响 因 素, 为 有 针 对 性 地 开 展 农 村 留 守 妇 女 焦 虑 的 预 防 干 预, 提 供 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 采 用 多 级 抽 样 方 法, 首 先 将 长 丰 县 16 个 乡 镇 开 发 区 根 据 人 口 密 度 分 成 3 层 ; 其 次, 在 每 层 随 机 选 取 1 个 乡 镇 ; 最 后, 在 所 抽 乡 镇 中 随 机 抽 取 若 干 名 农 村 已 婚 妇 女 于 2012 年 9 月 ~2012 年 10 月, 共 发 放 问 卷 2087 份, 全 部 收 回, 剔 除 不 合 格 问 卷 51 份, 得 到 有 效 问 卷 2036 份, 有 效 率 为 97 56% 1.2 方 法 采 用 问 卷 方 式, 由 经 过 培 训 的 调 查 员 对 调 查 者 进 行 施 测, 测 试 前 向 受 试 者 使 用 统 一 指 导 语, 当 场 填 写 并 回 收 问 卷 调 查 内 容 包 括 :1 自 编 一 般 情 况 问 卷 : 包 括 一 般 人 口 学 特 征 留 守 情 况 夫 妻 日 常 联 系 频 率 孤 独 感 身 体 状 况 等 其 中 身 体 状 况, 根 据 调 查 对 象 自 身 的 描 述 分 为 较 好 一 般 较 差 3 个 等 级 ; 孤 独 感 夫 妻 联 系 频 率, 根 据 调 查 对 象 自 身 描 述 分 别 分 为 偶 尔 有 时 经 常, 很 少 有 时 经 常 2 焦 虑 自 评 量 表 (Self RatingAnxietyScale,SAS) [6] : 共 20 个 题 目, 用 于 测 量 过 去 1 周 内 焦 虑 状 态 SAS 的 主 要 统 计 指 标 为 总 分 将 20 个 项 目 的 各 个 得 分 相 加, 即 得 粗 分 ; 用 粗 分 乘 以 1 25 以 后 取 整 数 部 份, 就 得 到 标 准 分,SAS 标 准 分 的 分 界 值 为 50 分, 以 得 分 越 高, 焦 虑 倾 向 越 明 显 3 匹 兹 堡 睡 眠 质 量 指 数 量 表 (Pitsburgh SleepQualityIndex,PSQI) [7] : 量 表 评 定 期 限 为 1 个 月, 由 18 个 自 评 条 目 7 个 成 份 构 成, 每 个 成 份 按 0 ~3 等 级 计 分, 累 积 各 成 份 得 分 即 为 PSQI 总 分, 总 分 范 围 为 0~21, 以 得 分 7 为 界 值, 得 分 越 高, 表 明 睡 眠 质 量 越 差 该 量 表 有 较 好 的 信 效 度 1.3 质 量 控 制 采 用 现 场 问 卷 调 查, 在 获 得 调 查 对

75 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1101 象 口 头 知 情 同 意 的 情 况 下, 由 经 过 统 一 培 训 的 调 查 员 进 行 面 对 面 问 答 现 场 对 收 回 问 卷 进 行 核 对 检 查, 剔 除 填 写 不 完 整 的 问 卷 1.4 统 计 学 处 理 采 用 EpiData3 1 软 件 进 行 数 据 的 建 库 录 入 应 用 SPSS17 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 两 独 立 样 本 t 检 验 χ 2 检 验, 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 对 单 因 素 筛 选 出 的 变 量 (P<0 10), 采 用 多 因 素 Logistic 回 归 分 析, 应 用 逐 步 向 前 法 进 行 模 型 拟 合 2 结 果 2.1 一 般 情 况 共 调 查 2036 名 农 村 已 婚 妇 女, 留 守 妇 女 672 人 (33 0%), 平 均 年 龄 (39 5±6 96) 岁, 其 中 <30 岁 108 人,30~40 岁 181 人,41~50 岁 222 人, 51 岁 161 人 ; 非 留 守 妇 女 1364 人 (67 0%), 平 均 年 龄 (40 3±7 48) 岁, 其 中 <30 岁 189 人,30~40 岁 425 人,41~50 岁 396 人, 51 岁 354 人 年 龄 文 化 程 度 家 庭 收 工 作 情 况 在 留 守 妇 女 组 与 非 留 守 妇 女 组 之 间 的 差 异 均 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 而 身 体 状 况 孤 独 感 在 两 组 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 表 1 表 1 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 一 般 人 口 学 特 征 比 较 [n(%)] 项 目 留 守 妇 女 非 留 守 妇 女 合 计 χ 2 /t 值 P 值 人 数 672(33.0) 1364(67.0) 2036 年 龄 ( 岁 ) 39.5± ± 文 化 程 度 文 盲 226(33.6) 462(33.9) 688(33.8) 小 学 或 初 中 434(64.6) 873(64.0) 1307(64.2) 高 中 及 以 上 12(1.8) 29(2.1) 41(2.0) 家 庭 月 收 入 ( 元 ) < (5.0) 67(4.9) 101(5.0) 1000~ (76.3) 1089(79.8) 1602(78.7) (18.7) 208(15.3) 333(16.3) 身 体 状 况 13.15<0.01 较 好 67(10.0) 153(11.2) 220(10.8) 一 般 366(54.5) 842(61.7) 1208(59.3) 较 差 239(35.5) 369(27.1) 608(29.9) 工 作 情 况 务 农 487(72.4) 987(72.3) 1474(72.4) 非 务 农 工 作 112(16.7) 217(16.0) 329(16.2) 无 73(10.9) 160(11.7) 233(11.4) 孤 独 感 经 常 121(18.0) 184(13.5) 305(15.0) 有 时 353(52.5) 727(31.3) 1080(53.1) 偶 尔 198(29.5) 453(55.2) 651(31.9) 2.2 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 质 量 的 比 较 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 障 碍 在 < 30 岁 30~40 岁 41~50 岁 51 岁 4 个 年 龄 段 的 患 病 人 数 ( 患 病 率 ), 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P< 0 01), 见 表 2 表 2 留 守 妇 女 与 非 留 守 妇 女 的 焦 虑 睡 眠 质 量 比 较 [n(%)] 年 龄 ( 岁 ) 留 守 妇 女 非 留 守 妇 女 合 计 χ 2 值 P 值 <30 焦 虑 28(25.7) 23(12.1) 51(17.1) 睡 眠 障 碍 36(32.9) 22(11.4) 58(19.5) < ~40 焦 虑 58(32.3) 85(20.1) 143(23.7) 睡 眠 障 碍 74(40.8) 97(23.0) 171(28.3) < ~50 焦 虑 101(45.4) 125(31.6) 226(36.6) 睡 眠 障 碍 106(47.6) 113(28.8) 219(35.4) < 焦 虑 86(53.4) 141(39.7) 227(44.0) 睡 眠 障 碍 82(51.2) 110(31.2) 192(37.2) <0.001 合 计 焦 虑 273(40.6) 375(27.5) 648(31.8) <0.001 睡 眠 障 碍 298(44.3) 342(25.1) 640(31.4) < 留 守 妇 女 焦 虑 相 关 影 响 因 素 的 Logistic 回 归 分 析 将 留 守 妇 女 是 否 出 现 SAS 总 得 分 50 作 为 因 变 量 (<50=0, 50=1), 并 对 相 关 因 素 进 行 赋 值, 见 表 3 首 先 对 可 能 影 响 焦 虑 的 因 素 作 为 自 变 量, 进 行 单 因 素 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 结 果 显 示 : 焦 虑 在 不 同 年 龄 文 化 程 度 身 体 状 况 家 庭 月 收 入 留 守 时 间 联 系 频 率 工 作 孤 独 感 以 及 睡 眠 较 差 的 组 间 存 在 差 异, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 在 单 因 素 分 析 的 基 础 上, 筛 选 P<0 10 的 变 量, 进 行 多 因 素 Logistic 回 归 模 型, 采 用 逐 步 向 前 法 对 模 型 进 行 拟 合 分 析 结 果 显 示 身 体 较 差, 年 龄 41 岁, 留 守 时 间 3 年, 睡 眠 质 量 较 差, 经 常 感 到 孤 独 是 影 响 留 守 妇 女 焦 虑 的 危 险 因 素 ; 经 常 联 系, 家 庭 月 收 入 3001 元 是 保 护 性 因 素, 见 表 4 表 3 变 量 赋 值 情 况 变 量 变 量 赋 值 焦 虑 SAS<50=0;SAS 50=1 年 龄 ( 岁 ) <30=0;30~40=1;41~50=2; 51=3 文 化 程 度 文 盲 =0; 小 学 及 初 中 =1; 高 中 及 以 上 =2 身 体 状 况 较 好 =0; 一 般 =1; 较 差 =2 家 庭 月 收 入 ( 元 ) <1000=0;1000~3000=1; 3001=2 独 居 否 =0; 是 =1 留 守 时 间 ( 年 ) <3=0;3~6=1; 7=2 担 心 丈 夫 否 =0; 是 =1 联 系 频 率 很 少 =0; 有 时 =1; 经 常 =2 工 作 种 地 =0; 非 务 农 工 作 =1; 无 =2 倾 诉 对 象 无 =0; 有 =1 孤 独 感 偶 尔 =0; 有 时 =1; 经 常 =2 睡 眠 质 量 PSQI<7=0;PSQI 7=1

76 1102 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 4 留 守 妇 女 焦 虑 相 关 因 素 的 多 因 素 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 项 目 B Wald OR 值 95% CI P 值 家 庭 月 收 入 ( 元 ) < ~ (0.829~2.082) (0.063~0.946) 身 体 状 况 <0.001 较 好 1 一 般 (1.525~4.754) 较 差 (1.361~34.718) <0.001 联 系 频 率 <0.001 很 少 1 有 时 (0.343~1.116) 经 常 (0.291~0.834) 留 守 时 间 ( 年 ) <0.001 <3 1 3~ (1.269~3.625) < (1.043~2.931) 睡 眠 质 量 (1.305~2.188) 年 龄 ( 岁 ) <0.001 < ~ (0.028~3.170) ~ (1.636~5.031) < (1.051~7.895) 孤 独 感 偶 尔 1 有 时 (0.438~1.205) 经 常 (1.142~1.855) 讨 论 [3] 调 查 显 示, 本 地 区 农 村 妇 女 留 守 率 为 33 0%, 高 于 2008 年 湖 南 省 调 查 的 留 守 率 30 6%, 原 因 可 能 与 安 徽 省 是 劳 务 输 出 大 省, 外 出 务 工 人 员 较 多 有 关 本 次 研 究 中,40 6% 的 留 守 妇 女 具 有 焦 虑 情 绪, 明 显 高 于 非 留 守 妇 女 的 27 5%, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 ; 两 组 间 各 个 年 龄 段 焦 虑 情 绪 的 差 异 也 都 具 有 统 计 学 意 义, 提 示 留 守 状 态 增 加 各 年 龄 段 妇 女 的 焦 虑 情 绪 多 因 素 非 条 件 Logistic 回 归 分 析 留 守 妇 女 焦 虑 的 影 响 因 素, 最 终 纳 入 的 因 素 有 : 家 庭 月 收 入 身 体 状 况 联 系 频 率 留 守 时 间 睡 眠 质 量 年 龄 孤 独 感 家 庭 月 收 入 高 ( 3001 元 ) 的 留 守 妇 女 具 有 焦 [8-9] 虑 情 绪 危 险 性 较 低, 这 与 国 内 外 的 研 究 结 果 相 一 致 可 能 因 为 较 好 的 经 济 条 件, 能 够 为 居 住 饮 食 就 医 等 方 面 提 供 保 障, 充 分 降 低 留 守 妇 女 的 生 活 压 力 和 精 神 负 担, 进 而 降 低 其 产 生 焦 虑 情 绪 的 风 险 身 体 状 况 较 差 的 留 守 妇 女 较 易 出 现 焦 虑, 这 可 能 由 于 一 些 慢 性 病 妇 科 病 等 躯 体 疾 患 易 继 发 焦 虑 [10-11] 此 外, 农 村 留 守 妇 女 需 要 承 担 繁 杂 的 家 务 劳 动 以 及 繁 重 的 农 业 生 产 活 动, 而 健 康 状 况 差 会 对 农 业 生 产 活 动 及 家 庭 经 济 状 况 产 生 影 响, 这 也 可 能 是 导 致 焦 虑 的 原 因 之 一 本 研 究 显 示, 偶 尔 有 孤 独 感 与 丈 夫 经 常 联 系 的 留 守 妇 女, 焦 虑 情 绪 的 出 现 率 较 低, 可 能 是 通 过 在 与 丈 夫 或 朋 友 的 交 流 过 程 中 经 常 倾 诉, 可 以 缓 解 由 于 情 感 缺 失 带 来 的 负 面 情 绪 有 关 留 守 时 间 3 年 是 影 响 焦 虑 的 危 险 因 素, 造 成 此 种 结 果 的 原 因 可 能 有 : 留 守 时 间 越 长, 留 守 妇 女 独 [12] 自 经 历 生 活 事 件 的 次 数 越 多 有 研 究 表 明, 心 理 应 激 是 包 括 生 活 事 件 ( 应 激 源 ) 应 对 方 式 社 会 支 持 和 身 心 反 应 等 多 种 因 素 的 作 用 系 统 而 生 活 事 件 所 引 发 的 各 种 压 力 反 应, 长 时 间 持 续 的 作 用 于 留 守 妇 女, 将 耗 尽 用 以 调 适 压 力 的 能 力 与 精 力, 从 而 导 致 机 体 产 生 生 理 反 应 以 及 焦 虑 等 心 理 反 应 [13] 焦 虑 是 常 见 的 一 种 心 理 障 碍, 与 睡 眠 障 碍 关 系 密 切 并 可 相 互 影 响 本 研 究 结 果 提 示 睡 眠 障 碍 与 焦 虑 有 密 切 关 联, 这 也 与 Kofeletal [14] 研 究 结 果 相 一 致 本 次 研 究 还 显 示 40 岁 以 上 留 守 妇 女 焦 虑 发 生 [15] 率 较 高, 这 与 之 前 一 些 文 献 结 论 相 一 致 随 着 年 龄 的 增 长, 农 村 留 守 妇 女 往 往 承 担 着 较 多 的 家 庭 社 会 责 任, 加 上 该 年 龄 段 的 人 群 躯 体 健 康 状 况 呈 下 降 趋 势, 身 心 更 可 能 处 于 应 激 状 况, 导 致 发 生 焦 虑 情 绪 的 风 险 增 加 农 村 留 守 妇 女 作 为 家 庭 结 构 中 重 要 的 一 员, 承 担 着 更 多 的 家 庭 责 任, 其 健 康 的 心 理 和 生 理 对 个 人 及 家 庭 都 起 到 重 要 的 作 用 本 研 究 结 果 提 示, 农 村 留 守 妇 女 的 焦 虑 情 绪 较 为 普 遍, 且 影 响 因 素 众 多 为 此, 制 定 干 预 对 策 时 应 综 合 考 虑 心 理 护 理 加 强 夫 妻 双 方 联 系 频 率, 并 把 留 守 时 间 较 长 者 作 为 重 点 干 预 对 象 开 展 健 康 教 育, 积 极 组 织 留 守 妇 女 之 间 的 交 流, 以 缓 解 留 守 带 来 的 焦 虑 情 绪, 提 高 留 守 妇 女 的 健 康 水 平 参 考 文 献 [1] 吴 惠 芳, 饶 静. 农 村 留 守 妇 女 研 究 综 述 [J]. 中 国 农 业 大 学 学 报 ( 社 会 科 学 版 ),2009,26(2): [2] 张 巧 遇. 安 徽 省 农 村 留 守 妇 女 研 究 [D]. 合 肥 : 安 徽 大 学, [3] 钟 斌, 姚 树 桥. 农 村 留 守 妇 女 的 抑 郁 症 状 及 相 关 心 理 社 会 因 素 [J]. 中 国 临 床 心 理 学 杂 志,2012,20(6): [4] RoestAM,MartensEJ,deJongeP,etal.Anxietyandriskof incidentcoronaryheartdisease:ameta analysis[j].jam Col

77 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1103 Cardiol,2010,56(1): [5] Veltman VerhulstSM,BoivinJ,EijkemansMJ,etal.Emotional distresisacommonriskinwomenwithpolycysticovarysyn drome:asystematicreviewandmeta analysisof28studies[j]. HumReprodUpdate,2012,18(6): [6] 汪 向 东, 王 希 林, 马 弘, 等. 心 理 卫 生 评 定 量 表 手 册 [J]. 中 国 心 理 卫 生 杂 志,1999,( 增 刊 ): [7] 刘 贤 臣, 唐 茂 芹, 胡 蕾, 等. 匹 兹 堡 睡 眠 质 量 指 数 的 信 度 和 效 度 研 究 [J]. 中 华 精 神 科 杂 志,1996,29(2): [8] GrantBF,HasinDS,StinsonFS,etal.Prevalence,corelates, comorbidity,andcomparativedisabilityofdsm Ⅳ generalized anxietydisorderintheusa:resultsfromthenationalepidemiolog icsurveyonalcoholandrelatedconditions[j].psychological Medicine,2005,35(12): [9] 王 小 燕, 方 鹏 骞, 傅 新 巧, 等. 中 部 地 区 城 市 社 区 居 民 焦 虑 流 行 特 点 及 心 理 护 理 服 务 利 用 态 度 调 查 [J]. 医 学 与 社 会,2012,25 (10):74-6. [10] 陆 文, 赵 宝 龙. 女 性 尿 路 感 染 患 者 焦 虑 抑 郁 症 状 发 生 率 调 查 [J]. 吉 林 医 学,2010,28(31): [11] 付 朝 伟, 徐 飚, 栾 荣 生, 等. 大 城 市 综 合 医 院 冠 心 病 病 人 抑 郁 / 焦 虑 影 响 因 素 探 讨 [J]. 卫 生 研 究,2006,5(35):63-6. [12] 姜 乾 金. 医 学 心 理 学 [M].4 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2004: [13] 栾 荣 生. 心 血 管 疾 病 与 心 理 社 会 因 素 [M]. 北 京 : 北 京 医 科 大 学 中 国 协 和 医 科 大 学 联 合 出 版 社,1994: [14] KofelE,WatsonD.Thetwo factorstructureofsleepcomplaints anditsrelationtodepresionandanxiety[j].jabnormpsychol, 2009,118(1): [15] 朱 大 方, 徐 水 洋, 杨 清, 等. 浙 江 省 城 市 居 民 焦 虑 抑 郁 现 状 及 影 响 因 素 [J]. 中 国 公 共 卫 生,2010,26(4): Studyonthecurrentstatusandinfluentialfactorsofanxietyof marriedwomeninruralareasofanhuiprovince ZhouYangyang,SuHong,SongJian,etal (DeptofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toinvestigatetheprevalenceofanxietyandtheefectfactorsamongleft behindwomenin ruralareas.methods Withmultistagesamplingmethod,2036left behindwomenweremeasuredwithpitsburgh SleepQualityIndex(PSQI),Self RatingAnxietyScale(SAS)andaself administeredquestionnaireduringsep tember,2012tooctober,2012.results 672left behindwomen,accountingfor33 0% ofthetotalwomen,were surveyedinthisinvestigation.theprevalenceratesofanxiety,amongleft behindwomenandnon left behind womenwere40 6%,27 5%,respectively.Thediferenceofanxietybetweenleft behindwomenandnon left be hindwomenwasobviouslysignificant(χ 2 =35 78,P<0 01).Comparedwithnon left behindwomen,thedifer encesoftheprevalenceofanxietyandsleepdisorderwerestatisticalysignificantregardingagediferences.results frommultivariatelogisticregresionanalysisindicatedthatphysicalhealthstatus(or=2 862,95%CI=1 361~ ),sleepdisorder(OR=1.780,95% CI=1 305~2 188),alone(OR=1 452,95% CI=1 142~ 1 855),elder( 41,OR=2.419,95%CI=1 636~5 031),timeofleft behind( 3years,OR=2.013, 95%CI=1 269~3 625)weretheriskfactors.Whileregularintouch(OR=0 503,95%CI=0 291~0 834), monthlyfamilyincome( 3001Yuan,OR=0 481,95%CI=0 063~0 946)wasprotectivefactors.Conclu sion Ourfindingsindicatethatthestatusofanxietyamongtheleft behindwomenisserious.itsoccurencemay betheresultofmanyfactors;thedevelopmentofpreventivemeasuresmustbeconsideredpsychologicalcareand strengtheningthelinkagesbetweenhusbandandwifetoimprovethequalityofsleepbehindwomen. Keywords left behindwomen;anxiety;influencingfactors

78 1104 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 药 学 研 究 白 藜 芦 醇 改 善 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 胰 岛 素 抵 抗 的 机 制 探 讨 陈 莉 1,2, 陈 冠 军 3, 陈 兵 1, 程 静 静 1 1, 鲁 云 霞 摘 要 目 的 探 讨 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 2 种 白 色 脂 肪 组 织 胰 岛 素 抵 抗 相 关 基 因 瘦 素 (Leptin) 肿 瘤 坏 死 因 子 α (TNF α) 和 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(GRP78) 表 达 的 影 响 方 法 24 只 雄 性 C57BL/6 小 鼠 随 机 分 为 标 准 饮 食 组 (SCD) 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 组 (HCD) 及 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 + 白 藜 芦 醇 组 [HCD+RES, 白 藜 芦 醇 400mg/(kg d),12 周 ] 葡 萄 糖 耐 量 实 验 和 胰 岛 素 耐 量 实 验 分 析 胰 岛 素 抵 抗 的 改 善 作 用, 检 测 血 脂 指 标, 称 取 皮 下 脂 肪 (SAT) 和 肾 周 脂 肪 组 织 (VAT) 重 量,HE 染 色 检 测 脂 肪 组 织 的 病 理 学 变 化, 免 疫 组 化 和 实 时 荧 光 定 量 PCR 分 析 Leptin TNF α GRP78 的 胞 内 分 布 和 基 因 表 达 的 改 变 结 果 HCD 组 小 鼠 出 现 明 显 的 胰 岛 素 抵 抗, 血 清 总 胆 固 醇 (TC) 三 酰 甘 油 (TG) 低 密 度 脂 蛋 白 C(LDL C) 显 著 增 高, 高 密 度 脂 蛋 白 C(HDL C) 明 显 降 低, 体 重 SAT VAT 的 重 量 均 明 显 增 加, 脂 肪 细 胞 体 积 明 显 增 大, Leptin TNF α GRP78 的 mrna 和 蛋 白 表 达 显 著 增 加, 且 均 位 于 胞 质 中 ; 白 藜 芦 醇 能 显 著 改 善 胰 岛 素 抵 抗, 明 显 降 低 体 重 和 逆 转 血 脂 水 平 变 化, 明 显 下 调 SAT 和 VAT 中 Leptin TNF α GRP78 的 蛋 白 表 达 和 分 布, 显 著 降 低 SAT 中 Leptin TNF α GRP78 和 VAT 中 Leptin TNF αmrna 的 表 达 结 论 白 藜 芦 醇 具 有 明 显 的 改 善 胰 岛 素 抵 抗 和 降 脂 作 用, 其 机 制 可 能 是 通 过 抗 炎 减 少 Leptin 表 达 和 内 质 网 (ER) 应 激 有 关, 但 对 不 同 部 位 白 色 脂 肪 组 织 基 因 表 达 的 影 响 差 异 不 大 关 键 词 抵 抗 中 图 分 类 号 白 藜 芦 醇 ; 高 脂 血 症 ; 小 鼠 ; 白 色 脂 肪 组 织 ; 胰 岛 素 R615;R332;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 脂 肪 组 织 不 仅 参 与 能 量 的 储 存, 也 是 重 要 的 内 分 泌 器 官, 能 分 泌 多 种 不 同 的 生 物 活 性 物 质, 如 瘦 素 (Leptin) 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tumornecrosisfactor α, TNF α) 视 黄 醇 结 合 蛋 白 4(retinolbindingprotein, 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : MH MH154); 安 徽 医 科 大 学 校 级 博 士 基 金 ( 编 号 : XJ201013) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 生 物 化 学 教 研 室 3 化 学 教 研 室, 合 肥 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 检 验 科, 合 肥 作 者 简 介 : 陈 莉, 女, 硕 士 研 究 生 ; 鲁 云 霞, 女, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:wwwd [email protected] RBP4) 抵 抗 素 (resistin) 等 多 种 脂 肪 因 子 [1-2] 研 [3] 究 表 明 胰 岛 素 抵 抗 与 脂 肪 组 织 中 激 活 的 内 质 网 (endoplasmicreticulum,er) 应 激 有 关 [4-5] 脂 肪 细 胞 具 有 ER, 过 度 的 ER 应 激 可 能 会 导 致 细 胞 功 能 受 损 甚 至 凋 亡, 并 伴 随 脂 肪 因 子 炎 症 细 胞 因 子 表 达 的 改 变, 最 终 导 致 胰 岛 素 抵 抗 的 发 生 [6] 白 藜 芦 醇 是 一 种 天 然 的 非 黄 酮 类 多 酚 化 合 物, 具 有 抗 炎 抗 氧 化 抗 肿 瘤 和 延 缓 衰 老 等 功 效 [7] [8] 既 往 报 道 称 白 藜 芦 醇 抑 制 前 脂 肪 细 胞 增 殖 和 向 成 熟 脂 肪 细 胞 分 化, 且 由 于 其 毒 性 较 小, 可 能 开 发 成 有 效 的 减 肥 降 脂 药 物, 但 是 关 于 白 藜 芦 醇 是 否 能 同 时 改 善 不 同 部 位 脂 肪 组 织 中 炎 性 激 活 Leptin 表 达 和 ER 应 激 的 研 究 较 少 该 研 究 以 高 脂 血 症 小 鼠 为 研 究 对 象, 探 讨 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 2 种 典 型 的 白 色 脂 肪 组 织 : 皮 下 脂 肪 组 织 (subcutaneousadiposetisue,sat) 和 肾 周 脂 肪 组 织 (visceraladiposetisue,vat) 中 炎 性 激 活 Leptin 表 达 和 ER 应 激 相 关 基 因 的 表 达 的 影 响 ; 由 于 白 藜 芦 醇 是 天 然 无 毒 化 合 物, 但 作 用 较 缓 [9] 慢, 因 此 参 照 文 献 选 取 单 一 的 较 高 剂 量 白 藜 芦 醇 400mg/(kg d) 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 8 周 龄 C57BL/6 小 鼠 24 只, 清 洁 级, 雄 性, 体 重 (21 43±2 08)g, 由 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供, 适 应 性 饲 养 1 周 后 实 验 1.2 主 要 试 剂 白 藜 芦 醇 ( 南 京 泽 朗 医 药 科 学 技 术 有 限 公 司 );RNAStore 样 品 保 存 液 ( 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ); 兔 抗 鼠 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78(glucose regulatedprotein,grp78) 一 抗 ( 美 国 Abcam 公 司 ); 兔 抗 鼠 Leptin TNF α 一 抗 山 羊 抗 兔 及 山 羊 抗 鼠 辣 根 过 氧 化 物 酶 抗 体 ( 武 汉 博 士 德 生 物 技 术 有 限 公 司 );TRIzol 试 剂 ( 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ); 逆 转 录 试 剂 盒 Revert TM FirstStrandcDNA SynthesisKit ( 立 陶 宛 FermentasLifeSciences 公 司 );GRP78 Lep tin TNF α GAPDH 引 物 ( 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 ); itaq TM UniversalSYBR Greensupermix( 美 国 Bio Rad 公 司 ) 1.3 造 模 及 分 组 将 C57BL/6 小 鼠 随 机 分 为 标 准

79 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1105 饮 食 组 (SCD) 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 组 (HCD,20% 猪 油 20% 蔗 糖 10% 蛋 黄 粉 1% 胆 固 醇 ) 和 高 热 量 高 胆 固 醇 饮 食 + 白 藜 芦 醇 组 (HCD+RES) 除 SCD 组 外, 其 余 两 组 均 为 HCD 喂 养,HCD+RES 组 在 HCD 的 同 时 灌 胃 白 藜 芦 醇 400mg/(kg d) 治 疗 12 周 操 作 均 遵 守 安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 要 求 1.4 葡 萄 糖 耐 量 (glucosetolerancetest,gtt) 和 胰 岛 素 耐 量 实 验 (insulintolerancetest,itt) 小 鼠 禁 食 12h 后, 灌 胃 给 予 葡 萄 糖 2g/kg, 分 别 于 min 鼠 尾 采 血 测 定 血 糖 水 平, 行 GTT; 小 鼠 禁 食 4h 后, 腹 腔 注 射 胰 岛 素 0.1U/kg, 分 别 于 min 采 血 测 定 血 糖 值, 行 ITT 采 血 量 约 为 5μl, 采 血 过 程 中 小 鼠 生 命 体 征 平 稳 1.5 小 鼠 血 标 本 及 组 织 留 取 所 有 小 鼠 禁 食 12h, 称 重, 麻 醉, 腹 主 动 脉 采 血, 常 规 制 备 血 清, 测 定 总 胆 固 醇 (totalcholesterol,tc) 三 酰 甘 油 (triglyceride, TG) 高 密 度 脂 蛋 白 (highdensitylipoprotein choles terol,hdl C) 和 低 密 度 脂 蛋 白 (lowdensitylipopro tein cholesterol,ldl C) 的 浓 度 (OlympusAU640 全 自 动 生 化 分 析 仪 ) 完 整 分 离 小 鼠 SAT 及 VAT( 代 表 内 脏 脂 肪 组 织 ), 电 子 天 平 称 重, 计 算 2 种 脂 肪 组 织 占 体 重 的 比 例 (g/g) 一 部 分 甲 醛 中 固 定, 另 一 部 分 在 预 冷 的 1 DEPC 水 中 清 洗 后 置 于 RNAStore 样 品 保 存 液 中,4 过 夜 后 倾 去 保 护 液, 储 存 在 -80 冰 箱 中 备 用 1.6 病 理 形 态 学 观 察 每 只 小 鼠 的 2 种 脂 肪 组 织 均 以 10% 中 性 多 聚 甲 醛 固 定, 石 蜡 包 埋 切 片, 常 规 HE 染 色, 光 镜 下 观 察 并 拍 照, 每 个 组 织 随 机 取 5 个 视 野 ( 200), 测 定 约 300 个 细 胞 的 大 小 1.7 免 疫 组 化 分 析 石 蜡 包 埋 脂 肪 组 织 以 4μm 连 续 切 片,SABC 法 进 行 Leptin TNF α GRP78 的 免 疫 组 化 分 析, 一 抗 为 羊 抗 兔 的 多 克 隆 抗 体,DAB 显 色, 脱 水 透 明 和 封 片, 光 镜 下 观 察 并 拍 照, 每 张 切 片 随 机 选 取 5 个 视 野, 再 用 metamorph 生 物 图 像 软 件 计 算 各 组 免 疫 阳 性 细 胞 的 平 均 光 密 度 值 (integral opticaldensity,iod) 1.8 实 时 荧 光 定 量 PCR 分 析 从 100mg 脂 肪 组 织 提 取 总 RNA, 取 RNA3μg 逆 转 录 合 成 cdna, 在 StepOnePlus(ABI 公 司 ) 上 进 行 实 时 荧 光 定 量 PCR 分 析 内 参 GAPDH 上 游 :5 TGTGTCCGTCGTG GATCTGA 3, 下 游 :5 CCTGCTTCAC CACCTTCTT GAT 3 Leptin 上 游 :5 GAGACCCCTGTGTCGGT TC 3, 下 游 :5 CTGCGTGTGTGAAATGTCATTG 3 TNF α 上 游 :5 CCCTCACACTCA GATCATCTTCT 3, 下 游 :5 GCTACGACGTGGGCTACAG 3 GRP78 上 游 :5 TGTGGTACCCACCAAGAAGTC 3, 下 游 :5 TTCAGCTGTCACTCGGAGAAT 3 反 应 体 系 为 20 μl, 反 应 条 件 为 95 30s 预 变 性,95 5s,60 30s,40 个 循 环 通 过 计 算 2 -ΔΔCt 得 出 各 组 基 因 的 相 对 表 达 水 平 1.9 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 计 量 资 料 以 x±s 珋 表 示, 多 组 间 均 数 比 较 采 用 方 差 分 析 (ANOVA), 两 两 比 较 采 用 最 小 显 著 差 异 法 (LSD 法 ) 2 结 果 2.1 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 GTT 和 ITT 实 验 均 表 明 HCD 组 小 鼠 空 腹 血 糖 比 SCD 和 HCD+RES 组 高, 注 射 葡 萄 糖 30min 后 血 糖 达 到 峰 值, 且 明 显 高 于 SCD 和 HCD+RES 组 ;HCD +RES 各 时 间 点 的 血 糖 值 介 于 SCD 和 HCD 组 之 间, 表 明 白 藜 芦 醇 有 明 显 的 改 善 胰 岛 素 抵 抗 的 作 用, 见 图 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 血 脂 指 标 的 影 响 与 SCD 组 比 较,HCD 组 小 鼠 TC TG LDL C 均 显 著 升 高,HDL C 明 显 降 低 (P<0 05,P<0 01);HCD+ RES 组 TG LDL C 均 显 著 低 于 HCD 组,HDL C 显 著 升 高 (P<0 05), 而 TC 与 HCD 组 比 较 降 低 不 明 显, 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 表 1 表 1 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 血 脂 指 标 的 影 响 (n=8, x±s) 珋 组 别 TC TG HDL C LDL C (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) SCD 1.49± ± ± ±0.05 HCD 3.10± ± ± ±0.12 HCD+RES 2.80± ±0.10 # 1.72±0.36 # 0.47±0.09 # F 值 与 SCD 组 比 较 : P<0.05, P<0.01; 与 HCD 组 比 较 : # P< 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 体 重 及 SAT VAT 的 影 响 与 SCD 组 比 较,HCD 组 小 鼠 体 重 SAT VAT 均 显 著 升 高 ; 与 HCD 组 比 较,HCD+RES 组 小 鼠 体 重 显 著 下 降 (P<0 05),SAT 和 VAT 组 织 SAT/ 体 重 和 VAT/ 体 重 的 比 值 均 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 表 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 细 胞 病 理 学 的 影 响 与 SCD 组 相 比,HCD 组 小 鼠 的 SAT 和 VAT 中 脂 肪 细 胞 的 体 积 明 显 增 大, 且 细 胞 大 小 不 一, 出 现

80 1106 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) A 25 B (mmol/l) HCD HCD+RES SCD (mmol/l) 10 6 HCD HCD+RES SCD C (GTT) (min) SCD HCD HCD+RES * ** (ITT) 0 D (min) SCD HCD HCD+RES * ** 图 1 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 胰 岛 素 抵 抗 的 影 响 A:GTT;B:ITT;C:GTT 曲 线 下 面 积 ;D:ITT 曲 线 下 面 积 ;1:SCD 组 ;2:HCD 组 ;3:HCD+RES 组 表 2 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 体 重 和 脂 肪 重 量 的 影 响 (n=8, x±s) 珋 组 别 体 重 (g) SAT(g) VAT(g) SAT/ 体 重 VAT/ 体 重 SCD 32.33± ± ± ± ±0.003 HCD 35.67± ± ± ± ±0.009 HCD+RES 31.00±3.03 # 0.98± ± ± ±0.010 F 值 与 SCD 组 比 较 : P<0.05, P<0.01; 与 HCD 组 比 较 : # P<0.05 冠 状 结 构 (crown likestructures,cls)( 见 图 2 中 箭 头 所 示 ); 与 HCD 组 相 比,HCD+RES 组 的 SAT 和 VAT 中 脂 肪 细 胞 明 显 变 小, 几 乎 无 CLS 脂 肪 细 胞 大 小 的 测 量 结 果 表 明, 高 脂 可 诱 导 SAT 和 VAT 中 的 脂 肪 细 胞 体 积 显 著 增 大, 白 藜 芦 醇 则 可 使 脂 肪 细 胞 体 积 明 显 减 小 (P<0 01), 见 表 3 表 3 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 细 胞 大 小 的 影 响 (μm, x±s) 珋 组 别 SAT VAT SCD 45.71± ±0.64 HCD 91.47± ±1.86 HCD+RES 40.25±0.36 ## 70.20±0.54 ## F 值 与 SCD 组 比 较 : P<0.05; 与 HCD 组 比 较 : ## P< 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 蛋 白 表 达 的 影 响 与 SCD 组 相 比,HCD 组 小 鼠 的 SAT 和 VAT 中 Leptin TNF α 和 GRP78 蛋 白 表 达 水 平 均 明 显 升 高, 且 主 要 分 布 在 胞 质 中 ;HCD+RES 组 小 鼠 SAT 和 VAT 中 Leptin TNF α 和 GRP78 的 蛋 白 表 达 均 明 显 减 少, 见 图 3~5; 免 疫 组 化 的 半 定 量 结 果 表 明,SCD 组 和 HCD 组 HCD 组 和 HCD+RES 组 间 各 基 因 的 蛋 白 表 达 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 表 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 mrna 表 达 的 影 响 与 SCD 组 相 比,HCD 组 小 鼠 SAT VAT 中 Leptin TNF α GRP78mRNA 表 达 显 著 增 高 (P< 0 05) 与 HCD 组 相 比,HCD+RES 组 SAT 中 Lep tin TNF α GRP78mRNA 表 达 明 显 降 低 ;HCD + RES 组 VAT 中 Leptin TNF αmrna 表 达 明 显 降 低 (P<0 05), 而 GRP78 的 mrna 表 达 虽 然 降 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 见 图 6

81 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 ２ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 ＨＥ染色图片 ２ ＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 １ ＳＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 Ａ Ｓ １１７ 图 ４ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 ＴＮＦ Ｐ ２ α免疫组化图片 Ｓ ＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 １ Ｓ ＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 Ａ Ｓ 图 ３ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 Ｌ ｐ ｎ免疫组化图片 ＳＰ ２ 图 ５ ＳＡＴ和 ＶＡＴ组织的 ＧＲＰ７ ８免疫组化图片 Ｓ Ｐ ２ １ ＳＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 Ａ ＳＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 Ａ Ｓ ＣＤ组 Ｂ ＨＣＤ组 Ｃ ＨＣＤ ＲＥＳ组 １ Ｓ ＡＴ组织 ２ ＶＡＴ组织 ３ 讨论 脂血症小鼠的降脂作用报道虽然较多 １ １１ 但尚无 其对不同脂肪组织基因表达影响的报道 本文的通 白藜芦醇是一类天然的抗氧化剂 可降低血液 黏稠度 抑制血小板聚集等功效 有关白藜芦醇对高 过研究白藜芦醇对高脂血症小鼠不同脂肪组织基因 表达的影响 探讨白藜芦醇改善胰岛素抵抗的机制

82 1108 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 4 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 蛋 白 表 达 的 影 响 (IOD, x±s) 珋 组 别 SAT VAT Leptin TNF α GRP78 Leptin TNF α GRP78 SCD 0.073± ± ± ± ± ±0.008 HCD 0.124± ± ± ± ± ±0.003 HCD+RES 0.104±0.007 # 0.070±0.007 ## 0.078± ±0.011 # 0.110±0.009 ## 0.075±0.008 # F 值 与 SCD 组 比 较 : P<0 05; 与 HCD 组 比 较 : # P<0.05 图 6 SAT 和 VAT 组 织 mrna 表 达 水 平 分 析 A:Leptin;B:TNF α;c:grp78;1:scd 组 ;2:HCD 组 ;3:HCD+ RES 组 ; 与 SCD 组 比 较 : P<0.05; 与 HCD 组 比 较 : # P<0.05 同 时 比 较 白 藜 芦 醇 在 抗 炎 和 缓 解 ER 应 激 时 是 否 存 在 差 异 本 实 验 显 示 HCD 饮 食 喂 养 3 个 月 后,HCD 组 小 鼠 的 血 脂 指 标 TG TC LDL C 显 著 增 加,HDL C 明 显 降 低, 体 重 SAT 和 VAT 重 量 均 明 显 增 加,GTT 和 ITT 实 验 结 果 表 明 成 功 建 立 了 胰 岛 素 抵 抗 模 型 ; HCD+RES 组 血 清 TC TG LDL C 与 HCD 组 相 比 显 著 下 降, 小 鼠 体 重 明 显 下 降,SAT 和 VAT 重 量 也 有 所 下 降,HCD+RES 组 各 时 间 点 血 糖 和 胰 岛 素 水 平 均 低 于 HCD 组, 表 明 白 藜 芦 醇 具 有 较 好 的 改 善 胰 岛 素 抵 抗 和 高 脂 血 症 的 作 用 Leptin 是 成 熟 脂 肪 细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子, 当 动 物 和 人 体 重 增 加 时 脂 肪 组 织 通 过 分 泌 Leptin 作 用 于 中 枢 神 经 系 统 来 降 低 体 重, 但 肥 胖 时 会 出 现 Leptin 抵 抗 本 实 验 中 白 藜 芦 醇 减 少 Leptin 表 达 的 机 制 可 能 是 通 过 抑 制 脂 肪 细 胞 的 分 化 [7] [12] 有 报 道 称 TNF α 水 平 与 体 重 呈 正 相 关, 肥 胖 者 TNF α 水 平 显 著 增 高, 体 重 减 轻 后 TNF α 水 平 也 随 之 降 低, 本 实 验 观 察 到 HCD 组 小 鼠 SAT 和 VAT 中 TNF α Leptin 表 达 均 明 显 增 加,HCD+RES 组 小 鼠 TNF α Leptin 表 达 明 显 降 低, 与 SAT 和 VAT 的 改 变 一 致, 这 表 明 白 藜 芦 醇 减 少 脂 肪 组 织 TNF α 和 Leptin 表 达 可 能 与 减 少 SAT 和 VAT 重 量 有 关 白 藜 芦 醇 是 天 然 的 自 由 基 清 除 剂, 能 有 效 降 低 高 脂 引 起 的 氧 化 应 激, 而 氧 化 应 激 与 ER 应 激 密 切 相 关, 故 推 测 白 藜 芦 醇 可 能 也 会 影 响 高 脂 血 症 小 鼠 脂 肪 组 织 中 的 ER 应 激 GRP78 是 参 与 ER 蛋 白 质 折 叠 和 转 运 的 一 种 重 要 分 子 伴 侣, 生 理 状 态 下, GRP78 与 ER 膜 上 无 活 性 的 跨 膜 蛋 白 ATF6 PERK IRE1 结 合 在 低 氧 低 葡 萄 糖 低 Ca 2+ 和 高 脂 等 应 激 状 态 下,GRP78 与 三 种 跨 膜 蛋 白 分 离, 转 而 与 未 折 叠 蛋 白 结 合, 导 致 未 折 叠 蛋 白 反 应 (UPR) 研 [13] 究 表 明 TG 是 引 起 ER 应 激 标 志 物 GRP78 等 增 加 的 重 要 因 素 本 实 验 中, 由 于 血 清 TG 的 明 显 增 加,HCD 组 小 鼠 SAT 和 VAT 组 织 的 GRP78 表 达 显 著 增 加, 表 明 小 鼠 脂 肪 组 织 已 出 现 明 显 的 ER 应 激 ; 白 藜 芦 醇 组 小 鼠 SAT 组 织 GRP78 的 表 达 显 著 下 降, VAT 组 织 GRP78 的 表 达 也 有 所 下 降, 提 示 白 藜 芦 醇 可 能 是 通 过 减 少 GRP78 的 表 达 来 改 善 脂 肪 组 织 的 ER 应 激, 但 不 同 部 位 白 色 脂 肪 组 织 基 因 表 达 的 差 异 不 大 参 考 文 献 [1] LowS,ChinM C,Deurenberg YapM.Reviewonepidemicofo

83 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1109 besity[j].annacadmedsingapore,2009,38(1):57-9. [2] OuchiN,ParkerJL,LugusJ,etal.Adipokinesininflammation andmetabolicdisease[j].natrevimmunol,2011,11(2): [3] KawasakinN,AsadaR,SaitoA,etal.Obesity inducedendo plasmicreticulumstrescauseschronicinflammationinadiposetis sue[j].scirep,2012,2:799. [4] CnopM,FoufeleF,VelosoLA.Endoplasmicreticulumstres, obesityanddiabetes[j].trendsmolmed,2012,18(1): [5] HosoiT,OzawaK. Endoplasmicreticulum stresin disease: mechanismsandtherapeuticopportunities[j].clinsci(lond), 2009,118(1): [6] GregorM,HotamisligilGS.Thematicreviewseries:Adipocyte Biology.Adipocytestres:theendoplasmicreticulumandmetabol icdisease[j].jlipidres,2007,48(9): [7] YuW,FuYC,WangW.Celularandmolecularefectsofres veratrolinhealthanddiseases[j].jcelbiochem,2012,113 (3): [8] 陈 思 凡, 肖 新 才, 孙 延 霜, 等. 白 藜 芦 醇 对 小 鼠 3T3 L1 细 胞 增 殖 与 分 化 的 影 响 及 其 机 制 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2010,26 (1): [9] LagougeM,ArgmannC,Gerhart HinesZ,etal.Resveratrolim provesmitochondrialfunctionandprotectsagainstmetabolicdis easebyactivatingsirt1andpgc 1alpha[J].Cel,2006,127 (6): [10]AubinM C,LajoieC,ClémentR,etal.Femaleratsfedahigh fat dietwereasociatedwithvasculardysfunctionandcardiacfibrosis intheabsenceofovertobesityandhyperlipidemia:therapeuticpo tentialofresveratrol[j].jpharmacolexpther,2008,325(3): [11] 李 萍, 杜 洪 霞, 李 新 华, 等. 白 藜 芦 醇 对 高 脂 血 症 大 鼠 血 脂 血 小 板 聚 集 释 放 功 能 的 影 响 [J]. 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志, 2010,26(5): [12] 赵 水 平, 吴 洁. 非 诺 贝 特 对 高 脂 血 症 兔 血 清 及 脂 肪 细 胞 分 泌 肿 瘤 坏 死 因 子 α 的 影 响 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2005,21(2): [13] KimDS,JeongSK,KimHR,etal.EfectsoftriglycerideonER stresandinsulinresistance[j].biochembiophysrescommun, 2007,363(1): Researchofmechanismsofresveratrolimprovinginsulinresistance inwhiteadiposetisuesofhyperlipidemicmice ChenLi 1,2,ChenGuanjun 3,ChenBing 1,etal ( 1 DeptofBiochemistryandMolecularBiology, 3 DeptofChemistry,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofMedicalLaboratory,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Tostudytheinfluencesofresveratroloninsulin resistancerelatedgeneexpresionoflep tin,tnf α,glucoseregulatedprotein78(grp78)intwodiferentadiposetisuesofhyperlipidemicmice.meth ods Twenty fourc57bl/6micewererandomlydividedintostandardcontroldiet(scd),high calorieandhigh cholestroldiet(hcd)andhigh calorieandhigh cholestroldietgrouptreatedwithresveratrol[hcd+res,400 mg/(kg d),12weeks].glucosetolerancetest(gtt)andinsulintolerancetest(itt)wereusedtoanalyzethe improvementoninsulinresistance.theserumlipidindicesweredetected,thebodyweight,subcutaneousadipose tisues(sat)andvisceraladiposetisues(vat)wereweighedrespectively.thepathologicalchangesoftwoadi posetisuesweredetectedwithhestaining,theproteindistributionandmrna levelsofleptin,tnf αand GRP78weremeasuredwithimmunohistochemistryandreal timefluorescencequantificationrt PCRrespectively. Results ComparedwithSCDgroupmice,micefedwithHCDshowedobviousinsulinresistance,higherserumlev elsoftotalcholesterol(tc),triglyceride(tg)andlowdensitylipoprotein cholesterol(ldl C)andlowerserumlev elofhighdensitylipoprotein cholesterol(hdl C),thebodyweight,weightofSATandVAT,celvolumeofadi pocyteswerealsoobviouslyincreased.themrnaandproteinlevelsofleptin,tnf αandgrp78wereremark ablyaugmented,mainlydistributedincytosol.resveratrolcouldobviouslyimproveinsulinresistance,reversethe serumlipidlevelsandbodyweight,decreasetheproteinexpresionanddistributionofleptin,tnf αandgrp78 insatandvat,reducethemrnaexpresionofletpin,tnf α,grp78insat,andleptin,tnf αinvatre spectively.conclusion Resveratrolhasobviousefectsofimprovinginsulinresistanceandlipid lowering.the mechanismsareposiblyrelatedwithanti inflammatoryandreduceleptinresistanceandendoplasmicreticulum stres.itsinfluenceonthegeneexpresionsofwhiteadiposetisuesindiferentsiteshasnoobviousdiferences. Keywords resveratrol;hyperlipidemia;mice;whiteadiposetisue;insulinresistance

84 1110 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) rhil 1α 和 rhtnf α 对 人 成 纤 维 滑 膜 细 胞 PGE 2 受 体 和 Gαs 的 影 响 及 芍 药 苷 的 作 用 戴 杏, 郭 晓 蓉, 魏 伟 摘 要 目 的 探 讨 rhil 1α 和 rhtnf α 对 人 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 (FLS)PGE 2 受 体 (EP 2 ) 及 Gαs 表 达 的 影 响 及 芍 药 苷 (Pae) 的 作 用 方 法 体 外 培 养 人 FLS, 使 用 不 同 浓 度 的 rhil 1α 和 rhtnf α 刺 激 人 FLS, 观 察 EP 2 及 Gαs 蛋 白 表 达 的 情 况, 观 察 Pae 对 其 的 影 响 采 用 免 疫 荧 光 标 记 法 结 合 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 分 析 技 术 检 测 人 FLS 的 EP 2 表 达,Western blot 检 测 Gαs 表 达 结 果 rhil 1α( μg/L) 和 rht NF α( μg/L) 明 显 降 低 人 FLSEP 2 和 Gαs 表 达, Pae( mol/l) 可 上 调 人 FLS 的 EP 2 和 Gαs 表 达 结 论 Pae 恢 复 rhil 1α 和 rhtnf α 刺 激 后 EP 2 和 Gαs 的 表 达 可 能 是 其 抑 制 滑 膜 细 胞 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 分 子 机 制 之 一 关 键 词 rhil 1α;rhTNF α; 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 ;PGE 2 受 体 ; Gαs 蛋 白 ; 芍 药 苷 中 图 分 类 号 R967;R593.22;R97.5;R392.5 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 类 风 湿 关 节 炎 (rheumatoidarthritis,ra) 是 一 种 以 关 节 滑 膜 组 织 慢 性 炎 症 为 主 要 特 征 的 自 身 免 疫 性 疾 病, 伴 有 血 管 翳 形 成, 软 骨 缺 失 以 及 近 关 节 处 骨 组 织 的 侵 蚀 [1] 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 (fibroblast likesy noviocytes,fls) 释 放 大 量 的 炎 性 因 子 和 基 质 降 解 酶, 是 炎 症 关 节 中 关 键 的 效 应 细 胞 PGE 2 白 介 素 1 (IL 1) 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α) 等 炎 症 介 质 和 细 胞 因 子 都 可 以 引 起 FLS 的 异 常 活 化 PGE 2 通 过 G 蛋 白 偶 联 的 4 个 受 体 (EP 1~4 ) 来 发 挥 生 物 学 功 效 EP 2 和 EP4 可 以 提 高 AC 活 性, 升 高 camp 水 平 活 化 G 蛋 白 二 者 在 滑 膜 组 织 中 均 有 表 达, 其 中 EP 2 与 关 节 炎 关 系 最 为 紧 密 且 研 究 较 多 [2] 芍 药 苷 (Pae 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 : ); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 : QH158) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 临 床 药 理 研 究 所, 抗 炎 免 疫 药 物 教 育 部 重 点 实 验 室, 安 徽 省 中 药 研 究 与 开 发 重 点 实 验 室, 抗 炎 免 疫 药 物 安 徽 省 工 程 技 术 研 究 中 心, 合 肥 作 者 简 介 : 戴 杏, 女, 博 士 研 究 生 ; 魏 伟, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:wwei@ ahmu.edu.cn oniflorin,pae) 是 白 芍 总 苷 (totalglucosidesofpaeony, TGP) 主 要 活 性 成 分, 经 研 究 证 实 具 有 免 疫 调 节, 抗 [3-4] 炎 和 镇 痛 等 作 用 该 课 题 组 前 期 研 究 表 明 : TGP 可 以 调 节 ril 1α 和 rtnf α 体 外 刺 激 的 CIA 大 鼠 FLS 功 能 ;Pae 与 ril 1α 体 外 共 同 作 用 12h 后 可 升 高 CIA 大 鼠 FLSEP4 受 体 的 表 达 Pae 可 抑 制 rhil 1α rhtnf α 诱 导 的 人 FLS 异 常 增 殖 和 产 生 TNF α IL 1β 和 PGE 2 的 水 平, 提 高 细 胞 内 camp 水 平 [5-6] 该 研 究 在 前 期 实 验 基 础 上 利 用 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 正 常 人 FLS 后 观 察 EP 2 Gαs 的 表 达 情 况 以 及 Pae 对 其 的 影 响, 进 一 步 探 讨 Pae 发 挥 抑 制 滑 膜 细 胞 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 作 用 机 制 1 材 料 与 方 法 1.1 组 织 来 源 滑 膜 组 织 取 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 科 骨 折 患 者, 行 膝 关 节 置 换 术 时 留 取 滑 膜 标 本 分 离 培 养 滑 膜 组 织, 术 前 患 者 签 署 知 情 同 意 书 1.2 药 物 Pae(C 23 H 28 O 11 ): 由 安 徽 医 科 大 学 临 床 药 理 研 究 所 提 供 1.3 试 剂 与 仪 器 rhil 1α rhtnf α: 美 国 CYTO LAB 公 司 ; 胎 牛 血 清 (FBS) 胰 蛋 白 酶 DMEM 培 养 粉 : 美 国 Gibco 公 司 ;FITC 标 记 羊 抗 兔 IgG Vimentin 抗 体 CD68 抗 体 辣 根 酶 山 羊 抗 兔 IgG(H+L): 北 京 中 杉 金 桥 公 司 ; 兔 抗 人 Anti Gαs Anti EP 2 : 美 国 SantaCruz 公 司 ;β actin: 美 国 Sigma 公 司 ; 倒 置 相 差 显 微 镜 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 : 日 本 OLYMPUS 公 司 1.4 人 FLS 的 分 离 与 培 养 无 菌 取 患 者 少 许 关 节 滑 膜 组 织, 用 含 有 双 抗 的 PBS 洗 涤 2~3 次 后 剪 成 1 mm 2 大 小 的 组 织 块 放 置 于 DMEM 培 养 液 中, 将 组 织 块 均 匀 排 列 在 培 养 瓶 底 壁 上, 轻 轻 翻 转 使 瓶 底 朝 上, 然 后 置 于 37 5% CO 2 培 养 箱 内 培 养 使 其 贴 壁 6h 后 取 出 培 养 瓶 加 入 少 许 预 温 的 含 20%FBS 的 DMEM 培 养 液, 以 刚 刚 覆 盖 组 织 块 为 宜, 继 续 培 养, 1~2d 后 更 换 培 养 液,3~5d 后 即 会 长 出 少 量 细 胞, 待 有 大 量 细 胞 长 出 后 可 去 除 组 织 块, 细 胞 长 满 后, 用 0 25% 胰 蛋 白 酶 消 化, 并 传 代 培 养, 取 对 数 生

85 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1111 长 期 3~5 代 细 胞 用 于 实 验 1.5 人 FLS 的 免 疫 组 化 鉴 定 将 无 菌 小 盖 玻 片 泡 酸 消 毒 后 置 于 6 孔 板 中, 细 胞 悬 液 接 种 于 盖 玻 片 上, 待 细 胞 爬 满 玻 片 后 取 出, 按 以 下 步 骤 操 作 :1 PBS 洗 涤 玻 片 3 次, 每 次 洗 3min 2 4% 多 聚 甲 醇 固 定 10min, 再 用 PBS 冲 洗 3 次, 干 燥 3 正 常 羊 血 清 封 闭 30min,PBS 洗 涤 4 加 入 鼠 抗 人 Vimentin CD68 单 克 隆 抗 体 20 孵 育 1h,PBS 洗 涤 5 滴 加 HRP 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG 室 温 静 置 6 DAB 显 色 5min,PBS 或 蒸 馏 水 冲 洗 10min 终 止 显 色 7 0 5% 苏 木 精 复 染, 乙 醇 梯 度 脱 水, 中 性 树 胶 封 片, 镜 下 观 察 拍 照 1.6 免 疫 荧 光 法 测 人 FLSEP 2 表 达 及 图 像 分 析 取 第 3~5 代 人 FLS 用 含 20% FBS 的 DMEM 培 养 液 制 成 个 /L 细 胞 悬 液 加 入 24 孔 培 养 板, 每 孔 1ml, 置 于 培 养 箱 中 培 养 12h 使 其 贴 壁 后 弃 上 清 液, 分 别 加 入 含 rhil 1α( μg/L) rhtnf α ( μg/L) 以 及 rhil 1α(10μg/L) rhtnf α (20μg/L) 分 别 和 不 同 浓 度 的 Pae( mol/l) 混 合 的 DMEM 培 养 24h 后 终 止 反 应, 用 PBS 洗 涤 3 次, 甲 醇 -20 固 定 10min, 自 然 干 燥 10min, 用 10% 正 常 山 羊 血 清 室 温 封 闭 30 min, 加 入 按 稀 释 的 兔 抗 人 Anti EP 2,20 过 夜,PBS 液 冲 洗, 再 加 入 FITC 标 记 的 按 稀 释 的 羊 抗 兔 IgG37 避 光 孵 育 1h,PBS 冲 洗 后 用 ph 值 为 8 5 的 封 闭 液 封 片 以 PBS 替 代 一 抗 作 阴 性 对 照, 省 略 一 抗 作 空 白 对 照 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 并 采 图 图 像 采 用 ImageProPlus5 1 分 析 系 统 分 析 显 微 镜 下 发 出 黄 绿 色 荧 光 者 为 阳 性 细 胞, 取 上 下 左 右 中 5 个 显 微 镜 视 野 采 图, 图 像 分 析 系 统 分 析 每 个 视 野 的 光 密 度 值, 然 后 求 平 均 光 密 度 值 1.7 Westernblot 法 测 Gαs 蛋 白 表 达 取 第 3~5 代 人 FLS 用 含 20% FBS 的 DMEM 培 养 液 制 成 个 /L 细 胞 悬 液 加 入 6 孔 培 养 板, 加 入 含 rhil 1α (10μg/L) rhtnf α(20μg/l) 和 不 同 浓 度 的 Pae ( mol/l) 培 养 24h 后 终 止 反 应,PBS 充 分 洗 涤 后 加 入 RIRA 裂 解 液 200μl, 裂 解 30min, 用 细 胞 刮 刮 下 细 胞 收 集 后 移 至 EP 管 中, 于 -80 冰 箱 反 复 冻 融 3 次, 冰 浴 超 声 降 解 1min 后, 14000r/min 离 心 20min, 取 上 清 液, 保 存 -80 冰 箱 制 备 电 泳 凝 胶, 将 提 取 的 蛋 白 样 本 进 行 SDS PAGE, 转 移 至 PVDF 膜 后, 用 5% 脱 脂 奶 粉 /PBS 室 温 封 闭 2h; 将 PVDF 膜 放 入 稀 释 一 抗 中 室 温 孵 育 2h,PBS 洗 3 次, 每 次 10min; 加 入 稀 释 二 抗 室 温 孵 育 2h, 再 PBS 洗 3 次, 每 次 10min; 加 入 显 色 液 显 色 结 果 采 用 凝 胶 成 像 系 统 扫 描 后, 以 特 异 性 条 带 浓 度 与 面 积 的 乘 积 为 有 效 值, 反 映 蛋 白 表 达 水 平 1.8 统 计 学 处 理 应 用 SPSS11.7 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 和 t 检 验 2 结 果 2.1 人 FLS 体 外 的 培 养 及 鉴 定 将 人 的 滑 膜 组 织 分 离 培 养 后, 置 于 倒 置 显 微 镜 下 观 察, 发 现 细 胞 贴 壁 后 逐 渐 伸 展 呈 梭 型 长 条 形 生 长 波 形 蛋 白 免 疫 组 化 染 色 结 果 发 现 胞 质 内 见 大 量 棕 黄 色 颗 粒, 核 呈 蓝 色 CD68 免 疫 组 化 染 色 第 3 代 滑 膜 细 胞 呈 阴 性, 纯 度 为 90% 以 上, 符 合 人 FLS 的 特 征, 见 图 1 图 1 人 FLSVimentin 染 色 阳 性 荧 光 显 微 镜 下 人 FLSEP 2 表 达 不 同 浓 度 rhil 1α 和 Pae 对 人 FLSEP 2 表 达 的 影 响 免 疫 荧 光 检 测 结 果 显 示 : 人 FLS 在 胞 膜 胞 质 可 发 出 黄 绿 色 荧 光,EP 2 主 要 定 位 于 人 FLS 的 胞 质 和 胞 膜 与 未 加 刺 激 的 人 FLS 相 比,rhIL 1α ( μg/L) 体 外 刺 激 24h 后 人 FLS 表 现 为 荧 光 度 不 同 程 度 降 低, 图 像 分 析 显 示 平 均 光 密 度 值 呈 浓 度 依 赖 性 降 低 (F=14 044,P<0 01), 提 示 EP 2 受 体 的 表 达 减 少 与 未 加 刺 激 的 人 FLS 相 比,rhIL 1α(10μg/L) 体 外 刺 激 24h 后, 荧 光 度 降 低,EP 2 受 体 表 达 减 少 Pae( mol/l) 体 外 培 养 24h 后 荧 光 度 不 同 程 度 增 强, 图 像 分 析 显 示 平 均 光 密 度 值 呈 浓 度 依 赖 性 升 高 (F=19 554,P< 0 01), 提 示 Pae 可 不 同 程 度 的 升 高 EP 2 受 体 的 表 达 见 图 2 3

86 １１１２ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ A B C D E F 珋 图 ２ ｒ ｈｉ Ｌ １α体外刺激人 ＦＬＳ２ ４ｈＥＰ２ 的表达 ２ ｎ ４ ｘ±ｓ 1.5 Ａ 正常组 Ｂ Ｃ Ｄ ｒ ｈ Ｉ Ｌ １α １ １ １μｇ Ｌ 刺激组 与正常组 比较 Ｐ ５ Ｐ １ ２ ２ ２ 不同浓度 ｒ ｈｔｎｆ 对人 ＦＬＳＥＰ２ 表 α和 Ｐａ 达的影响 免疫荧光检测结果显示 与未加刺激的 人 ＦＬＳ相比 ｒ ｈ ＴＮＦ Ｌ 体外刺激 α ２ ２ ２μｇ!"#$%& ** 1.0 * * D E * ## 0.5 ２ ４ｈ后人 ＦＬＳ表现为荧光度不同程度降低 图像分 析显 示 平 均 光 密 度 值 呈 浓 度 依 赖 性 降 低 Ｆ １ ６ ３ ６ Ｐ １ 提示 ＥＰ２ 受体的表达减少 与未 0.0 A B C F 加刺激的人 ＦＬＳ相比 ｒ ｈｔｎｆ μｇ Ｌ 体外刺激 α ２ 图 ３ Ｐａ 对 ｒ ｈｉ Ｌ １α体外刺激后人 ＦＬＳＥＰ２ ２ ４ｈ后 荧 光 度 降 低 ＥＰ２ 受 体 表 达 减 少 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 体外培养 ２４ｈ后荧 珋±ｓ 受体的表达 ２ ｎ ４ ｘ Ａ 正常组 Ｂ ｒ ｈ Ｉ Ｌ １α １ μｇ Ｌ 刺激组 Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ ｒ ｈ Ｉ Ｌ １α １ 光度不同程度增强 图像分析显示平均光密度值呈 Ｌ 和 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 共同作用组 与正常组 μｇ 浓度依赖性升高 Ｆ １８ ８６６ Ｐ １ 提示 Ｐａ 比较 Ｐ １ 与 ｒ ｈｉ Ｌ １α １ μｇ Ｌ 刺激组比较 Ｐ ５ Ｐ 可不同程度的升高 ＥＰ２ 受体的表达 见图 ４ ５ １ ２ ３ Ｐａ对人 ＦＬＳＧαｓ蛋白表达的影响 分别用 ｒ ｈｉ Ｌ １α １μｇ Ｌ 和 ｒ ｈ ＴＮＦ μｇ Ｌ 体外刺激 α ２ 低 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 体外培养 ２４ 人 ＦＬＳ２４ｈ后 Ｗ ｓ ｒ ｎｂ ｌ ｏ 法检测 Ｇαｓ表达水平 ｈ后可明 显 提 升 Ｇαｓ表 达 Ｆ ７ ７ ４７ ９ ４７６ Ｐ 结果表明 与正常组相比 刺激后Ｇαｓ 表达明显降 １ 见图 ６

87 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１１３ 图 ４ ｒ ｈｔｎｆ α体外刺激人 ＦＬＳ２４ｈＥＰ２ 珋±ｓ 受体的表达 ２ ｎ ４ ｘ Ａ 正常组 Ｂ Ｃ Ｄ ｒ ｈ ＴＮＦ ２ ２ ２μｇ Ｌ 刺激组 与正常组 α 比较 Ｐ ５ Ｐ １ ３ 讨论 ＲＡ的主要病理特点为慢性滑膜炎 血管翳形 成 侵及关节软骨和软骨下骨 使关节畸形并失去功 图 ５ Ｐａ 对 ｒ ｈｔｎｆ α体外刺激后人 ＦＬＳＥＰ２ 珋±ｓ 的表达 ２ ｎ ４ ｘ Ｌ １ Ｉ Ｌ ６ ＰＧＥ２ 高表达于 能 炎症因子如 ＴＮＦ α Ｉ Ａ 正常组 Ｂ ｒ ｈ ＴＮＦ μｇ Ｌ 刺激组 Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ ｒ ｈ ＴＮＦ α ２ α 滑膜细胞 在 ＲＡ的发生 发展中起着重要作用 Ｉ Ｌ ２ μｇ Ｌ 和 Ｐａ １ ８ １ ７ １ ６ １ ５ ｍｏ ｌ Ｌ 共同作用组 与正 １可以引起 ＲＡ骨破坏和软骨基质降解 ７ ＴＮＦ α 可刺激滑膜细胞和软骨细胞合成 ＰＧＥ２ 和胶原酶 促进 ＦＬＳ活化 破坏关节 ５ Ｐ １ ８ 子Ｉ Ｌ １ Ｉ Ｌ ６和 ＴＮＦ α分泌 ＥＰ２ 参与调节促炎因 ９ ＰＧＥ２ 参与 ＲＡ发病 的多个环节 与水肿 软骨和近关节骨的侵蚀都有关 联 ＰＧＥ２ 通过与细胞膜上相应的 ＥＰ受体结合而发 挥作用 ＥＰ２ 与 ＰＧＥ２结合后激活 Ｇαｓ并与其偶联 启动 ＰＧＥ２ ＥＰ Ｇ蛋白 ｃ ＡＭＰ信号通路来发挥其生 理和病理效应 常组比较 Ｐ １ 与 ｒ ｈ ＴＮＦ μｇ Ｌ 刺 激 组 比 较 Ｐ α ２ Ｇ蛋白由 α β γ３个亚基组成 α亚基是特异 性 ＧＴＰ ＧＤＰ结 合 位 点 具 有 ＧＴＰ酶 活 性 Ｇαｓ和 Ｇα的平衡是维持细胞正常生理功能的基础 Ｇαｓ 激活 ＡＣ 升 高 ｃ ＡＭＰ水 平 Ｇα则 抑 制 ＡＣ 降 低 ｃ ＡＭＰ水 平 Ｇαｓ Ｇα失 衡 时 会 导 致 细 胞 功 能 异 常 １ 该 课 题 组 前 期 研 究 ４ １１ 结 果 显 示 Ｇ蛋 白

88 1114 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 和 rhtnf α 刺 激 后 EP 2 和 Gαs 蛋 白 的 表 达, 恢 复 滑 膜 细 胞 PGE 2 EP G 蛋 白 camp 信 号 的 正 常 转 导 可 能 是 Pae 发 挥 抑 制 滑 膜 细 胞 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 重 要 分 子 机 制 之 一 参 考 文 献 图 6 Pae 对 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 后 人 FLSGαs 的 表 达 (n=4, 珋 x±s) 1: 正 常 组 ;2: 刺 激 组 ;3~6: 刺 激 剂 与 Pae( mol/l) 作 用 组 ; 与 正 常 组 比 较 : # P<0.05; 与 刺 激 组 比 较 : P< 0.05, P<0.01 AC camp 信 号 通 路 介 导 了 AA 和 CIA 大 鼠 FLS 的 异 常 增 殖 ;TGP 能 明 显 抑 制 AA 大 鼠 滑 膜 组 织 中 Gαi 的 表 达, 促 进 Gαs 的 表 达, 恢 复 Gαs/Gαi 的 平 衡 ; 促 进 EP 2 和 EP4 的 表 达 ; 提 高 细 胞 内 camp 水 平, 从 而 降 低 FLS 的 增 殖 与 分 泌 [12] 动 物 实 验 研 [4,12] 究 显 示 :TGP 可 能 是 通 过 影 响 PGE 2 EP G 蛋 白 camp 信 号 通 路 来 发 挥 治 疗 作 用 的 人 FLS 细 胞 水 [5-6] 平 的 前 期 研 究 已 经 显 示 不 同 浓 度 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 可 以 促 进 人 FLS 的 异 常 增 殖, 升 高 TNF α IL 1β 和 PGE 2, 降 低 FLS 产 生 的 camp, Pae 则 能 明 显 逆 转 rhil 1α 和 rhtnf α 对 人 FLS 的 影 响 为 了 进 一 步 明 确 Pae 抑 制 人 FLS 增 殖 和 亢 进 分 泌 功 能 的 作 用 机 制, 本 实 验 以 人 FLS 为 研 究 对 象, 深 入 研 究 Pae 对 rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 后 人 FLSEP 2 和 G 蛋 白 表 达 的 影 响, 明 确 Pae 调 节 PGE 2 EP G 蛋 白 camp 信 号 通 路 可 能 作 用 的 靶 点 Pae 为 天 然 药 物 TGP 的 活 性 单 体, 已 经 证 明 具 有 抗 炎 抗 过 敏 免 疫 调 节 神 经 保 护 抗 肿 瘤 等 作 用 [13-15] 本 研 究 通 过 免 疫 荧 光 标 记 法 结 合 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 分 析 技 术 发 现 :rhil 1α 和 rhtnf α 体 外 刺 激 使 人 FLSEP 2 蛋 白 表 达 明 显 降 低 Pae(10-8 ~10-5 mol/l) 可 上 调 EP 2 的 表 达 Westernblot 结 果 表 明 :rhil 1α 和 rhtnf α 使 人 FLSGαs 蛋 白 表 达 明 显 降 低,Pae(10-8 ~10-5 mol/l) 可 提 升 Gαs 蛋 白 表 达, 结 合 前 期 的 实 验 结 果 可 以 提 示 ; 恢 复 rhil 1α [1] YamamotoK.Geneticsanalysesofrheumatoidarthritis[J].Nihon Rinsho,2013,71(7): [2] FoudiN,GomezI,BenyahiaC,etal.ProstaglandinE2receptor subtypesinhumanbloodandvascularcels[j].eurjpharmacol, 2012,695(1-3):1-6. [3] 张 磊, 魏 伟, 常 艳, 等. 肿 瘤 坏 死 因 子 α 对 胶 原 性 关 节 炎 大 鼠 滑 膜 细 胞 功 能 的 影 响 及 白 芍 总 苷 的 作 用 [J]. 中 国 新 药 杂 志,2007,16(7): [4] ChangY,ZhangL,WangC,etal.Paeoniflorininhibitsfunction ofsynoviocytespretreatedbyril 1αandregulatesEP4receptorex presion[j].jethnopharmacol,2011,137(3): [5] 郭 晓 蓉, 戴 杏, 魏 伟. 芍 药 苷 对 ril 1α 诱 导 的 人 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 功 能 的 影 响 [J]. 中 国 药 理 学 通 报,2009,25(4): [6] 戴 杏, 郭 晓 蓉, 魏 伟. 芍 药 苷 对 肿 瘤 坏 死 因 子 α 诱 导 的 人 成 纤 维 样 滑 膜 细 胞 功 能 的 影 响 [J]. 中 国 临 床 药 理 学 杂 志, 2009,25(1): [7] AlamI,DjidjikR,OuikhlefN,etal.Interleukin 1andthein terleukin 1receptorantagonistgenepolymorphismsstudyinpa tientswithrheumatoidarthritis[j].patholbiol(paris),2013, 61(6): [8] JiaT,PanY,LiJ,etal.StrategiesforactiveTNF αvaccination inrheumatoidarthritistreatment[j].vaccine,2013,31(38): [9] TrefkornL,ScheibeR,MaruyamaT,etal.PGE 2 exertsitsefect onthelps inducedreleaseoftnf alpha,et 1,IL 1alpha,IL 6 andil 10viatheEP 2 andep4receptorinratlivermacrophages [J].ProstaglandinsOtherLipidMediat,2004,74(1-4): [10]JohnsonEN,DrucyKM.HeterotrimericGproteinsignaling:role inasthmaandalergicinflammation[j].jalergyclinimmunol, 2002,109(4): [11] Chen Q, WeiW. Efectsand mechanismsofglucosidesof chaenomelesspeciosaoncolagen inducedarthritisinrats[j].int Immunopharmacol,2003,3(4): [12] XuHM,WeiW,JiaXY,etal.Efectsandmechanismsoftotal glucosidesofpaeonyonadjuvantarthritisinrats[j].jethnophar macol,2007,109(3): [13]KimID,HaBJ.TheefectsofPaeoniflorinonLPS inducedliver inflammatoryreactions[j].archpharmres,2010,33(6): [14]LeeB,ShinYW,BaeEA,etal.Antialergicefectoftherootof PaeonialactifloraanditsconstituentsPaeoniflorinandpaeonol [J].ArchPharmRes,2008,31(4): [15]JiangW L,ChenXG,ZhuHB,etal.Paeoniflorininhibitssys temicinflammationandimprovessurvivalinexperimentalsepsis [J].BasicClinPharmacolToxicol,2009,105(1):64-71.

89 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1115 临 床 医 学 研 究 CXCR4 在 急 性 髓 系 白 血 病 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 内 的 表 达 及 分 布 桂 钰, 葛 健, 夏 瑞 祥 摘 要 目 的 探 讨 CXCR4 在 初 治 急 性 髓 系 白 血 病 (AML) 患 者 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (BM MSCs) 中 的 分 布 表 达 及 其 临 床 意 义 方 法 通 过 提 取 初 次 诊 断 的 AML 患 者 化 疗 前 后 骨 髓 单 个 核 细 胞, 进 行 BM MSCs 体 外 分 离 与 培 养 ; 用 免 疫 荧 光 共 聚 焦 的 方 法 观 察 各 组 P2 代 细 胞 中 CXCR4 的 亚 细 胞 器 定 位 以 及 在 细 胞 膜 上 的 分 布 ; 采 用 Westernblot 法 检 测 各 组 细 胞 CXCR4 的 蛋 白 表 达 量 的 变 化 结 果 在 初 治 组 AML 患 者 BM MSCs 内,CXCR4 较 缓 解 组 及 对 照 组 分 布 异 常, 未 在 高 尔 基 体 内 蓄 积, 多 分 布 在 细 胞 膜 上, 并 且 CXCR4 蛋 白 含 量 明 显 低 于 其 他 两 组 结 论 初 治 AML 患 者 BM MSCs 内 CXCR4 分 布 和 含 量 改 变 可 能 与 骨 髓 造 血 微 环 境 改 变 有 关, 并 且 对 白 血 病 细 胞 的 髓 外 浸 润 有 协 同 作 用 关 键 词 急 性 髓 系 白 血 病 ; 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ; 高 尔 基 体 ; CXCR4 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ); 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 联 合 资 助 课 题 ( 新 教 师 类 联 合 资 助 课 题, 编 号 : ); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : QH154) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 血 液 内 科, 合 肥 作 者 简 介 : 桂 钰, 女, 硕 士 研 究 生 ; 葛 健, 男, 副 教 授, 副 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者, E mail:[email protected] 夏 瑞 祥, 男, 教 授, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (bonemarowmesenchymal stemcels,bm MSCs) 具 有 多 向 分 化 潜 能 支 持 造 血, 促 进 干 细 胞 植 入 以 及 分 泌 各 种 细 胞 因 子 及 蛋 白, 能 够 同 时 表 达 基 质 细 胞 衍 生 因 子 1(SDF 1) 及 其 受 体 CXCR4, 二 者 特 异 性 结 合 能 够 促 进 干 细 胞 动 员, 迁 移 [1] 和 归 巢 研 究 表 明, 在 急 性 髓 系 白 血 病 (acute myeloidleukemia,aml) 患 者 骨 髓 中, 白 血 病 细 胞 表 面 CXCR4 的 表 达 量 增 加, 这 与 白 血 病 细 胞 的 增 殖 浸 润 抗 化 疗 药 物 作 用 的 形 成 有 着 重 要 的 关 系, 而 在 EfectsofpaeoniflorinonprostaglandinsE 2 receptorandgαson fibroblast likesynoviocytesofhumanunderthestimulationof rhil 1αandrhTNF α DaiXing,GuoXiaorong,WeiWei (InstituteofClinicalPharmacologyofAnhuiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofAnti inflammatoryand ImmunopharmacologyofEducationMinistryofChina,AnhuiKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentfor ChineseMedicine,AnhuiEngineringResearchCenterofAnti inflammatoryandimmunedrugs,hefei ) Abstract Objective Toinvestigatetheefectsofpaeoniflorin(Pae)onexpresionofEP 2 andgαsofhumanfi broblast likesynoviocytes(fls)underthestimulationofrhil 1αandrhTNF α.methods FLSofhumanwere culturedinvitro.theexpresionofep 2 onhumanflsunderthestimulationofrhil 1αandrhTNF αandtheefect ofpaewereobservedbyimmunofluorescence,analyzedbyconfocallasermicroscopy,theexpresionofgαswasde tectedbywesternblot.results rhil 1α(0.1,1,10μg/L)andrhTNF α(0.2,2,20μg/l)significantly inhibitedtheexpresionofep 2 andgαs,pae(10-8,10-7,10-6,10-5 mol/l)couldimprovetheexpresionof EP 2 andgαs.conclusion ImprovingtheabnormalexpresionofEP 2 andgasonhumanflsunderthestimula tionofrhil 1αandrhTNF αisprobablyoneofthemostimportantmoleculemechanismsofpaepreventingra. Keywords rhil 1α;rhTNF α;fibroblast likesynoviocytes;prostaglandinse 2 recepter;gαs;paeoniflorin

90 1116 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) BM MSCs 中,CXCR4 在 细 胞 内 的 定 位, 分 布 及 蛋 白 定 量, 目 前 仍 不 明 确 该 研 究 通 过 免 疫 荧 光 共 聚 焦 技 术 观 察 CXCR4 在 细 胞 中 的 细 胞 器 定 位 及 分 布, 并 进 一 步 采 用 Westernblot 法 检 测 其 蛋 白 表 达 量, 观 察 AML 骨 髓 环 境 对 BM MSCs 中 CXCR4 表 达 及 分 布 的 影 响, 从 而 为 指 导 AML 的 临 床 研 究, 治 疗 和 预 后 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 来 源 15 例 骨 髓 标 本 均 来 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 血 液 内 科, 骨 髓 采 集 过 程 中 患 者 均 属 知 情 同 意, 经 骨 髓 细 胞 学, 骨 髓 活 检, 免 疫 分 型, 染 色 体 等 检 查 明 确 诊 断 为 AML 患 者 的 骨 髓 标 本 5 例, 确 诊 后 采 用 标 准 IA( 去 甲 氧 柔 红 霉 3d+ 阿 糖 胞 苷 7d) 方 案 化 疗 诱 导 缓 解 后 AML 患 者 骨 髓 标 本 5 例 ( 完 全 缓 解 标 准 : 白 血 病 的 症 状 和 体 征 消 失, 外 周 血 中 性 粒 细 胞 绝 对 值 /L, 血 小 板 /L, 白 细 胞 分 类 中 无 白 血 病 细 胞, 骨 髓 中 原 始 粒 Ⅰ 型 +Ⅱ 型 5%,M 3 型 原 粒 + 早 幼 粒 5%, 无 Auer 小 体, 红 细 胞 及 巨 核 细 胞 系 列 正 常, 无 髓 外 白 血 病 ), 正 常 骨 髓 移 植 供 者 5 例 1.2 主 要 试 剂 及 仪 器 低 糖 DMEM 培 养 液 和 胎 牛 血 清 购 自 美 国 GbcoBRL 公 司 ;Percol 淋 巴 细 胞 分 离 原 液 购 自 美 国 AmershamBioscience 公 司 ;mousean ti CXCR4antibodyIgG2b(clone44716) 购 自 美 国 R&D 公 司 ;mousemonoclonaligg1 CXCR4 (SC 5353) 购 自 美 国 SantaCruz 公 司 ;Rabbitpolyclonalto GiantinIgG(ab24586) RabbitpolyclonaltoCalnexin IgG (ab22595) RabbitpolyclonaltoLAMP2aIgG (ab18528) RabbitpolyclonaltoEEA1IgG(ab2900) 均 购 自 美 国 Abcam 公 司 ; 山 羊 抗 小 鼠 IgG/Alexa Fluor594(ZF 0513) 山 羊 抗 兔 IgG/AlexaFluor488 (ZF 0511) 均 购 自 北 京 中 杉 金 桥 ;RIPA 蛋 白 裂 解 液 (P0013B) 购 自 碧 云 天 公 司 ;LeicaTCSSP5 单 光 子 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 购 自 德 国 莱 卡 公 司 ;Bioshine ChemiQSeries 显 影 仪 购 自 上 海 欧 翔 科 学 仪 器 有 限 公 司 1.3 方 法 BM MSCs 的 分 离 与 培 养 髂 后 上 棘 取 骨 髓 液 5ml, 放 在 肝 素 抗 凝 管 中, 梯 度 离 心 1000r/min 5min, 弃 脂 肪 层, 与 等 量 PBS 充 分 吹 打 混 匀 将 上 述 混 匀 的 液 体 1 1 缓 慢 叠 加 到 等 量 Percol 分 离 液 上, 梯 度 离 心 2300r/min 30min, 吸 取 白 膜 层 单 个 核 细 胞,PBS 洗 涤 1~2 次, 离 心 弃 上 清 液, 加 入 含 10% FBS 的 LG DMEM 培 养 液 吹 打 悬 浮 细 胞 以 /cm 2 的 密 度 接 种 于 含 5ml 培 养 液 的 T 25 培 养 瓶 中, 置 于 37 5% CO 2 饱 和 湿 度 条 件 下 培 养, 分 别 标 记 好 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 名 称 48 ~72h 后 全 量 换 液, 弃 去 非 贴 壁 悬 浮 细 胞 每 3d 全 量 换 液, 待 细 胞 长 至 90% 融 合 时, 用 0 25% 胰 酶 0.02% EDTA 消 化, 按 1 2 进 行 传 代 培 养 [2], 将 细 胞 悬 液 分 装 到 两 个 培 养 瓶 中, 补 足 培 养 液, 标 记 名 称 代 数 时 间, 放 入 CO 2 孵 箱 培 养 细 胞 爬 片 将 胰 酶 消 化 下 来 的 细 胞, 离 心 弃 上 清 液, 用 培 养 液 将 沉 淀 的 细 胞 吹 打 重 悬, 取 12 孔 板, 在 每 孔 中 滴 入 一 滴 培 养 液 可 避 免 放 入 的 爬 片 浮 起, 将 无 菌 多 聚 赖 氨 酸 爬 片 放 入 孔 中 后, 每 孔 加 1ml 培 养 液, 将 重 悬 后 的 细 胞 吹 打 混 匀 后 滴 在 爬 片 上, 盖 好 盖 子, 做 好 标 记, 放 入 培 养 箱 中 培 养 24h 免 疫 荧 光 共 聚 焦 观 察 CXCR4 在 细 胞 内 的 分 布 和 亚 细 胞 器 定 位 将 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 已 培 养 24h 的 细 胞 爬 片 ( 此 时 细 胞 的 形 态 及 细 胞 间 距 适 宜 荧 光 染 料 着 色 及 在 显 微 镜 下 观 察 ) 各 取 出 4 片, 分 别 固 定 在 玻 片 上, 用 PBS 漂 洗 5min 后 加 入 4% 多 聚 甲 醛 固 定 10min, 再 用 PBS 漂 洗 5min 3 次 加 0 2% tripton+2% BSA 混 合 液 封 闭 1h,PBS 漂 洗 每 组 的 4 张 片 上 分 别 加 入 CXCR4 和 亚 细 胞 器 标 志 蛋 白 的 一 抗 ( 分 别 按 抗 体 说 明 书 配 比 ),4 孵 育 1h 后,PBS 漂 洗 再 在 每 组 4 张 片 上 分 别 加 入 荧 光 二 抗 ( 分 别 按 抗 体 说 明 书 配 比 ), 避 光 室 温 孵 育 1h, PBS 漂 洗 后 用 95% 放 入 甘 油 封 片, 放 在 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察 Westernblot 测 定 CXCR4 在 细 胞 中 的 表 达 取 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 的 P2 代 细 胞, 收 集 细 胞 后, 加 入 150μl 蛋 白 裂 解 液, 冰 上 反 复 吹 打,4 下 12000r/min, 离 心 15min, 收 集 上 清 液 即 为 目 的 蛋 白 各 取 10μl 蛋 白 样 品 按 1 1 比 例 加 入 上 样 缓 冲 液,100 煮 沸 5min 使 蛋 白 变 性, 按 预 定 顺 序 加 样 (1~3 孔 : 初 治 组,4~6 孔 : 缓 解 组,7~9 孔 : 对 照 组 ), 电 泳 并 湿 转 PVDF 膜 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2h, PBS 洗 5min 3 次, 将 PVDF 膜 剪 成 所 需 分 子 量 的 条 带 (CXCR4 条 带 和 β tubulin 条 带 ), 分 别 加 入 相 应 的 一 抗, 摇 床 上 4 过 夜,PBS 洗 5min 3 次, 鼠 二 抗 室 温 下 孵 育 2h,PBS 洗 5min 3 次, 最 后 用 ECL 化 学 发 光 法 进 行 显 影 采 用 QuantityOne 软 件 对 实 验 结 果 进 行 分 析, 结 果 以 目 标 条 带 与 β tubulin 条 带 的 比 值 表 示 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS16 0 统 计 软 件 分 析,

91 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1117 定 量 资 料 以 x±s 珋 表 示, 以 α=0 05 为 检 验 水 准, 多 组 间 均 数 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 两 两 比 较 采 用 q 检 验 2 结 果 2.1 BM MSCs 的 分 离 与 培 养 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 骨 髓 液 经 密 度 梯 度 分 离 最 先 得 到 的 单 个 核 细 胞 主 要 为 圆 形, 大 小 不 等, 经 过 48h 培 养 后, 可 以 看 到 贴 壁 生 长 的 梭 形 细 胞,3~4d 后, 细 胞 逐 渐 开 始 生 长 并 形 成 小 的 细 胞 克 隆,1 周 后 细 胞 克 隆 数 明 显 增 加, 约 10d, 细 胞 克 隆 逐 渐 连 成 一 片, 细 胞 呈 成 纤 维 状 生 长, 形 态 呈 常 梭 形, 覆 盖 面 积 较 前 更 大, 约 15 d, 细 胞 生 长 可 达 90% 融 合, 见 图 1 图 1 体 外 分 离 培 养 的 BM MSCs 细 胞 形 态 1000 A:BM MSCs 的 P1 代 细 胞 ;B:BM MSCs 的 P2 代 细 胞 2.2 免 疫 荧 光 共 聚 焦 CXCR4 的 荧 光 发 光 色 表 现 为 红 色, 细 胞 器 高 尔 基 体 内 质 网 溶 酶 体 内 体 的 标 志 蛋 白 荧 光 发 光 色 表 现 为 绿 色 共 聚 焦 观 察 显 示 缓 解 组 及 对 照 组 CXCR4 的 红 色 免 疫 荧 光 与 高 尔 基 体 标 志 蛋 白 Giantin 绿 色 免 疫 荧 光 发 生 了 明 显 重 叠, 且 在 细 胞 内 成 少 量 弥 漫 性 的 分 布 ; 初 治 组 未 见 CXCR4 的 红 色 荧 光 与 这 4 种 细 胞 器 标 志 蛋 白 的 绿 色 荧 光 重 叠 及 在 细 胞 内 的 弥 漫 分 布, 但 在 细 胞 表 面 观 察 到 CXCR4 的 红 色 荧 光, 见 图 Westernblot 检 测 用 Westernblot 方 法 对 CXCR4 在 初 治 组 缓 解 组 对 照 组 的 P2 代 细 胞 中 的 表 达 总 量 进 行 检 测, 多 次 重 复 实 验 后 显 示, 初 治 组 的 CXCR4 表 达 水 平 明 显 低 于 缓 解 组 及 对 照 组 (P< 0 05), 而 缓 解 组 和 对 照 组 CXCR4 的 表 达 量 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 图 3 3 讨 论 BM MSCs 作 为 一 种 原 始 的 骨 髓 基 质 干 细 胞, 能 够 同 时 表 达 SDF 1 及 CXCR4, 二 者 特 异 性 的 结 合, 参 与 机 体 的 多 种 生 理 及 病 理 过 程, 被 称 为 SDF 1/ CXCR4 生 物 轴 CXCR4 能 够 广 泛 表 达 在 包 括 单 核 细 胞 淋 巴 细 胞 及 BM MSCs 等 细 胞 表 面 [3], 是 7 次 跨 膜 的 G 蛋 白 偶 联 受 体 [4], 在 BM MSCs 中 经 内 质 网 高 尔 基 体 等 一 系 列 细 胞 器 合 成 后, 经 过 解 折 叠 及 在 分 子 伴 侣 和 信 号 肽 等 分 子 的 协 助 下 运 输 到 细 胞 膜 上 [5] 研 究 表 明,SDF 1 与 CXCR4 的 结 合 除 了 影 响 正 常 骨 髓 细 胞 的 归 巢 外, 同 时 与 血 液 系 统 恶 性 疾 病 的 发 生 发 展 密 不 可 分 在 病 理 情 况 下, 白 血 病 细 胞 表 面 CXCR4 表 达 的 高 低 与 其 逸 出 骨 髓 进 入 外 周 血 水 平 呈 正 相 关 [6], 在 白 血 病 细 胞 增 殖 髓 内 外 迁 移 浸 润 及 抵 抗 化 疗 药 物 作 用 的 形 成 等 方 面 起 着 重 要 作 用 [7], 其 机 制 可 能 是 SDF 1/CXCR4 的 相 互 作 用 刺 激 细 胞 的 钙 离 子 内 流 及 跨 膜 能 力, 从 而 使 白 血 病 细 [8] 胞 的 迁 移 活 性 升 高 国 外 学 者 还 发 现 CXCR4 高 表 达 的 AML 患 者 预 后 较 差, 因 此 CXCR4 是 急 性 白 血 病 髓 外 浸 润 的 重 要 调 控 因 子 目 前, 对 于 AML 患 者 骨 髓 微 环 境 骨 髓 基 质 细 胞 趋 化 因 子 及 其 受 体 表 [9] 达 的 研 究 较 少, 有 研 究 将 骨 髓 基 质 细 胞 和 NB4 细 胞 ( 急 性 早 幼 粒 细 胞 白 血 病 细 胞 ) 共 培 养 后, 基 质 细 胞 可 通 过 分 泌 某 些 细 胞 因 子 如 IL 6 保 护 白 血 病 细 胞, 增 强 白 血 病 细 胞 对 化 疗 药 物 诱 导 细 胞 凋 亡 的 抵 [10] 抗 作 用, 前 期 的 研 究 显 示 初 治 AML 患 者 骨 髓 血 浆 中 SDF 1 缺 失, 这 种 缺 失 可 能 伴 随 着 CXCR4 的 表 达 下 调, 以 达 到 SDF 1/CXCR4 生 物 轴 在 细 胞 及 骨 髓 微 环 境 中 的 平 衡 本 研 究 显 示, 体 外 培 养 初 次 诊 断 标 准 方 案 化 疗 诱 导 缓 解 后 的 AML 患 者 及 正 常 人 的 BM MSCs,CX CR4 蛋 白 表 达 量 及 在 亚 细 胞 器 的 定 位 和 分 布 有 所 区 别 从 免 疫 荧 光 共 聚 焦 的 结 果 来 看, 初 治 组 BM MSCs 的 CXCR4 分 布 主 要 在 细 胞 膜 上, 而 在 细 胞 内 及 细 胞 器 中 几 乎 见 不 到 CXCR4 的 聚 集, 对 于 缓 解 组 及 对 照 组 而 言,CXCR4 除 了 在 细 胞 膜 上 表 达, 胞 质 内 也 可 见 其 弥 漫 分 布 以 及 在 高 尔 基 体 内 的 明 显 蓄 积,Westernblot 的 结 果 也 显 示 了 初 治 组 的 CXCR4 蛋 白 总 量 明 显 低 于 缓 解 组 和 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 对 于 正 常 者 及 治 疗 缓 解 患 者 而 言, 细 胞 表 达 正 常 含 量 的 CXCR4 及 按 照 跨 膜 蛋 白 转 运 的 顺 序, 周 期 进 行 转 运, 从 内 质 网 到 细 胞 膜, 细 胞 内 的 CXCR4 多 数 聚 集 在 高 尔 基 体 进 行 加 工, 部 分 转 移 到 细 胞 膜 上, 而 在 初 治 AML 患 者 的 BM MSCs 中,CXCR4 不 仅 表 达 量 减 少, 而 且 多 分 布 在 细 胞 膜 上, 高 尔 基 体 内 未 有 蛋 白 蓄 积 这 表 明 AML 患 者 BM MSCs 中 存 在 着 CXCR4 的 表 达 下 调 及 分 布 改 变, 经 过 化 疗 达 到 缓 解 后,CXCR4 的 表 达 量 及 分 布 异 常 明 显 改

92 １１１８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 ２ ＣＸＣＲ４在 ＢＭ ＭＳＣｓ内的分布及细胞器定位 免疫荧光双染 １ Ａ 初治组 Ｂ 缓解组 Ｃ 对照组 １ ＣＸＣＲ４和内质网标志蛋白 Ｃａ ｌ ｎ ｘ ｎ荧光双染 ２ ＣＸＣＲ４和高尔基体标志蛋白 Ｇ ａ ｎ ｎ荧光双染 ３ ＣＸ ＣＲ４抗体与溶酶体标志蛋白 ｌ ａ ｍｐ ２ａ荧光双染 ４ ＣＸＣＲ４和内体标志蛋白 ＥＥＡ１荧光双染 红色为 ＣＸＣＲ４蛋白 绿色为各细胞器标志蛋白 善 ＡＭＬ患 者 的 白 血 病 细 胞 表 面 ＣＸＣＲ４的 高 表 ＳＤＦ １的缺失 并且同时参与了骨髓基质细胞环境 达 细胞增殖及髓外侵犯及均与造血微环境的改变 庇护白血病细胞免于化疗药物的诱导凋亡 以及协 有关 而同时骨髓造血微环境的这一改变也影响着 同白血病细胞进行髓外迁移和浸润过程 这 ３种机 骨髓中其他基质细胞包括 ＢＭ ＭＳ Ｃｓ在内的相关细 制与白血病细胞耐药 增殖 抗凋亡密切相关 因 胞因子及受体蛋白的表达变化 如 ＣＸＣＲ４的表达下 而 ＣＸＣＲ４在 ＢＭ ＭＳＣｓ内及细胞膜上的分布改变 ＭＳＣｓ中 调 正如实验中观察的 在 ＡＭＬ患者 ＢＭ 可以作为预测急性白血病化疗疗效的指标之一 即 ＣＸＣＲ４表达量 及 分 布 发 生 改 变 这 种 改 变 伴 随 着 ＭＳＣｓ中 ＣＸＣＲ４表 达 量 减 少 初 治 的 ＡＭＬ患 者 ＢＭ

93 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1119 参 考 文 献 图 3 Westernblot 检 测 CXCR4 在 细 胞 内 的 表 达 量 及 各 组 表 达 水 平 变 化 1~3: 初 治 组 ;4~6: 缓 解 组 ;7~9: 对 照 组 ; 与 对 照 组 比 较 : P<0.05 并 且 分 布 改 变, 在 这 种 情 况 下, 白 血 病 细 胞 的 转 移 及 浸 润 的 机 会 较 大, 提 示 预 后 不 良, 而 化 疗 缓 解 后, 蛋 白 表 达 量 及 细 胞 内 外 的 分 布 异 常 得 以 纠 正 综 上 所 述, 认 为 CXCR4 在 AML 患 者 BM MSCs 内 及 细 胞 膜 上 分 布 异 常 与 白 血 病 的 发 病 浸 润 耐 药 参 与 体 内 残 留 病 灶 的 形 成 及 复 发 有 关, 对 于 疾 病 的 发 生 发 展, 预 后 评 估 有 着 一 定 的 意 义, 有 助 于 进 一 步 认 识 白 血 病 的 发 病 及 髓 外 浸 润 机 制, 并 为 白 血 病 的 诊 断 和 治 疗 诊 疗 提 供 新 的 思 路 [1] 李 晟, 陈 子 兴, 王 玮, 等.CXCR4 在 急 性 白 血 病 细 胞 中 的 表 达 及 其 对 髓 外 浸 润 的 意 义 [J]. 中 华 血 液 学 杂 志,2004,25(7): [2] 马 丽 花, 赵 熠, 蔡 学 敏, 等. 绿 色 荧 光 蛋 白 标 记 成 人 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 的 超 微 结 构 特 征 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复,2011,15(6): [3] Broxmeyer.Chemokinesinhematopoiesis[J].CurOpinHematol, 2008,15(1): [4] StrieterRM,BurdickMD,MestasJ,etal.CancerCXCehemokine networksandtumourangiogeneais[j].eurjcancer,2006,42 (6): [5] MirandolaL,ApicelaL,ColomboM,etal.Anti Notchtreatment preventsmultiplemyelomacelslocalizationtothebonemarowvia thechemokinesystem CXCR4/SDF 1[J].Leukemia,2013,27 (7): [6] PeledA,TavorS.RoleofCXCR4inthepathogenesisofacutemye loidleukemia[j].theranostics,2013,3(1):34-9. [7] SisonEA,McIntyreE,MagoonD,etal.Dynamicchemotherapy inducedupregulationofcxcr4expresion:amechanismofthera peuticresistanceinpediatricaml[j].molcancerres,2013,11 (9): [8] Tavernier TardyE,CornilonJ,CamposL,etal.Prognosticvalueof CXCR4andFAK expresioninacutemyelogenousleukem [J]. LeukRes,2009,33(6): [9] 周 志 诚, 夏 海 龙. 骨 髓 基 质 细 胞 抵 抗 三 氧 化 二 砷 诱 导 NB4 细 胞 株 凋 亡 的 作 用 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2013,48(10): [10]GeJ,HouR,LiuQ,etal.Stromal derivedfactor 1deficiencyin thebonemarow ofautemyeloidleukemia[j].intjhematol, 2011,93(6): ExpresionanddistributionofCXCR4inbonemarrowmesenchymal stem celsofacutemyeloidleukemia GuiYu,GeJian,XiaRuixiang (DeptofHematology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toexplorethedistribution,expresionofCXCR4inbonemarowmesenchymalstem cels (BM MSCs)ofuntreatedacutemyeloidleukemia(AML)patientsanditsclinicalsignificance.Methods Bone marowsamplesfromamlpatientswithinitialdiagnosiswhoweretreatedbeforeandafterchemotherapy,theniso latedandculturedbm MSCsinvitro.SubcelularlocalizationanddistributionofCXCR4onmembraneinP2celsof diferentgroupswereobservedbyusingconfocalimmunofluorescence.contentchangesofcxcr4weredetectedby usingwesternblot.results ThedistributionofCXCR4inBM MSCsofuntreatedAMLgroupwasdiferentfrom others,didnotaccumulateinthegolgiapparatus,mostofwhichwerelocatedonthecelmembraneinstead,and proteincontentwaslowerthantheothertwogroups.conclusion ThedistributionandcontentchangeofCXCR4 inbm MSCsofuntreatedAMLpatientsmaybeasociatedwiththechangeofbonemarowhematopoieticmicroenvi ronment,andcxcr4hasasynergisticefectonextramedularyinfiltrationofleukemiccels. Keywords acutemyeloidleukemia;bonemarowmesenchymalstemcels;golgiapparatus;cxcr4

94 1120 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 安 徽 汉 族 人 血 小 板 特 异 性 抗 原 1 17 多 态 性 分 布 调 查 朱 帮 强 1, 徐 元 宏 2, 陈 影 2 3, 周 娟 摘 要 目 的 研 究 安 徽 汉 族 人 群 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 (HPA)1 17 多 态 性 分 布 特 点, 为 临 床 进 行 血 小 板 相 容 性 输 注 提 供 实 验 依 据 方 法 随 机 选 取 150 例 健 康 安 徽 汉 族 献 血 者, 分 别 采 集 2ml 全 血 提 取 DNA 后 采 用 序 列 特 异 性 引 物 聚 合 酶 链 式 反 应 (SSP PCR) 方 法 进 行 HPA1 17 基 因 分 型 结 果 安 徽 汉 族 人 HPA 1a 2a 3a 4a 5a 6a 15a 基 因 频 率 分 别 为 ;HPA 1b 2b 3b 4b 5b 6b 15b 基 因 频 率 分 别 为 ;HPA 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14 a 16a 17a 基 因 频 率 为 ;HPA 7b 8b 9b 10b 11 b 12b 13b 14b 16b 17b 未 在 本 次 调 查 中 检 出 结 论 安 徽 汉 族 人 群 HPA1 17 多 态 性 分 布 显 示 出 自 身 特 点,HPA 2 HPA 3 HPA 15 具 有 较 高 的 遗 传 多 态 性 关 键 词 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 ; 基 因 分 型 ; 多 态 性 中 图 分 类 号 R457.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 (humanplateletanti gens,hpa) 位 于 血 小 板 膜 的 糖 蛋 白 分 子 上,HPA 不 相 容 可 引 起 血 小 板 同 种 免 疫 反 应, 产 生 血 小 板 同 种 抗 体, 导 致 同 种 免 疫 性 血 小 板 减 少, 诱 发 如 血 小 板 输 注 无 效 (platelettransfusionrefractorines,ptr) 输 血 后 血 小 板 减 少 性 紫 癜 (posttransfusionthrombocy topenicpurpura,ptp) 及 新 生 儿 同 种 免 疫 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 (neonatalaloimmunethrombocytopenicpur pura,naitp) 等 疾 病, 在 临 床 移 植 中 还 会 引 起 移 植 排 斥 等 [1], 因 此 鉴 定 HPA 对 临 床 医 学 及 输 血 实 践 具 有 重 要 意 义 [2] 研 究 安 徽 地 区 汉 族 人 群 HPA1 17 多 态 性 分 布 情 况, 可 预 测 血 小 板 特 异 性 同 种 免 疫 发 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 输 血 科 2 检 验 科, 合 肥 安 徽 医 科 大 学 公 共 卫 生 学 院, 合 肥 作 者 简 介 : 朱 帮 强, 男, 硕 士 研 究 生, 主 管 技 师 ; 徐 元 宏, 男, 教 授, 主 任 技 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 生 的 可 能 性, 为 临 床 进 行 血 小 板 相 容 性 输 注 提 供 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 来 源 从 2012 年 8 月 ~2013 年 1 月 在 安 徽 省 血 液 中 心 献 血 的 5834 例 安 徽 汉 族 合 格 献 血 者 中, 用 MicrosoftExcel2003 软 件 中 的 随 机 函 数 RAND() 对 此 5834 例 献 血 者 编 码 各 加 上 一 个 随 机 数 标 签, 然 后 按 照 此 随 机 数 进 行 排 序, 选 取 前 150 例 献 血 者, 其 中 男 78 例, 女 72 例 ; 年 龄 18~56 岁, 中 位 年 龄 37 岁, 分 别 采 集 静 脉 血 液 2ml 于 EDTA 抗 凝 管 中 备 用 1.2 实 验 器 材 台 式 高 速 离 心 机 ( 上 海 力 申 科 学 仪 器 有 限 公 司, 型 号 :Neofuge13); 涡 旋 混 匀 器 ( 上 海 医 科 大 学 仪 器 厂, 型 号 :XW 80A); 纯 水 仪 ( 上 海 摩 勒 科 学 仪 器 有 限 公 司, 型 号 :1010a); 数 字 恒 温 水 浴 锅 ( 江 苏 金 坛 市 江 南 仪 器 厂, 型 号 :HH W); 电 子 天 平 ( 上 海 良 平 仪 器 仪 表 有 限 公 司, 型 号 :JY 2002);PCR 仪 ( 德 国 BIOMETRA, 型 号 :BIOMETRA 梯 度 PCR 仪 ); 电 泳 仪 ( 北 京 市 六 一 仪 器 厂, 型 号 : DYY 10C); 电 泳 槽 ( 上 海 天 能 科 技 有 限 公 司, 型 号 : HE 90); 紫 外 凝 胶 成 像 系 统 ( 美 国 伯 乐, 型 号 :BIO RADGelDoc2000); 紫 外 分 光 光 度 计 ( 上 海 光 谱 仪 器 有 限 公 司, 型 号 :sp 754) 1.3 实 验 试 剂 TIANampBloodDNAKit 血 液 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 天 根 生 化 北 京 科 技 有 限 公 司, 批 号 :L0628);Taq 酶 ( 普 洛 麦 格 生 物 技 术 有 限 公 司, 批 号 : ); 琼 脂 糖 溴 化 乙 锭 溶 液 ( 批 号 : ) TBEpowder( 批 号 : ) HPA1 17 基 因 分 型 试 剂 盒 ( 批 号 :1207A)( 天 津 市 秀 鹏 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司 );DNAMarker B:100bp,200 bp,300bp,400bp,500bp,600bp( 上 海 生 工, 批 号 : ); 无 水 乙 醇 ( 安 徽 安 特 食 品 股 份 有 限 公 司, 批 号 : ); 液 体 石 蜡 ( 天 津 市 赢 达 稀 贵 化 学 试 剂 厂, 批 号 : ) 等 1.4 全 血 DNA 提 取 采 用 DNA 提 取 试 剂 盒 按 照 操 作 说 明 提 取 所 采 集 的 血 液 标 本 DNA 提 取 的

95 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1121 DNA 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 DNA 浓 度 及 纯 度, DNA 产 物 浓 度 为 25~30ng/μl,OD 260 /OD 280 比 值 在 1 8~2.0 之 间 符 合 实 验 要 求 1.5 PCR 扩 增 采 用 序 列 特 异 性 引 物 聚 合 酶 链 式 反 应 (sequencespecificprimerpolymerasechainreac tion,ssp PCR) 方 法 扩 增 根 据 GenBank 序 列 信 息 [3-4] 和 公 开 序 列 数 据 设 计 引 物 ( 天 津 市 秀 鹏 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司, 批 号 :1207A), 将 34 对 HPA1 17 正 反 向 特 异 性 干 燥 引 物 和 人 类 生 长 激 素 保 守 片 段 引 物 按 顺 序 预 先 包 被 在 96 孔 PCR 反 应 板 的 34 孔 内, 然 后 向 反 应 板 中 的 每 孔 加 入 如 下 物 质 :35~42ng DNA 样 本,0 5UTaq 酶,8μlPCR 混 合 缓 冲 液, 最 后 向 每 孔 加 入 石 蜡 油 PCR 循 环 程 序 设 定 为 :1 96 变 性 3min;2 96 变 性 25s,68 退 火 45s,72 延 伸 30s,5 个 循 环 ;3 96 变 性 25s,61 退 火 45s,72 延 伸 30s,22 个 循 环 ;4 96 变 性 20s, 55 退 火 45s,72 延 伸 60s,8 个 循 环 ;5 72 延 伸 3min,6 降 温 至 25, 完 成 PCR 扩 增 1.6 电 泳 及 凝 胶 成 像 将 6μlPCR 产 物 按 序 转 移 于 2 5% 琼 脂 糖 凝 胶 孔 中, 于 148V 下 电 泳 20min 后 将 凝 胶 置 于 凝 胶 成 像 系 统 中 成 像 并 保 存 实 验 结 果 1.7 统 计 学 处 理 按 群 体 遗 传 基 因 计 数 法 计 算 基 因 频 率, 用 SPSS17.0 进 行 统 计 分 析, 计 算 χ 2 值 后 比 较 基 因 型 期 望 值 与 观 察 值, 验 证 是 否 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 法 则 按 照 血 小 板 随 机 输 注 错 配 概 率 (mismatchprobabilityinrandomtransfusion,mp) 公 式 MP=a 2 (1-a 2 )+b 2 (1-b 2 )=2ab(1-ab) 计 算 得 出 血 小 板 随 机 输 注 错 配 概 率 [4] (a,b 为 对 偶 抗 原 等 位 基 因 频 率 ) 13b(-),HPA 14a(+),HPA 14b(-),HPA 16a (+),HPA 16b(-),HPA 17a(+),HPA 17b(-) HPA 1a,1b 特 异 性 条 带 为 196bp,HPA 2a,2b 特 异 性 条 带 为 241bp,HPA 3a,3b 特 异 性 条 带 为 267 bp,hpa 4a,4b 特 异 性 条 带 为 252bp,HPA 5a,5b 特 异 性 条 带 为 249bp,HPA 6a,6b 特 异 性 条 带 为 169bp,HPA 15b,15a 特 异 性 条 带 为 278bp,HPA 7a,7b 特 异 性 条 带 为 bp,HPA 8a,8b 特 异 性 条 带 为 bp,HPA 9a,9b 特 异 性 条 带 为 212bp,HPA 10a,10b 特 异 性 条 带 为 216bp,HPA 11a,11b 特 异 性 条 带 为 184bp,HPA 12a,12b 特 异 性 条 带 为 194bp,HPA 13a,13b 特 异 性 条 带 为 bp,HPA 14a,14b 特 异 性 条 带 为 bp, HPA 16a,16b 特 异 性 条 带 为 bp,HPA 17a, 17b 特 异 性 条 带 为 bp 图 1 1 号 样 本 HPA 分 型 结 果 M:Marker;1~16:HPA 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b 15b 15a 7a 7b 基 因 分 型 结 果 图 2 1 号 样 本 HPA 分 型 结 果 M:Marker;1~16:HPA 8a 8b 9a 9b 10a 10b 11a 11b 12a 12b 13a 13b 14a 14b 16a 16b 基 因 型 结 果 2 结 果 2.1 HPA1 17 等 位 基 因 分 型 结 果 凝 胶 成 像 图 ( 以 1 号 样 本 为 例 ) 图 1~3 所 示 HPA1 17 分 型 结 果 为 :HPA 1a(+),HPA 1b(-),HPA 2a(+), HPA 2b(+),HPA 3a(+),HPA 3b(+),HPA 4a (+),HPA 4b(-),HPA 5a(+),HPA 5b(-), HPA 6a(+),HPA 6b(+),HPA 15b(+),HPA 15a (-)HPA 7a(+),HPA 7b(-),HPA 8a(+), HPA 8b(-),HPA 9a(+),HPA 9b(-),HPA 10a (+),HPA 10b(-),HPA 11a(+),HPA 11b(-), HPA 12a(+),HPA 12b(-),HPA 13a(+),HPA 图 3 1 号 样 本 HPA 17 分 型 结 果 M:Marker;1~2:HPA 17a 17b 基 因 分 型 结 果 2.2 HPA 基 因 型 及 等 位 基 因 频 率 分 布 根 据 计 算 和 统 计 分 析,150 例 安 徽 汉 族 人 群 HPA1 17 基 因 型 等 位 基 因 频 率 及 血 小 板 MP 见 表 1 检 测 出 多 态 性 的 HPA 经 χ 2 检 验 P 值 均 大 于 0 05, 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 法 则

96 1122 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 基 因 型 及 等 位 基 因 频 率 分 布 表 抗 原 基 因 型 人 数 及 频 率 基 因 频 率 aa ab bb aa(%) ab(%) bb(%) a b χ 2 值 P 值 MP 值 HPA > HPA > HPA > HPA > HPA > HPA > HPA NA 0 HPA NA 0 HPA NA 0 HPA NA 0 HPA NA 0 HPA NA 0 HPA NA 0 HPA NA 0 HPA > HPA NA 0 HPA NA 0 NA: 无 法 评 估 3 讨 论 血 小 板 表 面 具 有 复 杂 的 血 型 抗 原, 除 与 其 他 细 胞 组 织 共 有 抗 原 如 红 细 胞 血 型 系 统 和 人 类 白 细 胞 抗 原 Ⅰ(humanleucocyteantigen Ⅰ,HLA Ⅰ) 类 抗 原 等 外, 还 存 在 HPA [1] 截 至 目 前 经 血 清 学 鉴 定 的 24 个 HPA 抗 原 中 有 23 个 HPA 抗 原 的 基 因 多 态 性 的 遗 传 基 础 已 经 阐 明 [5],HPA 基 因 位 于 第 和 22 号 染 色 体 上, 为 双 等 位 共 显 性 遗 传, 除 HPA 14bw 是 由 核 苷 酸 1909~1911 位 上 的 碱 基 序 列 AAG 3 个 碱 基 缺 失 外, 其 余 HPA 系 统 均 是 由 于 血 小 板 膜 糖 蛋 白 结 构 基 因 中 的 单 核 苷 酸 多 态 性 (singlenucle otidepolymorphisms,snp) 引 起 [6] HPA 抗 原 都 存 在 于 血 小 板 糖 蛋 白 上 [7], 其 抗 原 分 布 在 血 小 板 糖 蛋 白 GPⅠa(HPA 5,13) GPⅠbα(HPA 2) GPⅠbβ (HPA 12) GPⅡb(HPA 3,9) GPⅢa(HPA 1,4,6, 7,8,10,11,14,16,17) 和 CD109(HPA 15) 上 [8], 每 种 HPA 抗 原 由 于 碱 基 改 变 引 起 氨 基 酸 的 置 换 导 致 表 达 的 血 小 板 膜 糖 蛋 白 质 结 构 改 变, 产 生 了 不 同 的 肽, 从 而 导 致 同 种 免 疫 应 答 [7], 引 起 同 种 免 疫 性 血 小 板 减 少 国 际 输 血 协 会 和 国 际 血 栓 和 止 血 协 会 在 2003 年 建 立 的 国 际 血 小 板 命 名 委 员 会 对 人 类 血 小 板 特 异 性 抗 原 设 定 的 命 名 原 则 为 HPA 加 数 字 表 示, a 表 示 基 因 频 率 大 于 50% 的 等 位 基 因,b 表 示 基 因 频 率 小 于 50% 的 另 一 相 应 等 位 基 因 [6] 由 血 小 板 特 有 抗 原 决 定 簇 组 成 的 HPA 表 现 出 血 小 板 独 特 的 遗 传 多 态 性, 其 多 态 性 分 布 研 究 对 临 床 及 输 血 实 践 具 有 重 要 意 义 [2] HPA 不 相 容 的 血 小 板 输 注 易 诱 发 血 小 板 输 注 无 效 (platelettransfu sionrefractorines,ptr) 等 疾 病, 根 据 HPA 多 态 性 分 布 情 况 可 以 预 测 本 地 区 血 小 板 特 异 性 同 种 免 疫 发 生 的 可 能 性, 确 定 在 临 床 上 进 行 血 小 板 输 注 时 具 有 重 要 性 的 HPA, 进 行 HPA 相 容 性 的 血 小 板 输 注, 可 以 提 高 临 床 输 血 的 安 全 和 有 效 性 传 统 HPA 血 清 学 分 型 方 法 由 于 受 到 难 以 获 得 高 质 量 和 高 特 异 性 抗 血 清 等 因 素 制 约, 限 制 了 HPA 分 型 工 作 的 开 展, 而 基 于 HPA 基 因 分 子 生 物 学 特 点 设 计 的 SSP PCR 技 术 可 以 对 HPA 进 行 准 确 的 基 因 分 型 [8] 本 研 究 通 过 SSP PCR 技 术 对 150 例 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 进 行 了 基 因 分 型, 结 果 显 示 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 多 态 性 分 布 具 有 如 下 特 点 :1 HPA2a/2b HPA3a/3b HPA15a/15b 具 有 较 高 的 遗 传 多 态 性 ;2 HPA 1b HPA 4b HPA 5b HPA 6b 基 因 频 率 较 低 ;3 HPA 7b HPA 8b HPA 9b HPA 10b HPA 11b HPA 12b HPA 13b HPA 14b HPA 16b HPA 17b 未 在 本 次 调 查 中 检 出 分 析 本 研 究 结 果 可 以 发 现 安 徽 地 区 汉 族 人 HPA 系 统 引 起 的 血 小 板 MP 从 高 到 低 前 3 位 依 次 由 HPA 15 HPA 3 HPA 2 系 统 引 起, 提 示 在 临 床 输 血 实 践 中 进 行 HPA 基 因 分 型 对 预 防 由 HPA 引 起 PTR 具 有 重 要 意 义

97 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1123 HPA 作 为 人 类 遗 传 多 态 性 标 记,HPA 基 因 分 型 研 究 可 为 群 体 遗 传 学 和 人 类 学 研 究 提 供 重 要 数 据, 应 用 于 人 类 进 化 与 迁 徙 的 研 究, 同 时 还 应 用 于 某 些 疾 病 的 相 关 性 研 究 [9-11] 安 徽 汉 族 人 HPA1 17 多 态 性 分 布 研 究 不 仅 为 进 一 步 进 行 相 关 研 究 提 供 了 重 要 资 料, 利 用 本 研 究 掌 握 的 部 分 HPA 型 别 已 知 的 献 血 者 信 息 亦 为 临 床 上 由 HPA 不 合 引 起 的 疾 病 患 者 需 要 输 注 血 小 板 时 寻 找 HPA 相 容 的 供 者 提 供 了 便 利 参 考 文 献 [1] 李 勇, 马 学 严. 实 用 血 液 免 疫 学 血 型 理 论 和 实 验 技 术 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,2006: [2] ThomasJ,Kunicki,DianeJ,etal.HumanplateletAntigens[M]// Hilyer,Silberstein,Nes,etal.BloodBankingandTransfusion Medicine.2nd.Philadephia:ChurchilLivingstone,2006: [3] LyouJY,ChenYJ,HuH Y,etal.PCRwithsequence specific primer basedsimultaneousgenotypingofhumanplateletantigen 1 to 13w[J].Transfusion,2002,42(8): [4] FengML,LiuDZ,ShenW,etal.EstablishmentofanHPA 1 to 16 typedplateletdonorregistryinchina[j].transfusionmed, 2006,16(5): [5] StafordP,GarnerSF,RankinA,etal.Asingle nucleotidepoly morphisminthehumanitgb3geneisasociatedwiththeplatelet specificaloantigenva(hpa 17bw)involvedinfetalmaternalal loimmunethrombocytopenia[j].transfusion,2008,48(7): [6] MetcalfeP,WatkinsNA,OuwehandW H,etal.Nomenclatureof humanplateletantigens[j].voxsang,2003,85(3): [7] MetcalfeP.Plateletantigensandantibodydetection[J].Vox Sang,2004,87Suppl1:82-6. [8] 赵 桐 茂. 人 类 血 小 板 抗 原 研 究 概 况 [J]. 中 国 输 血 杂 志,2004, 17(2): [9] ReinerAP,KumarPN,SchwartzSM,etal.Geneticvariantsof plateletglycoproteinreceptorsandriskofstrokeinyoungwomen [J].Stroke,2000,31(7): [10] WiwanitkitV.PIA1/A2polymorphismoftheplateletglycoprotein receptorib/ Iaanditscorelationwithmyocardialinfarction:an appraisal[j].clinapplthrombhemost,2006,12(1):93-5. [11] 梁 晓 浏, 王 保 龙, 上 官 志 敏, 等. 特 发 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 与 HPA 等 位 基 因 相 关 性 研 究 [J]. 中 国 输 血 杂 志,2009,22(3): Geneticpolymorphism ofhumanplateletantigens1 17 inanhuihanpopulation ZhuBangqiang 1,XuYuanhong 2,ChenYing 2,etal ( 1 DeptofBloodTransfusion, 2 DeptofClinicalLaboratory,TheFirstAfiliatedHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective ToinvestigatethegeneticpolymorphismofHPA 1to 17antigensinAnhuiHanpopulation, soastoprovideexperimentalbasistoscreencompatibleplateletsforclinical.methods Atotalof150samples fromanhuihanblooddonorswererandomlyselectedandcolected2mlwholebloodrespectively,dnawasextrac tedfromwholebloodandthengenotypedhpa1 17bysequencespecificprimerpolymerasechainreaction(SSP PCR).Results ThegenefrequenciesofHPA 1a,2a,3a,4a,5a,6a,15awere0 9966,0 8800,0 6267, ,0 9700,0 9533and0 4833respectivelyinAnhuiHanpopulation.HPA 1b,2b,3b,4b,5b,6b,15 bwere0 0034,0 1200,0 3733,0 0034,0 0300,0 0467, ThegenefrequenciesofHPA 7a,8a,9 a,10a,11a,12a,13a,14a,16a,17awere HPA 7b,8b,9b,10b,11b,12b,13b,14b,16b,17b aleleswerenotdetected.conclusion HPA1 17inAnhuiHanpopulationshowsitsowncharacteristics,HPA 2, HPA 3,HPA 15arehighlypolymorphic Keywords humanplateletantigens;genomictyping;polymorphic

98 1124 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 7 基 因 甲 基 化 状 态 的 研 究 徐 培 坤 1, 邓 鹏 程 1, 朱 立 新 2, 王 斌 1 1, 成 金 民 摘 要 目 的 了 解 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 73 种 基 因 的 甲 基 化 状 况 方 法 应 用 巢 式 聚 合 链 式 反 应 (npcr) 方 法 和 亚 硫 酸 氢 盐 修 饰 后 测 序 (BSP) 方 法, 分 别 检 测 46 例 脑 胶 质 瘤 标 本 和 10 例 正 常 脑 组 织 标 本 的 3 种 基 因 启 动 子 区 CpG 岛 的 甲 基 化 状 态, 并 分 析 各 基 因 甲 基 化 程 度 与 临 床 资 料 的 关 系 结 果 正 常 脑 组 织 标 本 中 该 3 种 基 因 无 甲 基 化 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 73 种 基 因 启 动 子 甲 基 化 率 分 别 为 44.2%(19/43) 22.5%(9/40) 和 0%(0/5) 在 低 级 别 (Ⅰ ~Ⅱ 级 ) 脑 胶 质 瘤 组 中 ppenk 基 因 启 动 子 甲 基 化 率 (33.3%) 低 于 高 级 别 (Ⅲ ~Ⅳ 级 ) 脑 胶 质 瘤 组 中 ppenk 基 因 启 动 子 甲 基 化 率 (69.2%), 两 者 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 结 论 脑 胶 质 瘤 中 ppenk 和 EDNRB 基 因 启 动 子 区 CpG 岛 有 甲 基 化 现 象, 与 脑 胶 质 瘤 发 生 发 展 有 关 关 键 词 CpG 岛 ; 甲 基 化 ; 胶 质 瘤 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 脑 胶 质 瘤 至 今 仍 是 颅 脑 内 预 后 最 差 的 肿 瘤, 近 30 年 来 国 内 外 对 脑 胶 质 瘤 的 治 疗 没 有 显 著 的 突 破 脑 胶 质 瘤 的 发 病 机 制 的 不 详 治 疗 方 案 的 不 合 理 是 导 致 其 疗 效 不 佳 的 重 要 原 因 随 着 表 观 遗 传 学 的 研 究 发 展 : 基 因 甲 基 化 在 脑 胶 质 瘤 的 发 生 发 展 过 程 中 起 到 了 非 常 重 要 的 作 用, 某 些 基 因 的 甲 基 化 与 脑 胶 质 瘤 的 关 系 也 已 得 到 证 实 但 脑 胶 质 瘤 的 发 生 发 展 可 能 受 控 于 多 个 基 因 共 同 影 响, 发 现 和 检 测 尽 可 能 多 的 影 响 基 因 并 在 此 基 础 上 建 立 脑 胶 质 瘤 的 基 因 甲 基 化 谱 可 以 有 效 的 指 导 改 进 脑 胶 质 瘤 的 治 疗 目 前 在 除 脑 胶 质 瘤 外 的 很 多 其 他 恶 性 肿 瘤 中 发 现 ppenk EDNRB 和 CLDN 7 基 因 启 动 子 区 高 甲 基 化 的 现 象 [1-4] 该 实 验 采 取 巢 式 聚 合 链 式 反 应 (nested poly merasechainreaction,npcr) 方 法 和 亚 硫 酸 氢 盐 修 饰 后 测 序 (bisulfitesequencepolymerasechainreac tion,bsp) 方 法 研 究 脑 胶 质 瘤 中 ppenk EDNRB 和 CLDN 73 种 基 因 启 动 子 区 的 甲 基 化 状 态, 并 分 析 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 卫 生 厅 基 金 ( 编 号 :2010B013) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科 2 中 心 实 验 室, 合 肥 作 者 简 介 : 徐 培 坤, 男, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:xp [email protected] 该 3 种 基 因 的 甲 基 化 与 脑 胶 质 瘤 患 者 的 年 龄 性 别 及 肿 瘤 病 理 分 型 分 级 等 临 床 资 料 之 间 的 关 系, 以 探 索 基 因 甲 基 化 在 脑 胶 质 瘤 发 生 发 展 中 的 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 标 本 收 集 和 病 理 资 料 本 组 56 例 标 本 均 于 2010 年 11 月 ~2012 年 11 月 来 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科 手 术 中 脑 胶 质 瘤 标 本 46 例, 其 中 男 21 例, 女 25 例, 年 龄 19~76 岁, 中 位 年 龄 48 岁 按 照 世 界 卫 生 组 织 (WorldHealthOrganiza tion,who) 神 经 系 统 的 肿 瘤 分 级 标 准 进 行 病 理 分 级,Ⅰ ~Ⅱ 级 31 例,Ⅲ ~Ⅳ 级 15 例 其 中 胶 质 母 细 胞 瘤 13 例, 星 型 细 胞 瘤 为 25 例, 少 突 胶 质 细 胞 瘤 5 例, 室 管 膜 瘤 3 例 肿 瘤 组 织 标 本 均 由 经 验 丰 富 的 神 经 外 科 主 任 医 师 手 术 提 取, 并 都 由 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 的 病 理 科 检 验 确 诊 患 者 手 术 前 未 进 行 放 化 疗 等 前 期 治 疗, 可 排 除 其 他 治 疗 对 本 次 实 验 的 干 扰 另 提 取 10 例 因 脑 外 伤 进 行 开 颅 内 减 压 手 术 的 患 者 的 脑 组 织 标 本 作 为 实 验 对 照 组, 其 中 男 6 例, 女 4 例, 年 龄 25~56 岁, 中 位 年 龄 41 岁 提 取 标 本 均 快 速 放 入 液 氮 罐 并 转 入 -80 冰 箱 中 冷 冻 备 用 1.2 方 法 组 织 DNA 提 取 和 测 定 DNA 浓 度 采 用 Qi ampdnaminikit 试 剂 盒 ( 按 说 明 书 操 作 ):1 分 离 溶 解 标 本 : 从 -80 冰 箱 中 取 出 组 织 标 本 10~20 mg, 剪 碎 标 本 后 加 入 裂 解 液 并 充 分 研 磨 后 离 心 (4000r/min,10min), 弃 上 清 液, 打 散 混 匀 后 加 入 蛋 白 酶 k 混 匀 并 水 浴 ;2 清 洗 纯 化 标 本 DNA: 弃 上 清 液, 打 散 混 匀 后 加 入 无 水 乙 醇 并 混 匀, 加 入 Bufer Awl 并 离 心 (12000r/min,30s)( 重 复 一 次 充 分 清 洗 标 本 DNA);3 提 取 标 本 DNA: 弃 上 清 液 ; 加 入 BuferAE 并 水 浴 5min;4 验 证 提 取 标 本 DNA: 电 泳 验 证 DNA 存 在 与 否, 用 分 光 光 度 计 计 算 提 取 的 DNA 的 浓 度 及 纯 度 ;5 保 存 DNA: 将 提 取 标 本 的 DNA 置 于 -20 冰 箱 保 存 组 织 DNA 甲 基 化 修 饰 按 EpiGENETEK onestepdnamodificationkit 方 法 修 饰 :1 取 90% 乙 醇 1ml 加 入 10μlG3( 平 衡 液 ) 混 匀, 取 混 合 液 体

99 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１２５ ５ μｌ加入 ２ μｌｇ１ Ｇ２ Ｇ３洗涤前面步骤提取的 ＤＮＡ 振荡水浴 ８ｍ ｎ后离心 ２ｒ ｍ ｎ １ｍ ｎ ｒ ｍ ｎ １ｍ ｎ ② 加入 ３μｌＧ４修饰 离心 ２ 乙醇充分洗涤 反 并混匀 ③ 向混匀液中加入 ９ 复 ２次 ④ 向充分洗涤后的混匀液中加入 １８μｌ Ｇ６ １ ２ ３ ｎｐｃｒ法检测 ｎ ＰＣＲ即通过 ２轮的 ＰＣＲ反 应 使用的是两套引物来扩增特异性的 ＤＮＡ片段 引物序列见表 １ 其中第 ２对引物的功能是特异性 图 １ ｎｐｃｒ扩增后对扩增产物进行检测电泳图 １ １ １ 标本组织 Ｎ Ｈ２Ｏ阴性对照 Ｍ ＤＮＡ片段 Ｍａ ｒ ｋ ｒ 的扩增位于首轮 ＰＣＲ产物内的一段 ＤＮＡ片断 这 种 ＰＣＲ可以提高 ＤＮＡ扩增的特异性 避免扩增出 中的 Ｃ未发生甲基化 那么测序结果会显示 Ｃ经过 错误的 ＤＮＡ片段 试验处理后转变成胸腺嘧啶 Ｔ 见图 ２Ｂ Ｄ 表 １ ３种基因的引物序列及产物长度 基因 引物序列 ５ ３ ｐｐｅｎｋ 外引物 Ｆ１ ＧＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＡＡＧ 产物长度 ｂｐ ３８５ Ｒ１ ＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣ 内引物 Ｆ２ ＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴ ２３９ Ｒ２ ＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣ ＥＤＮＲＢ 外引物 Ｆ１ ＧＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴ １５５ Ｒ１ ＴＡＴＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＣＣＣ 内引物 Ｆ２ ＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧ ２４７ Ｒ２ ＣＴＧＧＣＣＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴ ＣＬＤＮ ７ 外引物 Ｆ１ ＴＴＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴ ３１４ Ｒ１ ＡＣＣＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡ 内引物 Ｆ２ ＴＴＴＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴ ３７７ Ｒ２ ＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＣ 首轮 ＰＣＲ 反应体系总共为 ２ ５μｌ 其中以蒸馏 水代替 ＤＮＡ模板作对照组 包括 ＤＮＡ模板 ４μｌ １ ＰＣＲＢｕｆ ｆ ｒ２ ５μｌ ｄｎｔｐ ５μｌ Ｍｇ Ｃｌ ５ ２２ ｑ酶 ２μｌ 内 外引物各 １ ５μｌ 再加双 μｌ Ｔａ 蒸水至 ２５μｌ 反应体系经过 ９５ １ ｍ ｎ预变性 再经过 ＰＣＲ循环 ９ ９ ６ｍ ｎ ６ ５ １ ２ ｍ ｎ ７ ２ ３ ３ｍ ｎ 首轮 ＤＮＡ的 ＰＣＲ为 ３个循环 ２μｌ首轮产物 经双蒸水稀释 首轮产物 双蒸水 １ ４ 后作为 目标物加入次轮反应 重复首轮 ＰＣＲ的过程 扩增 后的目标物用 ２ 琼脂糖凝胶电泳检测 见图 １ １ ２ ４ ＰＣＲ产物的测序 本次实验采用 ＢＳ Ｐ法 其测序工作由上海生物芯片公司完成 该法是检测 基因甲基化的有效手段 根据测序的结果 可确定扩 增的 ＰＣＲ产物目标片段中每个 Ｃｐ Ｇ岛中的胞嘧啶 Ｃ 的甲基化状态 如果目的片段的 ＣｐＧ岛中的 Ｃ 发生甲基化 那么测序结果会显示 Ｃ经过亚硫酸氢 盐修饰后无改变 见图 ２Ａ Ｃ 若目的片段的 ＣｐＧ岛 图 ２ ｐｐｅｎｋ Ａ Ｂ 和 ＥＤＮＲＢ Ｃ Ｄ 甲基化测序图 Ａ Ｃ 基因发生甲基化现象 Ｂ Ｄ 基因未发生甲基化现象

100 1126 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 分 析, 甲 基 化 率 与 标 本 的 病 理 级 别 患 者 的 性 别 年 龄 的 相 关 性 分 析 采 用 χ 2 检 验, 两 率 的 比 较 采 用 χ 2 检 验 2 结 果 2.1 ppenk EDNRB 和 CLDN 7 基 因 甲 基 化 情 况 本 组 46 例 脑 胶 质 瘤 标 本, 经 初 步 检 测 有 44 例 DNA 质 量 合 格, 经 npcr 扩 增 后 检 测 3 种 基 因 对 应 的 扩 增 产 物, 扩 增 成 功 的 例 数 分 别 为 43 例 40 例 5 例 对 扩 增 产 物 进 行 甲 基 化 测 序, 检 测 出 ppenk 基 因 甲 基 化 率 为 44.2%(19/43),EDNRB 基 因 甲 基 化 率 为 22 5%(9/40),CLDN 7 基 因 甲 基 化 率 为 0% (0/5) 10 例 正 常 脑 组 织 作 为 对 照 组, 均 未 发 现 基 因 甲 基 化 现 象 2.2 基 因 甲 基 化 与 临 床 资 料 的 相 关 性 脑 胶 质 瘤 组 织 中 ppenk EDNRB 基 因 甲 基 化 率 与 研 究 对 象 的 年 龄 性 别 病 理 分 型 病 理 级 别 之 间 相 关 性 的 统 计 学 分 析 见 表 2 其 中 在 低 级 别 (Ⅰ ~Ⅱ 级 ) 脑 胶 质 瘤 和 高 级 别 (Ⅲ ~Ⅳ 级 ) 脑 胶 质 瘤 中 ppenk 基 因 CpG 岛 的 甲 基 化 率 分 别 为 33 3% 和 69 2%, 两 者 之 间 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) CLDN 7 基 因 对 应 npcr 扩 增 产 物 仅 为 5 例, 所 以 其 与 临 床 资 料 之 间 的 关 系 未 进 行 统 计 学 分 析 表 2 ppenk EDNRB 基 因 启 动 子 甲 基 化 与 临 床 病 理 特 征 关 系 ppenk EDNRB 项 目 甲 基 甲 基 例 数 P 值 χ 2 值 例 数 P 值 χ 2 值 化 数 化 数 性 别 男 女 年 龄 ( 岁 ) < 肿 瘤 类 型 星 性 型 细 胞 瘤 少 枝 胶 质 细 胞 瘤 室 管 膜 瘤 胶 质 母 细 胞 瘤 病 理 分 级 低 级 别 高 级 别 讨 论 肿 瘤 的 发 生 发 展 常 涉 及 到 多 基 因 的 异 常, 导 致 基 因 异 常 的 原 因 有 很 多 如 基 因 突 变 启 动 子 甲 基 化 等 基 因 组 DNA 甲 基 化 修 饰 与 肿 瘤 的 发 生 侵 袭 转 移 耐 药 等 有 着 密 切 关 系, 其 机 制 可 能 与 DNA 修 复 基 因 抑 癌 基 因 细 胞 周 期 调 控 基 因 肿 瘤 侵 袭 基 因 等 甲 基 化 修 饰 致 其 异 常 表 达 有 关 近 年 来 恶 性 肿 [6-7] 瘤 研 究 显 示 hmlh1 hmsh2 MGMT APC 和 FHIT 等 基 因 存 在 甲 基 化 现 象 随 着 研 究 的 深 入, 一 [8] 些 学 者 认 为 基 因 甲 基 化 可 能 成 为 肿 瘤 预 后 预 测 标 记 物, 其 对 于 肿 瘤 的 分 子 诊 断 个 性 化 治 疗 有 着 重 要 的 意 义 同 样, 脑 胶 质 瘤 中 寻 找 基 因 甲 基 化 证 据, 为 研 究 脑 胶 质 瘤 的 发 病 机 制 诊 断 治 疗 提 供 新 的 方 向 ppenk 基 因 位 于 8q23 q24, 是 控 制 神 经 肽 分 泌 的 基 因, 其 编 码 的 甲 硫 脑 啡 肽, 与 阿 片 生 长 因 子 受 体 相 结 合 发 挥 作 用, 是 一 种 肿 瘤 抑 制 剂 Yangetal [9] 研 究 发 现 胰 腺 癌 组 织 中 ppenk 基 因 甲 基 化 率 为 90.3%, 正 常 胰 腺 中 却 未 发 现, 而 在 胰 腺 癌 细 胞 株 中 均 发 现 该 现 象 本 实 验 同 样 显 示 标 本 中 ppenk 基 因 存 在 高 甲 基 化 现 象,ppENK 基 因 的 甲 基 化 率 在 脑 胶 质 瘤 高 级 别 组 (Ⅲ ~Ⅳ 级 ) 与 低 级 别 组 (Ⅰ ~Ⅱ [10] 级 ) 存 在 显 著 差 异 研 究 表 明 胆 汁 中 ppenk 等 6 种 特 定 基 因 甲 基 化 可 能 作 为 生 物 标 志 物 用 于 鉴 别 诊 断 恶 性 和 良 性 胆 道 狭 窄 由 此 推 断 该 基 因 是 脑 胶 质 瘤 病 理 分 级 的 潜 在 生 物 标 志 物, 有 助 于 判 断 肿 瘤 预 后, 该 基 因 也 可 能 成 为 恶 性 程 度 高 的 胶 质 瘤 治 疗 靶 点 EDNRB 基 因 位 于 13q22.3, 其 编 码 的 ETBre ceotor 是 一 种 G 蛋 白 偶 联 跨 膜 蛋 白 EDNRB 基 因 甲 基 化 在 恶 性 肿 瘤 中 广 泛 存 在,Chenetal [11] 研 究 发 现 大 肠 癌 中 EDNRB 基 因 甲 基 化 现 象 较 正 常 组 织 更 为 频 繁 本 实 验 也 显 示 肿 瘤 中 存 在 EDNRB 基 因 [12] 甲 基 化 现 象 研 究 表 明 食 管 鳞 状 细 胞 癌 细 胞 株 在 去 甲 基 化 药 物 5 氮 杂 2 脱 氧 胞 苷 作 用 下 EDNRB 基 因 又 可 重 新 表 达, 正 常 细 胞 株 中 则 不 存 在 该 现 象, 从 另 一 面 显 示 肿 瘤 与 EDNRB 基 因 甲 基 化 是 有 关 系 的 同 时, 本 实 验 分 析 EDNRB 基 因 甲 基 化 与 相 关 临 床 资 料 并 无 显 著 相 关 性, 该 现 象 可 能 普 遍 存 在 胶 质 瘤 中, 由 此 推 断 该 基 因 甲 基 化 在 胶 质 瘤 的 发 生 发 展 中 是 一 个 重 要 事 件 CLDN 7 基 因 由 4 个 跨 膜 蛋 白 亚 型 组 成 及 2 个 [13] 细 胞 外 环 组 成 的 紧 密 连 接 蛋 白 有 研 究 表 明 大 肠 癌 组 织 中 CLDN 7 基 因 存 在 高 甲 基 化 状 态, 使 用 去 甲 基 化 药 物 处 理 后,CLDN 7 基 因 又 得 以 重 新 表 达, 并 通 过 实 验 数 据 分 析 得 出 大 肠 癌 的 病 理 等 级 与 CLDN 7 基 因 甲 基 化 存 在 相 关 性 本 实 验 并 未 显 示 该 基 因 甲 基 化 现 象 ( 实 验 仅 扩 增 出 5 例 目 的 基 因 ),

101 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1127 考 虑 实 验 室 引 物 设 计 或 是 酶 引 起 的 假 阴 性 现 象 的 可 能 课 题 组 之 后 的 实 验 可 进 一 步 验 证 综 上 所 述,ppENK 基 因 甲 基 化 水 平 与 胶 质 瘤 的 病 理 分 级 呈 正 相 关, 其 在 诊 断 胶 质 瘤 的 病 理 分 级 中 可 能 有 重 要 的 意 义, 可 能 成 为 恶 性 程 度 高 的 胶 质 瘤 治 疗 靶 点 ;EDNRB 基 因 甲 基 化 与 胶 质 瘤 发 生 发 展 密 切 相 关, 其 可 能 普 遍 存 在 于 胶 质 瘤 中, 可 能 是 脑 胶 质 瘤 发 生 发 展 过 程 中 的 一 个 重 要 事 件 本 实 验 显 示 胶 质 瘤 发 生 发 展 与 多 基 因 甲 基 化 相 关, 而 非 某 一 基 因 总 之, 随 着 更 多 的 基 因 甲 基 化 的 发 现, 寻 找 到 胶 质 瘤 的 DNA 甲 基 化 谱 成 为 可 能, 其 建 立 将 在 胶 质 瘤 的 分 类 诊 断 复 发 监 测 疗 效 评 价 和 预 后 判 断 等 方 面 有 着 深 远 的 意 义 参 考 文 献 [1] UekiT,ToyotaM,SkinnerH,etal.Identificationandcharacter izationofdiferentialymethylatedcpgislandsinpancreaticcarci noma[j].cancerres,2001,61(23): [2] KaurJ,DemokanS,TripathiSC,etal.Promoterhypermethyla tioninindianprimaryoralsquamouscelcarcinoma[j].intj Cancer,2010,127(10): [3] YatesDR,RehmanI,AbbodMF,etal.Promoterhypermethyla tionidentifiesprogresionriskinbladdercancer[j].clincancer Res,2007,13(7): [4] KojimaT,SawadaN.Regulationoftightjunctionsinhumannor malpancreaticductepithelialcelsandcancercels[j].annny AcadSci,2012,1257(10): [5] LeeKH,LeeJS,NamJH,etal.Promotermethylationstatusof hmlh1,hmsh2,andmgmtgenesincolorectalcancerasociat edwithadenoma carcinomasequence[j].langenbecksarch Surg,2011,396(7): [6] BeradaN,AmzaziS,AmezianeElHasaniR,etal.Epigenetic alterationsofadenomatouspolyposiscoli(apc),retinoicacidre ceptorbeta(rarβ)andsurvivingenesintumortisuesandvoid edurineofbladdercancerpatients[j].celmolbiol(noisy le grand),2012,suppl58:ol [7] PaluszczakJ,MisiakP,WierzbickaM,etal.Frequenthyperm ethylationofdapk,rarbeta,mgmt,rassf1aandfhitin laryngealsquamouscelcarcinomasandadjacentnormalmucosa [J].OralOncol,2011,47(2): [8] NalejskaE,M aczyńskae,lewandowskam A.Prognosticand predictivebiomarkers:toolsinpersonalizedoncology[j].moldi agnther,2014,18(3): [9] YangL,YangH,LiJ,etal.ppENKgenemethylationstatusin thedevelopmentofpancreaticcarcinoma[j].gastroenterolres Pract,2013,2013: [10] ZhangY,YangB,DuZ,etal.Identificationandvalidationof specificmethylationprofileinbilefordiferentialdiagnosisofma lignantbiliarystricture[j].clinbiochem,2010,43(16-17): [11] ChenC,WangL,LiaoQ,etal.HypermethylationofEDNRB promotercontributestotheriskofcolorectalcancer[j].diagn Pathol,2013,8(1):199. [12] ZhaoBJ,SunDG,ZhangM,etal.Identificationofaberant promotermethylationofednrbgeneinesophagealsquamouscel carcinoma[j].disesophagus,2009,22(1): [13]NakayamaF,SembaS,UsamiY,etal.Hypermethylation modu lateddownregulationofclaudin 7expresionpromotestheprogres sionofcolorectalcarcinoma[j].pathobiology,2008,75(3): MethylationofppENK,EDNRBandCLDN 7geneinglioma XuPeikun 1,DengPengcheng 1,ZhuLixin 2,etal ( 1 DeptofNeurosurgery, 2 DeptofCentralLab,TheFirstAfiliatedHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective TostudythemethylationofppENK,EDNRBandCLDN 7inglioma.Methods npcrand BSPwereadoptedtoinvestigatethepromoterfrequencyofthesegenesin46casesofgliomaand10normalbrain tisue.therelationshipbetweenfrequencyofmethylationofthesegenesandclinicaldiseasematerialwasanalyzed. Results Normalbraintisuehadnogenesmethylation.Inpatientionswithglioma,thefrequencyofmethylationin ppenk,ednrbandcldn 7was44.2%(19/43),22.5%(9/40)and0%(0/5).Therate(33.3%)ofppENK promotermethylationingradesⅠ ~Ⅱ gliomaswassignificantlylowerthanthat(69.2%)ingradesⅢ ~Ⅳ glio mas(p<0 05).Conclusion ppenk andednrbpromoter(cpg island)hypermethylationexistsinglioma, whichmaycorelatewiththeoccurenceofglioma. Keywords CpG;Methylation;glioma

102 1128 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 胆 碱 能 抗 炎 通 路 对 胃 癌 癌 前 病 变 炎 症 反 应 的 调 节 作 用 喻 大 军 1,2, 顾 康 生 1 2, 钱 军 摘 要 目 的 探 讨 胆 碱 能 抗 炎 通 路 (CAP) 对 胃 癌 癌 前 病 变 (PLGC) 炎 症 反 应 的 调 节 作 用 方 法 将 56 只 Wistar 大 鼠 随 机 分 为 正 常 对 照 组 10 只, 模 型 组 46 只 模 型 组 采 用 N 甲 基 N 硝 基 N 亚 硝 基 胍 (MNNG) 为 主 的 复 合 造 模 法 制 备 PL GC 大 鼠 模 型 将 造 模 成 功 的 大 鼠 随 机 抽 取 40 只 分 为 模 型 组 PNU 低 剂 量 组 (1 6mg/kg) PNU 中 剂 量 组 (2.0mg/kg) PNU 高 剂 量 组 (2 4mg/kg), 每 组 10 只 正 常 对 照 组 与 模 型 组 正 常 饲 养,PNU 组 每 日 按 以 上 剂 量 腹 腔 注 射 1 次, 给 药 3 周 检 测 各 组 大 鼠 血 清 和 病 变 组 织 中 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tnf α) 白 细 胞 介 素 6(IL 6) 促 炎 因 子 的 表 达 结 果 PLGC 造 模 成 功 的 各 组 大 鼠 血 清 及 病 变 组 织 中 TNF α IL 6 的 含 量 明 显 高 于 正 常 对 照 组 (P<0 05), PNU 高 剂 量 组 (2.4mg/kg) 大 鼠 血 清 及 病 变 组 织 中 TNF α IL 6 的 含 量 低 于 中 低 剂 量 组 及 模 型 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P <0 05) 结 论 α7 烟 碱 乙 酰 胆 碱 受 体 (α7nachrs) 激 动 剂 PNU 可 能 通 过 CAP 下 调 TNF α 和 IL 6 等 促 炎 因 子 的 水 平 关 键 词 中 图 分 类 号 胆 碱 能 抗 炎 通 路 ; 胃 癌 ; 炎 症 反 应 R735.2;R364.5;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 胃 癌 癌 前 病 变 (precancerouslesionsofgastric cancer,plgc) 被 认 为 是 胃 癌 发 病 前 一 定 存 在 的 一 个 缓 慢 渐 进 的 病 理 过 程, 有 向 胃 癌 转 变 的 趋 势 胃 癌 的 发 生 发 展 及 治 疗 还 存 在 不 少 有 待 解 决 的 问 题, 而 从 肿 瘤 预 防 角 度, 关 注 PLGC 的 转 化 与 逆 转 显 得 尤 为 重 要 PLGC 可 激 发 机 体 自 身 的 免 疫 炎 症 反 应, 激 活 巨 噬 细 胞 参 与 免 疫 炎 症 反 应, 释 放 各 种 促 炎 细 胞 因 子 如 肿 瘤 坏 死 因 子 α(tumornecrosisfactor α, TNF α) 白 细 胞 介 素 6(interleukin 6,IL 6) 等, 造 成 自 身 炎 症 反 应 的 加 重, 促 进 病 理 状 态 的 恶 化 多 种 促 炎 细 胞 因 子 可 通 过 调 控 不 同 系 统 和 局 部 炎 症 反 应, 最 终 导 致 胃 癌 的 发 生 发 展 [1-2] PLGC 被 认 为 是 一 个 复 杂 的 多 种 致 病 因 素 相 互 结 合 共 同 致 病 的 过 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 内 科, 合 肥 蚌 埠 医 学 院 第 一 附 属 医 院 肿 瘤 外 科, 蚌 埠 作 者 简 介 : 喻 大 军, 男, 主 治 医 师 ; 顾 康 生, 男, 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 程 虽 然 学 术 界 认 为 幽 门 螺 旋 杆 菌 是 PLGC 进 程 中 [3] 最 为 重 要 的 一 个 因 素, 但 研 究 显 示 抗 幽 门 螺 旋 杆 菌 也 未 必 可 以 逆 转 PLGC 的 病 理 进 程, 其 主 要 原 因 是 幽 门 螺 旋 杆 菌 感 染 还 可 以 激 发 体 内 的 免 疫 反 应, 造 成 各 种 促 炎 和 抗 炎 因 子 的 释 放, 即 使 根 除 了 幽 门 螺 旋 杆 菌 感 染, 因 为 免 疫 反 应 被 激 活, 各 种 炎 症 恶 性 循 环 的 刺 激 依 然 会 造 成 机 体 的 损 伤, 所 以 抑 制 免 疫 炎 症 反 应 的 恶 化 被 认 为 是 PLGC 治 疗 过 程 中 亦 较 为 重 要 的 一 个 部 分 PLGC 时 期 的 治 疗 存 在 着 逆 转 胃 癌 发 生 的 可 能 性 胆 碱 能 抗 炎 通 路 (cholinergican ti inflammatorypathway,cap) 是 近 10 年 来 研 究 较 为 热 点 的 神 经 抗 炎 通 路 [4], 被 认 为 是 体 内 最 有 效, 且 完 全 没 有 任 何 毒 副 作 用 的 神 经 抗 炎 通 路, 更 重 要 的 是 CAP 主 要 依 赖 迷 走 神 经 的 胆 碱 能 神 经 纤 维 支 配 各 个 效 应 器 官, 而 在 胃 部 存 在 体 内 最 多 的 迷 走 神 经 分 布 [5] 因 此 该 研 究 通 过 N 甲 基 N 硝 基 N 亚 硝 基 胍 (MNNG) 为 主 的 复 合 造 模 法 制 备 PLGC 大 鼠 模 型, 给 予 α7 烟 碱 乙 酰 胆 碱 受 体 (α7nicotinicacetyl cholinereceptors,α7nachr) 激 动 剂 PNU 干 预, 探 讨 CAP 对 PLGC 炎 症 反 应 的 调 节 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 主 要 材 料 MNNG PNU 购 自 美 国 Sig ma 公 司 ;TNF α 及 IL 6ELISA 试 剂 盒 购 自 上 海 美 轩 生 物 科 技 有 限 公 司 1.2 实 验 动 物 及 分 组 8~10 周 龄 雄 性 Wistar 大 鼠 56 只 ( 蚌 埠 医 学 院 实 验 动 物 中 心 ), 清 洁 级, 体 重 175~200g, 随 机 分 为 正 常 对 照 组 10 只, 模 型 组 46 只, 模 型 组 造 模 成 功 后 大 鼠 随 机 抽 取 40 只 分 为 模 型 组 PNU 低 剂 量 组 (1 6mg/kg) PNU 中 剂 量 组 (2.0mg/kg) PNU 高 剂 量 组 (2.4 mg/kg), 每 组 10 只 分 笼 饲 养 1.3 大 鼠 PLGC 动 物 模 型 的 建 立 采 用 MNNG 饮 用 液 自 由 饮 用 法 配 合 模 拟 幽 门 螺 杆 菌 感 染 状 态 下 高 氨 对 胃 黏 膜 的 毒 性 损 害 法 造 模 [6] 用 去 离 子 水 将 MNNG 配 成 1g/L 的 储 备 液 ( 每 周 配 制 1 次 ), 避 光 冷 藏 保 存 大 鼠 正 常 饮 食 适 应 喂 养 1 周 后, 临 用 时 将 其 配 成 200μg/ml 的 饮 用 液, 装 入 外 贴 黑 色 避 光

103 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１２９ 纸的 ５ ｍｌ饮水瓶中 整个配制过程避光操作 饮 大 异形 增生活跃 腺体拥挤 形态稍不规则 可见 水瓶内给大鼠自由引用 每 ２４ｈ更换 １次药液 用 复层及背靠背现象 间质有少量淋巴细胞浸润 大 ７ 乙醇 ３ｍｌ 每 ３ｄ１次 以及 １ 氨水 １ｍｌ 鼠 发 生 ＰＬＧＣ 炎 症 反 应 模 型 构 建 成 功 每周 １次 加入饮水液中 造模期间不再给予其 ＰＮＵ２８ ２ ９ ８７低剂量组黏膜完整度与模型组类似 脱 他饮水 连续 １１周 正常对照组常规喂养 于第 落变性 坏死的上皮细胞 伴有中 重度炎症表现 ８周末从造模组随机抽出 ６只大鼠 正常对照组抽 中 高剂量组则表现为黏膜完整度较模型组高 表面 出 ６只大鼠 采用戊巴比妥钠过量麻醉处死 取出 可见少许脱落的变性 坏死的上皮细胞 肠化生程度 胃黏膜组织 肉眼观察了解胃黏膜变化情况后 用 较轻 伴有轻 中度炎症表现 见图 １ ４ 多聚甲醛固定 于胃窦部剪取组织一块 石蜡包 埋 做常规病理切片 与正常对照组比较 模型组大 鼠胃黏膜呈现散落状 胃壁变薄 弹性变差等 色泽 苍白 黏液分泌减少 色泽晦暗等特点 光镜下显示 上皮细胞排列紊乱 异型增生 变性坏死的上皮细胞 随处可见 可见核分裂 肠化生程度每只程度接近 据此可以认为本次实验模型建立成功 １ ４ 实验方法 造模开始第 ９周开始给药 将造模 成功的大鼠随机分为模型组 ＰＮＵ２ ８２ ９８７低剂量组 １ ６ｍｇ ｋｇ ＰＮＵ２ ８２９８ ７中剂量组 ２ ｍｇ ｋｇ ＰＮＵ２８２９８７高剂量组 ２ ４ｍｇ ｋｇ 每组 １ 只 正 常对照组与模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水 低 剂 量 组 ＭＮＮＧ 造 模 后 腹 腔 注 射 １ ６ ｍｇ ｋｇ ＰＮＵ２８２９８７ 中剂量组 ＭＮＮＧ造模后腹腔注射 ２ 图 １ 各组大鼠胃黏膜病理形 ｍｇ ｋ ｇｐｎｕ２８２ ９８７ 高剂量组 ＭＮＮＧ造模后腹腔注 态 ＨＥ ４ 射２ ４ｍｇ ｋ ｇｐｎｕ２ ８２９８ ７ 每日腹腔注射 １次 给药 Ａ 正 常 对 照 组 Ｂ 模 型 ３周 组 Ｃ 中 剂 量 组 Ｄ 低 剂 量 １ ５ 标本收集及检测指标 于第 １１周末 禁食禁 组 Ｅ 高剂量组 水１ ２ｈ后脱颈椎处死大鼠取血检测各项指标 取 大鼠心脏血 离心分离血清 立即开腹 取下大鼠 胃部组织 经生理盐水冲洗漂净 然后取小块胃组 织以生理盐水 ｐ Ｈ７ ４ 制备成匀浆 ４ ３ ｒ 正常对照组 模型组以及 ＰＮＵ２８ ２９８ ７低 中 高 ｍ ｎ １５ｍ ｎ 离心 取匀浆上清液分装 ８ 保 ３ ２ １ １只 随着喂 剂量组大鼠死亡数目分别为 存 用 ＥＬＩ ＳＡ法检测大鼠血清及胃部组织中 ＴＮＦ α 养时间的延长 正常对照组大鼠皮毛光泽 精神佳 Ｉ Ｌ ６水平 于胃窦部剪取一块组织 使用 ４ 多聚 灵活喜动 饮食正常 模型组大鼠的皮毛疏松不齐 甲醛固定 石蜡包埋用于 ＨＥ染色并作病理切片 精神萎 靡 不 振 食 量 下 降 反 应 迟 钝 体 重 减 轻 １ ６ 统计学处理 采用 Ｓ ＰＳＳ１７ 统计软件进行 珋 分析 数据以 ｘ±ｓ表示 先对所有数据做正态分布 ＰＮＵ２８ ２ ９ ８７低 中 高剂量组大鼠均有不同程度皮 毛欠光泽 反应迟钝 精神欠佳 体重减轻等 而与模 检验 如果属于正态分布则组间比较采用单因素方 型组比较较正常 差分析 方差齐时用 检验 方差不齐采用 ＬＳ Ｄ法 ２ ２ α７ｎａｃｈｒ激动剂对 ＰＬＧＣ大鼠血清 ＴＮＦ α 非正态分布采用中位数表示 Ｉ Ｌ ６含量的影响 模型组以及 ＰＮＵ２８２９ ８７低 中 ２ 结果 高剂量组血清 ＴＮＦ Ｌ ６含量高于正常对照组 α和 Ｉ 差异有统计学意义 Ｐ ５ Ｐ １ 与模型组 ２ １ 大鼠一般情况 大鼠 ＰＬＧＣ动物模型建立后 相比 ＰＮＵ２８２ ９８７中 高剂量组血清 ＴＮＦ Ｌ ６ α和 Ｉ 经组织学检测 模型组大鼠胃部组织细胞核深染 增 含量降低 尤以高剂量组显著 差异有统计学意义

104 1130 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) (P<0 05,P<0 01); 低 剂 量 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 表 1 表 1 大 鼠 血 清 TNF α IL 6 含 量 比 较 ( 珋 x±s) 组 别 n TNF α(ng/l) IL 6(ng/L) 正 常 对 照 ± ±3.7 模 型 ±28.8 ## 64.8±3.9 ## PNU 低 剂 量 ±19.4 ## 59.6±3.8 # PNU 中 剂 量 ±23.5 ## 47.5±3.5 # PNU 高 剂 量 ±26.9 # 30.9±3.2 # 与 模 型 组 比 较 : P<0.05, P<0 01; 与 正 常 对 照 组 比 较 : # P <0.05, ## P< α7nachr 激 动 剂 对 PLGC 大 鼠 胃 组 织 TNF α IL 6 含 量 的 影 响 模 型 组 以 及 PNU 低 中 高 剂 量 组 胃 组 织 TNF α 和 IL 6 含 量 高 于 正 常 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01); 与 模 型 组 相 比,PNU 中 高 剂 量 组 TNF α 和 IL 6 含 量 降 低, 尤 以 高 剂 量 组 显 著, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01); 低 剂 量 组 与 模 型 组 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 见 表 2 表 2 大 鼠 胃 组 织 TNF α IL 6 含 量 比 较 ( 珋 x±s) 组 别 n TNF α(ng/g) IL 6(ng/g) 正 常 对 照 ± ±14.1 模 型 ±33.6 ## 515.1±77.1 ## PNU 低 剂 量 ±20.5 ## 305.6±16.5 ## PNU 中 剂 量 ±17.5 ## 262.1±30.2 ## PNU 高 剂 量 ±11.6 # 166.9±44.3 # 与 模 型 组 比 较 : P<0.05, P<0.01; 与 正 常 对 照 组 比 较 : # P <0.05, ## P< 讨 论 PLGC 包 括 慢 性 萎 缩 性 胃 炎 的 中 重 度 肠 上 皮 化 生 以 及 上 皮 内 瘤 变 浅 表 性 胃 炎 在 胃 黏 膜 长 期 慢 性 炎 症 浸 润 的 基 础 上, 经 过 伴 有 肠 化 生 的 多 灶 性 胃 炎 后 由 于 干 细 胞 不 稳 定 DNA 复 制 错 误 或 超 甲 基 化 导 致 基 因 突 变 积 累 或 杂 合 型 丢 失, 可 发 生 上 皮 内 瘤 变, 胃 癌 发 生 [7] 炎 性 微 环 境 在 肿 瘤 的 发 生 发 展 中 发 挥 着 重 要 的 促 进 作 用 CAP 是 一 条 中 枢 神 经 系 统 与 免 疫 系 统 之 间 的 具 有 拮 抗 炎 症 反 应 作 用 的 通 路, 其 作 用 在 内 毒 素 血 症 失 血 性 休 克 心 肌 缺 血 再 灌 注 [8] 实 验 性 关 节 炎 [9] [10] 溃 疡 性 结 肠 炎 和 胰 腺 炎 等 多 种 动 物 模 型 中 均 已 得 到 证 实, 但 其 是 否 参 与 PLGC 的 调 控, 目 前 国 内 外 尚 未 见 文 献 报 道 使 用 胆 碱 能 受 体 激 动 剂 可 活 化 CAP, 产 生 抗 炎 效 应,α7nAChR 激 动 剂 PNU 是 一 种 强 力 拟 胆 碱 药, 与 巨 噬 细 胞 表 面 的 烟 碱 受 体 α7nachr 结 合, 阻 止 炎 症 细 胞 因 子 的 释 放 [9,11] TNF α 是 由 巨 噬 细 胞 / 单 核 细 胞 活 化 产 生 的 一 种 细 胞 因 子, 在 炎 症 反 应 细 胞 免 疫 肿 瘤 免 疫 等 多 种 生 理 和 病 理 过 程 中 发 挥 关 键 作 用 TNF α 作 为 一 种 重 要 的 炎 性 细 胞 因 子, 其 慢 性 刺 激 也 可 促 进 肿 瘤 的 发 生 [12] IL 6 是 一 个 生 物 学 效 应 极 其 复 杂 的 白 介 素 类 细 胞 因 子, 其 可 以 促 进 T 细 胞 表 面 IL 2 受 体 的 表 达, 增 强 IL 1 和 TNF α 对 Th1 细 胞 的 致 有 丝 分 裂 作 用 ; 在 外 伤 感 染 的 时 候, 引 起 急 性 炎 症 反 应, 诱 导 急 性 期 反 应 中 反 应 蛋 白 的 合 成, 以 淀 粉 状 蛋 白 a 和 C 反 应 蛋 白 增 加 为 主 ; 促 进 B 细 胞 增 殖, 分 化 并 产 生 抗 体 ;IL 6 还 能 有 效 地 促 进 TNF α 和 IL 1 诱 导 恶 病 质, 促 进 糖 皮 质 激 素 合 成 [13] ; 刺 激 破 坏 骨 细 胞 活 性 和 角 质 细 胞 生 长, 其 主 要 作 用 并 非 直 接 作 用 形 成 炎 症, 而 是 加 强 各 种 促 炎 细 胞 因 子 的 致 炎 效 果 [14] 两 者 介 导 炎 症 反 应 和 肿 瘤 免 疫 等 方 面 发 挥 关 键 作 用 [15], 其 在 血 浆 的 含 量 也 是 测 量 细 胞 免 疫 和 体 液 免 疫 功 能 的 重 要 指 标 本 研 究 通 过 构 建 MNNG 为 主 的 复 合 造 模 法 制 备 PL GC 大 鼠 模 型, 给 予 α7nachr 激 动 剂 PNU 干 预, 结 果 PLGC 大 鼠 血 清 及 病 变 组 织 中 TNF α IL 6 的 含 量 降 低, 尤 以 高 剂 量 组 (2.4mg/kg) 显 著, 表 明 其 可 能 通 过 CAP 下 调 TNF α 和 IL 6 等 促 炎 因 子 的 水 平 综 上 所 述, 采 用 MNNG 可 以 有 效 的 造 成 大 鼠 PLGC 的 病 理 状 态, 而 且 还 激 活 了 体 内 免 疫 炎 症 反 应, 造 成 了 大 鼠 自 身 的 免 疫 炎 症 表 现 基 于 CAP 的 假 说, 使 用 药 物 干 预 的 方 式, 发 现 激 活 CAP 可 以 有 效 的 对 抗 炎 症 反 应, 可 通 过 下 调 TNF α 和 IL 6 等 促 炎 因 子 的 水 平, 以 2.4mg/kg 剂 量 疗 效 最 佳, 使 癌 变 的 胃 黏 膜 上 皮 得 到 一 定 的 修 复, 表 明 了 炎 症 反 应 对 胃 黏 膜 上 皮 也 存 在 一 定 的 影 响, 控 制 炎 症 对 其 存 在 疗 效 本 研 究 提 出 了 一 种 逆 转 PLGC 炎 症 发 展 的 方 法, 对 胃 癌 的 早 期 预 防, 早 期 干 预 有 一 定 的 应 用 价 值 但 CAP 对 炎 症 的 调 节 方 式 究 竟 是 否 是 通 过 α7nachr 或 毒 蕈 碱 受 体 来 实 现 的, 以 及 是 通 过 何 种 方 式 或 途 径 实 现 的 需 要 进 一 步 研 究 证 实 相 信 随 着 对 迷 走 神 经 及 其 递 质 Ach 抗 炎 作 用 的 深 入 研 究, 人 们 可 能 会 从 新 的 角 度 对 炎 症 反 应 有 一 个 新 的 认 识, 并 将 CAP 作 为 一 种 替 代 疗 法 或 潜 在 疗 法 用 于 治 疗

105 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1131 参 考 文 献 [1] SichererSH,SampsonHA.Foodalergy[J].AlergyClinImmu nol,2010,125(2): [2] Abraham SN,StJohnAL.Mastcel orchestratedimmunityto pathogens[j].natrevimmunol,2010,10(6): [3] ZorzetoV,MaddaloG,BasoD,etal.Immunotherapyforgastric premalignantlesionsandcancer[j].immunotherapy,2012,4(6): [4] MacDonaldTT,DiSabatinoA.Theimmunologicbasisforgastro intestinalfoodalergy[j].curopingastroenterol,2009,25 (6): [5] TongW D,RidolfiTJ,KosinskiL,etal.Efectsofautonomic nervestimulationoncolorectalmotilityinrats[j].neurogastroen terolmotil,2010,22(6): [6] NguyenTL,DipaoloRJ.Anewmousemodelofinflammation andgastriccancer[j].oncoimmunology,2013,2(10):e [7] PaulW E,ZhuJ.HowareT(H)2 typeimmuneresponsesinitia tedandamplified[j].natrevimmunol,2010,10(4): [8] XiongJ, YunaY J, XueF S, etal. Postconditioningwith α7nachragonistatenuatessystemicinflammatoryresponsetomy ocardialischemia reperfusioninjuryin rats[j].inflammation, 2012,35(4): [9] WangH,YuM,OchaniM,etal.Nicotinicacetylcholinereceptor alpha7subunitisanesentialregulatorofinflammation[j].na ture,2003,421(6921): [10] LunneyPC,LeongR W.Review article:ulcerativecolitis, smokingandnicotinetherapy[j].alimentpharmacolther,2012, 36(11-12): [11]StuckenholzV,BacherM,Balzer GeldsetzerM,etal.Theα7 nachragonistpnu reducesinflammationandMPTP in ducednigraldopaminergiccellosinmice[j].jparkinsonsdis, 2013,3(2): [12]McleanM H,El OmarEM.Geneticsofinflammationinthegas trointestinaltractandhowitcancausecancer[j].recentresults CancerRes,2011,185: [13]SugimotoM,YamaokaY,FurutaT.Influenceofinterleukinpoly morphismsondevelopmentofgastriccancerandpepticulcer[j]. WorldJGastroenterol2010,16(10): [14] HowletM,MenheniotTR,JuddLM,etal.Cytokinesignaling viagp130ingastriccancer[j].biochim BiophysActa,2009, 1793(11): [15]SzlachcicA,Krzysiek MaczkaG,PajdoR,etal.Theimpactof asymmetricdimethylarginine(adama),theendogenousnitric oxide(no)synthaseinhibitor,tothepathogenesisofgastricmu cosaldamage[j].curpharmdes,2013,19(1):90-7. Regulationofcholinergicanti inflammatorypathwayof inflammationongastricprecancerouslesions YuDajun 1,2,GuKangsheng 1,QianJun 2 ( 1 DeptofMedicalOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofSurgicalOncology,TheFirstAfiliatedHospitalofBengbuMedicalColege,Bengbu ) Abstract Objective Toinvestigatetheregulationofcholinergicanti inflammatorypathwayongastricprecancer ouslesionsandinflammatoryreaction.methods 56Wistarratswererandomlydividedintonormalgroup(n=10) andmodelinggroup(n=46)whichwerepreparedintoplgcratsmodelbythen methyl N nitro N nitrosogua nidine(mnng)basedcompositemodeling.then40ratsselectedfromthesuccesfulymodelingratswererandom lydividedintomodelgroup,pnu282987lowdosegroup(1.6mg/kg),pnu282987dosegroup(2.0mg/kg), PNU282987highdosesgroup(2.4mg/kg),(n=10).Thecontrolgroupandmodelgroupwerefednormaly. PNU282987groupsweregivenabovedailydosesofPNU282987byintraperitonealinjectionforthreeweeks.Then theexpresionsoftnf α,il 6inserumandstomachtisueweredetected.Results ThecontentsofTNF α,il 6 inserumandstomachtisueofplgcgroupsweresignificantlyhigherthanthoseofcontrolgroup(p<0 05).The contentsoftnf α,il 6inserumandstomachtisueofPNU282987highdosegroup(2.4mg/kg)werelowerthan thelow dosegroup,dosegroupandmodelgroup(p<0 05).Thediferencewassignificant.Conclusion The α7nachragonistpnu282987candown regulatetheleveloftnf αandil 6throughthecholinergicanti inflam matorypathway. Keywords cholinergicanti inflammatorypathway;gastriccancer;inflammatoryreaction

106 1132 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 减 阻 牵 张 远 移 上 颌 尖 牙 的 三 维 有 限 元 分 析 梁 志 红 1, 薛 俊 杰 2,3 1, 王 洪 军 摘 要 目 的 模 拟 不 同 术 式 远 移 上 颌 尖 牙, 分 别 建 立 其 三 维 有 限 元 模 型, 分 析 尖 牙 和 牙 周 组 织 的 生 物 力 学 状 况 方 法 分 别 建 立 常 规 状 态 下 移 动 尖 牙 ( 模 型 1) 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 术 移 动 尖 牙 ( 模 型 2) 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 术 移 动 尖 牙 ( 模 型 3) 的 三 维 有 限 元 模 型, 在 颊 腭 双 侧 力 的 加 载 后 观 察 牙 及 周 围 组 织 应 力 分 布 和 位 移 情 况 结 果 尖 牙 最 大 瞬 时 位 移 值 模 型 2> 模 型 3> 模 型 1, 最 大 等 效 应 力 值 模 型 2< 模 型 1< 模 型 3, 最 大 主 应 力 模 型 1< 模 型 2< 模 型 3, 最 大 剪 切 应 力 模 型 2< 模 型 1< 模 型 3 结 论 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 和 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 可 有 效 减 小 牙 移 动 阻 力, 加 大 尖 牙 瞬 时 位 移, 且 去 除 尖 牙 远 中 骨 质 效 果 较 去 除 颊 侧 骨 皮 质 更 为 显 著 两 种 方 法 均 成 功 避 免 了 支 抗 丧 失, 但 尖 牙 存 在 远 中 倾 斜 趋 势, 在 临 床 工 作 中 应 加 以 控 制 关 键 词 牵 张 成 骨 ; 三 维 有 限 元 法 ; 错 颌 畸 形 ; 牙 齿 移 动 中 图 分 类 号 R783.5 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 错 颌 畸 形 对 广 大 患 者 的 身 心 健 康 存 在 巨 大 危 害, 然 而, 常 规 牙 移 动 速 度 平 均 仅 1mm/ 月, 使 得 错 颌 畸 形 治 疗 时 间 长 达 约 2 年 [1] 且 拉 尖 牙 向 远 中 移 动 的 过 程 中, 支 抗 磨 牙 受 反 作 用 力 前 移, 从 而 引 起 支 抗 丧 失 为 加 快 牙 移 动 速 度, 控 制 支 抗,Liouetal [2] 出 了 牙 周 膜 牵 张 成 骨 的 概 念 随 后 Kisnisciet al [3] 进 一 步 提 出 了 牙 槽 骨 牵 张 成 骨 的 技 术 两 种 方 法 因 大 大 加 快 正 畸 牙 移 动 速 度 引 起 了 人 们 的 广 泛 关 注 [4-10] 目 前 对 这 两 种 术 后 生 物 力 学 特 性 的 报 道 甚 少 为 深 入 了 解 减 阻 牵 张 成 骨 术 所 引 起 的 牙 及 牙 周 组 织 的 生 物 力 学 特 点, 该 文 将 螺 旋 CT 与 多 种 软 件 相 结 合, 对 不 同 术 式 远 移 尖 牙 进 行 三 维 有 限 元 模 拟, 借 助 Ansys11.0 精 确 求 解, 客 观 准 确 地 反 映 瞬 时 位 移 应 力 分 布 情 况, 为 临 床 工 作 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 选 择 建 模 对 象 成 年 男 性 志 愿 者 1 例, 安 氏 Ⅰ 类 磨 牙 关 系, 无 正 畸 治 疗 史, 无 牙 体 缺 损, 无 牙 周 疾 病, 无 颞 下 颌 关 节 疾 病 1.2 CT 扫 描 美 国 通 用 公 司 GElightspeedVCT 64 排 螺 旋 CT 机 平 行 于 眶 耳 平 面 进 行 扫 描, 从 眶 下 缘 至 颏 部 下 缘 连 续 扫 描, 扫 描 层 厚 为 0 5mm, 将 数 据 以 医 学 图 像 通 讯 标 准 (digitalimagingandcommu nicationsinmedicine,dicom) 格 式 输 出 共 选 取 196 个 横 截 面 二 维 图 像 为 原 始 建 模 数 据 [11] 1.3 三 维 几 何 模 型 建 立 利 用 交 互 式 医 学 图 像 控 制 系 统 (Mimics) 软 件 调 整 图 像 的 阈 值, 从 而 区 分 下 颌 骨 牙 齿 牙 周 膜 以 多 面 体 方 式 重 构 出 下 颌 骨 牙 齿 牙 周 膜 的 三 维 几 何 实 体, 以 STL 格 式 转 入 GeomagicStudio8.0 软 件 中, 对 模 型 进 行 精 炼 和 细 化, 获 得 3D 模 型 最 后 将 模 型 以 STP 格 式 文 件 导 入 UnigraphicsNX 软 件 中, 分 别 模 拟 不 同 状 态 下 尖 牙 移 动 的 过 程 [11] 1.4 手 术 模 拟 模 型 1: 模 拟 常 规 状 态 下 远 移 尖 牙, 拔 除 第 一 前 磨 牙, 见 图 1 模 型 2: 模 拟 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 术 快 速 移 动 尖 牙,1 第 一 前 磨 牙 被 拔 除 国 ;2 将 垂 直 切 口 由 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 顶 向 根 尖 做 起 ;3 将 斜 形 切 口 由 第 1 前 磨 牙 近 根 尖 处 向 尖 牙 根 尖 方 向 做 起, 见 图 2 模 型 3: 模 拟 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 术 快 速 移 动 尖 牙,1 拔 除 第 1 前 磨 牙 ;2 去 除 第 1 前 磨 牙 颊 侧 骨 板 ;3 围 绕 尖 牙 垂 直 切 开 骨 皮 质, 见 图 接 收 基 金 项 目 : 新 疆 维 吾 尔 自 治 区 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金 ( 编 号 : B35) 作 者 单 位 : 1 上 海 市 虹 口 区 牙 病 防 治 所 口 腔 修 复 科, 上 海 四 川 大 学 华 西 口 腔 医 学 院 正 畸 科, 成 都 新 疆 医 科 大 学 附 属 第 一 医 院 口 腔 正 畸 科, 乌 鲁 木 齐 作 简 介 者 : 梁 志 红, 女, 主 治 医 师 ; 薛 俊 杰, 男, 住 院 医 师, 责 任 作 者,E mail:kevinjmj2011@ gmail.com 图 1 常 规 状 态 下 移 动 尖 牙 示 意 图 采 用 Ansys 软 件 分 别 对 3 种 三 维 几 何 模 型 进 行

107 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 四方体单元格划分 见表 １ 并分别对各部分赋予相 应的材料属性 １ ２ １ ３ 见表 ２ １１３３ １ ６ 统计学处理 任意加载条件下的全部节点计 算通过 Ａｎｓ ｙ ｓ１ １ 有限元软件来完成 ２ 结果 ２ １ 不同工况下瞬时位移比较 ３种模型瞬时位 移尖牙总体瞬时位移都是向远中方向 尖牙的最大 瞬时位移位于尖牙牙冠颊侧和腭侧切 １ ３区 从牙 冠向牙根逐渐减小 各模型尖牙牙根中 １ ３ 第一 前磨牙和第一磨牙牙根均未有可见位移 不同之处 在于 尖牙在模型 １的最大瞬时位移为 １ ８９２５ 图 ２ 模拟牙周膜减阻牵张成骨手术去骨的平面示意图 １ ３ ｍｍ 模型 ２为 １ ９ ８１２ １ ３ ｍｍ 模 型 ３为 １ ９４ ２６ １ ３ ｍｍ 见图 ５ ７ 图 ３ 模拟牙槽骨减阻牵张成骨手术去骨示意图 表 １ 三维有限元模型网格划分信息 信息 模型 １ 模型 ２ 模型 ３ 节点数 ８２１ ３ ８ ８ ３５７７ ８ ３１４ ９ 单元数 ４２９ ６ ６ ４ ３４７７ ４ ３４２ ７ 图 ５ 模型 １常规状态下尖牙移动时瞬时位移分布情况 表 ２ 材料力学参数 材料 弹性模量 ｋｇ ｍｍ２ 泊松比 牙齿 １ ８６ １ ３ ３１ 皮质骨 ２ ３７ １ ３ ３ 松质骨 ２ ３ ２ ４５ 牙周膜 ８ １ ７ ３ １ １ ５ 力的加载 在模型 １沿近远中方向在尖牙牙 冠中心处以磨牙为支抗向远中施加 １ ５Ｎ的牵引力 颊腭侧各 ７ ５Ｎ 时长为 １ｓ 见图 ４ 模型 ２ ３ 力的加载与模型 １相同 图 ６ 模型 ２模拟牙周膜减阻牵张成骨手术后尖牙 移动时瞬时位移分布情况 图 ７ 模型 ３模拟牙槽骨减阻牵张成骨术后尖牙 图 ４ 力的加载示意图 移动时瞬时位移分布情况

108 1134 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 2.2 不 同 工 况 下 等 效 应 力 比 较 3 种 模 型 最 大 等 效 应 力 集 中 区 都 位 于 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 处 其 值 于 模 型 1 为 MPa, 模 型 2 为 MPa, 模 型 3 为 MPa 见 图 8~ 种 模 型 剪 切 应 力 比 较 应 力 相 切 于 截 面 的 分 量 为 剪 切 应 力 3 种 模 型 最 大 剪 切 应 力 均 位 于 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 处, 在 尖 牙 和 第 一 磨 牙 腭 侧 中 1/3 第 一 前 磨 牙 牙 根 尖 1/3 处 均 受 到 了 较 强 的 剪 切 应 力 模 型 1 最 大 剪 切 应 力 为 MPa, 模 型 2 最 大 剪 切 应 力 为 MPa, 模 型 3 最 大 剪 切 应 力 为 MPa 3 讨 论 图 8 模 型 1 常 规 状 态 下 尖 牙 移 动 时 等 效 应 力 分 布 情 况 图 9 模 型 2 模 拟 牙 周 膜 减 阻 牵 张 成 骨 手 术 后 尖 牙 移 动 时 等 效 应 力 分 布 情 况 图 10 模 型 3 模 拟 牙 槽 骨 减 阻 牵 张 成 骨 术 后 尖 牙 移 动 时 等 效 应 力 分 布 情 况 2.3 不 同 工 况 下 最 大 主 应 力 比 较 最 大 主 应 力 反 映 材 料 内 部 各 点 的 最 大 可 拉 伸 应 力 3 种 模 型 最 大 主 应 力 均 位 于 第 一 磨 牙 腭 面 中 1/3 处, 模 型 1 最 大 主 应 力 为 MPa, 模 型 2 为 MPa, 模 型 3 为 MPa 1998 年 Liouetal [2] 在 临 床 治 疗 中 首 次 将 骨 牵 张 和 骨 缝 牵 张 成 骨 技 术 的 原 理 应 用 到 了 牙 周 膜 中, 此 次 试 验 首 次 提 出 了 牙 周 膜 牵 张 成 骨 的 概 念 2002 年 Kisniscietal [3] 在 Liou 的 基 础 上 提 出 了 牙 槽 骨 牵 张 (dentoalveolardistraction,dad) 快 速 移 动 尖 牙 的 技 术 为 深 入 剖 析 3 种 方 法 后 远 移 尖 牙 的 生 物 力 学 特 点, 本 文 引 入 了 三 维 有 限 元 分 析 法 进 行 分 析 本 实 验 研 究 显 示 在 力 的 加 载 下,3 种 模 型 尖 牙 的 最 大 等 效 应 力 和 剪 切 应 力 集 中 区 都 在 尖 牙 远 中 牙 槽 嵴 处, 此 处 产 生 牙 槽 骨 的 吸 收 沉 积 改 建, 从 而 产 生 远 中 移 位 模 型 2 和 模 型 3 尖 牙 最 大 瞬 时 位 移 量 均 大 于 模 型 1, 提 示 在 相 同 的 大 小 相 同 作 用 时 间 的 力 作 用 下, 牙 周 膜 牵 张 与 DAD 方 法 都 可 加 大 尖 牙 移 动 量, 且 牙 周 膜 牵 张 效 果 更 佳, 这 与 国 内 外 [2,14-15] 的 研 究 相 一 致 需 要 移 动 的 牙 齿 被 施 加 矫 治 力 的 时 候, 一 个 大 小 相 等, 方 向 相 反 的 反 作 用 力 就 会 同 时 产 生, 而 承 受 这 些 反 作 用 力 的 结 构 就 称 为 支 抗 支 抗 磨 牙 在 远 移 尖 牙 过 程 中 容 易 前 移, 这 是 临 床 中 应 尽 可 能 避 免 的 情 况, 本 研 究 模 拟 减 阻 牵 张 技 术 过 程 中 的 牙 移 动 情 况, 发 现 应 用 该 技 术 可 有 效 避 免 远 移 尖 牙 过 程 中 的 磨 牙 前 移, 即 在 治 疗 过 程 中 可 以 有 效 保 护 支 抗, 这 与 临 床 研 究 动 物 模 型 一 致 [2,14] Algayeret al [16] 对 牙 周 膜 牵 张 成 骨 术 后 的 1 例 患 者 进 行 了 2 年 随 访, 结 果 显 示 美 学 效 果 和 咬 合 稳 定 性 俱 佳 马 [15] 文 盛 研 究 发 现, 对 动 物 模 型 进 行 牙 槽 隔 减 阻 牙 周 膜 牵 张 DAD 拔 牙 固 定 矫 治 三 者 间 差 异 无 统 计 学 意 义 而 3 种 模 型 最 大 瞬 时 位 移 量 从 尖 牙 牙 冠 到 根 尖 均 逐 渐 减 少, 提 示 尖 牙 受 力 初 牙 冠 远 中 移 动 量 更 大, 尖 牙 有 远 中 倾 斜 趋 势 ; 在 尖 牙 牙 颈 部 牙 槽 骨 存 在 应 力 集 中 区, 从 而 引 起 不 良 的 牙 槽 骨 吸 收 在 临 床 研

109 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1135 究 中 也 发 现 此 类 现 象 : 牙 周 膜 牵 张 成 骨 术 后,Liouet al [2] 从 临 床 和 影 像 分 析 认 为 部 分 尖 牙 出 现 轻 度 倾 斜 ;Sayinetal [4] 测 量 发 现 尖 牙 远 中 倾 斜 牙 槽 骨 牵 张 后,Sukuricaetal [6] 报 道 尖 牙 倾 斜 为 9 1 ; [15] 马 文 盛 报 道 为 12.2 为 了 防 止 尖 牙 因 为 支 点 的 存 在 而 倾 斜, 在 临 床 手 术 的 过 程 中 应 充 分 去 除 牙 槽 间 隔 的 阻 力 ; 同 时 为 了 防 止 或 减 少 尖 牙 的 倾 斜 移 动, 临 床 上 应 尽 量 使 连 接 杆 的 高 度 接 近 移 动 牙 的 阻 力 中 心 [15] 云 图 显 示 3 种 模 型 第 二 前 磨 牙 根 尖 1/3 尖 牙 [17] 根 中 1/3 均 出 现 应 力 集 中 区 吕 涛 等 在 观 察 研 究 犬 科 动 物 模 型 的 时 候 发 现 : 牙 周 膜 牵 张 牙 根 吸 收 程 度 比 传 统 牙 移 动 要 严 重 很 多, 不 过 在 停 止 加 力 后 [11] 牙 根 吸 收 会 进 行 牙 骨 质 修 复 赵 玺 等 在 研 究 减 阻 牵 张 成 骨 术 后 下 颌 牙 的 等 效 应 力 时 发 现, 尖 牙 向 [15] 远 中 移 动 的 同 时 有 舌 向 旋 转 的 趋 势 ; 马 文 盛 于 临 床 研 究 中 发 现 尖 牙 有 的 近 中 颊 向 旋 转 本 研 究 中 未 发 现 类 似 现 象 综 上 所 述, 牙 周 膜 减 阻 和 牙 槽 骨 减 阻 具 有 牙 移 动 速 度 快 和 支 抗 丧 失 少 等 优 点, 但 在 临 床 应 用 中 应 注 意 控 制 牙 倾 斜 移 动, 严 格 把 握 适 应 症, 结 合 患 者 实 际 情 况 选 择 最 佳 诊 疗 方 式 但 本 研 究 存 在 部 分 局 限 性 在 研 究 对 象 方 面, 骨 骼 牙 齿 和 牙 周 组 织 都 是 各 向 异 性 的 非 线 性 材 料, 本 研 究 将 各 种 材 料 均 视 为 各 向 同 性 的 均 质 弹 性 体 ; 在 模 拟 受 力 方 面, 三 维 有 限 元 加 载 于 尖 牙 处 是 瞬 时 作 用 力, 而 在 实 际 治 疗 中, 牙 齿 移 动 所 受 的 是 一 个 持 续 的 力 为 使 得 三 维 有 限 元 法 能 更 好 地 模 拟 生 物 状 况, 得 出 更 为 准 确 的 数 据, 还 有 待 进 一 步 研 究 参 考 文 献 [1] HaslerR,SchmidG,IngervalB,etal.Aclinicalcomparisonof therateofmaxilarycanineretractionintohealedandrecentex tractionsites apilotstudy[j].eurjorthod,1997,19(6): [2] LiouEJ,HuangCS.Rapidcanineretractionthroughdistraction oftheperiodontalligament[j].amjorthoddentofacialorthop, 1998,114(4): [3] KisnisciRS,IseriH,TuzHH,etal.Dentoalveolardistractionos teogenesisforrapidorthodonticcanineretraction[j].joralmax ilofacsurg,2002,60(4): [4] SayinS,BengiAO,GurtonAU,etal.Rapidcaninedistalization usingdistractionoftheperiodontalligament:apreliminaryclinical validationoftheoriginaltechnique[j].angleorthod,2004,74 (3): [5] IseriH,KisnisciR,BziziN,etal.Rapidcanineretractionandor thodontictreatmentwithdentoalveolardistractionosteogenesis[j]. AmJOrthodDentofacialOrthop,2005,127(5):533-41,625. [6] SukuricaY,KaramanA,GurelH G,etal.Rapidcaninedistal izationthroughsegmentalalveolardistractionosteogenesis[j].an gleorthod,2007,77(2): [7] KurtG,IseriH,KisnisciR.Rapidtoothmovementandorthodon tictreatmentusingdentoalveolardistraction(dad).long term (5years)folow upofaclasicase[j].angleorthod,2010, 80(3): [8] KharkarVR,KotrashetiSM.Transportdentoalveolardistraction osteogenesis asistedrapidorthodonticcanineretraction[j].oral SurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod,2010,109(5): [9] PrabhatKC,MaheshwariS,GuptaND,etal.Periodontalliga mentdistraction:asimplifiedapproachforrapidcanineretraction [J].JIndianSocPeriodontol,2012,16(1): [10] LongH,PyakurelU,WangY,etal.Interventionsforaccelerating orthodonticotoothmovement:asystematicreview[j].angleorth od,2013,83(1): [11] 赵 玺, 薛 俊 杰, 米 丛 波. 减 阻 牵 张 成 骨 术 快 速 移 动 尖 牙 的 三 维 有 限 元 分 析 [J]. 中 华 医 学 美 学 美 容 杂 志,2012,18(4): [12]WagnerA,KrachW,SchichoK,etal.A3 dimensionalfinite- elementanalysisinvestigatingthebiomechanicalbehaviorofthe mandibleandplateosteosynthesisincasesoffracturesofthecon dylarproces[j].oralsurgoralmedoralpatholoralradiol Endod,2002,94(6): [13]ChangYI,ShinSJ,BaekSH.Three dimensionalfiniteelement analysisindistalenmasemovementofthemaxilarydentitionwith themultiloopedgewisearchwire[j].eurjorthod,2004,26 (3): [14] 龚 昕, 袁 晓, 稽 国 平, 等. 牙 间 隔 骨 外 科 改 建 加 速 尖 牙 移 动 的 临 床 效 果 评 价 [J]. 口 腔 医 学,2004,24(3): [15] 马 文 盛. 牵 张 成 骨 快 速 正 畸 牙 齿 移 动 的 实 验 与 应 用 研 究 [D]. 河 北 医 科 大 学,2009. [16]AlgayerS,RosenbachG,TavaresCA,etal.Periodontalliga mentdistraction:estheticsandocclusalstabilityatthe2 yearfol low up[j].amjorthoddentofacialorthop,2013,143(4): [17] 吕 涛. 牙 周 膜 牵 张 快 速 牙 移 动 的 实 验 研 究 [D]. 四 川 大 学, 2006.

110 1136 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) CHOP/GADD153 在 食 管 鳞 状 细 胞 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义 陈 海 1, 吴 勇 2, 于 在 诚 1 3, 汪 渊 摘 要 目 的 探 讨 内 质 网 应 激 相 关 蛋 白 CHOP/GADD153 在 食 管 鳞 状 细 胞 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义, 并 分 析 其 与 临 床 病 理 特 征 的 关 系 方 法 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 及 距 癌 组 织 5cm 以 上 的 手 术 远 端 切 缘 的 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 各 87 例, 应 用 组 织 芯 片 免 疫 组 化 法 及 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达, 并 分 析 其 表 达 与 患 者 性 别 年 龄 分 化 程 度 浸 润 深 度 病 理 分 期 及 淋 巴 转 移 等 临 床 病 理 特 征 之 间 的 关 系 结 果 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 中 CHOP/GADD153 的 表 达 在 蛋 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 普 胸 外 科, 合 肥 淮 南 新 华 医 疗 集 团 北 方 医 院 普 胸 外 科, 淮 南 安 徽 医 科 大 学 分 子 生 物 学 实 验 室, 省 部 共 建 重 要 遗 传 病 基 因 资 源 利 用 重 点 实 验 室, 合 肥 作 者 简 介 : 陈 海, 男, 医 师, 硕 士 研 究 生 ; 于 在 诚, 男, 主 任 医 师, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected]; 汪 渊, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:aydesm 白 水 平 明 显 高 于 食 管 正 常 鳞 状 上 皮 组 织 (P<0 01), 且 其 高 表 达 与 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 浸 润 深 度 分 化 程 度 病 理 分 期 及 淋 巴 转 移 密 切 相 关 (P<0 01), 而 与 患 者 性 别 及 年 龄 无 关 结 论 CHOP/GADD153 参 与 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 发 生 发 展, 其 表 达 水 平 随 着 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 恶 性 程 度 的 增 高 而 增 高, 可 能 作 为 衡 量 食 管 鳞 状 细 胞 癌 恶 性 程 度 的 一 种 有 潜 在 价 值 的 分 子 标 志 物 关 键 词 内 质 网 应 激 ;CCAAT 增 加 子 结 合 蛋 白 ; 食 管 肿 瘤 ; 鳞 状 细 胞 癌 中 图 分 类 号 R735.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 食 管 癌 是 我 国 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一, 尽 管 内 镜 检 查 能 够 发 现 部 分 早 期 病 变 患 者, 但 是 大 部 分 患 者 确 诊 即 是 中 晚 期, 预 后 差 [1] CHOP/GADD153, 又 称 CCAAT 增 强 子 结 合 蛋 白 (CCAATenhancerbind ingprotein,c/ebpξ) DNA 损 伤 诱 导 转 录 因 子 3 (DNA damageinducibletranscript3,ddit3), 属 于 Three dimensionalfiniteelementanalysisofrapidtoothmovement throughreducingresistanceanddistraction LiangZhihong 1,XueJunjie 2,3,WangHongjun 1 ( 1 Prophylactico therapeticinstitutionofhongkoudistrict,shanghai ; 2 DeptofOrthodontics, StateKeyLaboratoryofOralDisease,WestChinaHospitalofStomatology,Chengdu ; 3 Deptof Orthodontics,TheFirstAfiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi ) Abstract Objective Thisresearchusedthree dimensionalfiniteelementanalysistocomparethecaninedistal movementandforceddistributionofteethandperiodontaltisueinthreeways.methods Thisresearchestablished three dimensionalfiniteelementmodelsundertheconventionalconditiontomovethecanine(model1),rapidca ninemovementthroughdistractingosteogenesisoftheperiodontalligament(model2),rapidcaninemovement throughreducingresistanceanddistractingmethod(model3),thencariedstrengthonbuccalandpalatalsidesof teeth.results Thebiggestdisplacementquantityoncanine:model2>model3>model1;thebiggestequivalent stres:model2<model1<model3;thebiggestprincipalstres:model1<model2<model3;thebiggestshear stres:model2<model1<model3.conclusion Intheprocesofcaninedistalmovement,reducingboneresist ance,especialydistalalveolarcrestofcanine,canacceleratethetoothmovingspeedefectively.andthetwoways succesfulyavoidthelosofanchorage.while,thecaninehasdistalmotiontendencyundertheactionofforce, doctorsshouldtakeappropriatemeasurestocontrolitinclinicalwork. Keywords distractionosteogenesis;three dimensionalfiniteelement;malocclusion;toothmovement

111 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1137 C/EBP 家 族 成 员, 是 内 质 网 应 激 (endoplasmicreticu lumstres,ers) 特 异 的 转 录 因 子, 在 生 理 状 态 下 表 达 量 较 低, 但 当 各 种 损 伤 引 起 未 折 叠 蛋 白 或 错 误 折 叠 蛋 白 增 多 胞 内 Ca 2+ 稳 态 失 衡 而 导 致 ERS 反 应 时,CHOP 会 被 激 活 而 呈 现 高 表 达 [2] ERS 中 CHOP 介 导 的 凋 亡 与 许 多 疾 病 相 关, 如 糖 尿 病 病 毒 感 染 脑 缺 血 眼 科 疾 病 肝 病 和 帕 金 森 病 等 [3-4], 尤 其 是 其 与 肿 瘤 发 生 发 展 浸 润 及 转 移 的 相 互 关 系 备 受 各 国 研 究 者 的 关 注 近 来 国 内 外 对 CHOP 在 人 [5] 类 肿 瘤 中 的 研 究 颇 多, 陈 俊 榕 等 发 现 CHOP 在 伴 高 级 别 上 皮 内 瘤 变 和 恶 变 的 腺 瘤 和 腺 癌 组 织 阳 性 表 达 率 均 显 著 高 于 正 常 肠 黏 膜 和 早 期 腺 瘤 ;Mertani etal [6] 发 现 乳 腺 癌 细 胞 株 中 CHOPmRNA 呈 高 表 达, 但 有 关 CHOP 在 人 类 食 管 癌 中 的 研 究 尚 未 见 报 道 该 研 究 选 取 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 及 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 各 87 例, 分 别 应 用 组 织 芯 片 免 疫 组 化 法 及 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 水 平 的 表 达, 分 析 CHOP/GADD153 的 表 达 与 临 床 病 理 特 征 的 关 系 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 收 集 2011 年 11 月 ~2012 年 4 月 在 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 普 胸 外 科 Ⅰ Ⅱ 病 区 手 术 切 除 的 食 管 鳞 状 细 胞 癌 标 本 以 及 距 癌 组 织 5 cm 以 上 的 手 术 远 端 切 缘 的 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 标 本 各 87 例 患 者 术 前 均 未 接 受 放 化 疗 治 疗, 且 术 后 全 部 病 理 切 片 均 由 我 院 病 理 科 2 位 以 上 病 理 专 家 确 诊 将 所 取 标 本 迅 速 置 于 我 院 输 血 科 -80 保 存 备 用 87 例 患 者 中, 男 68 例, 女 19 例, 年 龄 43~80(62 0±7 2) 岁 经 术 后 病 理 检 查 确 诊, 其 中 分 化 程 度 Ⅰ 级 ( 高 分 化 )23 例 Ⅱ 级 ( 中 分 化 )53 例 Ⅲ 级 ( 低 分 化 )11 例 ; 浸 润 深 度 : 侵 及 黏 膜 层 5 例 侵 及 肌 层 19 例 侵 及 纤 维 膜 63 例 ; 食 管 癌 分 期 标 准 采 用 国 际 抗 癌 联 盟 (UnionforInternational CancerControl,UICC)2009 年 第 7 版 制 定 的 TNM 分 期 :Ⅰ ~Ⅱ 期 51 例 Ⅲ ~Ⅳ 期 37 例 ; 有 淋 巴 结 转 移 45 例 无 淋 巴 结 转 移 42 例 1.2 主 要 试 剂 兔 抗 人 CHOP 多 克 隆 抗 体 (sc 575) 鼠 抗 人 多 克 隆 抗 体 β actin 购 自 美 国 Santa CruzBiotechnology 公 司 ;PV 6000 免 疫 组 化 检 测 试 剂 盒 浓 缩 型 DAB 试 剂 盒 HRP 标 记 的 羊 抗 兔 及 羊 抗 鼠 IgG 购 于 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ; 预 染 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 购 自 加 拿 大 Fermentas 公 司 ; SuperSignal WestPicoTrialKit(ECL 显 色 试 剂 盒 ) 购 自 美 国 PIERCE 公 司 ;RIPA 裂 解 液 ( 强 ) PVDF 膜 BCA 试 剂 盒 及 一 抗 稀 释 液 购 自 上 海 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 1.3 方 法 组 织 芯 片 的 制 备 食 管 癌 标 本 手 术 离 体 后 立 即 置 于 10% 甲 醛 溶 液 固 定, 常 规 石 蜡 包 埋 切 片 及 组 织 病 理 诊 断 阅 片 在 HE 染 色 切 片 的 指 引 下 通 过 显 微 镜 对 目 标 组 织 定 位 标 记, 每 块 蜡 块 与 一 个 目 标 组 织 相 对 应, 共 计 175 个 位 点 利 用 组 织 芯 片 仪 依 次 从 原 始 蜡 块 上 穿 取 直 径 1.0mm 的 组 织 柱, 插 入 每 块 具 有 45 个 点 阵 的 受 体 蜡 块 中, 经 过 融 蜡 冷 却 之 后 制 成 组 织 芯 片 所 得 组 织 芯 片 常 规 切 片, 并 行 HE 染 色, 以 4μm 厚 连 续 切 片 备 用 免 疫 组 化 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达 切 片 常 规 脱 蜡 水 化 抗 原 修 复 等, 滴 加 抗 CHOP/GADD153 抗 体 孵 育 过 夜 ( 兔 抗 人,1 100), 滴 加 通 用 型 IgG 抗 体 HRP 多 聚 体 30min( 羊 抗 兔 / 小 鼠 IgG 多 聚 体 ), 滴 加 DAB 染 色, 自 来 水 冲 洗, 苏 木 精 复 染, 盐 酸 酒 精 分 化, 自 来 水 反 蓝, 梯 度 酒 精 脱 水, 二 甲 苯 透 明 树 脂 封 片, 显 微 镜 下 阅 片, 用 已 知 CHOP 阳 性 乳 腺 癌 组 织 作 阳 性 对 照 相 应 癌 旁 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 作 阴 性 对 照, 一 抗 予 PBS 代 替 作 阴 性 对 照 阳 性 结 果 表 现 为 棕 黄 色 细 颗 粒 分 布 于 细 胞 核 内, 采 用 ImageProPlus 分 析 软 件 测 定 阳 性 细 胞 的 平 均 吸 光 度 值 (averageabsorbancevalue,a) 每 张 切 片 随 机 测 定 5 个 区 域 的 阳 性 细 胞 平 均 光 密 度 (average opticaldensity,aod), 以 其 均 值 反 映 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达 水 平 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 蛋 白 的 表 达 根 据 免 疫 组 化 的 实 验 结 果, 选 取 典 型 病 例 13 例, 其 中 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 1 例, 食 管 鳞 状 细 胞 癌 12 例, 各 取 少 量, 匀 浆 器 研 碎, 加 入 蛋 白 裂 解 液, 提 取 浓 缩 得 到 蛋 白 样 本, 具 体 步 骤 严 格 按 说 明 书 进 行 蛋 白 样 本 电 泳 后, 转 到 聚 偏 二 氟 乙 烯 膜 (PVDF 膜 ) 上, 加 入 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 液, 室 温 下 孵 育 2h, 在 水 平 摇 床 上 振 摇 放 置 2h,PBST 漂 洗 PVDF 膜 3 遍, 加 入 抗 CHOP/GADD153 抗 体 ( 兔 抗 人 ),4 孵 育 过 夜 弃 去 一 抗,PBST 洗 涤 3 遍 加 入 的 通 用 型 IgG 抗 体 HRP 多 聚 体 ( 羊 抗 兔 / 小 鼠 IgG 多 聚 体 ), 室 温 振 摇 孵 育 2~3h 后, 弃 去 二 抗,PBST 洗 涤 3 遍, 不 含 0.05% Tween 20 的 PBS 洗 涤 1 遍, 增 强 化 学 荧 光 发 光 法 (ECL) 显 影, 曝 光 以 β actin 作 为 内 参 照, 结 果 以 灰 度 扫 描, 用 相 对 吸 光 度 值 ( 即 CHOP/GADD153 条 带 吸 光 度 值 /β

112 １１３８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 １ 免疫组化 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１ ５３在正常食管鳞状上皮及食管鳞状细胞癌组织中的表达 Ａ 正常食管鳞状上皮 Ｂ 高分化食管鳞状细胞癌组织 Ｃ 中分化食管鳞状细胞癌组织 Ｄ 低分化食管鳞状细胞癌组织 １ Ｓ Ｐ ２ ２ Ｓ Ｐ ４ 表 １ ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３的表达与食管鳞状细胞癌 ａ ｃ ｎ条带吸光度值 表示 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３蛋白的 患者临床病理特征的关系 相对表达强度 １ ４ 统计学处理 采用 Ｓ ＰＳＳ１７ 统计软件进行 珋±ｓ表示 组间比较采用 检验 分析 数据以 ｘ ２ 结果 ２ １ 免疫组化法比较两组 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１ ５ ３蛋白 项目 值 Ｐ值 １ ６４２４３ １４２７６ ７６８５５１ ４５４９３ １１ ４８４５５± ３１８２６ ３ ２３５８ ２１３３ 中 ５３ ３８１１４± ２８６７４ ６ ８９３９４ ４２ 高 ２３ ３１１± ２３２ ３ ３５４７８ １６４３ 男 ６８ ３８８± ５６１９２ １９ ３５８８１± ６５４７３ 年龄 岁 ６ １５ ３８１３３± ４４５４８ ６ ７２ ３７９７２± ５９４４３ 分化程度 染色阳性 ８７例对照组出现弱阳性结果 食管鳞状 低 ３ ７ ５４ ３± ５ ８６ 较对照组 ２ ８ ２３ ５± ６６７ ＡＯＤ 女 表达 ８７例食管鳞状细胞癌组织均存在核 ＣＨＯＰ 细 胞 癌 组 织 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３蛋 白 表 达 水 平 例数 性别 淋巴结转移 明显升高 Ｐ １ 见图 １ 在 ８ ７例食管鳞状细 阳性 ４５ ３４６２５± ４５５４５ ９ 例 女 性 ＣＨＯＰ 胞 癌 患 者 中 ６８ 例 男 性 及 １ 阴性 ４２ ４６７± ５５１６９ ３ ８ ８± ＧＡＤＤ１５３蛋 白 表 达 水 平 分 别 为 侵及深度 黏膜层 ５ ２７４９８± ２７７ ５ ６１９ 和 ３ ５８８１± ６ ５４７ 年龄 ６ 岁者 ６ ５３３７４ ２８３５ 肌层 １９ ３２１２± １２２２ ６ １７５６ ３６３７ １ ５例 ６岁 者 ７２例 蛋 白 表 达 水 平 分 别 为 纤维膜 ６３ ３９９７６± ４８７６１ ３８１３３± ４ ４５５ ３ ８９７ ２± ５９４ ４ 但 ＴＮＭ分期 ３ ６５７１２ ３４６４ 蛋白表达水平在性别和年龄分组比较上差异均无统 Ⅰ Ⅱ ５１ ３５７８± ４５２２４ Ⅲ Ⅳ ３６ ４１３５± ５８１３５ 计学意义 当按肿瘤侵及深度 黏膜层 肌层 纤维 中分化与低分化比较 高分化与低分化比较!侵及肌层与侵及黏膜层 膜 分化程度 高分化 中分化 低分化 淋巴结转 比较 侵及纤维膜与侵及黏膜层比较 移 阳性 阴性 及 ＴＮＭ分期进行分层分析时 发现 两组蛋白表达水平在各亚组比较差异均具有统计学 率和死亡率均较高 目前普遍认为食管癌变是一个 意义 Ｐ １ 见表 １ 涉及多因素 多阶段 多基因变异积累及相互作用的 ２ ２ Ｗ ｓ ｒ ｎｂｌ ｏ法 Ｗ ｓ ｒ ｎｂｌ ｏ 结果显示 食管 复杂过程 食管癌的发生 发展过程涉及大量基因表 鳞状细胞癌组织与正常食管鳞状上皮组织中均可检 达水平的 改 变 如 癌 基 因 的 激 活 和 抑 癌 基 因 的 失 测到 ＣＨＯＰ ＧＡＤＤ１５ ３的表达 见图 ２ 活 ７ 随着医疗水平的迅猛发展 食管癌的手术切 ３ 讨论 食管癌是我国常见的上消化道恶性肿瘤 发病 除率明显提高 手术死亡率明显下降 但是食管癌患 者的长期预后仍不容乐观 目前食管癌患者的 ５年 生 存率仍难以超过３５ 造成这一现象的主要原

113 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1139 CHOP/ β -actin CHOP β-actin 图 2 Westernblot 法 检 测 CHOP/GADD153 在 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 与 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 中 的 表 达 1: 正 常 鳞 状 上 皮 ;2~13: 食 管 鳞 状 细 胞 癌 (2: 男 性 ;3: 女 性 ;4:> 60 岁 ;5: 60 岁 ;6: 肿 瘤 侵 犯 黏 膜 层 ;7: 肿 瘤 侵 犯 肌 层 ;8: 肿 瘤 侵 犯 纤 维 层 ;9: 低 分 化 鳞 癌 ;10: 中 分 化 鳞 癌 ;11: 高 分 化 鳞 癌 ;12: 有 淋 巴 结 转 移 ;13: 无 淋 巴 结 转 移 ) 因 是 食 管 癌 患 者 早 期 无 明 显 的 特 异 性 症 状, 大 多 数 首 次 就 诊 的 食 管 癌 患 者 已 经 为 进 展 期 患 者, 临 床 治 疗 效 果 往 往 较 差 近 年 来, 随 着 分 子 生 物 学 的 迅 速 发 展, 研 究 者 发 现 一 些 与 食 管 癌 发 生 发 展 的 分 子 生 物 学 指 标, 如 鳞 状 上 皮 细 胞 癌 抗 原 (squamouscel carcinomaantigen,scca) 癌 胚 抗 原 (carcinoembry onicantigen,cea) 神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 (neuron specificenolase,nse) 细 胞 角 蛋 白 片 段 抗 原 21 1 (cytokeratinfragmentantigen21 1,Cyfra21 1) 糖 类 抗 原 19 9(carbohydrateantigen19 9,CA19 9) 组 织 多 肽 特 异 抗 原 (tisuepolypeptidespecificantigen,tps) 细 胞 质 胸 苷 激 酶 1(thymidinekinase1,TK1) 等, 可 用 于 食 管 癌 的 辅 助 诊 断 疗 效 检 测, 但 尚 不 能 用 于 食 管 癌 的 早 期 诊 断 [8-11] CHOP/GADD153 是 ERS 特 异 的 转 录 因 子 [12-13], 与 各 种 细 胞 活 动 如 增 殖 分 化 能 量 代 谢 凋 亡 相 关 正 常 情 况 下,CHOP 主 要 存 在 于 细 胞 质 内, 表 达 甚 微, 当 细 胞 处 于 应 激 状 态 下 时 被 活 化 并 转 位 到 细 胞 核 内 [14], 削 弱 Bcl 2 的 抗 凋 亡 功 能, 从 而 导 致 ER 膜 上 Bax 和 Bak 构 象 变 化 并 寡 聚 化, 破 坏 膜 的 完 整 性, 导 致 内 钙 外 流, 从 而 使 细 胞 质 内 Ca 2+ 浓 度 升 高, 诱 发 细 胞 凋 亡 本 实 验 通 过 对 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 和 正 常 食 管 鳞 状 上 皮 组 织 CHOP/ GADD153 蛋 白 的 检 测 显 示, 食 管 鳞 状 细 胞 癌 中 CHOP/GADD153 的 表 达 明 显 高 于 食 管 正 常 鳞 状 上 皮, 提 示 在 正 常 黏 膜 癌 变 过 程 中 ERS 被 激 活 本 研 究 显 示 CHOP/GADD153 的 表 达 与 肿 瘤 的 浸 润 深 度 分 化 程 度 病 理 分 期 及 有 无 淋 巴 结 转 移 相 关, 而 与 患 者 的 性 别 及 年 龄 无 关 CHOP/GADD153 的 表 达 程 度 随 着 浸 润 深 度 的 增 加 而 增 高 ; 随 着 分 化 程 度 的 降 低 而 增 高 ; 病 理 分 期 晚 的 表 达 高 于 病 理 分 期 早 的 ; 有 淋 巴 结 转 移 的 明 显 高 于 无 淋 巴 结 转 移 以 上 结 果 均 显 示,CHOP/GADD153 参 与 了 食 管 鳞 状 细 胞 癌 的 发 生 发 展, 表 达 水 平 随 着 食 管 鳞 状 细 胞 癌 组 织 恶 性 程 度 的 增 高 而 增 高, 其 作 用 贯 穿 于 肿 瘤 的 生 长 进 展 侵 袭 及 转 移 过 程 中, 因 此 可 能 成 为 衡 量 食 管 鳞 状 细 胞 癌 恶 性 程 度 的 一 种 有 潜 在 价 值 的 分 子 标 [15] 志 物 王 苏 美 等 发 现 鼻 咽 癌 组 织 中 CHOP 高 表 达 于 胞 质 及 细 胞 核, 鼻 咽 炎 组 织 中 CHOP 仅 弱 阳 性 低 表 达 于 胞 质 ;Connetal [16] 发 现 神 经 母 细 胞 瘤 中 CHOP 亦 有 表 达 [17-18] 另 外, 研 究 显 示 抗 肿 瘤 药 物 可 通 过 上 调 CHOP 基 因 的 表 达 来 诱 导 肿 瘤 细 胞 凋 亡 ; 同 时 CHOP 的 过 表 达 在 增 敏 化 疗 药 物 中 也 起 到 了 关 键 作 用 如 芬 维 A 胺 和 前 列 腺 素 A 类 似 物 clavulone 可 诱 导 神 经 母 细 胞 瘤 和 人 类 肝 癌 细 胞 血 癌 细 胞 凋 亡, 均 与 激 活 CHOP 介 导 的 ERS 相 关 凋 亡 途 径 有 关 [19] ;CHOP 基 因 沉 默 能 明 显 降 低 肿 瘤 细 胞 对 化 疗 药 的 敏 感 性, 甲 基 硒 酸 作 为 ERS 的 诱 导 剂 能 将 紫 杉 烷 类 化 疗 药 的 抗 癌 活 性 提 高, 实 验 中 观 察 到 了 CHOP 的 高 表 达 这 也 进 一 步 揭 示 了 CHOP/GADD153 在 恶 性 肿 瘤 发 生 发 展 过 程 中 发 挥 重 要 作 用, 然 而 提 高 CHOP 的 表 达 对 治 疗 食 管 癌 的 影 响 尚 有 待 进 一 步 的 研 究 参 考 文 献 [1] Lao SirieixP,FitzgeraldRC.Screeningforoesphagealcancer[J]. NatRevClinOncol,2012,9(5): [2] ZhaL,FanL,SunG,etal.Melatoninsensitizeshumanhepatoma celstoendoplasmicreticulumstres inducedapoptosis[j].jpine alres,2012,52(3): [3] OyadomariS,KoizumiA,TakedaK,etal.Targeteddisruptionof thechopgenedelaysendoplasmicreticulumstres mediateddiabe tes[j].jclininvest,2002,109(4): [4] SilvaRM,RiesV,OoTF,etal.CHOP/GADD153isamediator ofapoptoticdeathinsubstantianigradopamineneuronsinaninvi voneurotoxinmodelofparkinsonism[j].jneurochem,2005,95 (4): [5] 陈 俊 榕, 李 初 俊, 杨 惠 玲, 等. 结 直 肠 腺 瘤 及 癌 变 组 织 CHOP 蛋 白 表 达 与 细 胞 凋 亡 的 相 关 性 研 究 [J]. 中 国 病 理 生 理 杂 志, 2011,27(5): [6] MertaniHC,ZhuT,GohEL,etal.Autocrinehumangrowthhor mone(hgh)regulationofhumanmammarycarcinomacelgene expresion.identificationofchopasamediatorofhgh stimulated

114 1140 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) humanmammarycarcinomacelsurvival[j].jbiolchem,2001, 276(24): [7] ZhangXM,GuoM Z.Thevalueofepigeneticmarkersinesopha gealcancer[j].frontmedchina,2010,4(4): [8] 高 鼎 亮, 范 钟 麟, 王 学 红. 鳞 状 细 胞 癌 抗 原 癌 胚 抗 原 糖 类 相 关 抗 原 19-9 在 食 管 癌 中 的 表 达 及 意 义 [J]. 社 区 医 学 杂 志, 2011,9(6):36-8. [9] 曹 红, 江 华. 血 清 鳞 状 上 皮 细 胞 癌 相 关 抗 原 癌 胚 抗 原 神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 及 细 胞 角 蛋 白 19 片 段 抗 原 检 测 在 食 管 癌 诊 断 中 的 价 值 [J]. 医 学 检 验,2013,10(14): [10] 陈 俊 强, 陈 明 强, 李 云 英, 等. 食 管 癌 患 者 血 清 中 组 织 多 肽 特 异 抗 原 的 表 达 及 临 床 意 义 [J]. 肿 瘤 研 究 与 临 床,2005,17(5):33-4. [11]LiZ,WangY,HeJ,etal.Serologicalthymidinekinase1isaprog nosticfactorinoesophageal,cardialandlungcarcinomas[j].eurj CancerPrev,2010,19(4): [12] SzegezdiE,LogueSE,GormanAM,etal.Mediatorsofendoplas micreticulum stresinducedapoptosis[j].embo Rep,2006,7 (9): [13] YokouchiM,HiramatsuN,HayakawaK,etal.Atypicalbidirec tionalregulationofcadmium inducedapoptosisviadistinctsigna lingofunfoldedproteinresponse[j].celdeathdifer,2007,14 (8): [14] RonD,HabenerJF.CHOP,anoveldevelopmentalyregulated nuclearproteinthatdimerizeswithtranscriptionfactorsc/ebpand LAPandfunctionsasadominant negativeinhibitorofgenetran scription[j].genesdev,1992,6(3): [15] 王 苏 美, 张 惠 忠, 马 志 建, 等.CHOP 在 鼻 咽 癌 中 的 表 达 及 其 意 义 [J]. 分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志,2012,4(2):84-8. [16]ConnKJ,GaoW W,UlmanM D,etal.Specificup regulationof GADD153/CHOP in 1 methyl 4 phenyl pyridinium treated SH SY5Ycels[J].JNeurosciRes,2002,68(6): [17] MaJ,QiuY,YangL,etal.Desipramineinducesapoptosisinrat gliomacelsviaendoplasmicreticulum stres dependentchop pathway[j].jneurooncol,2011,101(1):41-8. [18] Akatsu Y,SaikawaY,KubotaT,etal.Predictive value of GADD153,p21andc Junforchemotherapyresponseingastric cancer[j].cancersci,2007,98(5): [19] ChiangPC,ChienCL,PanSL,etal.Inductionofendoplasmic reticulumstresandapoptosisbyamarineprostanoidinhuman hepatocelularcarcinoma[j].jhepatol,2005,43(4): ExpresionandclinicalsignificanceofCHOP/GADD153in humanesophagealsquamouscelcarcinoma ChenHai 1,WuYong 2,YuZaicheng 1,etal ( 1 DeptofThoracicSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofThoracicSurgery,NorthernHospitalofHuainanXinhuaMedicalGroup,Huainan ) Abstract Objective ToinvestigatetheexpresionandclinicalsignificanceofC/EBP homologousproteinor growtharestanddna damage induciblegene153(chop/gadd153)relatedtoendoplasmicreticulum stres (ERS)inhumanesophagealsquamouscelcarcinoma(ESCC),andtoevaluateitscorelationwithclinicalpatholog icalcharacteristicsofescc.methods Eighty sevenspecimensofhumanesccandeighty sevenadjacentnormal specimensofabove5cmfromthedistaledgeofthetumorwereincluded.chop/gadd153proteinexpresionwas examinedbytisuemicroaray,immunohistochemicaltechniquesandwesternblotrespectively.therelationshipbe tweenchop/gadd153expresionwithclinicalparametersofpatients,suchasgender,age,tumordiferentiation, tumorinfiltration depth,tumorpathologicalstage,and lymphaticmetastasiswasanalyzed.results CHOP/ GADD153proteinexpresionlevelsinhumanESCCweresignificantlyhigherthanthoseinthenormalesophageal tisues(p<0 01).CHOP/GADD153expresioninESCCtisueswascorelatedwiththeinfiltrationdepth,grade ofdiferentiation,pathologicalstageoftumors,andlymphaticmetastasis(p<0 01),butnotwithgenderorage. Conclusion CHOP/GADD153participatesinthedevelopment,progresofESCC,anditsexpresionispositively asociatedwiththemalignancyofcarcinoma.chop/gadd153maybetakenasapotentialbiomarkerinevaluating themalignancyofescc. Keywords endoplasmicreticulum stres;ccaatenhancerbindingprotein;esophagusneoplasms;esophageal squamouscelcarcinoma

115 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1141 Syk PI3K Akt 在 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 中 的 表 达 及 其 意 义 代 群 1,2, 詹 鹤 琴 1,2, 曹 立 宇 1,2, 陈 聪 1,2 1,2, 陈 顺 华 摘 要 目 的 探 讨 脾 酪 氨 酸 激 酶 (Syk) 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 (PI3K) 蛋 白 激 酶 B(Akt) 在 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 (PTCL) 组 织 中 的 表 达 及 意 义 方 法 应 用 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 84 例 PTCL 组 织 及 30 例 反 应 性 淋 巴 组 织 增 生 (RLH) 中 的 表 达 结 果 Syk PI3K Akt 在 84 例 PTCL 组 织 中 阳 性 表 达 率 分 别 是 73 81% 41 67% 和 36 90%, 在 30 例 RLH 中 的 阳 性 表 达 率 是 13 33% 33 33% 和 23 33%,Syk 蛋 白 在 PTCL 中 的 表 达 明 显 高 于 RLH(P<0 05),PI3K 与 Akt 蛋 白 在 PTCL 及 RLH 中 的 表 达 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) Syk 表 达 与 血 清 乳 酸 脱 氢 酶 (LDH) 水 平 临 床 分 期 相 关 (P<0 05), 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 一 般 状 况 (PS) 评 分 和 国 际 预 后 指 数 (IPI) 评 分 无 关 (P>0 05);PI3K 及 Akt 表 达 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 PS 评 分 临 床 分 期 LDH 水 平 和 IPI 指 数 均 无 关 (P>0 05) Syk 与 PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 有 相 关 性 (r=0 229,P<0 05) 结 论 Syk 在 PTCL 的 发 生 发 展 中 具 有 重 要 作 用, 可 能 与 PI3K 信 号 通 路 有 关, 与 Akt 的 表 达 无 直 接 关 系 关 键 词 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 ;Syk;PI3K;Akt; 免 疫 组 织 化 学 中 图 分 类 号 R733.4 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤 (peripheralt cellymphoma, PTCL) 来 源 于 成 熟 T 细 胞 或 胸 腺 后 T 细 胞 及 自 然 杀 伤 (naturalkiler,nk) 细 胞, 其 生 物 学 行 为 及 临 床 表 现 具 有 明 显 异 质 性, 是 最 具 侵 袭 性 的 非 霍 奇 金 淋 巴 瘤, 其 发 病 机 制 尚 未 明 确, 现 无 标 准 的 治 疗 方 案, 治 疗 反 应 差, 易 复 发 探 讨 新 的 基 因 功 能 改 变 与 PTCL 发 生 发 展 的 关 系, 有 助 于 研 究 其 发 病 机 制, 为 治 疗 及 预 后 判 断 提 供 理 论 依 据 脾 酪 氨 酸 激 酶 (spleen 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( 编 号 : MH175); 安 徽 医 科 大 学 博 士 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :XJ201101); 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 病 理 学 教 研 室, 合 肥 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科, 合 肥 作 者 简 介 : 代 群, 女, 硕 士 研 究 生 ; 詹 鹤 琴, 女, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: [email protected]; 曹 立 宇, 男, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:ca [email protected] tyrosinekinase,syk) 是 一 种 非 受 体 型 酪 氨 酸 激 酶, 参 与 许 多 信 号 转 导 途 径 [1-2], 能 催 化 底 物 蛋 白 酪 氨 酸 残 基 磷 酸 化, 控 制 细 胞 分 化 增 殖 和 扩 散, 与 人 类 多 种 肿 瘤 密 切 相 关 [2-4] Syk 在 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 (phosphatidylinositol3 kinase,pi3k) 激 活 的 过 程 中 起 关 键 的 作 用 [5] 蛋 白 激 酶 B(proteinkinaseB, PKB,Akt) 是 一 种 丝 氨 酸 / 苏 氨 酸 蛋 白 激 酶, 与 T 细 胞 淋 巴 瘤 中 的 逆 转 录 病 毒 癌 基 因 V Akt 高 度 同 源, 与 蛋 白 激 酶 A 和 蛋 白 激 酶 C 在 结 构 上 相 似, 其 PH 结 构 域 可 与 被 激 活 的 PI3K 结 合, 活 化 的 Akt 由 细 胞 膜 释 放 到 细 胞 质 内, 参 与 细 胞 的 分 化 增 殖 和 凋 亡 等 功 能 [6] 该 实 验 采 用 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 Syk PI3K Akt 在 PTCL 组 织 中 的 表 达, 探 讨 其 在 PTCL 组 织 中 的 表 达 意 义 及 相 互 关 系 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 标 本 来 源 收 集 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科 2001 年 1 月 ~2010 年 12 月 诊 断 及 分 型 均 明 确 的 PTCL84 例, 其 中 男 63 例, 女 21 例, 发 病 年 龄 在 14~85 岁, 中 位 年 龄 为 52 岁 切 片 均 经 2 位 以 上 病 理 专 家 重 新 阅 读, 并 按 照 2008 版 WHOclas sificationoftumoursofhaematopoieticandlymphoid tisues [7] 进 行 组 织 形 态 学 分 型, 其 中 外 周 T 细 胞 淋 巴 瘤, 非 特 指 型 (peripheralt cellymphoma,nototh erwisespecified,ptcl NOS)34 例, 血 管 免 疫 母 细 胞 性 T 细 胞 淋 巴 瘤 (angioimmunoblastict cellympho ma,aitl)21 例, 间 变 性 大 细 胞 淋 巴 瘤 (anaplastic largecellymphoma,alcl)7 例, 结 外 NK/T 细 胞 淋 巴 瘤, 鼻 型 (extranodalnk/t cellymphoma,nasal type,enktl)22 例 另 选 30 例 反 应 性 淋 巴 组 织 增 生 (reactivelymphoidhyperplasia,rlh) 作 为 对 照 标 本 均 经 10% 中 性 福 尔 马 林 液 固 定, 石 蜡 包 埋,3 μm 连 续 切 片, 分 别 作 HE 染 色 和 免 疫 组 化 染 色 主 要 试 剂 兔 抗 人 Syk(C 20) 多 克 隆 抗 体 购 自 美 国 SantaCruz 公 司 ; 兔 抗 人 PI3K(C73F8) 单 克 隆 抗 体 及 兔 抗 人 Akt(C67E7) 单 克 隆 抗 体 购 自 美 国 CelSignaling 公 司 ; 免 疫 组 织 化 学 二 步 法 染 色 试 剂 盒 EDTA 修 复 液 (1mmol,pH8.0) 及 柠 檬 酸 修 复

116 １１４２ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 液 ｐｈ６ 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ＤＡＢ显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司 １ ２ 实验方法 免疫组织化学染色 ＥｎＶ ｓ ｏ ｎ二步 采用 Ｐ ａ ｒ ｓ ｏ ｎ检验 设检验水平 α ５ ２ 结果 法 按试剂盒说明书操作 用已知阳性切片作阳性 ２ １ Ｓｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ蛋白在 ＰＴＣＬ和 ＲＬＨ中的表 对照 用 ＰＢＳ代替一抗作阴性对照 达 Ｓ ｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ主要着色部位在细胞质 部分可 １ ３ 结果判定标准 Ｓｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ免疫组化染色 伴有细胞核着色 三者在 ８４例 ＰＴＣＬ中的阳性表达 表达主要定位于细胞质 部分定位于细胞核 细胞质 率 分 别 是 ７３ ８１ ４１ ６ ７ ３６ ９ 在 ３ ４例 ｙ ｋ按在 １ ４倍 及细胞核呈棕黄色者为阳性 Ｓ ＰＴＣＬ ＮＯＳ中 的 阳 性 表 达 率 分 别 是 ７９ ４１ 镜下肿瘤区域随机选取 １个视野 计算 １ 个肿 ５ ３８ ２４ 在 ２ １例 ＡＩ ＴＬ中的阳性表达率分 ３ 以上的肿瘤细胞 瘤细胞中的阳性细胞数 １ ４３ ４７ ６ ２ ３３ ３３ 在 ２２例 ＥＮＫＴＬ中 别是 ７ 出现阳性染色判为阳性 采用半定量方法 ８ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ 的结果判读 ９ 的阳性 表 达 率 分 别 是 ６ ３ ６４ ２２ ７３ ２７ ２７ 在 ７例 ＡＬＣＬ中 的 阳 性 表 达 率 分 别 是 ８５ ７１ ① 按细胞染色强弱评分 分 不着色 １分 浅黄色 ２分 棕黄色 ３分 棕褐色 ② ４２ ８ ６ ７１ ４３ 在 ３ 例 ＲＬＨ中的阳性表达率分 选取 ５个高倍视野 １ ４ 计数阳性细胞百分 别是 １３ ３３ ３３ ３３ ２３ ３３ Ｓｙ ｋ蛋白在 ＰＴＣＬ 分 ２ ５ １分 ２ ６ ５ ２分 ５ １ 比 及各类型中的表达明显高于 ＲＬＨ 差异有统计学意 ７ ５ ３分 ７５ 按① ②相加判断结果 １为阴 义 Ｐ ５ ＰＩ ３Ｋ蛋白在各类型 ＰＴＣＬ及 ＲＬＨ中 性 ２为阳性 表达差 异 无 统 计 学 意 义 Ｐ ５ Ａｋ蛋 白 在 １ ４ 统计学处理 应用 Ｓ ＰＳ Ｓ１９ 软件进行统计 ２ ２ 分析 计 数 资 料 采 用 χ 检 验 或 校 正 的 χ 检 验 及 Ｆ ｓ ｈ ｒ精确概率法比较各组间的差异 相关性分析 ＡＬＣＬ中的表达明显高于 ＲＬＨ Ｐ ５ 见图 １ 表 １ ２ ２ ＰＴＣＬ中Ｓｙ ｋ ＰＩ ３Ｋ Ａｋ 蛋白表达与临床病 图 １ Ｓｙ ｋ ＰＩ ３ｋ Ａｋ在 ＰＴＣＬ中的表达 ４ １ ＨＥ染色 ２ ４ ＥｎＶ ｓ ｏ ｎ染色 ２ Ｓｙ ｋ ３ ＰＩ ３Ｋ ４ Ａｋ Ａ ＰＴＣＬ ＮＯＳ Ｂ ＡＩ ＴＬ Ｃ ＥＮＫＴＬ Ｄ ＡＬＣＬ

117 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1143 表 1 Syk PI3K Akt 在 PTCL 及 RLH 中 的 表 达 类 型 n Syk PI3K Akt + 阳 性 率 (%) P 值 + 阳 性 率 (%) P 值 + 阳 性 率 (%) P 值 PTCL PTCL NOS AITL ENKTL ALCL RLH 理 因 素 间 的 关 系 Syk 表 达 与 临 床 分 期 血 清 乳 酸 脱 氢 酶 (lacticdehydrogenase,ldh) 水 平 有 关 (P< 0 05), 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 一 般 状 况 (performancestatus,ps) 评 分 国 际 预 后 指 数 (in ternationalprognosticindex,ipi) 评 分 无 关 (P > 0 05);PI3K 和 Akt 表 达 与 临 床 病 理 因 素 均 无 关 (P >0 05), 见 表 2 PTCL 中 的 表 达 未 见 相 关 关 系 (r=0 154,P > 0 05), 见 表 5 表 3 PTCL 中 Syk 和 PI3K 蛋 白 表 达 之 间 的 关 系 Syk n PI3K 表 2 PTCL 中 Syk PI3K Akt 的 表 达 与 临 床 病 理 因 素 之 间 的 关 系 项 目 性 别 n Syk - + P 值 PI3K - + P 值 Akt - + P 值 男 女 年 龄 ( 岁 ) < 肿 块 大 小 (cm) < B 症 状 无 有 AnnArbor 分 期 Ⅰ ~Ⅱ Ⅲ ~Ⅳ LDH(U/L) < PS 评 分 0~ IPI 指 数 0~ ~ 有 部 分 相 关 资 料 缺 失 2.3 PTCL 中 Syk 蛋 白 的 表 达 与 PI3K Akt 蛋 白 表 达 的 相 关 性 Pearson 检 验 结 果 显 示,Syk PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 有 相 关 关 系 (r=0 229,P< 0 05), 见 表 3;Syk Akt 在 PTCL 中 的 表 达 未 见 相 关 关 系 (r=-0 049,P>0 05), 见 表 4;PI3K Akt 在 Syk 表 4 PTCL 中 Syk 和 Akt 蛋 白 表 达 之 间 的 关 系 n - Akt PI3K 表 5 PTCL 中 PI3K 和 Akt 蛋 白 表 达 之 间 的 关 系 n - Akt 讨 论 PTCL 是 我 国 常 见 的 淋 巴 瘤 类 型 之 一, 恶 性 程 度 高, 治 疗 效 果 不 理 想, 预 后 较 差, 其 发 生 发 展 是 一 个 涉 及 多 基 因 和 多 步 骤 的 复 杂 过 程, 其 中 癌 基 因 的 激 活 和 ( 或 ) 抑 癌 基 因 的 失 活 起 着 关 键 作 用 Syk 最 早 由 日 本 学 者 [10] 1991 年 从 猪 脾 cdna 中 克 隆 出 来 的, 该 基 因 位 于 人 类 染 色 体 9q22, 分 子 量 为 , 由 629 个 氨 基 酸 组 成, 含 1 个 内 含 子 和 2 个 外 显 子, 与 猪 Syk 基 因 具 有 最 大 的 同 源 性,93% 的 氨 基 酸 序 列 相 同 Syk 基 因 在 正 常 的 乳 腺 上 皮 细 胞 消 化 道 上 皮 细 胞 肝 细 胞 等 部 位 广 泛 表 达 近 年 来 一 些 研 [2-4] 究 表 明,Syk 是 控 制 多 种 细 胞 生 理 功 能 的 关 键 分 子, 与 肿 瘤 的 生 长 转 移 复 发 等 有 关, 在 人 类 肿 瘤 的 发 病 机 制 和 治 疗 等 方 面 的 研 究 中 起 着 重 要 的 作 用 2000 年 Coopmanetal [2] 首 次 研 究 发 现, 在 侵 袭 性 的 乳 腺 癌 细 胞 中 Syk 是 低 表 达 或 不 表 达 的, 在 正 + +

118 1144 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 常 乳 腺 组 织 和 非 侵 袭 性 的 乳 腺 癌 组 织 中 是 高 表 达 的, 其 表 达 的 缺 失 与 乳 腺 癌 细 胞 的 侵 袭 性 呈 负 相 关 [2-4] 后 来 的 一 些 研 究 也 显 示 Syk 在 乳 腺 癌 胃 癌 胰 腺 癌 等 的 表 达 是 降 低 或 缺 失,Syk 在 上 皮 性 肿 瘤 中 [11] 可 能 起 抑 癌 基 因 的 作 用 研 究 显 示 Syk 在 B 细 胞 淋 巴 瘤 中 高 表 达, 通 过 选 择 性 的 抑 制 阻 断 Syk 的 表 达, 可 以 抑 制 小 鼠 和 人 B 细 胞 淋 巴 瘤 的 生 长 Chenetal [12] 研 究 发 现,Syk 抑 制 剂 R406 可 以 抑 制 B 细 胞 淋 巴 瘤 细 胞 株 中 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 和 凋 亡 Fruchonetal [13] 实 验 得 出 在 滤 泡 性 淋 巴 瘤 中 基 质 金 属 蛋 白 酶 9(matrixmetaloproteinase 9,MMP 9) 和 血 管 内 皮 生 长 因 子 (vascularendothelialgrowthfac tor,vegf) 为 高 表 达,Syk 可 以 通 过 PI3K 的 介 导 参 与 MMP 9 和 VEGF 的 表 达, 应 用 Syk 抑 制 剂 R788 (fostamatinib) 可 以 抑 制 MMP 9 表 达 抗 血 管 的 生 成, 从 而 对 抗 肿 瘤 的 侵 袭 口 服 Syk 抑 制 剂 已 经 投 入 了 治 疗 B 细 胞 淋 巴 瘤 Ⅰ /Ⅱ 期 临 床 实 验, 治 疗 效 果 显 著 [14] 目 前 关 于 Syk 在 PTCL 中 表 达 的 研 究 较 少 ; Syk PI3K 及 Akt 在 PTCL 中 的 表 达 及 与 临 床 病 理 因 素 的 关 系, 国 内 外 未 见 报 道 Feldmanetal [8] 应 用 免 疫 组 化 Westernblot 和 流 式 细 胞 术 方 法 发 现 Syk 在 PTCL 中 呈 高 表 达, 阳 性 率 为 93%(133/144), 后 应 用 流 式 细 胞 仪 检 测 部 分 PTCL 病 例 发 现 Syk 表 达 在 肿 瘤 细 胞 和 反 应 性 增 生 的 B 细 胞 中, 在 外 周 血 淋 巴 结 和 脾 反 应 性 增 生 的 T 细 胞 中 不 表 达 这 与 上 述 上 皮 性 肿 瘤 中 的 抑 癌 作 用 相 反 本 研 究 采 用 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 Syk PI3K Akt 在 PTCL 组 织 中 的 表 达, 本 实 验 数 据 显 示 Syk 在 84 例 PTCL 组 中 阳 性 表 达 显 著 高 于 对 照 组, 提 示 Syk 在 PTCL 的 发 生 发 展 中 可 能 起 重 要 作 用, 与 Feldmanetal [8] 报 道 结 果 一 致 Syk 在 PTCL 中 的 表 达 与 临 床 因 素 的 关 系 还 不 清 楚, 本 研 究 结 果 显 示 Syk 的 表 达 与 临 床 分 期 及 LDH 水 平 有 关, 与 患 者 性 别 年 龄 肿 块 大 小 B 症 状 PS 评 分 IPI 指 数 无 关, 提 示 Syk 可 能 与 PTCL [15] 的 预 后 有 关 近 期 研 究 显 示 抑 制 T 细 胞 淋 巴 瘤 细 胞 株 中 的 Syk 的 表 达 可 以 诱 导 细 胞 的 凋 亡 并 阻 滞 细 胞 的 增 殖, 推 测 可 能 是 通 过 下 游 的 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen activatedproteinkinases,mapk) PI3K 磷 脂 酶 C γ(phospholipasec γ,plc γ) 起 作 用 的 本 研 究 中 PI3K Akt 在 PTCL 和 RLH 中 的 表 达 差 异 均 无 统 计 学 意 义,Syk 与 PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 呈 正 相 关, 提 示 Syk 在 PTCL 的 发 生 发 展 中 可 能 与 PI3K 的 表 达 有 关 ;Syk 和 PI3K 在 PTCL 中 的 表 达 与 Akt 均 无 明 显 相 关 性,Syk 在 PTCL 中 的 作 用 机 制 还 需 进 一 步 深 入 研 究 参 考 文 献 [1] TurnerM,MeePJ,CosteloPS,etal.Perinatallethalityand blockedb celdevelopmentinmicelackingthetyrosinekinasesyk [J].Nature,1995,378(6554): [2] CoopmanPJ,DoM T,BarthM,etal.TheSyktyrosinekinase suppresesmalignantgrowthofhumanbreastcancercels[j].na ture,2000,406(6797): [3] ZouXP,ZhangB,ZhangXQ,etal.Promoterhypermethylation ofmultiplegenesinearlygastricadenocarcinomaandprecancerous lesions[j].humpathol,2009,40(11): [4] LaytonT,StalensC,GundersonF,etal.Syktyrosinekinaseacts asapancreaticadenocarcinomatumorsuppresorbyregulatingcel lulargrowthandinvasion[j].amjpathol,2009,175(6): [5] MoonKD,PostCB,DurdenDL,etal.Molecularbasisforadi rectinteractionbetweenthesykprotein tyrosinekinaseandphos phoinositide3 kinase[j].jbiolchem,2005,280(2): [6] VivancoI,SawyersCL.Thephosphatidylinositol3 kinase AKT pathwayinhumancancer[j].natrevcancer,2002,2(7): [7] SwerdlowSH,CampoE,HarisNL,etal.WHOclasification oftumoursofhaematopoieticandlymphoidtisues[m].lyon: IARCPres,2008: [8] FeldmanAL,SunDX,LawM E,etal.OverexpresionofSyk tyrosinekinaseinperipheralt cellymphomas[j].leukemia, 2008,22(6): [9] 邢 传 平, 刘 斌, 董 亮. 免 疫 组 织 化 学 标 记 结 果 的 判 断 方 法 [J]. 中 华 病 理 学 杂 志,2001,30(4):318. [10] TaniguchiT,KobayashiT,KondoJ,etal.Molecularcloningofa porcinegenesykthatencodesa72 kdaprotein tyrosinekinase showinghighsusceptibilitytoproteolysis[j].jbiolchem,1991, 266(24): [11]GururajanM,JenningsCD,BondadaS.Cutingedge:constitu tivebcelreceptorsignalingiscriticalforbasalgrowthofblym phoma[j].jimmunol,2006,176(10): [12]ChenL,MontiS,JuszczynskiP,etal.SYK dependenttonicb celreceptorsignalingisarationaltreatmenttargetindifuselarge B cellymphoma[j].blood,2008,111(4): [13] FruchonS,KheiralahS,AlSaatiT,etal.Involvementofthe Syk mtorpathwayinfolicularlymphomacelinvasionandangio genesis[j].leukemia,2012,26(4): [14] FriedbergJW,SharmanJ,SweetenhamJ,etal.InhibitionofSyk withfostamatinibdisodiumhassignificantclinicalactivityinnon Hodgkinlymphomaandchroniclymphocyticleukemia[J].Blood, 2010,115(13): [15] WilcoxRA,SunDX,NovakA,etal.InhibitionofSykprotein tyrosinekinaseinducesapoptosisandblocksproliferationint cel non Hodgkin slymphomacellines[j].leukemia,2010,24 (1):

119 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1145 慢 性 淋 巴 细 胞 性 甲 状 腺 炎 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 临 床 相 关 性 张 懿, 邓 福 生, 刘 政 溶, 韦 后 清, 王 锡 宏, 马 小 鹏, 陈 浩 摘 要 目 的 探 讨 慢 性 淋 巴 细 胞 性 甲 状 腺 炎 (CLT) 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 之 间 的 临 床 相 关 性 方 法 回 顾 性 分 析 647 例 进 行 手 术 的 甲 状 腺 患 者, 研 究 CLT 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 关 系, 分 析 44 例 合 并 有 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 的 临 床 资 料 结 果 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40.7%, 非 CLT 患 者 中 发 病 率 为 18 7%, 两 者 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 中 CLT 和 非 CLT 患 者 TNM 分 期 无 明 显 差 异 结 论 CLT 合 并 甲 状 腺 癌 的 比 例 较 高, 当 B 超 提 示 甲 状 腺 肿 块 有 微 小 钙 化 边 界 不 清 或 颈 部 淋 巴 结 肿 大 时, 应 积 极 诊 治 并 谨 慎 评 估 恶 性 的 可 能 性 CLT 对 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 分 期 无 影 响 关 键 词 甲 状 腺 炎 ; 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 ; 相 关 性 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 卫 生 厅 科 研 基 金 资 助 项 目 ( 编 号 :13ZC007) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 普 通 外 科, 合 肥 作 者 简 介 : 张 懿, 男, 硕 士 研 究 生, 主 治 医 师 ; 邓 福 生, 男, 主 任 医 师, 责 任 作 者,E 中 图 分 类 号 R581.4;R736.1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 慢 性 淋 巴 细 胞 性 甲 状 腺 炎 (chroniclymphocytic thyroiditis,clt) 是 一 种 甲 状 腺 自 身 免 疫 性 疾 病, 近 年 来 发 病 率 明 显 增 高, 且 临 床 上 许 多 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 常 合 并 CLT Pearceetal [1] 发 现 CLT 与 许 多 甲 状 腺 其 他 自 身 免 疫 性 疾 病 以 及 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 共 存, CLT 可 增 加 原 发 性 甲 状 腺 淋 巴 瘤 的 发 病 概 率 [2], CLT 是 否 有 转 化 为 其 他 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 倾 向 目 前 尚 有 争 议 该 研 究 将 调 查 CLT 和 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 之 间 的 关 系, 并 评 估 CLT 对 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 影 响 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 回 顾 性 分 析 2012 年 在 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 甲 乳 外 科 进 行 手 术 的 647 例 甲 状 腺 ExpresionandrelationshipofSyk,PI3K andakt inperipheralt cellymphoma DaiQun 1,2,ZhanHeqin 1,2,CaoLiyu 1,2,etal ( 1 DeptofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofPathology,TheFirst AfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective Toinvestigatetheexpresionofspleentyrosinekinase(Syk),phosphatidylinositol3 kinase (PI3K)andproteinkinaseB(Akt)inpatientswithperipheralT cellymphoma(ptcl)andtheirclinicalsignifi cance.methods ImmunohistochemicalstainingforSyk,PI3KandAktproteinwasusedin84PTCLand30reac tivelymphoidhyperplasia(rlh).results ThepositiveratesofSyk,PI3KandAktwere73 81%,41 67%, 36 90% in84ptcl,and13 33%,33 33%,2 33% in30rlh.theexpresionofsykproteininptclwas significantlyhigherthanthatinrlh(p<0 05).TheexpresionofPI3KandAkthadnosignificantdiferencein PTCLandRLH (P>0 05).Sykexpresionwascorelatedwithserum lacticdehydrogenaselevel(ldh)and clinicstage.pi3kandaktexpresionshowednosignificantcorelationwithsex,age,bulkydisease,bsymptom, performancestatus(ps)score,clinicstage,serum LDH level,andinternationalprognosticindex(ipi)score. SykproteinwaspositivelycorelatedwiththeexpresionofPI3KproteininPTCL.Conclusion TheSykprotein playsanimportantroleinthecarcinogenesisofptcl.itmaybeasociatedwithpi3ksignalingpathway,butnot directlyrelatedtotheexpresionofakt. Keywords peripheralt cellymphoma;syk;pi3k;akt;immunohistochemistry

120 1146 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 患 者, 探 讨 108 例 CLT 患 者 与 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 关 系, 其 中 44 例 合 并 有 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 被 纳 入 研 究 依 据 年 龄 性 别 抗 甲 状 腺 抗 体 抗 甲 状 腺 球 蛋 白 抗 体 术 前 甲 状 腺 B 超 检 查 手 术 方 式, 对 患 者 进 行 评 价 CLT 诊 断 须 符 合 严 格 的 形 态 学 标 准, 如 弥 漫 性 淋 巴 细 胞 浸 润 多 发 淋 巴 滤 泡 小 叶 状 增 生 小 叶 间 纤 维 化 及 嗜 酸 细 胞 化 生 排 除 伴 局 灶 淋 巴 细 胞 浸 润 的 甲 状 腺 炎 患 者 1.2 统 计 学 处 理 使 用 SPSS11 5 统 计 软 件 进 行 分 析, 计 量 数 据 的 统 计 学 分 析 使 用 t 检 验, 计 数 数 据 使 用 χ 2 检 验 2 结 果 2.1 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 在 组 间 的 分 布 及 一 般 特 点 647 例 甲 状 腺 患 者 中, 女 509 例, 男 138 例, 女 / 男 比 例 为 3 70 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 共 144 例, 年 龄 20 ~82(46 9±13 9) 岁, 女 / 男 比 例 为 例 被 诊 断 为 CLT, 女 101 例, 男 7 例, 女 / 男 比 例 为 例 同 时 患 有 CLT 和 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤, 女 41 例, 男 3 例, 年 龄 15~71(43 3±13 2) 岁 44 例 当 中 乳 头 状 癌 41 例 (93 2%), 髓 样 癌 2 例 (4 4%), 淋 巴 瘤 1 例 (2 3%) 2.2 CLT 和 非 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 发 病 率 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40 7%, 而 非 CLT 患 者 中 发 病 率 为 18 6%, 差 异 有 统 计 学 意 义 (χ 2 =25 599,P=0 000) 见 表 1 表 1 CLT 及 非 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 百 分 比 [n(%)] 项 目 甲 状 腺 恶 性 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 (+) 肿 瘤 (-) 合 计 CLT(+) 44(40.7) 64(59.3) 108(16.9) CLT(-) 100(18.6) 439(81.4) 539(83.1) 合 计 144(22.4) 503(77.6) 647(100.0) 2.3 CLT 和 非 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 TNM 分 期 在 CLT(+) 和 CLT(-) 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 中, 主 要 为 Ⅰ 期 和 Ⅱ 期 患 者, 肿 瘤 分 期 差 异 无 统 计 学 意 义 (χ 2 =0 365,P>0 05), 见 表 例 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 合 并 CLT 患 者 的 辅 助 检 查 结 果 及 手 术 方 式 37 例 患 者 行 血 清 学 检 查, 其 中 甲 状 腺 过 氧 化 酶 抗 体 升 高 23 例 (62 2%), 甲 状 腺 球 蛋 白 抗 体 升 高 32 例 (86 5%) 44 例 患 者 术 前 超 声 检 查 均 发 现 结 节 样 增 生, 单 发 结 节 15 例 (34 1%), 多 发 结 节 29 例 (65 9%),25 例 伴 有 点 状 钙 化 (56 8%),18 例 边 界 欠 清 不 规 则 (40 9%),23 表 2 甲 状 腺 CLT(+) 和 CLT(-) 的 恶 性 肿 瘤 的 TNM 分 期 [n(%)] 甲 状 腺 恶 性 甲 状 腺 恶 性 TNM 分 期 肿 瘤 (+)CLT(44) 肿 瘤 (-)CLT(100) Ⅰ 期 26(31.3) 57(68.7) P 值 Ⅱ 期 11(32.4) 23(67.6) Ⅲ 期 4(26.7) 11(73.3) ⅣA 期 3(25.0) 9(75.0) 例 伴 颈 部 淋 巴 结 肿 大 (52 3%) 44 例 同 时 患 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 中, 行 单 侧 腺 叶 切 除 及 中 央 区 淋 巴 结 清 扫 13 例, 单 侧 腺 叶 对 侧 腺 叶 次 全 切 除 中 央 区 淋 巴 结 清 扫 10 例, 双 侧 全 切 及 中 央 区 淋 巴 结 清 扫 4 例, 单 侧 腺 叶 切 除 及 单 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 3 例, 单 侧 腺 叶 对 侧 次 全 切 除 单 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 6 例, 双 侧 腺 叶 切 除 及 单 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 4 例, 双 侧 全 切 及 双 侧 颈 部 淋 巴 结 清 扫 4 例 术 后 8 例 接 受 碘 131 治 疗, 所 有 患 者 术 后 口 服 左 旋 甲 状 腺 素 钠 片 行 内 分 泌 治 疗, 并 定 期 复 查 随 访 10~22 个 月, 平 均 15 个 月, 无 复 发 及 死 亡 病 例 3 讨 论 CLT 和 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 关 系 在 1955 年 由 Daileyetal [3] [4] 首 次 提 出, 不 同 研 究 表 明,CLT 患 者 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 0 5% ~23.0%,Pezola etal [5] 报 道 CLT 患 者 中 甲 状 腺 癌 患 病 率 明 显 高 于 无 合 并 甲 状 腺 炎 患 者 Repplingeretal [6] 发 现 CLT 患 者 中 甲 状 腺 乳 头 状 癌 患 病 率 显 著 升 高 本 研 究 显 示 CLT 患 者 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40 7%, 而 非 CLT 患 者 中 发 病 率 为 18 6%, 差 异 有 统 计 学 意 义 这 提 示 当 有 甲 状 腺 结 节 怀 疑 合 并 CLT 时, 合 并 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 可 能 性 明 显 增 加 至 于 甲 状 腺 炎 是 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 的 原 因 或 是 结 果 目 前 尚 不 明 确, 可 能 原 因 为 CLT 通 过 慢 性 淋 巴 细 胞 浸 润 和 甲 状 腺 激 素 刺 激, 致 使 细 胞 坏 死 有 丝 分 裂 加 强 和 滤 泡 上 皮 增 生, 或 伴 有 自 身 抗 肿 瘤 免 疫 监 督 机 制 紊 乱, 致 使 向 恶 [7] 性 肿 瘤 转 化 而 有 报 道 认 为 CLT 不 是 一 种 癌 前 病 变, 淋 巴 细 胞 浸 润 是 一 种 良 好 征 象, 是 针 对 甲 状 腺 肿 瘤 启 动 的 自 身 免 疫 机 制 而 本 组 中 CLT 患 者 甲 [4] 状 腺 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 40 7%, 高 于 文 献 报 道, 其 原 因 可 能 为 我 科 手 术 指 征 把 握 较 严 格, 主 要 是 术 前 有 甲 状 腺 结 节 并 怀 疑 为 恶 性 患 者 在 乳 腺 和 肾 脏 恶 性 肿 瘤 中, 淋 巴 细 胞 浸 润 被 认 为 肿 瘤 具 有 更 大 的 侵 袭 性 的 标 志, 但 在 肝 癌 和 恶 性 黑 色 素 瘤 中, 伴 淋 巴 细 胞 浸 润 却 被 认 为 具 有 较 为 良 好 的 预 后 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤, 特 别 是 甲 状 腺 乳 头 状

121 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1147 癌, 经 常 会 伴 有 淋 巴 细 胞 浸 润 Jeongetal [8] 发 现 淋 巴 细 胞 浸 润 不 是 一 个 影 响 预 后 的 独 立 因 素, 并 不 能 降 低 肿 瘤 复 发 和 远 处 转 移 的 机 率 本 研 究 结 果 显 示 CLT(+) 和 CLT(-) 组 中 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 TNM 分 期 差 异 无 统 计 学 意 义, 提 示 CLT 可 能 对 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 分 期 无 影 响 CLT 对 甲 状 腺 预 后 的 影 响 尚 需 大 样 本 的 前 瞻 性 对 照 研 究 [9] 研 究 表 明 并 发 CLT 的 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 主 要 为 甲 状 腺 乳 头 状 癌 44 例 患 者 中 有 41 例 为 甲 状 腺 乳 头 状 癌,2 例 为 髓 样 癌,1 例 为 淋 巴 瘤 144 例 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 中, 另 2 例 髓 样 癌 未 合 并 CLT, 共 有 2 例 甲 状 腺 滤 泡 癌 及 3 例 未 分 化 癌 均 不 伴 有 CLT 本 组 研 究 中,CLT 及 CLT 合 并 甲 状 腺 恶 性 肿 瘤 患 者 中 女 性 发 病 率 均 远 高 于 男 性 40~50 岁 患 [10] 者 发 病 率 升 高, 与 文 献 结 果 一 致 B 超 可 探 及 大 于 3mm 的 甲 状 腺 肿 块, 可 判 断 肿 块 是 囊 性 或 实 性, 帮 助 颈 部 淋 巴 结 定 位 及 辅 助 甲 状 腺 穿 刺, 并 广 泛 运 用 于 甲 状 腺 疾 病 随 访 中 当 B 超 表 现 甲 状 腺 肿 块 有 微 小 钙 化 边 界 不 清 或 颈 部 淋 巴 结 肿 大 时, 均 提 示 肿 块 恶 性 可 能 参 考 文 献 [1] PearceEN,FarwelAP,BravermanLE.Thyroiditis[J].NEn gljmed,2003,348(26): [2] KatoI,TajimaK,SuchiT,etal.Chronicthyroiditisasariskfac torofb cellymphomainthethyroidgland[j].jpnjcancer Res,1985,76(11): [3] DaileyM,LindsayS,SkahenR.Relationofthyroidneoplasmsto Hashi motodiseaseofthethyroidgland[j].ama ArchSurg, 1955,70(2): [4] Matesa AnicD,MatesaN,DabelicN,etal.Coexistenceofpapil larycarcinomaandhashimoto sthyroiditis[j].actaclincroat, 2009,48(1):9-12. [5] PezolaA,LataruloS,MilelaM,etal.Theasociationbetween diferentiatedthyroidcarcinomaandchroniclymphocyticthyroiditis [J].AmSurg,2012,78(12): [6] RepplingerD,BargrenA,ZhangYW,etal.IsHashimoto sthy roiditisariskfactorforpapilarythyroidcancer?[j].jsurgres, 2008,150(1): [7] ChuiM H,CasolCA,AsaSL,etal.Folicularepithelialdyspla siaofthethyroid:morphologicalandimmunohistochemicalcharac terizationofaputativepreneoplasticlesiontopapilarythyroidcar cinomainchroniclymphocyticthyroiditis[j].virchowsarch, 2013,462(5): [8] JeongJS,KimHK,LeeCR,etal.Coexistenceofchroniclym phocyticthyroiditiswithpapilarythyroidcarcinoma:clinicalmani festationandprognosticoutcome[j].jkoreanmedsci,2012,27 (8): [9] JaraSM,CarsonKA,PaiSI,etal.Therelationshipbetweenchro niclymphocyticthyroiditisandcentralnecklymphnodemetastasis innorthamericanpatientswithpapilarythyroidcarcinoma[j]. Surgery,2013,154(6): [10]YoonYH,KimHJ,LeeJW,etal.Theclinicopathologicdifer encesinpapilarythyroidcarcinomawithorwithoutco existing chroniclymphocyticthyroiditis[j].eurarchotorhinolaryngol, 2012,269(3): ClinicalcorrelationalresearchbetweenCLTand malignanttumoursofthethyroid ZhangYi,DengFusheng,LiuZhengrong,etal (DeptofGeneralSurgery,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Objective TodiscustheclinicalcorelationbetweenCLTandmalignanttumoursofthethyroid. Methods Inthisstudy,patientsoperatedonforthyroiddiseasesinAnhuiProvincialHospitalin2012wereinvesti gatedretrospectively.patientsdiagnosedashavingcltwereinvestigatedforanyconcurentmalignantneoplasm. 44patientsinwhomCLTandthyroidmalignancywerecoexistingwererecruitedinthestudy.Results Inourstud y,therateofmalignancyagainstthebackgroundofcltwas40.7%,whiletherateinthegroupswithoutcltwas 18.7%,withastatisticalysignificantdiferencebetweenthegroups(P<0 05).Therewasnostatisticaldiference intnm clasificationbetweenthegroupswithandwithoutclt.conclusion Therateofthroiditiscoexistentwith thyroidcarcinomaishigher.thepatientswithmicrocalcifications,irgularborderorcervicallymphadenectasisin preoperativesonogramshouldbeevaluatedmorecarefulyintermsofmalignancy.clthasnoefectonclinicaltnm clasificationofmalignanttumoursofthyroid. Keywords thyroiditis;malignantneoplasmofthyroidgland;corelation

122 １１４８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 经验与体会 琼脂石蜡双包埋法在小血管光镜制片中的优势 宾业健１ 黄华冰１ 洪燕语１ 伍 源２ 程盼盼１ 卢明科３ 齐忠权１ 摘要 预先将固定好的小血管包埋到 １ ５ 琼脂中 调整好 见图 ２ 其位置和管腔 采用自制的琼脂包埋模子可以方便快捷的 获得结构完整大小适中的组织琼脂块 再按照常规的的脱 水包埋程序做石蜡包埋 最后切片染色 结果显示 琼脂石 蜡双包埋法保持了小血管管腔的完整性和规则性 内膜等组 织结构几乎没有损坏和丢失 最终得到较为理想的光镜切 片 关键词 小血管 琼脂 石蜡 双包埋法 光镜切片 中图分类号 Ｒ３ ３ １ 图 １ 包埋用小血管 文献标志码 Ａ 文章编号 １ １ ４ ９ ２ ２ １ ４ ８ １ １ ４ ８ ３ Ａ 小动脉直径约 １ｍｍ Ｂ 长度约 １ ３ｃ ｍ 小血管因其体积微小 组织薄弱 按照常规的石 蜡包埋方法 在脱水透明浸蜡等过程中 由于器械夹 持 加热等因素 很容易塌陷变形甚至损坏 最终得 不到管腔较为规则和完整的血管光镜切片 为了解 决这一困难 该研究采用琼脂预先包埋小血管再进 行常规石蜡包埋制作光镜切片的方法和效果 １ ２ 并与单纯石蜡包埋法得到的结果进行了比较 现报 道如下 图 ２ 小血管预处理 １ 材料与方法 Ａ 将小动脉均分成两段 Ｂ 预先用伊红染色便于观察 １ １ 材料与试剂 以 ４ 多聚甲醛固定好的昆明 ３ 鼠胸主动脉为例 其血管管径约 １ｍｍ 长度约 １ ｃ ｍ 见图 １ 普通琼脂粉 规格为 １ｍｌ的一次性普 通医用注射器 眼科剪 眼科镊 大头针 常规脱水包 埋及 ＨＥ染色所用试剂等 １ ２ ２ 琼脂预包埋 准备１ｍｌ 注射器 切去注射器 乳头靠后部分 将普通琼脂粉预先配成 １ ５ 琼脂 粉悬浊液 再放入微波炉中低火加热至 ５ 左右成 液体状态 再将处理过的注射器活塞往外拉出 １ ５ ２ ｍｌ距离作为模子 用移液枪将熔化的琼脂液 １ ２ 操作步骤 １ ２ １ 小血管预处理 将固定好的小血管分割成 ５ １ ｃ ｍ若干段 或根据需要选 择 包 埋 长 度 为了便于观察血管的位置 预先用伊红将血管染红 加入注射器前端空缺处 并迅速将小血管段放入琼 脂中 用缝衣针或大头针调整血管在琼脂中的位置 尽量使血管段居中 并用针尖小心探入血管管腔内 将其塌陷的部分挑起来使管腔成为规则的圆形腔 待琼脂冷却凝固后 将注射器活塞往前推出获得琼 ２１ ４ ３ ２ 接收 基金项目 国家重点基础研究发展规划项目资助 ９ ７３计划项目 编 １ ２ ３ 脱水再包埋 包含有血管段的琼脂柱作为 ２ １ ２ＣＢＡ１ ３ ３ 号 １ 脂柱 见图 ３ ３ 作者单位 厦 门 大 学 器 官 移 植 研 究 所 生 命 科 学 学 院 厦 门 ３ ６ １１ ２ 一个整体再按照常规的脱水包埋程序做石蜡包埋 最后一步石蜡包埋时将琼脂柱竖立放于石蜡包埋模 ２ 厦门大学附属中山医院心外科 厦门 ３６ １ １ ４ 作者简介 宾业健 男 本科 齐忠权 男 博士后 教授 博士生导师 责任作者 Ｅ ｍａ ｌ ｚ ｑｑ ｘ ｍｕ ｄ ｕ ｃ ｎ 子中 并在其周围充满熔化的石蜡 便于后期切片 １ ２ ４ 切片和染色 包埋完毕后切片 石蜡切片厚 度为 ３μｍ 染色采用常规 ＨＥ染色 ３ ４

123 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１４９ ３ 讨论 研究 ５ ７ 表明琼脂石蜡双埋法在制作一些精细 组织的光镜切片上有着很大优势 该研究应用在小 血管的包埋和制片上也证实了这一点 采用琼脂石 蜡双包埋法可保持小血管的管腔完整性和规则性 小血管内膜等组织结构保存较完好 几乎没有损坏 和丢失 切片得到较为理想的结果 然而采用单纯 石蜡包埋法包埋的小血管 在脱水包埋等操作过程 中 血管的管壁容易贴在一起 且容易变形甚至破 裂 最终得不到令人满意的光镜切片 琼脂块脱水浸蜡加热之后体积会固缩一半以 上 然而为了保证脱水完全 琼脂包埋块又不能过 大 本实验证明课题组自制的 １ｍｌ注射器琼脂包埋 模子较为适合管径为 １ ３ｍｍ的小血管包埋所用 体积大小适中 且可以极为方便的将包埋琼脂块从 模子中取出 避免了用器械从其他类型的琼脂包埋 模子中取出琼脂块时 容易将已经包好组织的琼脂 块夹烂碰损的情况发生 图 ３ 琼脂包埋步骤 Ａ 自制琼脂包埋模子 Ｂ 血管包埋入琼脂中 调整好血管在琼 脂块中的位置和管腔形状 Ｃ 将琼脂块从模子中推出 Ｄ 得到琼脂 组织块 包埋所用琼脂浓度不宜过高也不宜过低 高浓 度琼脂 ３ 以上 使用相同剂量的脱水剂不能完 全脱水 最终琼脂和石蜡不能很好的融合在一起 无 法正常切片 推测原因可能是琼脂液密度过高导致 ２ 结果 琼脂块内部分子间隙过窄 脱水剂等不易浸入其内 琼脂石蜡双包埋法包埋的小血管组织块切片染 部 经过浓度梯度对照试验表明质量分数为 １ ５ 色后 可观察到管腔完整和规则的血管横断面 血管 琼脂用于包埋较为合适 琼脂浓度过低则不能很好 内膜等组织结构保存较完好 几乎没有损坏和丢失 的凝固 而且脱水之后严重固缩亦不能获得良好的 见图 ４Ａ 而单纯石蜡包埋法包埋的小血管组织块 效果 切片染色后 可观察到血管管壁打折和贴附在一起 变形甚至破裂的现象 见图 ４Ｂ Ｃ 用琼脂预包埋小血管最大的优势是在琼脂包埋 血管时可以调整和恢复在取用或固定等操作时发生 塌陷变形的血管原有的圆形管腔 且在整个脱水包 埋过程中都起到一个很好的支撑和保护作用 使血 管在其中不易被器械夹损 也不容易因加热等因素 而变形和损坏 更为重要的一点是切片时遗留的琼 脂具有黏附作用 染色洗片时不易掉片 琼脂石蜡双包埋法还可适用于组织工程血管的 包埋 因为血管脱细胞后失去弹性支撑会变得更加 图 ４ 琼脂石 蜡双 包埋法 与常规 柔软 管腔更容易塌陷 本课题组用该方法包埋组 石蜡包埋法得到的血管切片对比 织工程血管亦获得良好的效果 ＨＥ ４ Ａ 双 包 埋 法 得 到 的 血 管 切 片 Ｂ Ｃ 单纯石蜡包埋得到的血 管切片 琼脂石蜡双包埋法弥补了单纯石蜡包埋小血管 时易损坏血管以致难以获得管腔完整和规则的血管 光镜切片的不足 在小血管的光镜制片上具有明显的 优势 该方法操作简便快捷 使用材料价格低廉 对 条件一般的实验室开展动物实验有一定的实用价值

124 1150 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 一 次 性 充 填 感 染 根 管 的 疗 效 分 析 律 娜, 孙 明, 韩 晓 兰 摘 要 选 取 临 床 诊 断 为 牙 髓 坏 死 急 性 或 慢 性 根 尖 周 炎 的 单 根 管 患 牙 105 颗 作 为 研 究 对 象 一 次 组 51 颗, 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 一 次 性 充 填 二 次 组 54 颗, 两 次 疗 程 间 使 用 氢 氧 化 钙 封 药 7d, 常 规 冷 侧 压 法 行 根 管 充 填 术 后 6 个 月 1 年 一 次 组 的 治 愈 率 为 66 67% 94 12%, 二 次 组 分 别 为 59 26% 77 78%, 两 组 患 牙 在 术 后 6 个 月 治 愈 率 差 异 无 统 计 学 意 义, 术 后 1 年 治 愈 率 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 在 感 染 根 管 中 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 一 次 性 充 填 的 远 期 治 愈 效 果 较 好, 具 有 一 定 的 临 床 可 行 性 关 键 词 热 牙 胶 ; 一 次 性 根 管 充 填 ; 感 染 根 管 ; 疼 痛 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 院 内 青 年 基 金 ( 编 号 : 2010KJ20) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 口 腔 科, 合 肥 作 者 简 介 : 律 娜, 女, 主 治 医 师 ; 韩 晓 兰, 女, 副 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: @qq.com 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 根 管 治 疗 术 通 常 包 括 根 管 预 备 根 管 消 毒 和 根 管 充 填 3 个 步 骤 将 以 上 3 个 步 骤 在 一 次 诊 疗 内 完 成, 称 为 一 次 性 根 管 治 疗 术 其 优 点 包 括 : 减 少 患 者 就 诊 次 数, 缩 短 治 疗 过 程, 减 少 治 疗 过 程 间 细 菌 感 染 的 机 会, 提 高 患 者 依 从 性 对 于 非 感 染 性 根 管 采 用 一 次 法 治 疗 临 床 异 议 较 少, 但 对 于 感 染 性 根 管 的 临 床 应 用 尚 存 在 争 议 E&Q 根 管 充 填 系 统 是 热 牙 胶 垂 直 加 压 充 填 系 统, 该 系 统 包 含 了 热 牙 胶 连 续 波 充 填 和 热 牙 胶 高 温 注 射 的 功 能, 可 以 准 确 的 控 制 器 械 尖 端 温 度 和 加 热 时 间, 达 到 精 确 三 维 根 管 充 填, 能 够 有 效 消 灭 死 腔, 防 治 感 染 该 研 究 的 目 的 旨 在 感 染 根 管 中 评 价 E&Q 充 填 系 统 一 次 性 根 管 治 疗 的 临 床 应 用 价 值, 为 新 技 术 的 应 用 提 供 临 床 资 料 和 经 验 参 考 文 献 [1] 曾 晓 蓓, 张 立 新, 甄 亚 平, 等. 制 备 组 织 石 蜡 切 片 琼 脂 预 包 埋 法 的 应 用 性 探 讨 [J]. 实 验 技 术 与 管 理,2008,25(12):52-3, 57. [2] 吴 中 华. 动 物 组 织 石 蜡 切 片 的 琼 脂 预 包 埋 法 [J]. 黄 冈 师 专 学 报,1998,18(4):66-8. [3] 刘 岩, 吴 秉 铨, 钟 镐 镐, 等. 琼 脂 石 蜡 双 包 埋 和 免 疫 细 胞 化 学 染 色 的 细 胞 学 应 用 [J]. 诊 断 病 理 学 杂 志,2013,20(3): [4] 王 可 耕, 曾 庆 仁, 张 愉 快, 等. 日 本 血 吸 虫 琼 脂 - 石 蜡 双 包 埋 纵 向 切 片 的 制 备 [J]. 中 国 寄 生 虫 学 与 寄 生 虫 病 杂 志,2012,30 (5): [5] 张 月, 康 健. 琼 脂 石 蜡 双 包 埋 切 片 在 胸 水 细 胞 学 诊 断 中 的 应 用 [J]. 解 剖 科 学 进 展,2008,14(4): [6] 吴 庚 利, 周 伊, 白 高 玉, 等. 学 生 完 成 石 蜡 切 片 及 HE 染 色 操 作 对 形 态 实 验 教 学 的 作 用 分 析 [J]. 吉 林 医 学,2013,34 (5): [7] 蔡 晓 雯, 沈 武 成. 石 蜡 切 片 HE 染 色 的 体 会 [J]. 医 药 论 坛 杂 志,2011,32(1): Advantagesofdouble embeddingwithagarandparafin inmakinglightmicroscopeslicesofsmalvesels BinYejian,HuangHuabing,HongYanyu,etal (OrganTransplantationInstituteofXiamenUniversity,Xiamen ) Abstract Thefixedsmalveselswerepre embeddedinto1 5% agarinadvance,anditspositionandlumenwere adjustedwel.byusingself madeagarembeddingmould,theagarblockincompletestructureandrightsizecould beobtainedconveniently.thenparafinembeddingwasdoneaccordingtotheconventionaldehydrationandembed dingprocedure,andstainingwasthelaststep.theresultsindicatedthat,byusingthedoubleembeddingmethod, theintegrityoflumenwaskept,theintimaandothertisuesofveselwerenotdamagedandlost,theideallightmi croscopeslicesweregotenultimately. Keywords smalvesels;agar;parafin;doubleembeddingmethod;lightmicroscopeslices

125 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 材 料 与 方 法 1.1 病 例 选 择 2011 年 1 月 ~2011 年 12 月 在 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 口 腔 科 就 诊 的 患 者 将 明 确 诊 断 的 患 牙 按 照 首 次 就 诊 时 间 分 为 两 组, 将 第 1 2 周 的 病 例 纳 入 一 次 根 管 治 疗 组 ( 简 称 一 次 组 ), 第 3 4 周 的 病 例 纳 入 二 次 根 管 治 疗 组 ( 疗 程 间 使 用 氢 氧 化 钙 封 药 7d, 简 称 二 次 组 ), 依 此 类 推,4 周 1 次 循 环 一 次 组 患 牙 51 颗, 男 20 例, 女 31 例, 年 龄 17 ~67(43 0±11 6) 岁 ; 二 次 组 患 牙 54 颗, 男 22 例, 女 32 例, 年 龄 20~68(44 6±12 2) 岁 患 牙 纳 入 标 准 : 临 床 诊 断 为 牙 髓 坏 死 急 性 或 慢 性 根 尖 周 炎 的 单 根 管 患 牙 排 除 标 准 : 患 者 伴 有 全 身 系 统 性 疾 病, 不 能 长 时 间 耐 受 椅 位 时 间 ; 根 管 内 炎 性 渗 出 物 无 法 有 效 控 制, 急 性 根 尖 周 炎 伴 有 颌 面 部 间 隙 感 染, 根 管 再 治 疗 的 患 牙 术 前 向 患 者 交 待 根 管 治 疗 过 程 及 术 中 术 后 可 能 出 现 的 并 发 症, 取 得 患 者 知 情 同 意 1.2 临 床 检 查 记 录 问 诊 望 诊 探 诊 叩 诊 触 诊 嗅 诊 咬 诊 松 动 度 及 牙 髓 状 态 判 定 结 果 [1] 1.3 疼 痛 评 定 疼 痛 自 评 标 准 患 者 根 据 自 身 疼 痛 感 受 打 分, 在 记 录 卡 上 记 录 疼 痛 情 况 采 用 VAS 疼 痛 标 尺 法 [2], 分 为 以 下 4 类 :0 分 记 为 无 疼 痛 ;1~3 分 记 为 轻 度 疼 痛 ;4~7 分 记 为 中 度 疼 痛 ;8~10 分 记 为 重 度 疼 痛 统 计 分 析 结 果 位 于 2 个 分 值 之 间 的, 记 录 较 高 的 分 值 一 次 组 记 录 术 前 术 后 即 刻 到 术 后 第 7 天 复 诊 时 的 疼 痛 情 况 二 次 组 分 别 记 录 术 前 每 次 治 疗 后 即 刻 至 第 7 天 复 诊 时 的 疼 痛 情 况 临 床 评 定 由 同 一 名 有 临 床 经 验 的 专 业 医 师 对 牙 齿 进 行 检 查, 记 录 患 牙 的 疼 痛 情 况 无 痛 : 临 床 检 查 无 明 显 不 适 (-); 轻 度 疼 痛 : 叩 扪 咬 诊 略 有 不 适 或 疼 痛 (+); 中 度 疼 痛 : 叩 诊 疼 痛, 或 扪 咬 诊 疼 痛 ( ); 重 度 疼 痛 : 叩 诊 疼 痛 ( ), 或 不 能 咬 合 1.4 治 疗 步 骤 通 过 病 史 采 集 以 及 相 关 的 术 前 检 查, 由 患 者 根 据 自 身 感 受 在 疼 痛 记 录 卡 上 记 录 术 前 疼 痛 分 值 术 前 拍 摄 X 线 牙 片, 上 橡 皮 障, 根 尖 定 位 仪 确 定 工 作 长 度, 采 用 ProTaper 机 用 镍 钛 器 械 和 冠 根 向 预 备 技 术 进 行 根 管 预 备 预 备 过 程 中 配 合 使 用 17%EDTA 凝 胶,4% 次 氯 酸 钠 和 3% 过 氧 化 氢 进 行 根 管 交 替 冲 洗 一 次 组 根 管 应 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 垂 直 加 压 充 填 根 管 二 次 组 在 根 管 预 备 后 使 用 氢 氧 化 钙 封 药 7d, 根 管 充 填 采 用 常 规 冷 侧 压 法, 充 填 材 料 为 AHPlus 根 充 糊 剂 和 牙 胶 尖 术 后 拍 摄 X 线 片, 要 求 充 填 严 致 密 且 为 恰 填 均 由 同 一 名 临 床 医 师 对 所 有 患 者 进 行 根 管 治 疗 1.5 疗 效 评 定 X 线 牙 片 评 定 根 尖 周 指 数 (periapicalindex, PAI) 术 前 和 术 后 6 个 月 1 年 的 X 线 片 经 编 号 后 盲 法 评 片, 均 由 同 一 名 口 腔 放 射 医 师 评 定 将 PAI 按 5 个 等 级 分 类 标 准 记 分 [3] 每 张 X 线 片 均 读 3 次, 取 两 次 相 同 的 结 果 作 为 评 定 结 果 综 合 疗 效 评 估 术 前 术 后 6 个 月 术 后 1 年 采 用 X 线 牙 片 结 合 临 床 检 查 结 果 进 行 综 合 评 估 综 合 疗 效 评 估 分 为 3 级 : 治 愈 有 效 和 失 败 治 愈 : 无 不 适 主 诉,PAI 降 为 1 级 ~2 级 有 效 : 无 不 适 主 诉,PAI 数 值 维 持 不 变 或 下 降 失 败 : 有 不 适 主 诉, 临 床 检 查 窦 道 未 愈 或 复 发, 牙 齿 松 动,PAI 上 升 1.6 统 计 学 处 理 采 用 SPSS19 0 统 计 软 件 进 行 分 析 秩 和 检 验 比 较 两 组 术 前 和 术 后 疼 痛 的 组 间 差 异,χ 2 检 验 比 较 两 组 术 后 6 个 月 1 年 治 愈 率 的 组 间 差 异 2 结 果 2.1 疼 痛 评 估 疼 痛 自 我 评 定 术 前 两 组 患 牙 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 601), 一 次 组 术 后 第 7 天 分 别 和 二 次 组 第 1 次 第 2 次 术 后 第 7 天 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 324;P= 0 383) 见 表 1 表 1 两 组 根 管 治 疗 患 者 术 前 和 术 后 自 我 评 定 疼 痛 情 况 [n(%)] 时 间 一 次 组 二 次 组 术 前 术 后 术 前 第 1 次 术 后 第 2 次 术 后 无 痛 18(35.29) 44(86.28) 23(42.59) 40(74.08) 48(88.89) 轻 度 疼 痛 15(29.41) 4(7.84) 12(22.22) 8(14.81) 2(3.70) 中 度 疼 痛 13(25.49) 2(3.92) 15(27.78) 5(9.26) 3(5.56) 重 度 疼 痛 5(9.81) 1(1.96) 4(7.41) 1(1.85) 1(1.85) 疼 痛 临 床 评 定 术 前 两 组 患 牙 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 947), 一 次 组 术 后 第 7 天 分 别 和 二 次 组 第 1 次 第 2 次 治 疗 术 后 第 7 天 各 级 疼 痛 的 构 成 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P= 0 320,P=0 108) 见 表 综 合 疗 效 评 估 两 组 患 牙 在 术 后 6 个 月 治 愈 率 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (χ 2 =0 616,P=0 432) 术 后 1 年 的 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (χ 2 =4 462,P =0 035) 见 表 典 型 病 例 1 患 者, 男,54 岁 主 诉 : 右 下 颌 后 牙 不 适 数 月 余 临 床 检 查 :45 颈 部 充 填 物, 叩 痛

126 1152 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 2 两 组 根 管 治 疗 患 者 术 前 和 术 后 临 床 评 定 疼 痛 情 况 [n(%)] 疼 痛 级 别 一 次 组 二 次 组 术 前 术 后 术 前 第 1 次 术 后 第 2 次 术 后 无 痛 15(29.41) 42(82.35) 19(35.19) 40(74.08) 50(92.59) 轻 度 疼 痛 19(37.25) 8(15.69) 13(24.07) 13(24.07) 4(7.41) 中 度 疼 痛 10(19.61) 1(1.96) 14(25.93) 1(1.85) 0 重 度 疼 痛 7(13.73) 0 8(14.81) 0 0 表 3 两 组 根 管 治 疗 术 后 6 个 月 1 年 的 疗 效 比 较 [n(%)] 时 间 一 次 组 二 次 组 治 愈 有 效 治 愈 有 效 6 个 月 34(66.67) 17(33.33) 32(59.26) 22(40.74) 1 年 48(94.12) 3(5.88) 42(77.78) 12(22.22) ( ), 松 动 Ⅰ 度,X 线 片 显 示 根 尖 区 阴 影 ( 图 1A) 临 床 诊 断 : 慢 性 根 尖 周 炎 治 疗 方 法 :45 纳 入 一 次 组, 机 用 镍 钛 根 管 预 备,E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 ( 图 1B) 术 后 6 个 月 和 1 年 复 查, 疗 效 良 好,X 线 片 显 示 已 治 愈 ( 图 1C D) 2 患 者, 男,17 岁 前 牙 外 伤 两 年 余 术 前 PAI 为 5 级 ( 图 2A), 一 次 性 根 管 充 填 后,X 线 片 结 果 显 示 根 管 糊 剂 超 填 ( 图 2B) 术 后 1 年 间 的 临 床 随 访 显 示, 患 者 无 不 适 主 诉,PAI 由 5 级 变 为 1 级, 疗 效 评 估 为 治 愈 ( 图 2C D) 图 1 病 例 术 前 和 术 后 X 线 片 A:45 术 前 PAI3 级 ;B: 一 次 性 充 填 ;C: 术 后 6 个 月 PAI3 级 ; D: 术 后 1 年 PAI2 级 3 讨 论 感 染 根 管 残 留 的 微 生 物 清 除 不 彻 底 将 对 根 管 治 疗 的 预 后 产 生 显 著 的 影 响, 彻 底 清 除 根 管 系 统 内 的 感 染 物 质, 是 保 证 根 管 治 疗 成 功 的 关 键 所 在 [4-5] 一 次 性 根 管 治 疗 术 用 于 治 疗 非 感 染 根 管 的 少 有 争 议, 但 对 于 感 染 性 根 管 的 治 疗 目 前 仍 存 在 争 议 为 了 保 证 一 次 性 根 管 治 疗 的 疗 效, 本 研 究 在 临 图 2 病 例 术 前 和 术 后 X 线 片 A:11 术 前 PAI5 级 ;B: 一 次 性 充 填 ;C: 术 后 6 个 月 PAI3 级 ;D: 术 后 1 年 PAI1 级 床 上 采 用 规 范 化 的 治 疗 步 骤 加 强 感 染 根 管 的 控 制 : 橡 皮 障 的 使 用, 机 用 镍 钛 冠 根 向 预 备 以 及 EDTA 与 次 氯 酸 钠 联 合 应 用 结 果 表 明 两 种 方 法 在 术 后 各 级 疼 痛 的 比 较 差 异 均 无 统 计 学 意 义 Figinietal [6] 研 究 发 现 一 次 法 术 后 疼 痛 率 为 3% ~40%, 与 多 次 法 [7] 对 比 中 争 论 较 大 为 此 孙 玉 亮 等 将 一 次 法 与 多 次 法 进 行 了 Cochrane 系 统 评 价, 多 次 法 术 后 1 周 出 现 疼 痛 几 率 比 一 次 法 要 低, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 以 上 表 明 在 控 制 感 染 扩 散 的 条 件 下, 对 于 单 根 管 患 牙 采 用 一 次 性 根 管 治 疗 是 可 行 的 但 由 于 二 次 法 需 要 再 次 进 入 根 管, 出 现 二 次 刺 激, 反 而 增 加 了 其 激 惹 疼 痛 的 机 会 根 管 充 填 能 够 严 密 封 闭 根 管 系 统, 消 灭 死 腔, 杜 绝 来 自 冠 方 或 根 尖 的 各 种 微 渗 漏, 促 进 根 尖 周 组 织 的 愈 合 传 统 的 侧 方 加 压 充 填 不 能 严 密 充 填 主 根 管 副 根 管 及 其 峡 部 [8] 本 研 究 追 踪 观 察 了 两 组 术 后 6 个 月 及 1 年 治 愈 情 况, 结 果 显 示 术 后 6 个 月 两 组 治 愈 率 差 异 无 统 计 学 意 义, 而 术 后 1 年 的 两 组 治 愈 率 差 异 有 统 计 学 意 义 考 虑 其 中 的 因 素 可 能 有 : 1 所 有 根 管 预 备 均 采 用 ProTaper 机 用 镍 钛 预 备, 敞 开 根 管 口, 能 够 较 好 清 理 根 管 上 段 以 及 根 尖 部 的 感 染 物, 根 管 成 形 效 果 好, 有 利 于 根 充 的 严 密, 提 高 了 常 规 冷 牙 胶 侧 方 加 压 充 填 的 短 期 临 床 治 愈 率 (6 个 月 内 ) 2 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 能 够 使 根 管 中

127 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1153 的 根 充 材 料 加 热 软 化, 促 使 其 更 为 致 密 地 充 填 根 管 各 解 剖 区 域, 包 括 充 填 主 根 管 侧 副 根 管 根 管 峡 部 根 尖 分 歧 等 [9], 达 到 根 管 的 三 维 充 填 相 对 于 冷 牙 胶 侧 方 加 压 充 填, 热 牙 胶 连 续 波 充 填 法 在 充 填 单 根 管 前 磨 牙 根 管 的 中 上 部 更 具 优 势 [10] 有 学 者 对 根 管 治 疗 的 患 牙 进 行 1 年 随 访 观 察, 结 果 发 现 病 变 的 根 尖 周 组 织 的 治 愈 率 在 术 后 1 年 达 到 最 高 [11] 本 研 究 显 示 两 组 根 尖 周 病 变 的 治 愈 率 在 根 管 治 疗 1 年 后 才 出 现 较 为 显 著 的 差 异, 提 示 E&Q 连 续 波 热 牙 胶 充 填 系 统 在 根 管 治 疗 的 远 期 疗 效 中 具 有 一 定 的 优 势 根 管 治 疗 失 败 原 因 很 多, 包 括 根 管 超 充, 是 导 致 治 疗 失 败 的 一 个 重 要 原 因 本 研 究 中 发 现 1 例 患 者 术 前 PAI 为 5 级, 一 次 性 根 管 充 填 后,X 线 片 显 示 根 管 超 填 1 年 后 复 查 X 线 片 显 示 PAI 变 为 1 级, 根 尖 部 根 尖 周 投 射 区 消 失, 骨 密 度 增 加, 牙 周 膜 间 隙 均 匀 一 致, 骨 质 结 构 正 常 分 析 其 原 因 可 能 包 括 : 根 充 使 用 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 系 统, 能 够 严 密 的 封 闭 根 管, 杜 绝 了 根 管 内 的 再 感 染 ;AHPlus 树 脂 根 充 糊 剂, 具 有 较 好 流 动 性, 能 够 更 好 的 渗 透 进 牙 本 质 小 管, 增 强 封 闭 性, 从 而 提 高 抑 菌 作 用 提 示 临 床 上 E&Q 热 牙 胶 连 续 波 充 填 系 统 在 根 管 超 填 的 病 例 也 可 能 会 有 较 好 的 远 期 疗 效 参 考 文 献 [1] 樊 明 文, 周 学 东. 牙 体 牙 髓 病 学 [M].4 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2012: [2] WilershausenB,WilershausenI,EhlersV,etal.Aprospective clinicaltrialontheinfluenceofatriamcinolone/demeclocycline andacalciumhydroxidebasedtemporarycementonpainpercep tion[j].headfacemed,2012,5(13):8-9. [3] HuumonenS,OrstavikD.Radiographicfolow upofperiapicalsta tusafterendodontictreatmentofteethwithandwithoutapicalperi odontitis[j].clinoralinvestig,2013,17(9): [4] VeraJ,SiqueiraJF,RicucciD,etal.One versustwo visitendo dontictreatmentofteethwithapicalperiodontitis:ahistobacterio logicstudy[j].jendod,2012,38(8): [5] BacaP,Mendoza LlamasM L,Arias MolizM T,etal.Residual efectivenesoffinalirigationregimensonenteroccusfaecalis in fectedrootcanals[j].jendod,2011,37(8): [6] FiginiL,LodiG,GorniF,etal.Singleversusmultiplevisitsfor endodontictreatmentofpermanentteeth:acochranesystematicre view[j].jendod,2008,34(9): [7] 孙 玉 亮, 梁 学 萍, 赵 今. 比 较 一 次 法 与 多 次 法 根 管 治 疗 术 治 疗 慢 性 牙 髓 炎 根 尖 周 炎 疗 效 的 系 统 评 价 [J]. 牙 体 牙 髓 牙 周 病 学 杂 志,2011,21(8): [8] RechenbergDK,De DeusG,ZehnderM.Potentialsystematicer rorinlaboratoryexperimentsonmicrobialleakagethroughfiled rootcanals:reviewofpublishedarticles[j].intendodj,2011,44 (3): [9]?zcanE,EldenizAU,AnH.Bacterialkilingbyseveralrootfil ingmaterialsandmethodsinanexvivoinfectedrootcanalmodel [J].IntEndodJ,2011,44(12): [10] 王 艳 平, 李 颂, 吴 光 远.13~22 岁 单 根 管 前 磨 牙 充 填 效 果 的 比 较 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2011,46(12): [11]PatelS,WilsonR,DawoodA,etal.Thedetectionofperiapicalpa thosisusingdigitalperiapicalradiographyandconebeamcomputed tomography part2:a1 yearpost treatmentfolow up[j].int EndodJ,2012,45(8): Clinicalevaluationofone visitendodontictreatmentwith E&Q continuouswavegutaforinfectedrootcanals LvNa,SunMing,HanXiaolan (DeptofStomatology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract 105casesofsinglerootcanalteethwithaclinicaldiagnosisofpulpnecrosis,acuteorchronicperiapical periodontitiswereselected.51caseswereincludedinone visitrootcanaltherapygroupand54casesintwo visit groupusingcalciumhydroxideasaninterappointmentmedicament.aftersixmonthsandoneyear,thecureratesof one visitgroupwere66.67% and94.12%,whilethoseoftwo visitgroupwere59.26% and77.78%,respective ly.therewasnostatisticalsignificancebetweenthegroupsincurerateaftersixmonths,butstatisticalysignificant diferencewasfoundafteroneyear(p<0 05).One visitendodontictreatmentwithe&qcontinuouswavegutafor infectedrootcanalshasthebeterclinicaleficacythantwo visitinlong termhealing. Keywords warmguta;one visitendodonticstreatment;infectedrootcanals;pain

128 1154 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 经 阴 道 超 声 联 合 宫 腔 声 学 造 影 在 宫 腔 病 变 中 的 诊 断 价 值 吴 静 1,2, 蔡 传 兰 3, 魏 清 4, 周 群 英 5 1, 王 静 摘 要 采 用 阴 道 超 声 (TVS) 联 合 宫 腔 声 学 造 影 (SHG) 检 查 诊 断 出 宫 腔 内 病 变 130 例, 并 以 病 理 检 查 结 果 为 金 标 准 计 算 其 诊 断 敏 感 性 及 准 确 性 TVS 联 合 SHG 诊 断 子 宫 内 膜 增 生 子 宫 内 膜 息 肉 子 宫 黏 膜 下 肌 瘤 子 宫 内 膜 炎 不 全 流 产 的 灵 敏 度 分 别 为 94 1% 72 7% 88 9% 83 3% 81 8%, 准 确 性 分 别 为 76 2% 88 9% 80 0% 87 0% 81 8% 关 键 词 阴 道 超 声 ; 宫 腔 声 学 造 影 ; 病 理 诊 断 中 图 分 类 号 O426.9 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 目 前 经 阴 道 超 声 (transvaginalsonography,tvs) 检 查 在 临 床 中 已 经 广 泛 应 用, 对 于 可 疑 的 宫 腔 病 变 是 首 选 的 检 查 手 段 宫 腔 病 变 最 常 见 的 表 现 为 子 宫 异 常 出 血 在 这 些 患 者 中, 虽 然 大 部 分 都 是 良 性 病 变, 但 也 有 少 数 患 者 可 能 是 恶 性 疾 病, 因 此 彻 底 的 检 查 以 明 确 诊 断 是 必 要 的, 特 别 是 在 围 绝 经 期 前 后 的 女 性 虽 然 宫 腔 镜 与 病 理 活 检 是 对 可 疑 病 变 确 诊 的 金 标 准, 但 毕 竟 是 侵 入 性 的 创 伤 检 查 [1] [2] 研 究 表 明, 宫 腔 声 学 造 影 (sonohysterography,shg) 是 一 种 成 本 较 低 的 微 创 手 术, 有 类 似 宫 腔 镜 诊 断 的 准 确 性, 并 能 有 效 评 估 功 能 失 调 性 子 宫 出 血 不 孕 症 子 宫 内 膜 病 变 如 息 肉 和 黏 膜 下 肌 瘤 SHG 可 以 成 为 一 个 有 用 的 术 前 评 估 肌 层 浸 润 方 式, 不 影 响 国 际 妇 产 科 协 会 (FederationInternationalofGynecologyandOb stetrics,figo) 制 订 的 肿 瘤 分 期 因 此, 该 研 究 回 顾 性 分 析 130 例 病 例, 评 价 TVS 联 合 SHG 检 查 对 宫 腔 病 变 的 诊 断 价 值 1 材 料 与 方 法 1.1 研 究 对 象 2012 年 1 月 ~2013 年 4 月 在 我 院 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 教 育 厅 自 然 科 研 重 点 项 目 ( 编 号 :KJ2012A165); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : MH169) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 与 卫 生 统 计 学 系, 合 肥 六 安 市 金 安 区 妇 幼 保 健 院 超 声 科 3 儿 保 科, 六 安 六 安 市 第 二 人 民 医 院 病 理 科 5 妇 产 科, 六 安 作 者 简 介 : 吴 静, 女, 副 主 任 医 师, 硕 士 研 究 生 ; 王 静, 女, 教 授, 博 士, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: [email protected] 就 诊,TVS 检 查 怀 疑 有 宫 腔 病 变 者 共 130 例, 年 龄 32~72(46 7±9 2) 岁 因 不 规 则 出 血 拟 诊 宫 腔 内 病 变 的 患 者, 病 理 检 查 诊 断 结 果 包 括 子 宫 内 膜 增 生 子 宫 内 膜 息 肉 子 宫 黏 膜 下 肌 瘤 子 宫 内 膜 炎 退 变 的 绒 毛 及 蜕 膜 组 织 等 SHG 检 查 前 排 除 内 外 生 殖 器 官 炎 症 或 亚 急 性 炎 症, 各 种 疾 病 的 急 性 期 或 严 重 的 全 身 病 变, 不 能 耐 受 手 术, 可 疑 妊 娠 及 滋 养 细 胞 疾 病 等 禁 忌 证 1.2 方 法 TVS 检 查 采 用 德 国 产 西 门 子 G50 彩 色 超 声 诊 断 仪, 使 用 7.5MHz 阴 道 探 头 检 查 时 间 定 为 : 无 症 状 者 于 月 经 干 净 后 3~7d 进 行 TVS 检 查, 有 不 规 则 阴 道 出 血 者 在 出 血 量 明 显 减 少 时 进 行 TVS 检 查, 如 果 出 血 量 持 续 较 多 的 患 者 则 行 经 直 肠 超 声 检 查 经 阴 道 ( 或 经 直 肠 ) 检 查 前 常 规 外 阴 消 毒 后 以 一 次 性 避 孕 套 隔 离 探 头 超 声 下 观 察 子 宫 及 内 膜 的 形 态 厚 度 回 声 强 度 宫 腔 线 回 声 及 子 宫 内 膜 的 血 流 显 示 情 况 有 异 常 病 变 时, 则 记 录 病 变 的 大 小 范 围 位 置 血 流 显 示 情 况, 是 否 有 其 他 合 并 病 变, 并 常 规 观 察 双 侧 附 件 区 SHG 经 TVS 检 查 宫 腔 线 显 示 不 清 晰 或 者 宫 腔 内 有 边 界 清 晰 的 异 常 回 声 者, 于 出 血 量 明 显 减 少 时, 行 SHG 检 查, 采 用 双 腔 囊 管, 注 入 5% 生 理 盐 水 5~10ml, 进 一 步 观 察 内 膜 形 态 前 后 壁 内 膜 的 回 声 宫 腔 内 异 常 回 声 的 部 位 大 小, 有 无 蒂 等 并 记 录 病 理 检 查 对 可 疑 病 变, 在 超 声 引 导 下 取 材 行 病 理 细 胞 学 检 查 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS11 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 对 TVS 联 合 SHG 诊 断 结 果 与 病 理 结 果 进 行 一 致 性 检 验, 计 算 其 诊 断 灵 敏 度 准 确 性 2 结 果 2.1 TVS 联 合 SHG 诊 断 结 果 与 病 理 结 果 对 比 130 例 患 者 行 TVS 检 查, 其 中 23 例 宫 腔 线 显 示 不 清 晰 或 者 宫 腔 内 有 边 界 清 晰 的 异 常 回 声, 进 一 步 行 SHG 检 查 TVS 联 合 SHG 诊 断 结 果 与 病 理 结 果 对 比, 前 者 诊 断 子 宫 内 膜 增 生 子 宫 内 膜 息 肉 子 宫 黏 膜 下 肌 瘤 子 宫 内 膜 炎 不 全 流 产 的 灵 敏 度 分 别 为 94 1% 72 7% 88 9% 83 3% 81 8%, 准 确 性 分

129 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１５５ 表 １ ＴＶＳ联合 ＳＨＧ诊断结果与病理结果对比 ｎ ＴＶＳ联合 Ｓ ＨＧ检查 病理结果 子宫内膜增生 子宫内膜息肉 子宫黏膜下肌瘤 子宫内膜炎 不全流产 其他 合计 子宫内膜增生 ４８ １ １ １ ５ １ 子宫内膜息肉 ２ ８ １ １ １ 子宫黏膜下肌瘤 ８ １ ９ 子宫内膜炎 ３ ２ １ ２ ４ 退变的绒毛及蜕膜组织 ２ ９ １ １ 其他 １ １ １ ３ ２ ４ 合计 ６３ ９ １ ２３ １ １ １ ４ １ ３ 别为 ７６ ２ ８８ ９ ８ ８ ７ ８ １ ８ 见 表 １ ２ ２ 部分典型病例的 ＴＶＳ和 ＳＨＧ 声像图 子宫 内膜炎在 ＴＶＳ下显示 宫腔中上段呈扩张状 范围 约２ ７ｍｍ １ ４ｍｍ 内可见少许密集的点状回声浮 ｏ ｌ ｏ ｒｄｏ ｐｐ ｌ ｒｆ ｌ ｏ ｗ ｍａ 动 彩 色 多 普 勒 血 流 显 像 ｃ ＣＤＦＩ 和脉冲多普勒 ｐ ｕ ｌ ｓ ｄ ｗａ ｖ Ｄｏ ｐ ｐ ｌ ｒ ＰＷ ｇ ｎｇ 显示其内未见明显彩色血流信号 子宫内膜增生在 ＴＶＳ下显示 宫腔线显示清晰 双层内膜厚约 ２ ８ｍｍ 图 ３ 子宫黏膜下肌瘤 内可见蜂窝样的小囊回声 ＣＤＦＩ ＰＷ 显示其内未探 及明显彩色血流信号 子宫黏膜下肌瘤在 Ｓ ＨＧ下显 示 宫腔注入生理盐水后 于后壁内膜扫见一 １ ２ｍｍ ８ｍｍ的中等回声 边界清晰 位置固定 子宫内膜 ＨＧ下显示 宫腔注入生理盐水后 息肉 多发性 在 Ｓ 于子宫内膜前 后壁可清晰显示多个大小不等的中等 回声 边界光滑 内部回声均匀 见图 １ ４ 图 ４ 子宫内膜息肉 多发性 ３ 讨论 ３ １ ＳＨＧ有助于提高宫腔病变的诊断准确率 本 图 １ 子宫内膜炎 文研究结果表明 ＴＶＳ联合 ＳＨＧ检查对宫腔病变的 诊断具有较高的灵敏度和准确性 在 ＴＶＳ和 ＳＨＧ下 的声像 图 显 示 清 晰 这 与 研 究 ３ 结 果 一 致 有 研 究 ４ 结果表明 经 ＴＶＳ评估宫腔病变是一个相当敏 感的方 法 具 有 较 高 的 灵 敏 度 和 准 确 性 Ｒｙ ｕ ５ ａ ｌ 研究发现 Ｓ ＨＧ对子宫内膜病变的评估是比阴 道超声更好的工具 能准确的区分内膜病变是局部 的还是弥漫性的 有利于宫腔镜检查和病理定向活 ２ 检 Ｃｈａ ｎ ｇ ａ ｌ 比较了 ＳＨＧ和 ＭＲＩ在子宫内膜 癌患者肌层浸润程度的诊断价值进行了比较 结果 图 ２ 子宫内膜增生 显示 ＳＨＧ对子宫肌层浸润程度鉴别的敏感度 特

130 1156 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 异 度 阳 性 预 测 值 阴 性 预 测 值 分 别 为 64 7% 87 7% 61 1% 和 89 3%,MRI 对 子 宫 肌 层 浸 润 程 度 鉴 别 的 敏 感 度 特 异 度 阳 性 预 测 值 阴 性 预 测 值 分 别 为 70 6% 84 2% 57 1% 90 6%, 两 者 诊 断 一 致 性 分 别 为 82 4% 和 81 1% 因 此, 建 议 SHG 应 该 作 为 在 子 宫 异 常 出 血 的 病 例 中 的 一 个 初 步 的 检 查 3.2 TVS SHG 和 病 理 检 查 三 者 联 合 是 宫 腔 病 变 诊 断 的 有 力 依 据 TVS 检 查 是 诊 刮 前 初 筛 的 重 要 手 段, 可 以 选 择 在 子 宫 内 膜 增 生 早 期 检 查, 此 时 内 膜 较 薄 且 呈 低 回 声, 易 与 强 回 声 的 息 肉 辨 别, 有 助 提 高 较 小 内 膜 息 肉 的 检 出 率, 也 有 利 于 避 免 将 内 膜 增 生 误 诊 为 息 肉 [6] 在 实 际 工 作 中, 对 于 高 度 怀 疑 宫 腔 有 病 变 而 普 通 的 TVS 又 不 能 识 别 的 病 例, 可 选 择 SHG 以 进 一 步 了 解 病 变 的 详 细 情 况, 这 是 基 于 生 理 盐 水 注 入 后 宫 腔 的 边 界 与 子 宫 肌 层 之 间 形 成 了 良 好 的 对 比 界 面, 提 高 了 宫 腔 微 小 病 变 的 检 出 率 在 SHG 下, 可 以 更 加 清 晰 的 观 察 到 宫 腔 内 和 宫 颈 管 的 形 态 与 结 构, 了 解 病 变 的 位 置 范 围 和 外 形, 可 以 清 晰 地 观 察 到 病 变 是 单 性 发 还 是 多 性 发, 是 局 部 性 还 是 弥 漫 性 的, 并 可 准 确 定 位 以 帮 助 病 例 取 材 和 活 检, 提 高 诊 断 的 准 确 性 在 子 宫 内 膜 癌 的 患 者 中, 经 TVS 可 见 宫 腔 内 有 增 强 或 减 弱 的 回 声, 官 腔 线 紊 乱, 形 态 不 规 则, 血 管 走 形 紊 乱, 阻 力 指 数 (resistanceindex,ri) 明 显 降 低 子 宫 内 膜 良 性 病 变 和 恶 性 病 变 之 间 的 RI 值 差 异 有 统 计 学 意 义 [7] 超 声 下 诊 断 性 刮 宫 方 法 简 便, 在 一 定 程 度 上 降 低 了 盲 目 刮 宫 的 漏 诊 率, 还 可 起 到 止 血 作 用, 但 对 一 些 微 小 病 变 及 位 于 宫 角 宫 底 处 的 局 限 性 病 灶, 不 能 刮 出 组 织 送 检, 易 引 起 漏 诊 [8] 参 考 文 献 [1] HunterDC,McClureN.Abnormaluterinebleeding:anevalua tionendometrialbiopsy,vaginalultrasoundandoutpatienthyste roscopy[j].ulstermedj,2001,70(1): [2] ChangSJ,LeeEJ,KimW Y,etal.Valueofsonohysterography inpreoperativeasesmentofmyometrialinvasionforpatientswith endometrialcancer[j].jultrasoundmed,2010,29(6): [3] AslamM,IjazL,TariqS,etal.Comparisonoftransvaginalsonog raphyandsalinecontrastsonohysterographyinwomenwithabnor maluterinebleeding:corelationwithhysteroscopyandhistopa thology[j].intjhealthsci(qasim),2007,1(1): [4] 朱 颖, 曹 云 霞. 经 阴 道 超 声 与 宫 腔 镜 检 查 对 不 孕 症 及 复 发 性 流 产 患 者 宫 腔 病 变 的 诊 断 价 值 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报, 2010,45(6): [5] RyuJA,KimB,LeeJ,etal.Comparisonoftransvaginalultra sonographywithhysterosonographyasascreeningmethodinpa tientswithabnormaluterinebleeding[j].koreanjradiol,2004, 5(1): [6] 龚 先 莲. 经 过 阴 道 超 声 诊 断 子 宫 内 膜 息 肉 的 82 例 分 析 [J]. 中 国 民 族 民 间 医 药,2012,21(8):68. [7] 洪 琼. 经 阴 道 超 声 检 测 子 宫 内 膜 病 变 的 临 床 价 值 [J]. 中 国 实 用 医 药,2012,7(18):54-5. [8] 张 克 群. 超 声 下 诊 断 性 刮 宫 与 宫 腔 镜 检 查 对 绝 经 后 子 宫 出 血 的 诊 断 价 值 [J]. 中 华 实 用 诊 断 与 治 疗 杂 志,2011,25(5): Thediagnosticvalueoftransvaginalsonographywith sonohysterographyinuterinecavitylesions WuJing 1,2,CaiChuanlan 3,WeiQing 4,etal ( 1 DeptofEpidemiologyandHealthStatistics,AnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 Deptof Ultrasound, 3 DeptofChildHealth,Jin anmaternalandchildhealthcarehospital,lu an ; 4 DeptofPathology,TheSecondPeople shospitaloflu an,lu an ) Abstract 130casesofsuspecteduterineabnormalitiesunderwenttransvaginalsonography(TVS)andsonohyster ography(shg),andcalculatedsensitivityandaccuracycomparedwithpathologicalresults.comparedwithpatho logicalresults,thesensitivityofintimahyperplasia,intimapolypus,mucousmembranetumor,intimainflammation andplacentaresiduewere94 1%,72 7%,88 9%,83 3%,81 8%,indiagnosinguterinecavitylesionsbyTVS combinedwithshg,respectively Theaccuraterateswere76 2%,88 9%,80 0%,87 0%,81 8%,respec tively. Keywords transvaginalsonography;sonohysterography;pathologicaldiagnosis

131 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1157 成 年 裸 鼠 和 成 人 体 表 皮 肤 的 比 较 组 织 形 态 学 研 究 王 溯, 陈 晓 蓉 摘 要 取 成 年 裸 鼠 及 成 人 体 表 皮 肤, 用 HE 染 色 Mason Fontana 染 色 及 透 射 电 镜 等 方 法, 观 察 二 者 全 层 皮 肤 组 织 学 结 构 及 黑 色 素 分 布 情 况 提 示 二 者 皮 肤 的 组 织 学 结 构 在 光 镜 水 平 存 在 差 异, 裸 鼠 无 汗 腺, 皮 下 有 横 纹 肌 层 ;Mason Fon tana 染 色 在 裸 鼠 显 示 为 阴 性 结 果 然 而 在 电 镜 水 平 可 以 发 现 裸 鼠 皮 肤 基 底 层 存 在 黑 色 素 细 胞 关 键 词 黑 色 素 细 胞 ; 裸 鼠 ; 皮 肤 ; 比 较 组 织 学 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 裸 鼠 作 为 一 种 特 殊 的 模 式 动 物 广 泛 用 于 免 疫 肿 瘤 移 植 等 研 究 领 域 裸 鼠 胸 腺 免 疫 缺 陷, 体 表 无 毛, 类 似 人 体 皮 肤 外 观, 是 异 种 异 体 皮 肤 移 植 的 理 想 受 体 但 是 裸 鼠 皮 肤 又 有 其 自 身 组 织 学 特 点 因 此, 将 裸 鼠 与 人 的 体 表 皮 肤 的 组 织 学 异 同 作 一 比 较 显 得 必 要, 为 受 试 前 后 的 研 究 结 果 提 供 可 靠 参 照, 以 促 使 其 向 临 床 转 化 然 而, 既 往 研 究 多 从 纯 生 物 学 角 度 出 发, 侧 重 不 同 纲 目 间 的 横 向 比 较, 忽 略 了 比 较 组 织 学 在 转 化 医 学 方 面 的 价 值, 涉 及 鼠 与 人 皮 肤 形 态 学 差 异 的 描 述 较 为 笼 统 [1-3], 更 缺 乏 专 门 以 裸 鼠 皮 肤 为 比 较 对 象 的 报 道 该 研 究 选 取 正 常 成 年 裸 鼠 皮 肤 与 正 常 成 人 体 表 皮 肤 作 一 组 织 学 比 较, 为 皮 肤 病 学 和 肿 瘤 学 领 域 的 研 究 提 供 可 靠 的 形 态 学 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 健 康 裸 鼠,SPF 级,8 周,Balb/c nu, 雌 雄 不 限, 体 重 19~21g, 购 于 湖 南 斯 莱 克 景 达 实 验 动 物 有 限 公 司, 以 裸 鼠 专 用 标 准 饲 料 灭 菌 水, 25 室 温 无 菌 条 件 喂 养, 自 由 取 食 饮 水,1 周 后 取 用 动 物 合 格 证 号 :SCXK( 湘 ) 在 本 实 验 全 过 程 中, 动 物 处 置 方 法 确 保 符 合 动 物 伦 理 学 要 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 教 育 厅 基 金 项 目 ( 编 号 :KJ2007A034) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 基 础 医 学 院 组 织 胚 胎 学 教 研 室, 合 肥 作 者 简 介 : 王 溯, 女, 硕 士 研 究 生 ; 陈 晓 蓉, 女, 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E 求 1.2 方 法 取 裸 鼠 背 部 全 层 皮 肤, 用 4% 甲 醛 固 定 24h, 常 规 脱 水 透 明 石 蜡 包 埋 成 人 皮 肤 由 徐 州 医 学 院 第 二 附 属 医 院 病 理 科 惠 赠, 取 自 胸 部 正 常 皮 肤 将 上 述 材 料 制 成 4μm 切 片, 脱 蜡 至 水 后 行 HE 染 色 或 Mason Fontana 染 色, 光 镜 (ECLIPSE80i 高 级 研 究 用 生 物 显 微 镜,Nikon, 日 本 ) 观 察 基 本 组 织 结 构 及 黑 色 素 染 色 情 况 另 取 裸 鼠 新 鲜 皮 肤 置 于 2 5% 戊 二 醛 溶 液 固 定 12h 常 规 用 丙 酮 / 环 氧 树 脂 包 埋 制 成 500? 的 切 片, 醋 酸 铀 和 柠 檬 酸 铅 染 色, 透 射 电 镜 (JEM 1230, 电 子 株 式 会 社, 日 本 ) 观 察 黑 色 素 细 胞 2 结 果 2.1 HE 染 色 HE 染 色 显 示 裸 鼠 和 成 人 体 皮 均 由 表 皮 及 真 皮 构 成, 真 皮 下 为 皮 下 组 织 观 察 比 较 二 者 显 微 结 构 可 见 低 倍 镜 下 人 全 层 皮 肤 明 显 厚 于 裸 鼠, 尤 其 是 人 皮 肤 的 真 皮 层 明 显 较 裸 鼠 发 达 裸 鼠 的 表 皮 与 真 皮 接 壤 处 较 平 整, 成 人 的 表 皮 与 真 皮 相 结 合 处 常 呈 波 浪 形, 二 者 犬 牙 交 错, 形 成 表 皮 嵴 及 真 皮 乳 头 裸 鼠 皮 下 组 织 中 可 见 一 肌 层, 这 在 人 皮 下 组 织 中 未 见 见 图 1A B, 图 2A 高 倍 镜 下 可 见 裸 鼠 表 皮 薄 于 成 人 ( 裸 鼠 表 皮 2 ~5 层 角 质 形 成 细 胞, 成 人 5~8 层 ), 二 者 均 具 有 典 型 复 层 结 构, 表 皮 最 外 方 为 角 质 层 裸 鼠 和 人 表 皮 的 颗 粒 层 和 基 底 层 细 胞 在 形 态 上 存 在 差 异 裸 鼠 表 皮 颗 粒 层 细 胞 轮 廓 不 清 晰, 可 见 浓 染 颗 粒 成 人 表 皮 颗 粒 层 由 1~2 层 颗 粒 细 胞 构 成, 细 胞 切 面 呈 长 梭 形, 细 胞 轮 廓 较 清 晰, 细 胞 核 扁 圆 居 中, 胞 质 内 可 见 均 匀 细 密 深 染 的 颗 粒 成 人 表 皮 基 底 层 细 胞 排 列 规 整 紧 密, 胞 质 少, 细 胞 核 小 圆, 深 染, 居 中 个 别 细 胞 胞 质 区 可 见 浅 棕 色 颗 粒, 且 颗 粒 多 富 集 在 细 胞 核 上 方 的 胞 质 区 裸 鼠 基 底 层 细 胞 排 列 较 紧 密, 细 胞 核 小 圆, 深 染, 胞 质 少, 未 见 有 如 在 成 人 表 皮 基 底 层 细 胞 间 所 见 的 含 浅 棕 褐 色 颗 粒 的 细 胞 见 图 1A1 B1 裸 鼠 真 皮 明 显 薄 于 成 人, 高 倍 镜 下 可 见 染 成 浅 红 呈 波 浪 状 的 胶 原 纤 维 交 织, 梭 形 细 胞 散 布 其 间

132 １１５８ 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ 图 １ ＨＥ染色示裸鼠及成人皮肤 Ａ Ａ１ ３ 成人皮肤 Ｂ Ｂ１ ２ 裸鼠皮肤 Ａ 成人皮肤 低倍镜 Ａ１ 成人表皮及真皮 Ａ２ 成人皮脂腺 其右侧为毛囊 Ａ３ 成人汗腺 Ｂ 裸 鼠皮肤 低倍镜 Ｂ１ 裸鼠表皮及真皮 Ｂ２ 裸鼠皮脂腺 其下方为毛囊 Ｃ 成人毛囊 皮脂腺及其一侧的立毛肌 Ａ Ｃ １ Ａ１ ３ Ｂ１ ２ ４ 成人真皮基质发达 在高倍镜下可见均质红染 粗宽 的胶原纤维断面 细胞散布其间 见图 １Ａ１ Ｂ１ 成人真皮中可见毛囊 皮脂腺 汗腺等皮肤附属 结构 皮脂腺一侧常见立毛肌附着 见图 １Ａ２ Ａ３ Ｃ 而裸鼠真皮中仅见毛囊和皮脂腺 汗腺缺如 未 见明显立毛肌结构 见图 １Ｂ２ 与成人相比 裸鼠毛 囊狭长 深入皮下 与裸鼠皮脂腺相比 成人皮脂腺 显著发达 低倍镜下 成人皮脂腺的细胞数量明显 多于裸鼠 高倍镜下 成人皮脂腺细胞体积大 细胞 质染色浅 充满脂滴 细胞核小 近腺体中心细胞的 细胞核趋小 裸鼠皮脂腺细胞的细胞质染色较深 细胞核较大 腺体中心与周边细胞的细胞核差别不 大 可见双核 成人皮下组织由脂肪组织及疏松结缔组织构 成 裸鼠皮下组织中还可见一层肌纤维 见图 ２Ａ Ｂ Ｃ 高倍镜下 肌纤维纵切面成带状 可见基本处于 图 ２ ＨＥ染色示裸鼠皮下肌层及成人皮下组织 Ａ 成人皮下组织 无肌层 Ｂ Ｃ Ｂ１ Ｃ１ 裸鼠皮下肌层 Ｂ Ｂ１ 同一水平的清晰横纹 细胞核多个 呈长卵圆形 沿 裸鼠皮下肌层纵切面 Ｃ Ｃ１ 裸鼠皮下肌层横切面 Ａ Ｃ １ 肌膜下分布 横切面可见肌纤维呈多边形 细胞核 Ｂ１ Ｃ１ ４ 分布于外周 见图 ２Ｂ１ Ｃ１ ２ ２ Ｍａｓ ｓ ｏｎ Ｆｏ ｎ ａｎａ染色 Ｍａ ｓ ｓ ｏ ｎ Ｆｏ ｎ ａ ｎ ａ染色 浓集 见图 ３Ａ Ａ１ Ｍａ ｓ ｓ ｏ ｎ Ｆｏ ｎ ａ ｎａ染色显示裸鼠 利用黑素可将氨银溶液中的银离子还原的原理显示 基底层细胞淡染 其间无棕黑色带状颗粒分布 为阴 黑色素细胞 经本方法处理的裸鼠和成人皮肤显示 性结果 见图 ３Ｂ Ｂ１ 了很大的差异 低倍镜下可见成人皮肤基底层棕黑 ２ ３ 透射电镜观察 透射电镜观察表明 裸鼠皮肤 色颗粒带 高倍镜下可见基底层间细胞的胞质中富 基底层可见黑色素细胞 见图 ４ 胞质内可见以 Ⅲ 含 黑色颗粒 且颗粒在细胞的近棘细胞侧的胞质中 Ⅳ期为主的黑素小体 数量不多 呈高电子密度颗

133 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1159 粒 核 糖 体 线 粒 体 丰 富, 粗 面 内 质 网 高 尔 基 复 合 体 发 达, 张 力 微 丝 少, 与 相 邻 细 胞 间 无 桥 粒 连 接, 见 图 4 图 3 Mason Fontana 银 染 法 示 裸 鼠 及 成 人 皮 肤 黑 色 素 分 布 A A1: 成 人 皮 肤 ;B B1: 裸 鼠 皮 肤 ;A B: 100;A1 B1: 400 图 4 电 子 透 射 显 微 镜 示 裸 鼠 皮 肤 基 底 层 的 黑 素 细 胞 Nu 示 细 胞 核 ;( ) 示 高 电 子 密 度 黑 素 小 体 3 讨 论 [2-3] 研 究 显 示, 体 表 毛 发 丰 密 的 哺 乳 动 物 表 皮 薄 且 平 坦 ( 如 普 通 鼠 类 ), 无 毛 发 的 哺 乳 动 物 表 皮 厚 且 不 平 坦 ( 如 人 类 ), 而 真 皮 厚 度 由 表 皮 厚 度 决 定 [2-3] 这 一 组 织 学 特 点 有 其 功 能 意 义 : 一 方 面, 缺 乏 毛 发 保 护 的 表 皮 易 磨 损, 需 要 获 得 更 丰 富 的 细 胞 来 源, 以 保 证 表 皮 更 新 所 需 另 一 方 面, 厚 的 表 皮 需 要 获 得 更 丰 富 的 营 养 支 持 [3] 本 研 究 表 明, 光 镜 下 HE 染 色 显 示 裸 鼠 的 表 皮 及 真 皮 均 较 成 人 为 薄, 且 裸 鼠 表 皮 基 部 较 平 整, 未 见 形 成 表 皮 嵴 及 真 皮 乳 头 说 明 裸 鼠 虽 然 体 表 无 毛, 但 依 然 承 袭 了 鼠 类 表 皮 的 结 构 特 点 ; 且 裸 鼠 优 越 的 饲 养 环 境 大 大 减 弱 了 表 皮 [2] 磨 损 报 道 指 出, 成 人 角 质 层 薄 部 位 的 皮 肤 颗 粒 层 仅 含 1~3 层 细 胞, 实 验 动 物 表 皮 颗 粒 层 常 缺 如 或 不 连 续 本 研 究 显 示 成 人 皮 肤 颗 粒 层 含 1 层 细 胞, 裸 鼠 表 皮 颗 粒 层 不 清 晰, 证 实 了 这 一 观 点 [2-3] 有 研 究 表 明, 哺 乳 类 有 汗 腺 的 现 象 几 乎 仅 见 于 较 高 等 的 灵 长 类, 啮 齿 类 汗 腺 仅 存 在 于 趾 垫 本 研 究 表 明, 裸 鼠 体 皮 汗 腺 缺 如, 成 人 具 备 汗 腺, 证 实 了 这 一 观 点 [2-3] 研 究 显 示 不 同 动 物 皮 脂 腺 结 构 和 腺 细 胞 形 态 差 别 不 大 而 本 研 究 显 示 : 成 人 皮 脂 腺 明 显 比 裸 鼠 发 达, 腺 细 胞 成 熟, 而 裸 鼠 皮 脂 腺 不 发 达, 成 熟 程 [2-3] 度 较 低 研 究 显 示, 不 同 物 种 的 皮 脂 腺 合 成 的 酶 有 所 不 同, 灵 长 类 合 成 的 酶 种 类 更 复 杂 由 此 可 见, 人 的 皮 脂 腺 细 胞 较 其 他 物 种 行 使 更 成 熟 的 分 泌 功 能 皮 脂 腺 具 有 分 泌 皮 脂, 滋 润 体 表 的 作 用, 而 裸 鼠 生 活 环 境 单 一, 湿 度 温 度 恒 定, 这 也 或 可 解 释 本 研 究 中 人 和 裸 鼠 皮 脂 腺 细 胞 的 组 织 学 差 异 [2-3] 研 究 显 示, 立 毛 肌 维 持 毛 囊 与 表 皮 的 成 角, 维 持 毛 发 趋 向 走 形 本 研 究 显 示,HE 染 色 未 见 裸 鼠 具 有 立 毛 肌 结 构, 成 人 立 毛 肌 明 显 近 年 一 项 研 [4] 究 显 示, 对 立 毛 肌 进 行 免 疫 组 织 化 学 检 测 可 见 裸 鼠 立 毛 肌 表 明 虽 然 裸 鼠 体 表 几 乎 无 毛, 但 立 毛 肌 结 构 并 未 完 全 退 化 消 失 近 年 在 涉 及 皮 下 组 织 的 移 植 研 究 中, 啮 齿 动 物 的 皮 下 肌 层 被 用 作 定 位 标 志 [5] 并 用 于 微 循 环 缺 血 再 灌 注 对 横 纹 肌 影 响 的 研 究 [6] 但 未 见 文 献 指 明 裸 鼠 皮 下 该 肌 层 及 其 组 织 学 性 质 本 研 究 表 明, 裸 鼠 皮 下 具 有 连 续 的 菲 薄 肌 层, 且 为 骨 骼 肌 是 否 该 层 肌 肉 能 自 主 收 缩, 或 是 否 可 通 过 非 自 主 的 收 缩 调 节 微 循 环 的 血 量 进 而 参 与 体 温 调 节, 其 生 理 学 意 义 及 胚 胎 来 源 有 待 进 一 步 研 究 [2-3] 有 研 究 指 出, 鼠 类 的 皮 肤 色 素 仅 存 于 毛 发, 躯 干 部 缺 失 有 活 性 的 黑 色 素 细 胞 [7] [8] 有 研 究 显 示, 裸 鼠 为 黑 色 素 细 胞 标 志 物 S 100 的 阴 性 对 照 Mason Fontana 染 色 是 检 测 皮 肤 黑 色 素 分 布 情 况 的 简 便 方 法 [9] 在 本 研 究 中, 裸 鼠 同 样 表 现 为 阴 性 结 果 但 经 透 射 电 镜 检 查, 可 以 在 裸 鼠 表 皮 基 底 层 观 察 到 含 有 黑 色 素 细 胞 及 黑 素 小 体 ( 黑 素 小 体 分 期 参 见 文 献 [7,10] ) 鉴 于 黑 色 素 细 胞 对 调 节 皮 肤 色 泽 以 及 防 止 紫 外 线 照 射 引 起 的 细 胞 损 伤 起 着 重 要 作 用 [7,11-12] 结 合 成 人 皮 肤 黑 色 素 细 胞 相 关 研 究, 可 见 裸 鼠 黑 素 细 胞 的 颗 粒 数 量 少 于 成 人 [11,13] 表 明 裸 鼠 虽 然 缺 少 毛 发 保 护, 貌 似 承 袭 了 鼠 类 皮 肤 黑 色 素 分 布 的 一 般 特 点, 却 并 非 完 全 缺 失 黑 色 素 细 胞

134 1160 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 皮 肤 作 为 人 体 最 大 的 器 官, 具 有 屏 障 黑 色 素 代 谢 分 泌 汗 液 体 温 调 节 等 重 要 功 能 皮 肤 结 构 作 为 其 功 能 的 基 础, 值 得 对 其 深 入 研 究 尤 其 随 着 近 年 来 皮 肤 移 植 领 域 的 发 展, 裸 鼠 在 动 物 实 验 中 被 广 泛 应 用, 这 些 研 究 后 续 不 可 避 免 地 需 要 对 新 生 的 皮 肤 结 构 及 功 能 进 行 观 察 评 估 因 此 对 正 常 成 年 裸 鼠 皮 肤 和 正 常 成 人 体 表 皮 肤 的 组 织 学 结 构 的 异 同 进 行 比 较 显 得 尤 为 必 要, 以 更 好 地 对 研 究 结 果 进 行 对 照 评 估 另 外, 在 使 用 裸 鼠 模 型 的 皮 肤 病 学 研 究 中, 动 物 实 验 也 要 求 研 究 者 知 悉 正 常 裸 鼠 的 皮 肤 组 织 学 结 构 及 其 与 人 体 皮 肤 的 组 织 学 结 构 异 同, 以 促 进 其 向 临 床 转 化 [14-15] 参 考 文 献 [1] LucyDLeake.Clasmammalia[M]//LucyDLeake.Compara tivehistology.london:academicpres,1975: [2] MontagnaW.Comparativeanatomyandphysiologyoftheskin [J].ArchDermatol,1967,96(4): [3] MontagnaW.Cutaneouscomparativebiology[J].ArchDermatol, 1971,104(6): [4] SatoA,ToyoshimaKE,TokiH,etal.Singlefolicularunittrans plantationreconstructsarectorpilimuscleandnerveconnections andrestoresfunctionalhairfoliclepiloerection[j].jdermatol, 2012,39(8): [5] IwasakiT,ImadoT,KitanoS,etal.Hepatocytegrowthfactora melioratesdermalsclerosisinthetight skinmousemodelofsclero derma[j].arthritisresther,2006,8(6):r161. [6] LindenblatN,CalcagniM,ContaldoC,etal.Anewmodelfor studyingtherevascularizationofskingraftsinvivo:theroleofan giogenesis[j].plastreconstrsurg,2008,122(6): [7] SlominskiA,TobinDJ,ShibaharaS,etal.Melaninpigmentation inmammalianskinanditshormonalregulation[j].physiolrev, 2004,84(4): [8] 宋 可 新, 乔 群, 王 晓 军. 黑 色 素 细 胞 与 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 复 合 构 建 组 织 工 程 化 皮 肤 [J]. 中 国 医 学 科 学 院 学 报,2011,33 (4): [9] JungE,LeeJA,ShinS,etal.Madecasosideinhibitsmelanin synthesisbyblockingultraviolet inducedinflammation[j].mole cules,2013,18(12): [10] CichorekM,WachulskaM,StasiewiczA,etal.Skinmelanocytes: biologyanddevelopment[j].postepydermatolalergol,2013,30 (1): [11] AndoH,NikiY,ItoM,etal.Melanosomesaretransferedfrom melanocytestokeratinocytesthroughtheprocesesofpackaging, release,uptake,anddispersion[j].jinvestdermatol,2012,132 (4): [12] VideiraIF,MouraDF,MaginaS,etal.Mechanismsregulating melanogenesis[j].anbrasdermatol,2013,88(1): [13] 人 体 皮 肤 电 镜 图 谱 编 写 组. 正 常 人 体 皮 肤 超 微 结 构 [M]. 南 京 : 东 南 大 学 出 版 社,1990:4. [14]HuangSP,HsuCC,ChangSC,etal.Adipose derivedstemcels seededonacelulardermalmatrixgraftsenhancewoundhealingin amurinemodelofaful thicknesdefect[j].annplastsurg, 2012,69(6): [15]Martínez SantamaríaL,Guerero AspizuaS,DelRíoM.Skinbio engineering:preclinicalandclinicalapplications[j].actasder mosifiliogr,2012,103(1):5-11. Thehistologicalcomparasionoftheadultnude miceskin totheadulthumanskin WangSu,ChenXiaorong (DeptofHistologyandEmbryology,TheBasicMedicalColegeofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Afterskinflapswereharvestedfromtheadultnude miceandtheadulthuman,theyweremadeintosec tionsandstainedbyhestainormason Fontanastain.Thustheskinstructuresandthedistributionofmelanin wereobservedunderthelightmicroscopy.theultra structureofmelanocyteswasdetailedbytransmisionelec tromicroscopy.underthelight microscopicobservation,sweatglandswerefoundagenesisinnudemice,witha thinlayerofstraitedmuscleshowninthesubcutaneouslayer.mason Fontanastainshowednegativeresultsinnude mice,butundertransmisionelectromicroscopy,melanocyteswereprominentinthebasallayer. Keywords melanocytes;nudemice;skin;comparativehistology

135 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1161 声 触 诊 组 织 定 量 技 术 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 应 用 价 值 章 生 龙 1, 邓 克 学 2, 隋 秀 芳 1 1, 刘 卫 勇 摘 要 99 例 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 患 者 分 为 两 组 :Graves 病 (GD) 组 45 例 ; 桥 本 甲 状 腺 炎 (HT) 组 54 例 另 选 取 甲 状 腺 功 能 及 超 声 图 像 正 常 者 64 例 进 行 对 照 比 较, 对 病 变 组 及 正 常 对 照 组 甲 状 腺 组 织 行 声 触 诊 组 织 定 量 (VTQ) 技 术 检 查, 记 录 各 甲 状 腺 组 织 的 剪 切 波 传 播 速 度 (SWV) 比 较 3 组 甲 状 腺 组 织 的 SWV GD 组 正 常 对 照 组 HT 组 SWV 值 依 次 增 大, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 对 病 变 组 绘 制 受 试 者 工 作 特 征 曲 线 (ROC), 当 SWV 2 20m/s 时, 诊 断 HT 的 敏 感 性 和 特 异 性 分 别 为 90 7% 和 84 4%, 阳 性 似 然 比 和 阴 性 似 然 比 分 别 为 5 81 和 0 11, 约 登 指 数 为 75 1% 结 果 表 明 VTQ 技 术 在 常 规 超 声 的 基 础 上 能 对 甲 状 腺 组 织 的 硬 度 进 行 定 量 测 算, 有 助 于 临 床 鉴 别 GD 及 HT 关 键 词 中 图 分 类 号 声 触 诊 组 织 定 量 技 术 ; 超 声 检 查 ; 甲 状 腺 R445.1;R581 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) Graves 病 (GD) 及 桥 本 甲 状 腺 炎 (hashimoto s thyroiditis,ht) 是 较 为 常 见 的 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变, 属 于 自 身 免 疫 性 疾 病, 发 病 年 龄 多 在 30~50 岁, 且 近 年 来 发 病 率 逐 渐 升 高 临 床 上 较 为 常 见 的 诊 断 及 鉴 别 诊 断 的 方 法 以 实 验 室 检 查 为 主 穿 刺 活 检 是 诊 断 的 金 标 准, 但 因 其 有 创 而 存 在 一 定 的 风 险, 往 往 不 为 患 者 所 接 受 因 此, 需 要 寻 找 一 种 无 创 且 能 较 为 准 确 的 鉴 别 此 两 种 疾 病 的 方 法 该 文 运 用 声 触 诊 组 织 定 量 (virtualtouchtisuequantification,vtq) 技 术 定 量 测 量 GD 组 HT 组 及 正 常 对 照 组 甲 状 腺 组 织 的 剪 切 波 传 播 速 度 (shearwavevelocities,swv), 探 讨 其 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 应 用 价 值 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 2013 年 3 月 ~12 月 在 我 院 就 诊 的 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 等 学 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 : KJ2013Z151) 1 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 超 声 科 2 影 像 科, 合 肥 作 者 简 介 : 章 生 龙, 男, 主 治 医 师 ; 邓 克 学, 男, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: dengkexue [email protected]; 隋 秀 芳, 女, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail: [email protected] 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 患 者 99 例 及 甲 状 腺 正 常 者 志 愿 者 64 例, 年 龄 23~60(41 23±12 52) 岁 患 者 均 有 详 细 的 临 床 及 实 验 室 检 查 资 料, 部 分 患 者 有 病 理 结 果 病 变 组 纳 入 标 准 :1 GD 组 患 者 及 HT 组 患 者 均 符 合 全 国 高 等 学 校 教 材 内 科 学 第 7 版 诊 断 标 准 [1] ;2 患 者 均 为 初 诊, 未 经 药 物 手 术 等 临 床 治 疗 ;3 常 规 超 声 检 查 甲 状 腺 内 无 明 显 占 位 性 病 变 1.2 仪 器 与 方 法 仪 器 采 用 德 国 西 门 子 公 司 AcusonS2000 超 声 诊 断 仪,9L4 高 频 线 阵 探 头, 频 率 4~9MHz, 探 头 配 有 VTQ 技 术 成 像 软 件 检 查 方 法 嘱 受 试 者 取 仰 卧 位, 充 分 暴 露 颈 部 首 先 用 常 规 超 声 横 轴 及 纵 轴 各 切 面 扫 查 甲 状 腺 组 织, 观 察 其 大 小 内 部 回 声 血 流 情 况 等 资 料 并 记 录 然 后 切 换 至 VTQ 测 量 模 式, 将 取 样 框 移 至 合 适 位 置 ( 尽 量 避 开 甲 状 腺 组 织 内 的 血 管 并 远 离 颈 动 脉 ) 嘱 患 者 屏 气 并 暂 停 吞 咽 动 作, 图 像 稳 定 后, 按 下 update 键, 即 获 得 一 个 SWV 值, 计 算 机 以 Vs 的 形 式 显 示, 单 位 以 (m/s) 表 示 当 出 现 X.XXm/s 时, 认 为 该 数 据 无 效, 重 新 测 量 并 纳 入 每 位 患 者 甲 状 腺 左 右 叶 分 别 测 量 8 次, 分 别 去 除 1 个 最 大 值 和 最 小 值, 剩 余 的 12 个 值 取 平 均 值, 以 该 平 均 值 作 为 此 患 者 甲 状 腺 组 织 的 SWV 值 1.3 统 计 学 处 理 采 用 SPSS18.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 分 析 各 组 甲 状 腺 组 织 的 SWV 值, 计 量 资 料 均 以 x±s 珋 表 示 采 用 方 差 分 析 比 较 正 常 对 照 组 GD 组 及 HT 组 之 间 SWV 差 异, 进 一 步 采 用 LSD 检 验 进 行 组 间 两 两 比 较 对 两 病 变 组 绘 制 受 试 者 工 作 特 征 曲 线 (receiveroperatingcharacteristiccurve,roc), 确 定 最 佳 临 界 点, 计 算 在 最 佳 临 界 点 处 的 敏 感 性 特 异 性 阳 性 似 然 比 阴 性 似 然 比 及 约 登 指 数 2 结 果 2.1 病 例 资 料 正 常 对 照 组 64 例, 年 龄 21~45 (30 82±14 28) 岁 ;GD 组 45 例, 年 龄 24~56 (39 13±15 02) 岁 ;HT 组 54 例, 年 龄 19~55 (39 62±12 38) 岁 2.2 SWV 测 值 GD 组 正 常 对 照 组 及 HT 组 3 组 之 间 SWV 值 依 次 增 大, 差 异 有 统 计 学 意 义 (F=

136 1162 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 71 67,P<0 05), 见 图 1~3, 表 1 进 一 步 进 行 两 两 比 较,GD 组 正 常 对 照 组 HT 组 各 组 间 SWV 值 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P<0 01) 图 1 GD 患 者 甲 状 腺 组 织 A: 彩 色 多 普 勒 声 像 图 ;B:SWV=1.62m/s 图 4 SWV 值 的 ROC 曲 线 图 2 正 常 对 照 组 甲 状 腺 组 织 A: 彩 色 多 普 勒 声 像 图 ;B:SWV=2.02m/s 图 3 HT 患 者 甲 状 腺 组 织 A: 彩 色 多 普 勒 声 像 图 ;B:SWV=2.47m/s 表 1 各 组 SWV 值 测 量 情 况 ( x±s) 珋 组 别 例 数 SWV(m/s) 95%CI GD ± ~1.94 正 常 对 照 ±0.24 ## 1.94~2.06 HT ± ~2.73 与 GD 组 比 较 : P<0 05, P<0 01; 与 HT 组 比 较 : ## P< ROC 曲 线 根 据 ROC 曲 线 可 知,ROC 曲 线 下 最 大 面 积 为 0 94(P<0 01), 选 取 约 登 指 数 ( 敏 感 性 + 特 异 性 -1) 最 大 值 所 对 应 的 点 为 最 佳 临 界 点, 确 定 SWV 值 =2 20m/s 即 在 病 变 组 中 当 SWV 值 2 20m/s 时, 其 诊 断 HT 的 敏 感 性 为 90 7%, 特 异 性 为 84 4%, 阳 性 似 然 比 为 5 81, 阴 性 似 然 比 为 0 11, 约 登 指 数 为 75 1% 见 图 4 3 讨 论 常 规 超 声 在 诊 断 甲 状 腺 弥 漫 性 疾 病 时 有 一 定 价 值, 但 对 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 鉴 别 诊 断 存 在 一 定 困 难 超 声 弹 性 成 像 技 术 可 以 反 映 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 硬 度 特 征, 对 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 的 鉴 别 诊 断 及 指 导 治 疗 有 临 床 意 义 [2-3] VTQ 技 术 作 为 无 创 性 量 化 组 织 硬 度 的 技 术, 其 原 理 是 通 过 超 声 探 头 向 感 兴 趣 区 域 组 织 发 射 低 频 振 动 或 低 频 脉 冲, 感 兴 趣 区 域 组 织 受 到 脉 冲 波 作 用 后, 发 生 形 变, 产 生 横 向 运 动 的 剪 切 波, 利 用 探 头 对 剪 切 波 进 行 检 测, 从 而 得 出 被 测 组 织 的 弹 性 量 化 值, 这 个 值 反 应 组 织 弹 性 的 大 小 此 技 术 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 方 面 的 报 道 较 少, 此 前 在 甲 状 腺 方 面 的 应 用 主 要 集 中 在 甲 状 腺 占 位 性 病 变 良 恶 性 鉴 别 诊 断 上 [4-8] 病 理 学 上 GD 病 患 者 甲 状 腺 弥 漫 性 对 称 性 增 大, 血 管 充 血, 间 质 血 管 丰 富, 质 地 较 柔 软 正 常 的 甲 状 腺 组 织 细 胞 功 能 正 常, 无 明 显 的 纤 维 化 及 增 生 HT 患 者 甲 状 腺 组 织 的 病 变 通 常 分 为 3 期 [9], 可 表 现 为 甲 状 腺 功 能 亢 进 甲 状 腺 功 能 正 常 或 甲 状 腺 功 能 低 下, 但 最 终 均 发 展 为 甲 状 腺 功 能 低 下 由 于 HT 甲 状 腺 多 呈 弥 漫 性 肿 大 ( 以 峡 部 锥 体 叶 肿 大 明 显 ), 有 中 重 度 的 结 缔 组 织 增 生 及 纤 维 化, 故 甲 状 腺 组 织 质 地 坚 硬 VTQ 技 术 所 测 得 的 SWV 值, 定 量 反 应 出 组 织 的 弹 性 特 征,SWV 值 越 低, 反 应 该 组 织 质 地 [10] 越 软, 反 之 说 明 该 组 织 质 地 越 硬 有 文 献 报 道 甲 状 腺 组 织 硬 度 : 甲 亢 组 < 正 常 对 照 组 < 桥 本 组, 差 异 有 统 计 学 意 义 本 研 究 测 得 3 组 之 间 SWV 值 依 次 增 大, 差 异 有 统 计 学 意 义, 与 组 织 的 SWV 与 其 弹 性 系 数 呈 反 比 的 结 论 相 符 [11] 由 于 部 分 HT 患 者 在 早 期 因 炎 症 破 坏 滤 泡 甲 状 腺 激 素 过 多 释 放 入 血, 也 可 出 现 一 过 性 甲 状 腺 功 能 亢 进 表 现 常 规 超 声 表 现 为 甲 状 腺 内 彩 色 血 流 信 号 极 其 丰 富, 呈 火 海 征, 甲 状 腺 上 动 脉 增 宽, 收 缩 期 峰 值 流 速 增 快 此 类 超 声 表 现 则 与 大 部 分 GD 患

137 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1163 者 声 像 图 相 似 因 此 常 规 超 声 通 过 二 维 图 像 彩 色 多 普 勒 及 频 谱 多 普 勒 对 HT 患 者 及 GD 患 者 的 鉴 别 诊 断 存 在 一 定 的 困 难 本 文 运 用 VTQ 技 术, 正 是 基 于 GD 患 者 和 HT 患 者 的 组 织 病 理 学 特 点 的 不 同 所 造 成 的 组 织 的 硬 度 不 同, 根 据 所 测 SWV 值 的 大 小 对 甲 状 腺 组 织 的 硬 度 进 行 量 化 分 析 利 用 ROC 曲 线 试 图 寻 找 鉴 别 两 种 疾 病 的 最 佳 临 界 值 根 据 ROC 曲 线 可 知, 当 曲 线 下 最 大 面 积 为 0.94 时,SWV 最 佳 [12-13] 临 界 值 为 2.20m/s, 与 文 献 报 道 相 类 似 统 计 学 中, 当 ROC 曲 线 下 面 积 在 0.9 以 上 时 表 示 诊 断 准 确 性 较 高, 本 研 究 中 曲 线 下 面 积 为 0.94, 说 明 VTQ 技 术 对 鉴 别 HT 患 者 和 GD 患 者 具 有 很 大 意 义, 可 以 为 临 床 鉴 别 此 两 种 病 变 提 供 帮 助 总 之, 与 其 他 检 测 手 段 相 比, 常 规 超 声 具 有 无 创 价 格 低 廉 操 作 简 单 等 优 势, 并 可 随 时 观 察 病 情 发 展 而 VTQ 技 术 在 提 供 临 床 医 师 所 需 要 的 超 声 声 像 图 及 测 量 结 果 基 础 上, 更 能 定 量 反 应 出 甲 状 腺 弥 漫 性 疾 病 与 正 常 甲 状 腺 组 织 的 弹 性 特 征, 弥 补 以 往 传 统 弹 性 成 像 技 术 对 甲 状 腺 组 织 评 判 标 准 不 客 观 缺 乏 定 量 指 标 等 不 足 有 助 于 临 床 提 高 鉴 别 HT 和 GD 的 准 确 性, 为 临 床 医 师 在 治 疗 方 法 的 选 择 上 提 供 参 考 依 据 参 考 文 献 [1] 陆 再 英, 钟 南 山. 内 科 学 [M].7 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社, 2008: [2] 谢 萍, 肖 萤, 刘 芳, 等. 实 时 超 声 弹 性 成 像 在 亚 急 性 甲 状 腺 炎 中 的 初 步 应 用 [J]. 中 国 超 声 医 学 杂 志,2010,26(5): [3] 熊 毅, 欧 国 成. 实 时 超 声 弹 性 成 像 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 初 步 应 用 [J]. 中 国 血 液 流 变 学 杂 志,2010,20(2): [4] LuoS,KimEH,DigheM,etal.Thyroidnoduleclasificationusing ultrasoundelastographyvialineardiscriminantanalysis[j].ultra sonics,2011,51(4): [5] VorlanderC,WolfJ,SaalabianS,etal.Real timeultrasoundelas tography anoninvasivediagnosticprocedureforevaluatingdomi nantthyroidnodules[j].langenbecksarchsurg,2010,395(7): [6] DingJ,ChengH,NingC,etal.Quantitativemeasurementforthy roidcancercharacterizationbasedonelastography[j].jultra soundmed,2011,30(9): [7] BhatiaKS,RasalkarDP,LeeYP,etal.Cysticchangeinthyroid nodules:aconfoundingfactorforreal timequalitativethyroidultra soundelastography[j].clinradiol,2011,66(9): [8] 甘 科 红, 丛 淑 珍, 冯 占 武, 等. 甲 状 腺 结 节 性 疾 病 超 声 弹 性 成 像 误 诊 原 因 分 析 [J]. 中 国 超 声 医 学 杂 志,2011,27(6): [9] ZhangY,GaoY,LiM,etal.Avidityofthyroglobulinantibodyin setafrompatientswithhashimoto sthyroiditiswithdiferentthy roidfunctionalstatus[j].clinexpimmunol,2010,161(1): [10] 刘 凤 菊, 勇 强, 陶 虹. 超 声 实 时 组 织 弹 性 成 像 技 术 在 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 中 的 应 用 [J]. 临 床 超 声 医 学 杂 志,2012,14 (11): [11] OsakiA,KubotaT,SudaT,etal.Shearwavevelocityisauseful markerformanagingnonalcoholicsteatohepatitis[j].worldjgas troenterol,2010,16(23): [12] 张 凤 娟, 纪 晓 惠, 孟 洁, 等. 声 触 诊 组 织 量 化 技 术 在 桥 本 氏 甲 状 腺 炎 诊 断 中 的 应 用 价 值 [J]. 中 华 超 声 影 像 学 杂 志,2011,20 (9): [13] 张 毅, 张 超, 杨 琰, 等. 声 辐 射 力 脉 冲 成 像 技 术 初 步 评 价 甲 状 腺 弥 漫 性 病 变 [J]. 医 学 研 究 杂 志,2012,4(16):25-7. Evaluationtheapplicationvalueofvirtualtouchfordifusethyroiddiseases ZhangShenglong 1,DengKexue 2,SuiXiufang 1,etal ( 1 DeptofDiagnosticUltrasound, 2 DeptofImaging,TheAfiliatedProvincialHospitalof AnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Atotalof99patientswithdifusethyroiddiseasesweredividedintotwogroups:onegroupincluded45 caseswithgrave sdisease(gd),theothergroupincluded54caseswithhashimoto sthyroiditis(ht).virtual touchtisuequantification(vtq)techniquewasusedtomeasuretheshearwavevelocities(smv)ofthyroidlobes ofthetwogroups,andthecontrolgroupincluded64peoplewhohadnormalthyroidfunctionandultrasonoscopy. Theresultsofthethreegroupswerecompared.ThevalueofSMVamongtheGDgroup,thecontrolgroupandthe HTgroup,inturn,increased,withstatisticalysignificantdiferences(P<0 05).Receiveroperatingcharacteris tic(roc)curvewasdrawntoasesthediagnosticaccuracy.thesensitivityandspecificityofsmv(cut ofvalue =2.20m/s)indiagnosingGDandHTwas90.7% and84.4% respectively.thepositivelikelihoodratio(lr+) andnegativelikelihoodratio(lr-)was5.81and0.11respectively.theyoudenindexwas75.1%.inconclu sion,vtqtechnologyonthebasisofconventionaldopplerultrasoundcanasesthethyroidtisuequantitatively, andhelpclinicalidentificationofgdandht. Keywords virtualtouchtisuequantification;ultrasonography;thyroid

138 1164 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 鼻 咽 癌 静 态 IMRT 与 VMAT 同 步 加 量 放 疗 剂 量 学 比 较 唐 正 中, 吴 爱 东, 钱 立 庭, 刘 磊, 周 解 平 摘 要 选 择 21 例 同 步 加 量 调 强 放 射 治 疗 (SMART) 鼻 咽 癌 患 者, 在 计 划 系 统 中 以 相 同 处 方 剂 量 和 目 标 限 量 要 求 分 别 设 计 9 野 静 态 调 强 (simrt) 和 双 弧 容 积 旋 转 调 强 放 射 治 疗 (VMAT) 计 划, 满 足 95% 靶 体 积 达 到 处 方 剂 量 要 求 的 前 提 下, 比 较 两 种 计 划 的 靶 区 剂 量 危 及 器 官 和 正 常 组 织 的 受 照 剂 量 以 及 机 器 跳 数 (MU) 和 治 疗 时 间 的 差 异 结 果 显 示 两 种 计 划 靶 区 最 大 最 小 剂 量 以 及 均 匀 性 指 数 差 异 均 无 统 计 学 意 义, 但 VMAT 靶 区 的 适 形 指 数 (CI) 显 著 提 高 (t=-3.86, P<0.05), 转 移 淋 巴 结 计 划 靶 体 积 (PGTVnd) 高 危 淋 巴 引 流 区 计 划 靶 体 积 (PTV1) 和 预 防 照 射 淋 巴 引 流 区 计 划 靶 体 积 (PTV2) 的 平 均 剂 量 降 低, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) VMAT 计 划 的 脑 干 脊 髓 和 视 交 叉 最 大 剂 量 以 及 双 侧 腮 腺 的 60% 体 积 受 到 的 剂 量 (D 60% ) 都 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) VMAT 计 划 正 常 组 织 受 照 5Gy 体 积 (V 5 ),V 10 和 V 15 略 高 于 simrt 计 划 值 (P>0 05), 但 V 20 V 25 V 30 V 35 V 40 V 45 V 50 和 平 均 剂 量 统 计 明 显 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量 (P<0 05,P<0 01);VMAT 计 划 平 均 总 MU 和 治 疗 时 间 分 别 减 少 约 14 2% 和 68 8% 关 键 词 鼻 咽 癌 / 放 射 治 疗 ; 同 步 加 量 调 强 放 射 治 疗 ; 容 积 旋 转 调 强 放 疗 ; 静 态 调 强 放 射 治 疗 ; 剂 量 学 中 图 分 类 号 R739.63;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 目 前, 鼻 咽 癌 放 疗 已 广 泛 采 用 同 步 加 量 调 强 放 射 治 疗 (simultaneousmodulatedacceleratedradiother apy,smart) 技 术, 该 技 术 在 不 降 低 鼻 咽 肿 瘤 剂 量 的 前 提 下, 可 有 效 降 低 腮 腺 等 正 常 组 织 的 受 照 体 积 和 剂 量, 降 低 口 干 的 发 生 率, 提 高 放 疗 疗 效 及 患 者 的 生 活 质 量 [1] 但 以 静 态 或 动 态 调 强 放 疗 为 代 表 的 常 规 调 强 放 疗 (intensitymodulatedradiationtherapy, IMRT) 实 际 治 疗 时 间 较 长, 增 加 了 治 疗 中 不 确 定 影 响 因 素, 亦 增 加 了 患 者 不 适 感 [2] 近 年 来, 容 积 旋 转 调 强 放 射 治 疗 (volumetricmodulatedarctherapy, VMAT) 已 逐 渐 应 用 于 临 床, 与 常 规 IMRT 相 比, 接 收 基 金 项 目 : 高 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2010B380) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院 放 疗 科, 合 肥 作 者 简 介 : 唐 正 中, 女, 硕 士 研 究 生 ; 吴 爱 东, 男, 副 教 授, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:aid [email protected] VMAT 有 相 近 或 更 好 的 剂 量 分 布, 并 可 减 少 机 器 跳 数 (monitorunit,mu) 以 及 患 者 的 治 疗 时 间 [3] 该 研 究 通 过 比 较 21 例 鼻 咽 癌 同 步 加 量 静 态 调 强 (step andshootimrt,simrt) 与 VMAT 计 划, 分 析 两 种 技 术 在 靶 区 剂 量 分 布 和 正 常 组 织 受 照 剂 量 上 的 差 异, 以 期 为 临 床 工 作 提 供 一 定 的 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 选 择 21 例 经 病 理 检 查 证 实 为 低 分 化 鳞 癌 的 鼻 咽 癌 放 疗 患 者, 且 无 放 疗 禁 忌 证 男 15 例, 女 6 例, 年 龄 31~71 岁, 中 位 年 龄 49 5 岁 其 中 T1 期 2 例 T2 期 3 例 T3 期 12 例 T4 期 4 例 患 者 均 签 署 放 疗 知 情 同 意 书, 在 kv 级 图 像 引 导 加 速 器 上 按 医 师 要 求 的 时 间 行 锥 形 束 CT 图 像 引 导, 确 认 摆 位 误 差 <3mm 后 实 施 调 强 放 疗 1.2 体 位 固 定 和 CT 扫 描 所 有 患 者 取 仰 卧 位, 采 用 头 枕 加 头 颈 肩 热 塑 面 膜 固 定, 做 好 体 表 标 记 并 行 螺 旋 CT 扫 描, 扫 描 范 围 从 头 顶 至 胸 骨 切 迹 下 2 cm, 层 厚 3mm, 扫 描 的 CT 图 像 经 网 络 传 输 到 ADAC Pinnacle310.0 治 疗 计 划 系 统 1.3 靶 区 和 危 及 器 官 的 勾 画 参 照 2010 年 鼻 咽 调 强 放 疗 专 家 共 识, 医 师 在 三 维 重 建 后 的 CT 图 像 或 CT 与 MRI 融 合 图 像 上 逐 层 勾 画 鼻 咽 部 和 颈 部 转 移 淋 巴 结 大 体 肿 瘤 靶 体 积 (grostargetvolume,gtvnx GTVnd) 临 床 靶 体 积 与 高 危 淋 巴 引 流 区 的 临 床 靶 体 积 (clinicaltargetvolume,ctv1) 以 及 需 预 防 照 射 的 淋 巴 结 引 流 区 (CTV2) 依 照 本 单 位 的 摆 位 误 差 数 据 相 应 外 扩 得 到 各 部 分 的 计 划 靶 体 积 (planningtar getvolume,ptv) 并 分 别 定 义 为 PGTV PGTVnd PTV1 PTV2 危 及 器 官 (organatrisk,oar) 参 照 ICRU83 号 报 告 进 行 定 义 和 勾 画 OAR 主 要 包 括 脑 干 脊 髓 颞 叶 视 神 经 视 交 叉 垂 体 颞 颌 关 节 腮 腺 等 1.4 治 疗 计 划 设 计 患 者 计 划 均 采 用 6MV X 线 同 步 加 量 调 强 照 射 技 术, 计 划 靶 体 积 的 处 方 剂 量 PGTV 为 2.27Gy/ 次 PGTVnd 为 2.2Gy/ 次 PTV1 为 2Gy/ 次 PTV2 为 1.8Gy/ 次, 共 分 30 次 同 期 完 成, 总 剂 量 分 别 为 Gy 在 计 划 系 统 上 对 21 例 患 者 分 别 设 计 9 个 固 定 野 simrt 和 双 弧

139 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1165 VMAT 计 划,sIMRT 计 划 的 9 个 照 射 野 在 360 内 等 角 布 野, 相 邻 射 野 间 隔 为 40, 治 疗 床 及 准 直 器 角 度 均 为 0 ; 双 弧 VMAT 计 划 治 疗 床 角 度 为 0, 机 架 先 逆 时 针 从 179 旋 转 至 181, 准 直 器 为 350 ; 再 顺 时 针 自 181 旋 转 至 179, 准 直 器 为 10 两 种 计 划 的 剂 量 约 束 条 件 和 优 化 参 数 相 同, 并 采 用 靶 区 平 均 剂 量 归 一 方 式, 要 求 所 有 95% 计 划 靶 体 积 不 低 于 相 应 处 方 剂 量 要 求 正 常 组 织 剂 量 限 值 : 脊 髓 <45Gy; 脑 干 <54Gy; 腮 腺 V 30 <50%; 晶 状 体 <8Gy; 视 交 叉 <54Gy; 颞 颌 关 节 <70Gy; 颞 叶 <60Gy, 眼 球 < 50Gy 1.5 治 疗 计 划 评 估 利 用 剂 量 体 积 直 方 图 (dose volumehistogram,dvh) 对 两 种 计 划 的 计 划 靶 区 OAR 和 正 常 组 织 的 受 照 射 剂 量 进 行 统 计 学 分 析, 如 下 : 1 所 有 计 划 靶 区 (PGTV PGTVnd PTV1 PTV2) 剂 量 和 体 积 参 数 : 靶 区 最 大 剂 量 D max 最 小 剂 量 D min 平 均 剂 量 D mean 以 及 95% 等 剂 量 曲 线 所 包 围 PTV 体 积 V 95%,5% 和 95%PTV 体 积 所 受 的 照 射 剂 量 D 5% 和 D 95% 2 PTV 靶 区 剂 量 均 匀 性 指 数 (homogeneityindex, HI) [4] : 验 图 1 IMRT 与 VMAT 治 疗 计 划 的 DVH 比 较 2 结 果 2.1 DVH 图 和 等 剂 量 线 分 布 比 较 21 例 患 者 两 种 计 划 的 剂 量 分 布 及 计 划 参 数 都 能 达 到 临 床 处 方 剂 量 要 求 DVH 图 显 示 VMAT 计 划 的 计 划 靶 区 剂 量 统 计 优 于 simrt 计 划, 见 图 1;VMAT 靶 区 剂 量 覆 盖 和 适 形 性 也 好 于 simrt 计 划 结 果, 图 2 为 1 例 患 者 两 种 计 划 的 横 断 面 等 剂 量 分 布 比 较 图 HI= D 5% D 95% HI 值 越 低 ( 即 越 接 近 1), 表 示 靶 区 剂 量 均 匀 性 越 好, 反 之,HI 值 越 大 表 明 剂 量 不 均 匀 性 较 大 3 PTV 靶 区 剂 量 适 形 指 数 (comfomityindex,ci) [5] : CI= V T,ref V T,ref V T V ref 其 中,V T,ref 为 参 考 等 剂 量 线 所 覆 盖 的 所 有 PTV 体 积 ;V T 为 PTV 体 积 ;V ref 为 参 考 等 剂 量 线 所 包 围 的 所 有 体 积,CI 值 为 0~1,CI 值 越 大, 表 示 适 形 度 越 好, 等 于 1 时 最 理 想, 等 于 0 时 最 差 4 主 要 OAR 受 量 : 脊 髓 和 晶 体 的 最 大 剂 量 ; 脑 干 神 交 叉 和 视 神 经 的 最 大 剂 量 及 平 均 剂 量, 腮 腺 平 均 剂 量 及 33% 体 积 受 到 的 剂 量 (D 33 ) 以 及 D 50 和 D 60, 扣 除 所 有 PTV 后 靶 区 外 正 常 组 织 体 积 [ 本 文 定 义 为 全 身 (body,b) 减 去 PTV 后 体 积, 即 [B-P] 受 照 平 均 剂 量 及 受 照 5Gy 体 积 (V 5 ) 以 及 V 10 V 15 V 20 V 25 V 30 V 35 V 40 V 45 V 50 占 总 B-P 体 积 百 分 比 5 两 种 计 划 的 平 均 MU 和 治 疗 时 间 1.6 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17 0 统 计 软 件 进 行 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 数 据 进 行 参 数 间 配 对 t 检 图 2 两 种 计 划 横 断 面 等 剂 量 线 分 布 比 较 图 A:sIMRT;B:VMAT 2.2 计 划 靶 区 剂 量 学 参 数 比 较 VMAT 和 simrt 计 划 所 有 计 划 靶 区 (PGTV PGTVnd PTV1 PTV2) 的 最 大 最 小 剂 量 以 及 HI 相 差 不 大, 但 VMAT 计 划 的 PGTVnd PTV1 和 PTV2 平 均 剂 量 D mean 较 低, 所 有 计 划 靶 区 的 靶 区 CI 较 高, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0 05), 见 表 OAR 剂 量 比 较 VMAT 计 划 的 脑 干 脊 髓 最 大 剂 量 以 及 双 侧 腮 腺 D 60% 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05) 晶 体 最 大 剂 量 视 神 经 与 脑 干 平 均 剂 量 双 侧 腮 腺 平 均 剂 量 D 33% 和 D 50% 两 种 计 划 的 结 果 相 似, 见 表 2

140 1166 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 表 1 两 种 计 划 间 靶 区 的 剂 量 学 指 标 ( 珋 x±s) 参 数 simrt VMAT t 值 P 值 PGTV D max (Gy) 74.85± ± D min (Gy) 60.03± ± D mean (Gy) 71.15± ± HI 1.08± ± CI 0.36± ± PGTVnd D max (Gy) 70.76± ± D min (Gy) 64.30± ± D mean (Gy) 68.80± ± HI 1.04± ± CI 0.08± ± PTV1 D max (Gy) 74.86± ± D min (Gy) 47.33± ± D mean (Gy) 67.16± ± HI 1.17± ± CI 0.31± ± PTV2 D max (Gy) 74.87± ± D min (Gy) 33.96± ± D mean (Gy) 61.28± ± HI 1.29± ± CI 0.62± ± 表 2 两 种 计 划 间 OAR 的 剂 量 学 指 标 ( 珋 x±s) 参 数 (Gy) simrt VMAT t 值 P 值 脑 干 D max 53.76± ± D mean 29.59± ± 脊 髓 D max 39.02± ± 晶 体 D max ( 左 ) 6.18± ± D max ( 右 ) 6.16± ± 视 神 经 D max ( 左 ) 31.40± ± D mean ( 左 ) 22.6± ± D max ( 右 ) 25.64± ± D mean ( 右 ) 24.18± ± 腮 腺 D mean ( 左 ) 34.27± ± D 33% ( 左 ) 36.27± ± D 50% ( 左 ) 29.98± ± D 60% ( 左 ) 28.13± ± D mean ( 右 ) 34.01± ± D 33% ( 右 ) 36.06± ± D 50% ( 右 ) 30.14± ± D 60% ( 右 ) 28.05± ± 靶 区 外 正 常 组 织 受 照 剂 量 VMAT 计 划 靶 区 外 正 常 组 织 (B-P) 低 剂 量 区 受 照 体 积 V 5,V 10 高 于 simrt 计 划 值, 但 差 异 无 统 计 学 意 义 ; 而 V 15 V 20 V 25 V 30 V 35 V 40 V 45 V 50 和 V mean 明 显 小 于 simrt 计 划 相 应 剂 量, 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 05,P< 0 01), 见 表 3 表 3 两 种 计 划 间 正 常 组 织 的 剂 量 学 指 标 ( x±s) 珋 参 数 (Gy) simrt VMAT t 值 P 值 V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V ± ± V mean 17.25± ± MU 值 740±91 635± MU 和 治 疗 时 间 比 较 VMAT 和 simrt 计 划 的 平 均 MU 差 异 显 著, 其 值 分 别 为 635±62 和 740± 91(t=6.14,P=0 00),VMAT 的 平 均 MU 减 少 105 (14 2%) VMAT 双 弧 计 划 平 均 治 疗 时 间 是 2~3 min,simrt 计 划 平 均 治 疗 时 间 是 7~9min,VMAT 比 simrt 治 疗 时 间 平 均 减 少 约 68.8% 3 讨 论 Vanetietal [6] 比 较 29 例 头 颈 部 肿 瘤 单 双 弧 VMAT 以 及 7~9 野 IMRT 计 划, 结 果 表 明 两 组 计 划 的 PTV 剂 量 线 覆 盖 范 围 和 适 形 性 相 似,VMAT 计 划 的 OAR 照 射 量 减 少, 平 均 剂 量 较 低 而 Oliveret al [7] 利 用 模 体 对 VMAT 和 IMRT 计 划 质 量 进 行 了 比 较,VMAT 计 划 在 靶 区 适 形 度 靶 区 均 匀 性 以 及 对 模 拟 OAR 的 保 护 方 面 均 优 于 IMRT 计 划 这 些 不 同 可 能 与 很 多 因 素 有 关, 包 括 用 于 VMAT 计 划 弧 的 数 量 ( 一 般 双 弧 计 划 好 于 单 弧 计 划 ) VMAT 优 化 方 法 的 类 型 和 静 态 子 野 调 强 的 最 大 子 野 数 有 关, 一 般 来 说,IMRT 可 以 通 过 增 加 更 多 的 子 野 数 来 得 到 更 高 质 量 的 治 疗 计 划 本 研 究 21 例 鼻 咽 癌 simrt 与 VMAT 计 划 比 较 结 果 显 示 两 种 计 划 的 靶 区 剂 量 分 布 均 能 满 足 临 床 治 疗 要 求, 但 VMAT 计 划 的 靶 区 剂 量 的 适 形 性 优 于 simrt 计 划,VMAT 计 划 可 降 低 患 者 脑 干 脊 髓 和 视 交 叉 的 最 大 照 射 剂 量, 对 这 些 重 要 OAR 具 有 一 定 保 护 作 用, 但 对 晶 体 和 视 神 经 等 其 他 [8] 重 要 器 官 保 护 优 势 不 明 显 一 些 研 究 报 道, 由 于 VMAT 是 360 的 弧 形 治 疗, 在 降 低 靶 区 外 正 常 组 织 的 平 均 受 照 剂 量 的 同 时, 低 剂 量 辐 射 区 域 也 将 增 加

141 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1167 本 组 VMAT 计 划 靶 区 外 正 常 组 织 在 5~15Gy 的 低 剂 量 辐 射 区 平 均 体 积 稍 大 于 IMRT 计 划, 但 高 于 20 Gy 的 高 剂 量 区 照 射 体 积 和 总 平 均 剂 量 却 明 显 降 低 与 常 规 IMRT 相 比,VMAT 最 大 的 优 势 是 可 提 高 工 作 效 率, 表 现 在 加 速 器 总 MU 及 总 治 疗 时 间 的 减 少 本 研 究 21 例 患 者 VMAT 计 划 的 平 均 MU 比 simrt 减 少 14.2%, 平 均 总 治 疗 时 间 减 少 约 68 8%, 患 者 可 在 2~4min 内 完 成 治 疗 VMAT 照 射 过 程 中 的 每 个 瞬 间 射 野 面 积 一 般 都 大 于 simrt 的 子 野 面 积, 所 以 前 者 的 射 线 利 用 率 高, 加 速 器 所 需 的 总 输 出 量 ( 总 MU) 减 少 VMAT 总 治 疗 时 间 的 缩 短 不 仅 可 提 高 设 备 使 用 率, 也 可 减 轻 患 者 不 舒 适 度, 减 小 患 者 分 次 治 疗 内 体 位 移 动 器 官 体 积 变 化 和 运 动 等 不 确 定 性 因 素 对 放 疗 精 度 的 影 响, 更 重 要 的 是 治 疗 时 间 的 缩 短 也 可 增 加 肿 瘤 的 相 对 生 物 学 效 应, 并 对 开 展 图 像 引 导 下 的 调 强 放 射 治 疗 也 具 有 重 要 的 意 义 参 考 文 献 [1] KoomW S,KimTH,ShinKH,etal.SMART(simultaneous modulatedacceleratedradiotherapy)forlocalyadvanced,naso pharyngealcarcinomas[j].headneck,2007,30(2): [2] 陈 进 琥, 尹 勇, 刘 同 海, 等, 颈 段 食 管 癌 固 定 野 调 强 与 旋 转 调 强 放 疗 计 划 比 较 研 究 [J]. 中 华 放 射 肿 瘤 学 杂 志,2010,19(5): [3] VanBenthuysenL,HalesL,PodgorsakMB.Volumetricmodula tedarctherapyvs.imrtfortreatmentofdistalesophagealcancer [J].MedicalDosimetry,2011,36(4): [4] BraggCM,ConwayJ,RobinsonMH.Theroleofintensity modu latedradiotherapyinthetreatmentofparotidtumors[j].intjra diatoncolbiolphys,2002,53(3): [5] Van trieta,maka C,MoerlandM A,etal.A conformation numbertoquantifythedegreeofconformalityinbrachytherapyand externalbeamiradiation:applicationtotheprostate[j].intjra diatoncolbiolphys,1997,37(3): [6] VanetiE,ClivioA,NicoliniG,etal.Volumetricmodulatedarc radiotherapyforcarcinomasoftheoropharynx,hypopharynxand larynx:atreatmentplanningcomparisonwithfixedfieldimrt [J].RadiotherOncol,2009,92(1): [7] OliverM,AnsbacherW,Beckham W A.Comparingplanning time,deliverytimeandplanqualityforimrt,rapidarcandtomo therapy[j].japplclinmedphys,2009,10(4): [8] ZhangP,HappersetL,HuntM,etal.Volumetricmodulatedarc therapy:planningandevaluationforprostatecancercases[j].int JRadiatOncolBiolPhys,2010,76(5): Dosimetriccomparisonofintensitymodulatedradiotherapywith volumetricmodulatedarctherapyforsimultaneousmodulated acceleratedradiotherapyofnasopharyngealcarcinoma TangZhengzhong,WuAidong,QianLiting,etal (DeptofRadiationOncology,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract 21patientsforNPCtreatedwithsimultaneousmodulatedacceleratedradiotherapy(SMART)werese lectedrandomly.botha9 fieldstepandshootimrt(simrt)planandadouble arcvolumetricmodulatedarc therapy(vmat)weredesignedforeachpatientusingthesameprescribeddoseandoptimizationconstraints.al planswereoptimizedtomeettherequirementof95% planningtargetvolume(ptv)coveredbyprescribeddose. ThedosimetricparametersofPTVandorganatrisk(OAR),themonitorunits(MU)andmeandeliverytimewere compared.theptvmaximumdose(d max ),PTVminimumdose(D min ),andhomogeneityindex(hi)werestatis ticalysimilarbetweenthesimrtandvmatplans,respectively.however,theconformalityindex(ci)ofvmat planhadastatisticalysignificantincrease(t=-3 86,P<0 05).ThemeandosetoPGTVnd,PTV1andPTV2of VMATplanwasalsolowerthanthatofthesIMRTplanandthereweresignificantdiferences.Themaximumdoseof brain stem,spinalcord,opticchiasmandparotidd 60% byvmatplanningweresignificantlylowerthanthoseby simrtplanning(p<0 05).ThenormaltisueV 5,V 15 andv 20 invmatplanwasslightlyhigherthanthoseof simrtplan(p>0 05),however,theVMATplanswerestatisticalysignificantreductionintermsofV 20,V 25, V 30,V 35,V 40,V 45,V 50 andmeandoseofthenormaltisue(p<0 05,P<0 01).Thetotalmonitorunitsand meandeliverytimeofvmatweresignificantlylowerbyabout14.2% and68.8% incomparisonwiththatbythe simrtrespectively. Keywords nasopharyngealneoplasm/radiotherapy;simultaneousmodulatedacceleratedradiotherapy;volumetric modulatedarctherapyradiotherapy;stepandshootimrt;dosimetry

142 1168 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 右 美 托 咪 定 对 Supreme 喉 罩 置 入 丙 泊 酚 EC 50 的 影 响 李 云 1, 王 斌 1,2, 张 野 1, 胡 宪 文 1 1, 翁 立 军 摘 要 择 期 全 麻 妇 科 手 术 患 者 64 例 (ASAⅠ ~Ⅱ 级 ), 随 机 分 为 两 组 : 对 照 组 和 右 美 托 咪 定 (Dex) 组 Dex 组 麻 醉 诱 导 前 静 脉 泵 注 Dex1.0μg/kg(15min), 对 照 组 给 予 等 量 生 理 盐 水 麻 醉 诱 导 予 以 瑞 芬 太 尼 2μg/kg 复 合 丙 泊 酚 靶 控 输 注 (TCI), 按 Dixon 序 贯 法 调 节 丙 泊 酚 的 效 应 室 靶 浓 度, 初 始 浓 度 为 3.0μg/ml, 如 果 出 现 插 喉 罩 阳 性 反 应, 则 使 用 上 一 级 浓 度 ; 如 果 出 现 阴 性 反 应, 则 使 用 下 一 级 浓 度 计 算 Supreme 喉 罩 置 入 时 丙 泊 酚 半 数 有 效 浓 度 (EC 50 ) 和 95% 可 信 区 间 (95% CI) 结 果 显 示 对 照 组 Supreme 喉 罩 置 入 时 丙 泊 酚 的 EC 50 为 2.27μg/ml,95%CI 为 2 20~2 33μg/ml Dex 组 Supreme 喉 罩 置 入 时 丙 泊 酚 的 EC 50 为 1 57μg/ml,95%CI 为 1 47~1 68μg/ml 关 键 词 度 中 图 分 类 号 右 美 托 咪 定 ; 丙 泊 酚 ; 靶 控 输 注 ; 喉 罩 ; 半 数 有 效 浓 R614.2;R971.2 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 右 美 托 咪 定 (dexmedetomidine,dex) 是 一 种 高 选 择 性 α 2 肾 上 腺 素 受 体 激 动 剂, 具 有 抗 交 感 镇 静 遗 忘 抗 焦 虑 抗 应 激 反 应 的 作 用, 可 以 减 少 麻 醉 剂 的 用 量 并 减 轻 气 管 插 管 反 应, 在 临 床 实 践 中 具 有 重 要 价 值 [1] 丙 泊 酚 把 控 输 注 技 术 已 在 临 床 中 广 泛 应 用 [2], 然 而 目 前 研 究 Dex 对 麻 醉 诱 导 时 瑞 芬 太 尼 联 合 靶 控 输 注 丙 泊 酚 抑 制 插 入 喉 罩 反 应 的 半 数 有 效 浓 度 影 响 尚 鲜 有 报 道 该 研 究 旨 在 观 察 Dex 对 瑞 芬 太 尼 复 合 丙 泊 酚 靶 控 输 注 (target controledinfusion, TCI) 麻 醉 Supreme 喉 罩 (SLMA) 置 入 时 丙 泊 酚 半 数 有 效 浓 度 (medianefectiveconcentration,ec 50 ) 的 影 响, 为 临 床 应 用 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 选 择 择 期 全 麻 下 妇 科 手 术 患 者 64 例,ASAⅠ 或 Ⅱ 级, 年 龄 18~45(37 5±8 3) 岁, 体 重 45~65kg 排 除 标 准 : 有 循 环 神 经 系 统 肝 肾 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 教 育 厅 基 金 ( 编 号 :KJ ) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 二 附 属 医 院 麻 醉 科, 合 肥 皖 南 医 学 院 弋 矶 山 医 院 麻 醉 科, 芜 湖 作 者 简 介 : 李 云, 男, 副 主 任 医 师 ; 张 野, 男, 教 授, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 等 重 要 脏 器 功 能 障 碍 ;Malampati 分 级 Ⅲ 或 Ⅳ 级, 头 颈 活 动 受 限, 张 口 度 <2 5cm; 体 重 指 数 30kg/ m 2 ; 术 前 长 期 服 用 镇 痛 或 镇 静 药 物 史 患 者 随 机 分 为 Dex 组 和 对 照 组 本 研 究 经 患 者 知 情 同 意 及 本 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准 1.2 主 要 药 物 与 仪 器 Dex( 批 号 : , 江 苏 恒 瑞 医 药 股 份 有 限 公 司 ); 丙 泊 酚 ( 批 号 :JT943, 阿 斯 利 康 公 司 ); 瑞 芬 太 尼 ( 批 号 : , 宜 昌 人 福 药 业 有 限 公 司 ); 多 功 能 生 命 体 征 监 护 仪 (Philips MP50, 美 国 Philips 公 司 ); 多 功 能 麻 醉 机 (Ohmeda, 美 国 Ohmeda 公 司 ) 1.3 麻 醉 方 法 患 者 未 用 术 前 药, 入 室 后 开 放 上 肢 静 脉, 多 功 能 生 命 体 征 监 护 仪 连 续 监 测 平 均 动 脉 压 (mean arterialpresure,map) 心 率 (heartrate, HR) 脉 搏 氧 饱 和 度 (pulseoxygensaturation,spo 2 ) 呼 气 末 二 氧 化 碳 分 压 (end tidalcarbondioxidepartial presure,p ET CO 2 ) 和 脑 电 双 频 指 数 (bispectralindex, BIS) 麻 醉 开 始 前 两 组 均 预 输 注 6ml/kg 乳 酸 钠 林 格 氏 液, 随 后 持 续 输 注 10ml/(kg h) 乳 酸 钠 林 格 氏 液 Dex 组 给 予 Dex1.0μg/kg( 原 液 2mg 用 生 理 盐 水 稀 释 至 50ml, 即 4μg/ml) 静 脉 泵 注 15min, 对 照 组 给 予 同 等 量 的 生 理 盐 水 静 脉 泵 注 丙 泊 酚 采 用 靶 控 输 注 (Marsh 药 代 动 力 学 模 型 ), 达 效 应 室 浓 度 后 且 BIS<60 时, 缓 慢 静 推 瑞 芬 太 尼 2μg/kg,2 min 后 置 入 SLMA 丙 泊 酚 的 初 始 靶 浓 度 为 3 0μg/ ml, 依 次 降 低 丙 泊 酚 靶 浓 度, 每 次 降 低 0 2μg/ml 以 出 现 SLMA 阳 性 反 应 ( 置 入 失 败 ) 的 上 一 级 为 入 选 本 研 究 的 第 1 例, 共 56 例 患 者 纳 入 本 研 究 进 行 统 计 分 析 按 Dixon 序 贯 法 调 节 丙 泊 酚 的 靶 控 浓 度 : 如 果 SLMA 阳 性 反 应, 则 后 一 例 患 者 靶 浓 度 增 加 0 2μg/ml; 如 果 SLMA 阴 性 反 应 ( 置 入 成 功 ), 则 后 一 例 患 者 靶 浓 度 降 低 0 2μg/ml 采 用 改 良 Muzi 评 分 ( 下 颌 活 动 度 : 完 全 松 弛 1 分, 轻 度 抵 抗 2 分, 紧 但 能 张 开 3 分, 关 闭 4 分 ; 咳 嗽 和 体 动 : 均 为 1 分,1 次 或 2 次 咳 嗽 为 2 分,3 次 或 多 次 咳 嗽 为 3 分, 呛 咳 / 体 动 4 分 ) 和 SLMA 置 入 后 MAP HR 的 变 化 评 价 SLMA 置 入 情 况, 一 次 操 作 不 能 满 足 SLMA 置 入 成 功 标 准 者 均 视 为 置 入 失 败 ( 通 过 加 深 麻 醉 再 次 行 SLMA 置 入 或 更 换 为 气 管 导 管 ) 丙 泊 酚 TCI SLMA

143 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1169 置 入 和 SLMA 置 入 情 况 的 评 估 分 别 由 不 同 麻 醉 医 师 独 立 执 行 SLMA 阴 性 反 应 的 标 准 为 :Muzi 评 分 中 2 项 评 价 指 标 即 下 颌 活 动 度 和 咳 嗽 体 动 的 评 价 均 2 及 SLMA 置 入 后 3min 内 MAP 和 HR 增 加 不 超 过 基 础 值 20% 当 MAP<7.3kPa 或 下 降 幅 度 > 基 础 值 30% 时 给 予 麻 黄 碱 5~10mg 静 脉 注 射, 若 HR <50 次 /min, 给 予 阿 托 品 0 3~0 5mg 静 脉 注 射 1.4 观 察 指 标 患 者 常 规 监 测 MAP HR SPO 2 P ET CO 2, 记 录 注 药 前 (T 1 ) 麻 醉 诱 导 前 (T 2 ) SLMA 置 入 前 (T 3 ) 和 置 入 后 1min(T 4 ) 3min(T 5 ) 的 血 流 动 力 学 参 数 记 录 每 个 靶 浓 度 的 有 效 病 例 数 无 效 病 例 数 及 置 入 SLMA 成 功 率 采 用 Dixon 序 贯 法 计 算 两 组 50% 患 者 置 入 SL MA 时 所 需 的 丙 泊 酚 EC 50 和 EC 50 的 95% 可 信 区 间 (95% CI), 具 体 计 算 过 程 如 下 : 记 录 各 组 各 靶 浓 度 下 SLMA 阳 性 反 应 的 例 数 (s) 和 阴 性 反 应 的 例 数 (r), 计 算 各 靶 浓 度 的 对 数 (LogX) 及 该 浓 度 下 SLMA 阳 性 反 应 和 阴 性 反 应 的 例 数 之 和 (n),slma 置 入 成 功 率 (p), 两 相 邻 靶 浓 度 对 数 的 差 值 (d),ec 50 的 标 准 误 记 为 Sm EC 50 的 对 数 值 :logec 50 = nlogx/ n EC 50 的 95% CI 的 对 数 值 :(logec SmlogEC 50,logEC SmlogEC 50 ), 其 中 SmlogEC 50 =d 槡 p(1-p)/(n-1 ) 1.5 统 计 学 处 理 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析 计 量 资 料 用 x±s 珋 表 示 组 内 比 较 采 用 重 复 测 量 数 据 的 方 差 分 析 ; 组 间 比 较 采 用 t 检 验 两 组 丙 泊 酚 EC 50 比 较 采 用 两 组 独 立 样 本 的 μ 检 验 2.2 喉 罩 置 入 前 后 的 血 流 动 力 学 比 较 与 T 1 时 比 较, 对 照 组 T 4~5 时 MAP 均 明 显 降 低 (t= ;P<0 05,P<0 01) T 3~5 时 HR 明 显 减 慢 (t = ;P<0 05,P<0 01),Dex 组 T 4~5 时 MAP 明 显 降 低 (t= ;P<0 05,P <0 01) T 2~5 时 HR 明 显 减 慢 (t= ;P<0 01); 与 对 照 组 比 较,Dex 组 T 3 时 MAP 明 显 升 高 T 2 时 HR 明 显 减 慢 (t= ;P<0 05,P<0 01) 见 表 丙 泊 酚 的 EC 50 对 照 组 31 例 患 者 中 从 SLMA 阴 性 反 应 与 阳 性 反 应 交 叉 出 现 时 的 病 例 开 始 计 算, 共 28 例 纳 入 序 贯 法 中 进 行 结 果 的 计 算,SLMA 阴 性 反 应 和 阳 性 反 应 的 例 数 均 为 14 例, 见 图 1 Dex 组 33 例 患 者 中 从 SLMA 阴 性 反 应 与 阳 性 反 应 交 叉 出 现 时 的 病 例 开 始 计 算, 共 28 例 纳 入 序 贯 法 中 进 行 结 果 的 计 算,SLMA 阴 性 反 应 和 阳 性 反 应 的 例 数 分 别 为 15 例 和 13 例, 见 图 2 采 用 序 贯 法 计 算 对 照 组 丙 泊 酚 EC 50 为 2 27μg/ml(95% 的 可 信 区 间 为 2 20 ~2 33μg/ml),Dex 组 丙 泊 酚 EC 50 为 1.57μg/ml (95% 的 可 信 区 间 为 1 47~1 68μg/ml),Dex 组 明 显 低 于 对 照 组 (P<0 05) 2 结 果 2.1 一 般 情 况 两 组 患 者 年 龄 体 重 身 高 等 差 异 无 统 计 学 意 义 (t= ;P>0.05), 见 表 1 表 1 两 组 患 者 的 一 般 资 料 比 较 (n=28, x±s) 珋 组 别 年 龄 ( 岁 ) 体 重 (kg) 身 高 (cm) 对 照 36.5± ± ±6.6 Dex 38.4± ± ±5.9 图 1 对 照 组 不 同 丙 泊 酚 靶 浓 度 SLMA 置 入 反 应 序 贯 图 3 讨 论 选 择 合 适 的 麻 醉 方 法 和 药 物 剂 量 是 减 少 麻 醉 不 表 2 两 组 患 者 喉 罩 置 入 前 后 的 MAP 和 HR 的 比 较 (n=28, x±s) 珋 指 标 T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 MAP(kPa) 对 照 11.5± ± ± ±1.2 ## 9.7±1.7 # Dex 11.1± ± ± ±1.3 ## 10.3±1.1 # HR( 次 /min) 对 照 78.7± ± ±10.0 ## 66.7±13.7 ## 69.1±16.3 # Dex 75.6± ±8.1 ## 60.6±8.7 ## 61.5±9.6 ## 64.0±13.3 ## 与 T 1 时 比 较 : # P<0.05, ## P<0.01; 与 对 照 组 比 较 : P<0.05, P<0.01

144 1170 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 现 时 的 病 例 开 始 计 算, 依 次 降 低 丙 泊 酚 浓 度, 浓 度 梯 度 为 0.2μg/ml, 观 察 SLMA 置 入 时 的 反 应 如 出 现 阳 性 反 应, 则 增 加 丙 泊 酚 浓 度 直 至 反 应 消 失 ; 反 之, 若 出 现 阴 性 反 应, 则 降 低 丙 泊 酚 浓 度, 观 察 连 续 的 置 入 反 应 阳 性 阴 性 拐 点 单 独 靶 控 输 注 丙 泊 酚 行 麻 醉 诱 导 时, 丙 泊 酚 抑 制 喉 罩 插 管 反 应 的 EC 50 为 3 25 μg/ml [11], 而 本 研 究 结 果 表 明, 瑞 芬 太 尼 2μg/kg 联 合 靶 控 输 注 丙 泊 酚 抑 制 插 入 SLMA 反 应 的 丙 泊 酚 EC 50 降 低 为 2.27μg/ml, 而 给 予 Dex 后 丙 泊 酚 EC 50 降 低 为 1 57μg/ml 图 2 Dex 组 不 同 丙 泊 酚 靶 浓 度 SLMA 置 入 反 应 序 贯 图 良 反 应 降 低 麻 醉 风 险 的 关 键 喉 罩 不 插 入 声 门 和 气 管 不 使 用 咽 喉 镜 对 咽 喉 部 刺 激 小, 故 已 广 泛 应 用 于 临 床 SLMA 是 根 据 食 管 引 流 型 喉 罩 的 原 理 而 研 制 出 的 新 型 一 次 性 喉 罩, 不 仅 避 免 了 交 叉 感 染, 而 且 SLMA 引 导 柄 的 弯 曲 度 符 合 口 咽 喉 部 的 生 理 解 剖 曲 度, 使 得 置 入 喉 罩 易 于 操 作, 且 对 位 更 加 精 准 [3] 丙 泊 酚 是 短 效 的 静 脉 麻 醉 药, 可 有 效 降 低 咽 喉 部 反 射, 广 泛 应 用 于 全 麻 诱 导 期 喉 罩 的 置 入, 然 而 若 单 独 应 用 丙 泊 酚, 常 需 要 较 大 剂 量 才 能 完 成 此 操 作 [4] 瑞 芬 太 尼 镇 痛 效 果 强, 起 效 迅 速, 作 用 时 间 短, 无 蓄 积 作 用, 与 丙 泊 酚 复 合 应 用 于 喉 罩 插 入 是 理 想 的 配 伍 [5] [6-7], 研 究 表 明 瑞 芬 太 尼 能 够 减 少 丙 泊 酚 置 入 喉 罩 的 用 量 Dex 是 一 种 高 选 择 性 的 α 2 肾 上 腺 素 受 体 激 动 剂, 通 过 降 低 交 感 神 经 活 性 和 镇 静 作 用, 有 效 抑 制 手 术 应 激 状 态 下 异 常 增 高 的 血 压 和 HR, 保 持 血 流 动 力 学 稳 定, 联 合 使 用 Dex 可 明 显 减 少 其 他 麻 醉 药 的 用 量 [8-9] Dex 复 合 丙 泊 酚 喉 罩 置 入 时 更 能 有 效 地 保 持 自 主 呼 吸, 但 目 前 Dex 对 麻 醉 诱 导 时 瑞 芬 太 尼 联 合 靶 控 输 注 丙 泊 酚 抑 制 插 入 SLMA 反 应 的 EC 50 影 响 研 究 较 少 Dex 对 血 流 动 力 学 的 影 响, 受 剂 量 和 给 药 速 率 的 影 响, 大 剂 量 使 用 时 可 以 直 接 收 缩 血 管 导 致 血 压 升 高 HR 下 降 明 显, 因 此 本 研 究 选 择 缓 慢 泵 注 Dixon 序 贯 法 也 称 上 下 法 或 阶 梯 法, 是 将 研 究 对 象 序 贯 地 进 行 实 验, 其 优 点 是 可 以 由 尽 量 少 的 病 例 得 出 结 论, 不 仅 可 以 节 省 时 间 和 人 力, 而 且 可 以 避 免 用 欠 佳 的 方 法 治 疗 过 多 的 病 例, 使 用 Dixon 序 贯 法 需 具 备 条 件 是 所 采 用 剂 量 便 于 更 换 且 实 验 结 果 快 速 出 现 [10] 采 用 序 贯 法 计 算 EC 50 时, 应 选 择 一 个 接 近 50% 反 应 率 的 剂 量 或 浓 度 作 为 起 始 剂 量 或 浓 度, 因 此, 本 研 究 从 SLMA 阴 性 反 应 与 阳 性 反 应 交 叉 出 参 考 文 献 [1] CaroloDS,NosamanBD,RamadhyaniU.Dexmedetomidine: areview ofclinicalapplications[j].curopinanaesthesiol, 2008,21(4): [2] YangW H,GuHB,ChenB,etal.EvaluationofSLOG/TCI I pediatricsystemontargetcontrolinfusionofpropofol[j].jtransl Med,2011,9:187. [3] EschertzhuberS,BrimacombeJ,HohlriederM,etal.TheLaryn gealmaskairwaysupreme TM asingleuselaryngealmaskairway withanoesophagealvent.arandomised,cros overstudywiththe LaryngealMaskAirwayProSeal TM inparalysed,anaesthetisedpa tients[j].anaesthesia,2009,64(1): [4] RichebéP,RivalanB,BaudouinL,etal.Comparisonofthean aestheticrequirementwithtarget controledinfusionofpropofolto insertthelaryngealtubevs.thelaryngealmask[j].eurjanaes thesiol,2005,22(11): [5] KimM K,LeeJW,JangDJ,etal.Efect siteconcentrationof remifentanilforlaryngealmaskairwayinsertionduringtarget con troledinfusionofpropofol[j].anaesthesia,2009,64(2): [6] ParkHJ,LeeJR,KimCS,etal.RemifentanilhalvestheEC 50 ofpropofolforsuccesfulinsertionofthelaryngealmaskairwayand laryngealtubeinpediatricpatients[j].anesthanalg,2007,105 (1): [7] KimHS,ParkHJ,KimCS,etal.Combinationofpropofoland remifentaniltarget controledinfusionforlaryngealmaskairwayin sertioninchildren[j].minervaanestesiol,2011,77(7): [8] RamadhyaniU,ParkJL,CaroloDS,etal.Dexmedetomidine: clinicalapplicationasanadjunctforintravenousregionalanesthe sia[j].anesthesiolclin,2010,28(4): [9] GerlachAT,MurphyCV,DastaJF.Anupdatedfocusedreview ofdexmedetomidineinadults[j].annpharmacother,2009,43 (12): [10] GooEK,OhAY,ChoSJ,etal.Optimalremifentanildosagefor intubationwithoutmusclerelaxantsinelderlypatients[j].drugs Aging,2012,29(11): [11]KodakaM,OkamotoY,HandaF,etal.Relationbetweenfenta nyldoseandpredictedec 50 ofpropofolforlaryngealmaskinsertion [J].BrJAnaesth,2004,92(2):

145 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1171 影 响 神 经 胶 质 瘤 术 后 生 存 的 相 关 因 素 分 析 程 毅 飞, 张 晓 东, 万 强, 洪 文 清, 张 昊 摘 要 回 顾 性 分 析 119 例 脑 胶 质 瘤 术 后 患 者 临 床 资 料, 以 选 定 的 10 项 因 素 为 变 量, 生 存 状 况 为 结 局 进 行 Kaplan Meier 法 分 析,Log Rank 检 验, 以 P<0 05 为 统 计 学 有 意 义 的 参 数 应 用 多 因 素 COX 回 归 模 型 分 析 单 因 素 分 析 表 明, 患 者 发 病 年 龄 50 岁 低 KPS 评 分 高 级 别 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 高 Ki 67 指 数 及 术 后 不 进 行 放 疗 患 者 预 后 较 差 (P< 0 05); 多 因 素 分 析 表 明,KPS 评 分 病 理 分 级 Ki 67 指 数 及 术 后 放 疗 对 胶 质 瘤 患 者 预 后 有 影 响 (P<0 05,P<0 01) 关 键 词 胶 质 瘤 ; 手 术 ; 生 存 分 析 ; 预 后 ; 生 存 率 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 接 收 基 金 项 目 : 卫 生 部 课 题 项 目 ( 编 号 :W ) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科, 合 肥 作 者 简 介 : 程 毅 飞, 男, 硕 士 研 究 生 ; 张 晓 东, 男, 副 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 神 经 胶 质 瘤 是 颅 内 常 见 恶 性 肿 瘤, 约 占 颅 内 肿 瘤 的 50% [1] 因 其 生 物 学 行 为 多 呈 浸 润 性 生 长, 由 于 手 术 难 以 彻 底 切 除 造 成 复 发 率 高, 严 重 影 响 患 者 的 生 存 质 量 目 前 神 经 胶 质 瘤 的 治 疗 方 法 仍 以 手 术 治 疗 为 主, 放 疗 化 疗 结 合 的 综 合 治 疗 [2] 该 研 究 应 用 统 计 学 单 因 素 多 因 素 方 法 分 析 神 经 胶 质 瘤 患 者 术 后 生 存 期 及 影 响 因 素, 评 价 手 术 预 后, 并 对 患 者 进 行 生 存 预 测, 为 更 好 地 指 导 临 床 工 作 1 材 料 与 方 法 1.1 一 般 临 床 资 料 回 顾 性 分 析 2008 年 1 月 ~ 2010 年 12 月 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 神 经 外 科 资 料 齐 全 的 手 术 治 疗 患 者 119 例, 病 理 证 实 为 胶 质 瘤, 且 为 首 次 诊 断 术 后 平 均 3 个 月 进 行 一 次 门 诊 或 电 话 随 访, 随 访 截 止 至 2013 年 1 月, 集 中 对 以 上 患 者 手 术 后 恢 复 及 死 亡 情 况 进 行 电 话 随 访 或 直 接 访 问, 随 访 已 死 亡 者 获 完 全 数 据, 术 后 死 亡 术 后 死 于 EfectofdexmedetomidineontheEC 50 ofpropofolforinhibiting theinsertionreactionofthesupremelaryngealmaskairway LiYun 1,WangBin 1,2,ZhangYe 1,etal ( 1 DeptofAnesthesiology,TheSecondAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofAnesthesiology,YijishanHospitalofWannanMedicalColege,Wuhu ) Abstract Sixty fourpatients(asaⅠ ~Ⅱ)scheduledforelectivegynecologicaloperationundergeneralanesthe siawereenroledinthisstudy.alpatientswererandomlydividedintotwogroups:controlgroupanddexmedetomi dine(dex)group.inthedexgroupthepatientsreceiveddex1.0μg/kgintravenouslywithin15minutesbefore inductionofanesthesia.inthecontrolgroupthepatientsreceivedequalvolumeofsaline.propofolwasusedtoin ductionofanesthesiabytarget controledinfusion(tci)combinedwith2μg/kgremifentanil.theinitialtarget propofolefectiveconcentrationwas3.0μg/ml,folowedbyreducingtheconcentrationofpropofol,eachtime0.2 μg/ml.theefectiveconcentrationoftarget controledpropofolwasdeterminedbydixon ssequentialmethod.if thesupremelaryngealmaskairway(slma)wasinsertedsuccesfuly,thepreviousconcentrationwasselected; otherwise,thenextlevelofconcentrationwasselected.themedianefectiveconcentration(ec 50 )and95%confi denceinterval(95%ci)ofpropofolforinhibitionoftheresponsetoslma insertionwerecalculated.ec 50 of propofoltcicombinedwith2μg/kgremifentanilforinsertingslmawas2.27μg/ml(95%ci2 20~2 33μg/ ml)inthecontrolgroupand1 57μg/ml(95%CI1 47~1 68μg/ml)intheDexgroup. Keywords dexmedetomidine;propofol;target controledinfusion;laryngealmask;medianefectiveconcentra tion

146 1172 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 非 原 发 病 者 和 失 去 随 访 者 获 取 截 尾 数 据 以 性 别 年 龄 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 等 10 项 因 素 为 解 释 变 量, 见 表 治 疗 依 据 肿 瘤 术 前 MRI 图 像 表 现 确 定 手 术 范 围, 尽 可 能 全 切 肿 瘤 ; 位 于 功 能 区 肿 瘤 则 在 保 护 正 常 神 经 功 能 基 础 上 尽 可 能 切 除 ; 高 级 别 胶 质 瘤 (high gradeglioma,hgg) 术 后 进 行 放 疗 ( 采 用 直 线 加 速 器 放 疗, 剂 量 为 每 次 2Gy, 共 30 次, 总 剂 量 60 Gy) 和 ( 或 ) 化 疗 ( 化 疗 方 案 为 以 下 三 种 方 案 中 的 一 种 :1 替 尼 泊 苷 300mg/(m 2 d),3d;2 尼 莫 司 汀 2mg/(kg d),1d;3 替 莫 唑 胺 150mg/(m 2 d),6d, 低 级 别 胶 质 瘤 (low gradeglioma,lgg) 患 者 术 后 肿 瘤 复 发 或 生 长 较 快 或 未 能 全 切 时 进 行 放 疗,2 周 后 进 行 化 疗 [ 主 要 方 案 为 尼 莫 司 汀 2mg/(kg d),1d] LGG 患 者 术 后 未 放 疗 者 5 例, 放 化 疗 结 合 者 26 例,HGG 单 纯 放 疗 9 例, 放 化 疗 结 合 57 例 ; 根 据 术 后 早 期 复 查 MRI 并 结 合 医 师 术 中 所 见 判 断 手 术 切 除 程 度, 其 中 手 术 全 切 者 90 例,29 例 为 次 全 切 出 或 仅 取 到 病 理 标 本 1.3 统 计 学 处 理 使 用 SPSSStatistics19 进 行 统 计 分 析 采 用 Kaplan Meier 法 进 行 单 因 素 分 析, 用 存 活 时 间 结 局 作 为 因 变 量, 死 亡 =1, 生 存 =0, 生 存 时 间 以 患 者 手 术 日 期 至 死 亡 日 期 或 最 后 一 次 随 访 日 期 计 算, 考 察 临 床 采 集 的 10 项 因 子 对 其 影 响, 采 用 Log Rank 法 进 行 检 验, 对 于 P<0 05 者 进 行 多 因 素 COX 回 归 模 型 分 析 表 1 Kaplan Meier 单 因 素 分 析 项 目 n 中 位 生 存 期 最 短 生 存 期 / ( 月 ) 最 长 生 存 期 ( 月 ) 性 别 男 /59 女 /55 年 龄 ( 岁 ) < / /31 病 理 分 级 LGG /59 HGG /33 术 前 KPS /59 < /50 肿 瘤 直 径 (mm) /59 < /51 手 术 切 除 范 围 全 切 除 /59 次 全 切 除 /35 术 前 有 无 癫 痫 有 /59 无 /56 Ki 67 指 数 <10% /59 10% /26 术 后 放 疗 有 /59 无 /46 术 后 化 疗 有 /59 无 /59 表 2 COX 多 因 素 比 例 分 析 P 值 结 果 2.1 单 因 素 分 析 对 选 定 的 10 项 因 素 进 行 Kap lan Meier 法 分 析 后 表 明, 发 病 年 龄 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 Ki 67 指 数 及 术 后 是 否 放 疗 对 于 胶 质 瘤 患 者 预 后 有 影 响, 差 异 有 统 计 学 意 义 (P<0 05), 见 表 多 因 素 分 析 对 患 者 发 病 年 龄 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 Ki 67 指 数 及 术 后 是 否 放 疗 5 个 因 素 进 行 COX 多 因 素 回 归 模 型 分 析 后 显 示, 术 前 KPS 评 分 肿 瘤 病 理 分 级 肿 瘤 组 织 Ki 67 指 数 及 术 后 是 否 放 疗 4 个 因 素 对 于 胶 质 瘤 患 者 预 后 有 影 响, 见 表 2 3 讨 论 目 前 公 认 病 理 分 级 和 年 龄 是 影 响 胶 质 瘤 预 后 的 因 素 β P 值 Exp(β) Age KPS 病 理 级 别 Ki 术 后 放 疗 因 素 本 研 究 通 过 Kaplan Meier 法 和 COX 多 因 素 回 顾 性 分 析 119 例 脑 胶 质 瘤 患 者 临 床 资 料 表 明, 发 病 年 龄 肿 瘤 病 理 分 级 手 术 切 除 程 度 术 前 KPS 评 分 术 后 行 放 疗 是 胶 质 瘤 患 者 术 后 生 存 独 立 危 险 因 [3-4] 素 多 数 研 究 表 明, 患 者 发 病 年 龄 及 术 前 KPS 评 分 是 影 响 胶 质 瘤 患 者 预 后 的 重 要 因 素 本 组 资 料 表 明, 首 次 发 病 年 龄 <50 岁 患 者 中 位 生 存 期 (24 个 月, 显 著 高 于 发 病 年 龄 50 岁 患 者 (10 个 月 ), 这 与 [4] 文 献 报 道 基 本 相 符, 除 其 他 儿 童 好 发 恶 性 肿 瘤 如 小 儿 髓 母 细 胞 瘤 外, 成 人 LGG 患 者 年 龄 >40 岁, 预

147 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1173 后 较 差 [5],Mikheevetal [6] 研 究 发 现, 成 人 恶 性 胶 质 瘤 随 年 龄 的 增 长, 胶 质 瘤 的 恶 性 程 度 会 增 加 且 治 疗 抗 性 更 强 KPS 评 分 是 影 响 胶 质 瘤 患 者 术 后 独 立 危 险 因 素,KPS 70 分 较 <70 分 患 者 中 位 生 存 期 延 长 13 个 月 胶 质 瘤 的 病 理 级 别 是 公 认 的 影 响 胶 质 瘤 预 后 独 立 危 险 因 素, 本 组 资 料 显 示, 低 级 别 组 较 高 级 别 组 患 者 中 位 生 存 期 明 显 延 长, 但 也 有 Philipponet al [7] 报 道 Ⅰ ~Ⅱ 级 胶 质 瘤 生 存 无 明 显 差 异, 甚 至 认 为 Ⅱ 级 生 存 质 量 优 于 Ⅰ 级, 这 表 明 单 纯 应 用 组 织 病 理 分 级 判 断 预 后 具 有 一 定 的 局 限 性 目 前 手 术 治 疗 为 神 经 胶 质 瘤 的 首 选, 但 目 前 手 术 后 患 者 预 后 仍 不 乐 观 本 组 患 者 生 存 模 型 表 明, 手 术 切 除 程 度 越 高, 其 中 位 生 存 期 延 长, 但 差 异 无 统 计 学 意 义, 表 明 胶 质 瘤 患 者 手 术 是 否 能 肉 眼 全 切 对 于 预 后 无 明 显 影 响 造 成 该 结 果 的 原 因 可 能 是 因 为 胶 质 瘤 多 呈 浸 润 性 生 长 常 伴 有 伪 足 [8], 肿 瘤 所 生 长 的 范 围 远 远 超 出 了 肉 眼 可 见 的 肿 瘤 边 界, 故 外 科 手 术 无 法 达 到 真 正 意 义 上 的 病 理 完 全 切 除 现 患 者 术 后 常 规 采 用 放 疗 化 疗 已 被 业 界 广 泛 认 同 和 应 用 [9-10] 本 研 究 表 明, 进 行 常 规 放 疗 和 化 疗 的 患 者 其 中 位 生 存 率 较 不 进 行 常 规 治 疗 的 患 者 有 明 显 提 高 参 考 文 献 [1] FabiA,MetroG,RusiloM,etal.Treatmentofrecurentmalig nantgliomawithfotemustinemonotherapy:impactofdoseandcor relationwithmgmt promotermethylation[j]. BMC Cancer, 2009,31(9):101. [2] JacksonM,BydderS,MaujeanE.Radiotherapyinthemanage mentofhigh gradegliomasdiagnosedinwesternaustralia:apat ternsofcarestudy[j].jmedimagingradiatoncol,2012,56 (1): [3] LorenzoniJ,ToricoA,VilanuevaP,etal.Surgeryforhigh grade gliomasinadevelopingcountry:survivalestimationusingasimple stratificationsystem[j].surgicalneurology,2008,70(6): [4] 朱 浩, 沈 宏, 徐 锦 芳, 等. 脑 功 能 区 胶 质 瘤 预 后 相 关 因 素 分 析 [J]. 中 国 神 经 肿 瘤 杂 志,2012,10(4): [5] PignatiF,vandenBentM,CuranD,etal.Prognosticfactorsfor survivalinadultpatientswithcerebrallow gradeglioma[j].j ClinOncol,2002,20(8): [6] MikheevAM,RamakrishnaR,StolEA,etal.Increasedageof transformedmouseneuralprogenitor/stem celsrecapitulatesage dependentclinicalfeaturesofhumangliomamalignancy[j].ag ingcel,2012,11(6): [7] PhilipponJH,ClemneeanSH,FauehonFH,etal.Supratento riallow gradeastrocytomasinadults[j].neurosurgery,1993,32 (4): [8] WenPY,KesariS.Malignantgliomasinadults[J].EnglJMed, 2008,359(5): [9] 汪 洋, 盛 晓 芳, 高 晶. 高 分 级 神 经 胶 质 瘤 112 例 术 后 放 化 疗 疗 效 及 其 预 后 分 析 [J]. 肿 瘤,2009,29(7): [10] WakabayashiT,NatsumeA,FujiM.Chemotherapyformalignant gliomas:anupdate[j].gantokagakuryoho,2013,40(10): Clinicalresearchontheprognositicfactorsinpatients afteroperationwithglioma ChengYifei,ZhangXiaodong,WanQiang,etal (DeptofNeurosurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Clinicaldataof119gliomapatientswereretrospectivelyreviewed,and10factorswereasignedasvari antsandsurvivalstatuswasestimatedusingkaplan Meiersurvivalanalysis,andLog Ranktest.Statisticalysignifi cantparameterswithp<0 05wereappliedtomultivariateCOXregresionanalysis.Unilabiateanalysisshowed thatpatientswithage 50,lowKPS,highgrade,highKi 67indexandpostoperativeradiotherapysuferedpoor prognosis(p<0 05).MultivariateCOXanalysisshowedthatpreoperativeKPSscore,pathologicgrade,Ki 67in dexandpostoperativeradiotherapywereinvolvedinprognosisofgliomapatients(p<0.05,p<0 01). Keyword glioma;surgery;survivalanalysis;prognosis;survivalrate

148 1174 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1 在 人 肝 细 胞 癌 中 的 表 达 及 临 床 意 义 卢 贤 映 1,2, 高 群 2 1, 吴 文 涌 摘 要 应 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 100 例 人 肝 细 胞 癌 (HCC) 肿 瘤 组 织 和 相 应 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1(GLUT1) 的 表 达 情 况 GLUT1 在 HCC 肿 瘤 组 织 和 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 阳 性 表 达 率 分 别 为 83 0% 和 65 0%, 两 者 之 间 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01);HCC 肿 瘤 组 织 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 大 小 临 床 TNM 分 期 均 呈 显 著 正 相 关 (P<0 05), 与 患 者 的 总 生 存 率 和 无 复 发 生 存 率 均 呈 显 著 负 相 关 (P< 0 01) 关 键 词 肝 细 胞 癌 ;GLUT1; 免 疫 组 织 化 学 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 肝 癌 是 我 国 常 见 的 一 种 恶 性 肿 瘤, 其 发 病 率 和 死 亡 率 均 居 世 界 首 位 [1] 肿 瘤 细 胞 必 须 依 赖 于 宿 主 间 质 细 胞 的 支 持 才 能 够 无 限 增 殖 并 形 成 肿 瘤, 其 增 殖 过 程 中 所 需 的 能 量 决 定 其 生 长 速 度, 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 1(glucosetransporter1,GLUT1) 是 细 胞 内 糖 转 运 和 代 谢 的 关 键 限 速 因 子, 在 维 持 细 胞 生 理 状 态 [2-3] 有 着 重 要 作 用 近 来 研 究 显 示 :GLUT1 在 多 种 恶 性 肿 瘤 中 高 表 达, 与 细 胞 恶 性 转 化 生 长 和 侵 袭 有 着 密 切 关 系 本 研 究 应 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 肝 细 胞 肝 癌 (hepaticcelcarcinoma,hcc) 肿 瘤 组 织 及 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 GLUT1 的 表 达 状 况, 分 析 其 与 患 者 临 床 病 理 特 征 和 预 后 的 关 系, 探 讨 其 在 HCC 预 后 评 估 中 的 临 床 意 义 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 收 集 2004 年 1 月 ~2007 年 8 月 安 接 收 基 金 项 目 : 安 徽 省 高 校 省 级 自 然 科 学 研 究 项 目 ( 编 号 :KJ2011Z211); 安 徽 省 自 然 科 学 基 金 项 目 ( 编 号 : MH169); 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金 培 育 计 划 项 目 ( 编 号 :2009KJ05) 作 者 单 位 : 1 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 普 通 外 科, 合 肥 安 徽 省 儿 童 医 院 普 外 一 科, 合 肥 作 者 简 介 : 卢 贤 映, 男, 主 治 医 师 ; 吴 文 涌, 男, 副 主 任 医 师, 博 士, 责 任 作 者,E mail:hfw [email protected] 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 病 理 科 共 接 收 HCC 病 例 100 例, 男 84 例, 女 16 例, 年 龄 33~72(51 0±2 8) 岁 所 有 患 者 术 前 未 做 化 疗 免 疫 或 放 射 治 疗 HCC 患 者 均 有 详 细 生 存 资 料, 包 括 术 后 总 生 存 期 和 术 后 无 复 发 生 存 期 另 收 集 每 例 样 本 中 距 离 肿 瘤 组 织 边 缘 2cm 以 外 处 非 肿 瘤 性 肝 组 织 所 有 组 织 样 本 均 以 10% 福 尔 马 林 固 定, 石 蜡 包 埋, 行 HE 染 色, 组 织 病 理 学 证 实 诊 断 1.2 试 剂 与 方 法 浓 缩 型 鼠 抗 人 GLUT1 单 克 隆 抗 体 购 于 美 国 SantaCruz 公 司, 工 作 浓 度 1 100; 通 用 型 Envision 两 步 法 免 疫 组 织 化 学 试 剂 盒 及 DAB 显 色 剂 均 购 自 福 州 迈 新 公 司 ; 免 疫 组 织 化 学 操 作 步 骤 按 说 明 书 染 色 进 行 以 PBS 缓 冲 液 代 替 一 抗 作 阴 性 对 照 1.3 结 果 判 定 GLUT1 染 色 结 果 判 断 以 细 胞 质 或 细 胞 膜 出 现 明 显 的 黄 色 或 棕 黄 色 颗 粒 视 为 阳 性 着 [4] 色 阳 性 判 定 标 准 按 照 文 献 报 道, 每 个 样 本 随 机 计 数 五 个 高 倍 视 野 ( 400) 的 阳 性 细 胞 数, 取 其 平 均 值 代 表 每 个 高 倍 镜 视 野 下 GLUT1 细 胞 数, 其 中 1% 的 细 胞 着 色 视 为 阳 性 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS10 0 统 计 软 件 进 行 分 析 定 性 资 料 比 较 采 用 χ 2 检 验, 生 存 率 的 组 间 比 较 采 用 Kaplan Meier 生 存 曲 线 法 及 Log Rank 检 验 2 结 果 2.1 GLUT1 的 表 达 及 分 布 GLUT1 主 要 表 达 于 正 常 肝 细 胞 和 肿 瘤 细 胞, 定 位 于 细 胞 质 和 ( 或 ) 细 胞 膜 肝 癌 细 胞 一 般 呈 高 表 达, 而 癌 旁 肝 细 胞 表 达 较 弱, 见 图 例 HCC 肿 瘤 组 织 中 GLUT1 阳 性 表 达 率 为 83.0%,100 例 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 中 GLUT1 阳 性 表 达 率 为 65.0%, 两 者 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P <0 01) 2.2 GLUT1 蛋 白 表 达 与 HCC 临 床 病 理 特 征 的 关 系 HCC 组 织 GLUT1 蛋 白 的 表 达 与 肿 块 大 小 肿 瘤 TNM 分 期 均 呈 显 著 正 相 关 (P<0 05), 而 与 患 者 年 龄 性 别 组 织 学 分 级 HBsAg 感 染 和 肝 硬 化 状 况 均 无 显 著 相 关 性 (P>0 05) 见 表 1

149 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1175 图 1 肝 细 胞 癌 和 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 细 胞 中 GLUT1 的 表 达 200 A: 肝 细 胞 癌 ;B: 癌 旁 非 肿 瘤 组 织 表 1 肝 细 胞 癌 组 织 中 GLUT1 蛋 白 表 达 与 患 者 临 床 病 理 特 征 的 关 系 [n(%)] 临 床 病 理 特 征 n GLUT1 表 达 P 值 年 龄 ( 岁 ) (59.3) > (52.8) 性 别 男 84 55(65.5) 女 16 10(62.57) 肝 硬 化 有 89 57(64.0) 无 11 8(72.7) HBsAg 阳 性 81 54(66.7) 阴 性 19 11(57.9) 肿 瘤 大 小 (cm) < (50.0) (71.4) 组 织 学 分 级 Ⅰ 5 4(80.0) Ⅱ 91 58(63.7) Ⅲ 4 3(75.0) 临 床 分 期 Ⅰ ~Ⅱ 73 42(57.5) Ⅲ ~Ⅳ 27 23(85.2) 上 述 表 中 并 未 用 相 关 分 析, 而 是 χ 2 检 验 GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 预 后 关 系 采 用 Kaplan Meier 曲 线 法 和 Log Rank 检 验 对 GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 总 生 存 率 (overalsurvival,os) 和 无 复 发 生 存 率 (recurencefreesurvival,rfs) 关 系 进 行 单 因 素 生 存 分 析, 结 果 显 示 :HCC 患 者 中 GLUT1 阳 性 表 达 者 OS 显 著 低 于 阴 性 表 达 患 者 (P = 0 002) 同 时 GLUT1 阳 性 表 达 患 者 RFS 也 显 著 低 于 阴 性 表 达 患 者 (P=0 001) 见 图 2 3 讨 论 恶 性 肿 瘤 的 一 个 重 要 特 点 就 是 相 当 于 正 常 细 胞 显 著 增 高 的 糖 代 谢 率, 肿 瘤 细 胞 通 过 自 身 调 节 机 制 [2] 以 满 足 其 快 速 生 长 需 要 目 前 研 究 显 示, 恶 性 肿 图 2 GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 OS 和 RFS 的 关 系 A:GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 RFS 的 关 系 ;B:GLUT1 表 达 与 肝 细 胞 癌 患 者 OS 的 关 系 瘤 细 胞 GLUT1 的 高 表 达 可 能 是 肿 瘤 糖 代 谢 率 增 高 的 机 制 之 一 GLUT1 是 葡 萄 糖 转 运 蛋 白 家 族 重 要 成 员 之 一, 在 细 胞 转 运 葡 萄 糖 跨 膜 进 入 细 胞 的 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 本 研 究 显 示 :GLUT1 在 HCC 肿 瘤 组 织 中 普 遍 表 达, 并 且 表 达 率 和 强 度 显 著 高 于 癌 旁 非 肿 瘤 性 肝 组 织 Wangetal [5] 在 子 宫 内 膜 病 变 中 研 究 发 现, 子 宫 内 膜 癌 中 GLUT1 普 遍 高 表 达, 子 宫 内 膜 非 典 型 增 生 病 变 则 低 表 达, 而 正 常 子 宫 内 膜 组 织 无 表 达, 提 示 GLUT1 的 高 表 达 可 能 是 细 胞 恶 性 转 化 的 一 个 重 要 标 志 本 研 究 进 一 步 显 示 :HCC 肿 瘤 组 织 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 大 小 临 床 TNM 分 期 均 呈 显 著 正 相 关, 与 患 者 的 OS 和 RFS 均 呈 显 著 负 相 关 Kangetal [6] 使 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 了 乳 腺 癌 组 织 中 GLUT1 的 表 达, 结 果 发 现 乳 腺 癌 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 组 织 学 分 级 呈 显 著 正 相 关, 并 且 与 患 者 RFS 和 OS

150 1176 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 呈 显 著 负 相 关, 提 示 其 是 乳 腺 癌 预 后 不 良 的 一 个 标 志 物 Amannetal [7] 使 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 检 测 了 152 例 HCC 病 例 的 GLUT1 表 达, 结 果 发 现 GLUT1 表 达 与 肿 瘤 细 胞 增 殖 指 数 临 床 分 期 和 肿 瘤 组 织 学 分 级 呈 正 相 关, 并 且 下 调 GLUT1 表 达 可 以 显 著 降 低 HCC 细 胞 株 的 侵 袭 和 迁 移 能 力, 提 示 GLUT1 可 能 [8] 参 与 了 HCC 的 恶 性 演 进 过 程 张 鹏 飞 等 研 究 还 发 现 : 胃 癌 GLUT1 阳 性 表 达 与 肿 瘤 浸 润 深 度 淋 巴 结 转 移 和 临 床 分 期 显 著 相 关, 提 示 GLUT1 可 能 也 参 与 了 胃 癌 细 胞 的 侵 袭 转 移 综 上 所 述,GLUT1 在 HCC 肿 瘤 组 织 中 高 表 达, 并 且 与 肿 瘤 临 床 进 展 密 切 相 关, 是 HCC 患 者 预 后 不 良 的 潜 在 标 志 物 随 着 对 GLUT1 研 究 的 深 入, 以 其 为 靶 点 的 治 疗 可 能 成 为 恶 性 肿 瘤 综 合 治 疗 和 预 防 的 手 段 之 一 参 考 文 献 [1] El SeragHB,RudolphKL.Hepatocelularcarcinoma:epidemi ologyandmolecularcarcinogenesis[j].gastroenterology,2007, 132(7): [2] RamaniP,HeadfordA,MayMT.GLUT1proteinexpresioncor relateswithunfavourablehistologiccategoryandhighriskinpa tientswithneuroblastictumours[j].virchowsarch,2013,462 (2): [3] SaigusaS,ToiyamaY,TanakaK,etal.Prognosticsignificanceof glucosetransporter 1(GLUT1)geneexpresioninrectalcancer afterpreoperativechemoradiotherapy[j].surgtoday,2012,42 (5): [4] CooperR,SariogluS,SokmenS,etal.Glucosetransporter 1 (Glut1):apotentialmarkerofprognosisinrectalcarcinoma[J]. BrJCancer,2003,89(5): [5] WangBY,KalirT,SaboE,etal.Immunohistochemicalstaining ofglut1inbenign,hyperplasia,andmalignantendometrialepi thelia[j].cancer,2000,88(12): [6] KangSS,ChunYK,HurM H,etal.Clinicalsignificanceof glucosetransporter1(glut1)expresioninhumanbreastcarci noma[j].jpnjcancerres,2002,93(10): [7] AmannT,MaegdefrauU,HartmannA,etal.GLUT1expresion isincreasedinhepatocelularcarcinomaandpromotestumorigene sis[j].amjpathol,2009,174(4): [8] 张 鹏 飞, 吴 继 锋, 张 红, 等. 胃 癌 中 HIF 1 VEGF 及 Glut1 的 表 达 [J]. 安 徽 医 科 大 学 学 报,2010,45(1):86-9. ExpresionofGLUT1inhepatocelularcarcinomaand itsclinicopathologicsignificance LuXianying 1,2,GaoQun 2,WuWenyong 1 ( 1 DeptofGeneralSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ; 2 DeptofPediatricSurgery,TheChildren shospitalofanhuiprovince,hefei ) Abstract Theexpresionofglucosetransporter1(GLUT1)wasexaminatedin100casesofhepatocelularcarci noma(hcc)and100casesofnon tumorhepatictisuesbyimmunohistochemicalmethod.thepositiveratesof GLUT1inHCCweresignificantlyhigherthanthatinthenon tumorhepatictisues(83.0% and65.0%,p< 0 01).TheexpresionofGLUT1wassignificantlycorelatedtotumorsizeandTNM staging(p<0.05)andpa tientrelapse freeandoveralsurvival(p<0 01). Keywords hepaticcelcarcinoma;glut1;immunohistochemicalmethod

151 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1177 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 修 复 手 背 IV 度 烧 伤 创 面 王 飞, 刘 晟, 周 波, 王 仁 素, 王 超, 王 永 杰, 陈 旭 林 摘 要 探 讨 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 修 复 严 重 手 背 IV 度 烧 伤 创 面 的 疗 效 收 治 手 部 IV 度 烧 伤 患 者 9 例, 其 中 电 烧 伤 6 例, 热 压 伤 3 例 手 背 创 面 清 创 后 采 用 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 修 复 结 果 显 示 :8 例 术 后 皮 瓣 完 全 成 活, 颜 色 和 弹 性 与 受 区 较 匹 配, 无 臃 肿 和 畸 形,1 例 术 后 由 于 皮 瓣 下 感 染, 皮 瓣 部 分 坏 死, 创 面 经 换 药 引 流 后 移 植 中 厚 皮 修 复 随 访 6~12 个 月, 手 部 功 能 良 好, 外 观 满 意 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣, 皮 下 脂 肪 组 织 较 少, 厚 度 较 薄, 一 次 成 型, 是 修 复 严 重 手 背 烧 伤 创 面 的 理 想 皮 瓣 之 一 关 键 词 薄 型 皮 瓣 ; 手 ;IV 度 烧 伤 ; 创 面 修 复 中 图 分 类 号 R644;R628 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 严 重 手 背 部 烧 伤 往 往 易 累 及 肌 腱, 甚 至 关 节 骨 质, 处 理 不 当 会 严 重 影 响 患 者 的 手 功 能 和 整 体 生 活 质 量 修 复 严 重 手 部 烧 伤 仍 是 重 建 外 科 医 师 的 一 大 挑 战 传 统 的 腹 部 局 部 随 机 皮 瓣 或 腹 壁 下 动 脉 皮 瓣 因 为 其 手 术 简 单 安 全, 故 常 常 被 用 于 手 部 软 组 织 损 伤 的 修 复 重 建 然 而, 这 些 一 般 常 规 手 术 的 缺 点 包 括 外 形 臃 肿 和 功 能 受 限, 而 且 需 要 多 次 手 术 修 整 [1-2] 为 获 得 更 为 满 意 的 功 能 性 和 美 容 性 效 果, 该 研 究 在 2010 年 3 月 ~2012 年 3 月 期 间 应 用 薄 型 腹 壁 手 套 样 皮 瓣 来 修 复 了 9 例 严 重 手 背 烧 伤 患 者, 效 果 满 意, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 资 料 9 例 患 者 均 来 自 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院, 男 7 例, 女 2 例, 年 龄 为 19~58 岁, 中 位 年 龄 为 28 岁 均 为 IV 度 烧 伤, 其 中 电 烧 伤 6 例, 热 压 伤 3 例, 烧 伤 面 积 0 5% ~6 0% 2 例 为 右 手 烧 伤,4 例 为 左 手 烧 伤,3 例 为 双 手 烧 伤 4 例 合 并 有 甲 床 损 伤, 其 中 1 例 合 并 指 骨 骨 折, 平 均 有 5 5 个 关 节 暴 露 入 院 时 间 为 伤 后 4h~10d 1.2 手 术 方 法 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 烧 伤 科, 合 肥 作 者 简 介 : 王 飞, 男, 主 治 医 师 ; 刘 晟, 男, 副 主 任 医 师, 责 任 作 者,E 清 创 及 清 创 术 沿 创 缘 切 开, 彻 底 清 除 坏 死 组 织, 保 留 变 性 的 肌 腱 和 骨 膜 组 织, 清 创 后 均 有 肌 腱 或 骨 质 外 露, 关 节 外 露 时 用 克 氏 针 固 定, 反 复 用 体 积 分 数 3% 过 氧 化 氢 溶 液 及 生 理 盐 水 冲 洗 创 面 皮 瓣 设 计 和 切 取 选 择 患 肢 同 侧 的 腹 壁 皮 瓣, 手 套 型 皮 瓣 大 小 一 般 根 据 手 背 烧 伤 创 面 来 设 计 并 在 腹 壁 上 用 美 兰 进 行 标 记 仅 在 手 部 的 入 口 和 每 个 手 指 的 出 口 处 切 开 腹 壁, 组 织 剪 在 皮 下 浅 层 脂 肪 进 行 分 离 皮 瓣, 并 仔 细 地 修 薄 皮 瓣 只 保 留 4~5mm 厚 度 脂 肪 层 来 保 护 真 皮 下 血 管 网, 最 终 形 成 一 个 每 个 手 指 有 独 立 隧 道 的 手 套 样 皮 瓣 其 中 保 留 皮 瓣 下 的 指 间 区 域 组 织 以 固 定 手 指 然 后 手 部 插 入 手 套 样 皮 瓣, 每 个 手 指 通 过 皮 下 隧 道 伸 出, 放 置 橡 胶 引 流 条, 缝 合 手 背 近 端 和 远 端 创 缘 创 面 封 闭 约 3 周 后 从 腹 壁 上 断 蒂, 将 皮 瓣 指 间 区 域 二 等 分 切 开 至 指 蹼 间 并 进 行 指 蹼 的 形 成, 如 果 指 蹼 间 皮 瓣 组 织 不 足 以 覆 盖 手 指 侧, 采 用 中 厚 皮 片 封 闭 余 下 创 面 供 瓣 区 创 面 可 行 皮 下 组 织 分 离 后 拉 拢 缝 合 或 移 植 刃 厚 皮 封 闭 2 结 果 8 例 患 者 术 后 皮 瓣 完 全 成 活, 颜 色 和 弹 性 与 受 区 较 匹 配, 无 臃 肿 和 畸 形,1 例 患 者 严 重 左 手 热 压 伤 皮 瓣 术 后 因 皮 瓣 下 感 染, 术 后 第 5 天 皮 瓣 部 分 坏 死, 创 面 经 换 药 引 流 和 局 部 抗 感 染 治 疗 1 周 后 移 植 中 厚 皮 修 复 ; 全 部 病 例 经 过 包 括 弹 力 手 套 在 内 的 康 复 治 疗, 随 访 6~12 个 月, 手 功 能 恢 复 良 好, 外 形 满 意, 无 需 二 次 手 术 典 型 病 例, 女,48 岁, 因 150 度 压 膜 机 压 伤 左 手 1d 入 院, 检 查 见 左 手 第 指 背 及 部 分 手 背 创 面 呈 深 Ⅱ ~Ⅳ 度 创 面, 第 2 和 3 手 指 甲 床 有 损 伤, 入 院 后 第 4 天 清 创, 见 左 手 第 指 伸 指 肌 腱 外 露, 部 分 变 性, 连 续 性 尚 存 于 左 下 腹 部 设 计 手 套 样 皮 瓣, 术 后 皮 瓣 存 活 良 好, 术 后 3 周 断 蒂, 供 瓣 区 直 接 拉 拢 缝 合 见 图 1 皮 瓣 外 形 较 薄, 不 显 臃 肿 随 访 6 个 月, 左 手 功 能 正 常, 活 动 自 如, 外 形 满 意 3 讨 论 手 部 Ⅳ 度 烧 伤 在 临 床 上 很 常 见, 最 常 见 为 电 烧

152 1178 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 图 1 典 型 病 例 A: 术 前 左 手 背 IV 度 烧 伤 创 面 ;B: 清 创 后 伸 指 肌 腱 外 露 ;C: 腹 部 设 计 手 套 样 皮 瓣 ;D: 手 指 插 入 腹 部 手 套 样 皮 瓣 后 ;E: 断 蒂 后 左 手 皮 瓣 外 形 较 薄 ;F: 腹 部 供 瓣 区 直 接 拉 拢 缝 合 伤, 其 次 为 热 压 伤 由 于 手 背 部 皮 下 组 织 少 及 皮 肤 薄 的 特 性, 其 不 能 给 肌 腱 和 关 节 等 深 部 组 织 提 供 较 多 的 保 护, 因 此 尤 其 是 热 压 伤 和 电 烧 伤 时, 手 背 部 烧 伤 更 易 累 及 肌 腱 和 关 节, 且 截 指 率 较 高 等 对 于 深 度 手 背 部 烧 伤, 早 期 清 创 和 皮 瓣 覆 盖 可 明 显 保 存 暴 露 的 肌 腱 和 关 节, 最 大 可 能 改 善 手 部 功 能 [3-4] 可 供 使 用 的 皮 瓣 包 括 局 部 远 隔 的 甚 至 游 离 皮 瓣, 多 采 用 的 形 式 从 穿 支 皮 瓣 到 微 血 管 网 皮 瓣 目 前 对 修 复 严 重 手 部 烧 伤, 多 采 用 腹 部 皮 瓣 和 髂 腹 股 沟 皮 瓣 等 带 蒂 皮 瓣 传 统 的 这 些 带 蒂 皮 瓣 手 术 方 式 简 单 且 安 全, 但 这 两 者 主 要 的 缺 点 是 皮 瓣 外 形 臃 肿, 一 般 需 要 多 次 皮 瓣 修 薄 和 分 指 手 术 才 能 达 到 较 理 想 的 效 果 腹 部 手 套 样 皮 瓣 最 早 在 1936 年 首 次 描 述, 但 其 仍 有 不 少 缺 点 如 皮 瓣 外 形 臃 肿 等 [5] 直 至 薄 型 皮 瓣 在 1966 年 被 提 出, 这 些 薄 型 皮 瓣 目 前 已 经 被 用 于 面 颈 等 部 位, 其 优 点 在 于 提 供 最 大 可 能 的 外 观 和 质 感 [6] Goushehetal [7] 率 先 用 薄 型 腹 部 穿 支 皮 瓣 来 修 复 手 背 部 严 重 瘢 痕 挛 缩, 其 皮 瓣 厚 度 薄, 没 有 多 余 的 皮 下 脂 肪, 甚 至 修 剪 至 皮 下 真 皮 血 管 网 应 用 薄 型 腹 部 手 套 样 皮 瓣 修 复 手 部 IV 度 烧 伤, 术 后 皮 瓣 存 活 良 好 只 有 1 例 患 者 皮 瓣 远 端 出 现 部 分 坏 死, 该 患 者 系 全 手 背 及 指 背 热 压 伤, 由 于 入 院 创 面 有 感 染, 术 后 皮 瓣 部 分 坏 死, 经 换 药 植 皮 后 愈 合 薄 型 手 套 样 腹 部 皮 瓣 厚 度 合 适, 术 后 随 访 6~12 个 月, 手 功 能 良 好, 达 到 较 为 理 想 的 外 观 效 果 手 套 样 皮 瓣 可 通 过 皮 下 组 织 间 隔 来 固 定 手 指, 可 以 有 效 地 促 进 皮 瓣 与 受 区 的 及 早 黏 附 尽 管 有 些 [8] 文 献 报 道 可 以 在 皮 瓣 术 后 2 周 断 蒂, 但 3 周 是 比 较 适 宜, 安 全 的 其 主 要 的 原 因 是 由 于 术 后 疼 痛 和 体 位 的 不 适 应 有 可 能 影 响 早 期 皮 瓣 的 黏 附 此 外, 薄 型 手 套 样 腹 部 皮 瓣 手 术 相 对 不 复 杂, 而 且 在 修 复 手 指 深 度 烧 伤 时 不 需 要 进 行 并 指 术, 在 断 蒂 同 时 可 以 进 行 指 蹼 的 重 建, 避 免 传 统 腹 部 皮 瓣 并 指 和 二 次 分 指 手 术, 极 大 缩 短 了 住 院 时 间, 减 轻 了 患 者 的 痛 苦, 并 能 早 期 功 能 锻 炼 参 考 文 献 [1] 黄 国 宝, 张 科 验, 张 磊, 等. 应 用 皮 瓣 移 植 修 复 手 部 深 度 烧 伤 96 例 治 疗 体 会 [J]. 中 华 损 伤 与 修 复 杂 志 ( 电 子 版 ),2010, (52):44-5. [2] 龚 志 鑫, 田 德 虎, 张 经 岐, 等. 双 髂 腹 股 沟 及 腹 部 联 合 皮 瓣 修 复 前 臂 与 手 大 面 积 皮 肤 缺 损 [J]. 中 国 修 复 重 建 外 科 杂 志, 2009,23(8): [3] 谢 卫 国, 王 德 运, 刘 杰 峰, 等. 手 部 电 烧 伤 的 皮 瓣 修 复 [J]. 中 华 烧 伤 杂 志,2010,26(1):30-3. [4] 黄 晓 元. 皮 瓣 移 植 在 我 国 烧 伤 外 科 中 的 应 用 [J]. 中 华 烧 伤 杂 志,2008,24(5): [5] PradierJP,OberlinC,BeyE.Acutedeephandburnscoveredby apocketflap graft:long termoutcomebasedonninecases[j].j BurnsWounds,2007,6:e1. [6] YanH,ZhangF,AkdemirO,etal.Clinicalapplicationsofve nousflapsinthereconstructionofhandsandfingers[j].archor thoptraumasurg,2011,131(1): [7] GoushehJ,ArastehE,MafiP.Super thinabdominalskinpedicle flapforthereconstructionofhypertrophicandcontracteddorsal handburnscars[j].burns,2008,34(3): [8] UrushidateS,YotsuyanagiT,YamauchiM,etal.Modifiedthin abdominalwalflap(gloveflap)forthetreatmentofacuteburnsto thehandsandfingers[j].jplastreconstraesthetsurg,2010,63 (4): Abstract RepairofIVdegreeburnswoundonthedorsum ofhandsusing thinabdominalwalgloveflap WangFei,LiuSheng,ZhouBo,etal (DeptofBurns,TheFirstAfiliatedHosptialofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) ToinvestigatetheefectofthinabdominalwalgloveflapinrepairingtheIVdegreeburnswoundonthe

153 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1179 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 透 析 相 关 性 腹 膜 炎 临 床 病 例 分 析 赵 洪 静, 张 炜, 吴 永 贵, 齐 向 明 摘 要 回 顾 性 分 析 7 例 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 透 析 相 关 性 腹 膜 炎 患 者 资 料, 总 结 相 关 资 料 并 参 阅 国 内 外 相 关 文 献 分 析, 结 果 7 例 鲍 曼 不 动 杆 菌 性 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎 中,2 例 为 多 重 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌,1 例 为 耐 碳 青 霉 烯 类 菌 株 所 有 的 多 重 耐 药 菌 都 未 能 治 愈 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 炎 常 为 难 治 性 腹 膜 炎, 细 菌 呈 多 重 耐 药, 及 早 拔 除 腹 膜 透 析 管 可 降 低 该 类 患 者 病 死 率 关 键 词 腹 膜 炎 ; 鲍 曼 不 动 杆 菌 ; 多 重 耐 药 ; 腹 膜 治 疗 中 图 分 类 号 R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 鲍 曼 不 动 杆 菌 是 一 种 革 兰 阴 性 杆 菌, 已 经 被 证 实 是 一 种 耐 药 性 感 染 的 重 要 细 菌 并 且 被 认 为 是 最 棘 手 的 病 原 菌 之 一 [1] 耐 碳 青 霉 烯 类 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 越 来 越 常 见 一 些 鲍 曼 不 动 杆 菌 菌 株 已 经 被 证 实 对 目 前 已 知 的 所 有 抗 生 素 耐 药 [2] 虽 然 多 重 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 在 腹 透 患 者 中 很 少 报 道, 但 一 旦 出 现, 将 会 导 致 严 重 的 感 染 并 增 加 腹 膜 透 析 的 退 出 率 和 死 亡 率 [3-5] 现 腹 膜 透 析 中 心 发 生 7 例 鲍 曼 氏 不 动 杆 菌 引 起 的 腹 膜 炎, 其 中 2 例 多 重 耐 药,1 例 是 耐 碳 青 霉 烯 类 的 菌 株 3 例 难 治 性 腹 膜 炎 导 致 住 院 时 间 延 长 及 拔 管,4 例 得 到 治 愈 并 继 续 行 腹 膜 接 收 基 金 项 目 : 教 育 部 博 士 点 基 金 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 肾 脏 内 科, 合 肥 作 者 简 介 : 赵 洪 静, 女, 硕 士 研 究 生 ; 吴 永 贵, 男, 教 授, 博 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:wuyong [email protected] 透 析, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 病 例 选 择 回 顾 性 分 析 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 2009 年 ~2011 年 收 治 的 7 例 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 透 析 相 关 性 腹 膜 炎 患 者 资 料, 患 者 均 植 入 Tenckhof 导 管, 使 用 双 联 系 统 进 行 持 续 不 卧 床 腹 膜 透 析 (continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD), 透 析 液 使 用 Baxter 公 司 生 产 的 PD4 透 析 液, 每 日 腹 透 液 交 换 量 为 6~8L 1.2 腹 膜 炎 诊 断 标 准 1 有 腹 膜 炎 的 症 状 和 体 征 ;2 透 出 液 混 浊, 白 细 胞 计 数 > /L, 中 性 粒 细 胞 百 分 比 >50%;3 透 出 液 找 到 或 培 养 有 致 病 菌 患 者 出 现 上 述 3 项 中 的 2 项 即 诊 断 为 腹 膜 炎 1.3 致 病 菌 培 养 及 药 敏 试 验 方 法 患 者 就 诊 时, 先 留 取 腹 透 液 进 行 细 胞 分 类 计 数, 同 时 进 行 腹 透 液 致 病 菌 培 养 具 体 方 法 为 : 取 10~20ml 腹 透 液 直 接 接 种 于 需 氧 厌 氧 血 培 养 瓶, 如 患 者 入 院 前 已 经 使 用 抗 生 素, 则 采 用 活 性 炭 吸 附 培 养 瓶, 接 种 后 及 时 送 检, 置 于 35 温 箱 培 养 16~18h, 药 敏 用 纸 片 扩 散 法, 判 断 标 准 按 NCCLS2004 版 执 行 1.4 欧 洲 临 床 微 生 物 与 感 染 性 疾 病 学 会 对 获 得 性 耐 药 的 葡 萄 球 菌 属 肠 球 菌 属 肠 杆 菌 科 铜 绿 假 单 胞 菌 不 动 杆 菌 属 耐 药 程 度 的 定 义 1 多 重 耐 药 : 对 药 敏 结 果 中 3 类 或 3 类 以 上 抗 菌 药 物 不 敏 感 ;2 泛 耐 药 : 对 药 敏 结 果 中 只 有 1~2 类 药 物 敏 感 ;3 全 dorsumofhands.ninepatientswithivdegreeburnswoundwerehospitalizedfrommarch2010tomarch2012.six caseswereduetoelectricalburns,3werehotcrushinjuries.afterdebridement,athinabdominalwalskinglove flapwasdesignedtorepairthewounds.theflapsin8patientssurvivedcompletelywitharesultofagoodelasticity andmatchedappearanceoftherecipientareawithoutobviousbulkinesanddeformity.partialnecrosisofflapoc curedinonlyonepatientduetoinfectionanditwasclosedbytransplantationofpartial thicknesskinafterdres ingchange.until6~12monthsfolow up,thefunctionofinjuredhandsrecoveredwelwithsatisfactoryappear ance.thinabdominalwalgloveflapwithlesadiposetisue,isoneoftheidealflapforrepairingsevereburn woundsonthedorsumofhands. Keywords thinflap;hand;ivdegreeburns;woundrepair

154 1180 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 耐 药 : 对 药 敏 结 果 抗 菌 药 物 均 不 敏 感, 具 体 抗 菌 药 物 谱 参 见 相 关 文 献 [6] 2 结 果 2.1 临 床 资 料 7 例 患 者 中,5 例 发 生 于 腹 膜 透 析 的 第 1 年 只 有 1 例 既 往 发 生 过 感 染 : 上 次 感 染 发 生 在 20d 之 前, 诊 断 为 鲁 氏 不 动 杆 菌 感 染 的 腹 膜 炎 抗 生 素 治 疗 2 周 后 有 效, 腹 透 液 白 细 胞 计 数 降 至 正 常, 然 而,1 周 后 患 者 再 次 出 现 腹 痛 腹 泻, 腹 透 液 培 养 出 耐 多 种 抗 生 素 ( 包 括 亚 胺 培 南 在 内 ) 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 所 有 的 这 些 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 感 染 均 为 社 区 获 得 性 的, 除 1 例 患 者, 其 他 患 者 均 有 贫 血, 除 2 例 患 者, 其 他 患 者 的 血 白 蛋 白 水 平 均 低 于 30g/L 这 7 例 患 者 均 有 腹 透 液 浑 浊 和 频 繁 的 腹 痛 4 例 有 腹 泻, 只 有 1 例 有 发 热 在 4 例 得 到 治 愈 的 患 者 中, 经 过 4d 的 治 疗 后 腹 透 液 白 细 胞 数 开 始 下 降 然 而, 有 1 例 患 者 在 抗 感 染 治 疗 的 第 5 天 拒 绝 继 续 治 疗, 未 带 任 何 药 物 出 院 另 外 3 例, 持 续 治 疗 了 至 少 14d 感 染 耐 碳 青 霉 烯 类 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 患 者, 曾 感 染 过 鲁 氏 不 动 杆 菌, 该 患 者 也 有 贫 血 低 蛋 白 血 症, 体 质 指 数 也 很 低, 仅 有 16 9kg/m 2 该 类 患 者 的 再 发 感 染 没 有 得 到 治 愈, 在 明 确 是 该 种 细 菌 感 染 的 当 天 拔 除 了 腹 透 管, 并 静 脉 予 以 环 丙 沙 星 治 疗 7d 2.2 预 后 7 例 患 者 中,2 例 是 多 重 感 染 3 例 退 出 腹 膜 透 析 改 为 血 透, 其 中 1 例 1 年 后 死 于 脑 出 血 另 外 4 例, 得 到 治 愈 并 继 续 行 腹 膜 透 析 治 疗 在 3 个 退 出 腹 膜 透 析 的 患 者 中, 均 为 耐 药 菌 感 染 : 其 中 2 例 是 多 重 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌,1 例 是 耐 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 的 菌 株 在 4 例 得 到 治 愈 的 患 者 中 只 有 1 例 是 阿 米 卡 星 耐 药 3 讨 论 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎 的 预 后 很 大 程 度 上 取 决 于 感 染 的 病 原 菌 的 种 类 革 兰 阳 性 球 菌 仍 是 大 多 数 腹 膜 炎 的 致 病 菌 在 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎 中, 鲍 曼 不 动 杆 菌 较 少 见, 一 旦 发 生, 抗 感 染 治 疗 很 难 有 效 [7-8] 本 研 究 回 顾 性 分 析 了 过 去 3 年 (2009 年 ~2011 年 ) 的 腹 透 相 关 性 腹 膜 炎, 其 中 72 4% 为 革 兰 阳 性 球 菌, 只 有 7 6% 为 不 动 杆 菌 属, 在 不 动 杆 菌 属 感 染 中, [1,9] 87 5% 为 鲍 曼 不 动 杆 菌 其 他 的 研 究 也 表 明 最 常 见 的 不 动 杆 菌 属 病 原 菌 为 鲍 曼 不 动 杆 菌 亚 胺 培 南 和 美 罗 培 南 是 目 前 认 为 抗 鲍 曼 不 动 杆 菌 最 有 效 的 抗 生 素 [10] 但 耐 碳 青 霉 烯 类 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 报 道 现 在 越 来 越 常 见 耐 药 菌 这 一 标 准 术 语 是 由 一 个 国 际 专 家 小 组 提 出 并 在 临 床 微 生 物 与 感 染 杂 志 上 出 版 [11] 本 研 究 7 例 中 的 2 例 是 由 多 重 耐 药 鲍 曼 不 动 杆 菌 引 起 的, 而 且 其 中 1 例 为 耐 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 这 2 例 均 治 疗 无 效, 最 终 拔 管 该 研 究 中,3 例 退 出 腹 膜 透 析,4 例 治 愈 3 例 转 为 血 透 的 患 者 中,1 例 死 于 脑 出 血 ( 而 不 是 死 于 感 染 ) 所 有 的 对 抗 生 素 反 应 不 佳 的 患 者 感 染 的 均 为 耐 药 细 菌 其 中 1 例 耐 碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 的, 该 例 中 耐 阿 米 卡 星 的 的 细 菌 感 染 提 示 鲍 曼 不 动 杆 菌 的 耐 药 可 能 是 腹 膜 炎 再 发 的 一 个 关 键 因 素 Solaket al [5] 曾 报 道 过 仅 对 氨 基 糖 苷 类 和 替 加 环 素 敏 感 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 性 腹 膜 炎 最 后 死 于 难 治 性 败 血 症 另 外 2 例 非 多 重 耐 药 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 炎 经 抗 感 染 治 疗 以 后 恢 复 [3-4] Galvaoetal [12] 调 查 了 23 例 不 动 杆 菌 属 腹 膜 炎, 超 过 一 半 发 生 在 腹 透 的 第 1 年 本 研 究 中,7 例 中 的 5 例 是 在 腹 透 的 第 1 年 发 生 的 除 患 者 5 外, 不 动 杆 菌 属 的 感 染 都 是 他 们 腹 透 以 来 首 次 发 生 腹 膜 炎 Galvaoetal [12] 研 究 发 现, 不 动 杆 菌 在 6 例 患 者 中 排 第 2 位 不 动 杆 菌 属 腹 膜 炎 的 发 生 率 在 前 1 次 腹 膜 炎 之 后 的 2~3 个 月 发 生 率 明 显 增 高 [12] 而 在 本 研 究 中, 有 1 例 不 动 杆 菌 的 感 染 发 生 在 前 一 次 感 染 20d 之 后 在 现 有 的 文 献 中, 关 于 不 动 杆 菌 属 合 并 其 他 病 原 微 生 物 感 染 的 临 床 特 点 和 预 后 的 报 道 较 少 见 本 研 究 中, 有 1 例 患 者 为 合 并 感 染, 腹 透 液 同 时 培 养 出 鲍 曼 不 动 杆 菌 和 表 皮 葡 萄 球 菌, 该 患 者 得 到 了 治 愈, 表 明 合 并 其 他 细 菌 感 染 可 能 不 是 鲍 曼 不 动 杆 菌 腹 膜 炎 难 治 的 因 素 另 外, 本 研 究 中 1 例 患 者 发 生 过 两 次 腹 膜 炎, 但 是 在 这 两 次 腹 透 感 染 的 间 期, 腹 透 液 并 未 行 培 养 该 患 者 在 抗 感 染 治 疗 结 束 20d 以 后 腹 透 液 再 次 出 现 浑 浊, 并 且 拔 出 的 腹 透 导 管 培 养 出 绿 脓 杆 菌 本 研 究 的 结 果 表 明 在 腹 透 患 者 中 发 生 腹 膜 炎 的 高 危 因 素 有 : 年 龄 ( 60 岁 ), 贫 血 ( 血 红 蛋 白 <70 g/l), 低 蛋 白 血 症 ( 血 清 白 蛋 白 <30g/L, 或 者 在 一 些 研 究 中 为 <35g/L), 低 钾 血 症 (<3.5mmol/ L), 憩 室 病, 糖 尿 病 及 其 他 [13] 在 本 研 究 中,7 例 中 的 6 例 有 贫 血, 其 中 1 例 血 红 蛋 白 浓 度 低 于 70g/L 患 者 均 有 低 蛋 白 血 症, 其 中 5 例 血 清 白 蛋 白 低 于 30

155 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1181 g/l 7 例 患 者 中,4 例 有 低 钾 血 症,2 例 有 糖 尿 病 患 者 年 龄 为 28~64 岁 ( 只 有 1 例 患 者 超 过 60 岁 ) 关 于 患 者 是 否 有 憩 室 病, 因 为 未 行 结 肠 镜 和 钡 剂 灌 肠 检 查, 暂 不 能 明 确 这 些 高 危 因 素 中, 低 蛋 白 血 症 可 能 是 更 重 要 的 因 素 总 之, 鲍 曼 不 动 杆 菌 是 一 种 多 重 耐 药 菌, 可 导 致 严 重 的 感 染, 当 抗 感 染 治 疗 无 效 时, 死 亡 率 很 高 本 研 究 中 有 1 例 耐 碳 青 霉 烯 类 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 泛 耐 药 的 鲍 曼 不 动 杆 菌 可 能 对 腹 透 患 者 造 成 很 大 的 威 胁 为 了 降 低 腹 膜 炎 的 发 生 率, 应 及 时 纠 正 营 养 不 良 贫 血 低 蛋 白 血 症 等 高 危 因 素 教 育 患 者 或 护 理 人 员 更 换 腹 透 液 时 操 作 规 范 对 预 防 腹 膜 炎 的 发 生 也 很 有 帮 助 参 考 文 献 [1] DijkshoornL,NemecA,SeifertH.Anincreasingthreatinhospi tals:multidrug resistantacinetobacterbaumanni[j].natrevmi crobiol,2007,5(12): [2] PelegAY,SeifertH,PatersonDL.Acinetobacterbaumanni:e mergenceofasuccesfulpathogen[j].clinmicrobiolrev,2008, 21(3): [3] FriedmanO,JasalSV,BargmanJM.Acinetobacterperitoneal dialysisperitonitis:descriptionandrelationtothespicefamilyof organisms[j].peritdialint,2008,28(2): [4] LeeYK,KimJK,OhSE,etal.Succesfulantibioticlockther apyinpatientswithrefractoryperitonitis[j].clinnephrol,2009, 72(6): [5] SolakY,AtalayH,PolatI,etal.CAPD relatedperitonitisafter renaltransplantation[j].peritdialint,2010,30(6): [6] MagiorakosAP,SrinivasanA,CareyRB,etal.Multidrug re sistant,extensivelydrug resistantandpandrug resistantbacteria: aninternationalexpertproposalforinterimstandarddefinitionsfor acquiredresistance[j].clinmicrobiolinfect,2012,18(3): [7] OliveiraLG,LuengoJ,CaramoriJC,etal.Peritonitisinrecent years:clinicalfindingsandpredictorsoftreatmentresponseof170 episodesatasinglebraziliancenter[j].inturolnephrol,2012, 44(5): [8] RuizA,RamosB,BurgosD,etal.Acinetobactercalcoaceticus peritonitisincontinuousambulatoryperitonealdialysis(capd) patients[j].peritdialint,1988,8(4): [9] DoughariHJ,NdakidemiPA,HumanIS,etal.Theecology, biologyandpathogenesisofacinetobacterspp.:anoverview[j]. MicrobesEnviron,2011,26(2): [10]UnalS,Garcia RodriguezJA.Activityofmeropenemandcompa ratorsagainstpseudomonasaeruginosaandacinetobacterspp.iso latedinthemysticprogram, [J].DiagnMicrobiol InfectDis,2005,53(4): [11]MagiorakosAP,SrinivasanA,CareyRB,etal.Multidrug re sistant,extensivelydrug resistantandpandrug resistantbacteria: aninternationalexpertproposalforinterimstandarddefinitionsfor acquiredresistance[j].clinmicrobiolinfect,2012,18(3): [12] GalvaoC,SwartzR,RocherL,etal.Acinetobacterperitonitis duringchronicperitonealdialysis[j].amjkidneydis,1989,14 (2): [13] YipT,TseKC,LamMF,etal.Colonicdiverticulosisasarisk factorforperitonitisinchineseperitonealdialysispatients[j]. PeritDialInt,2010,30(2): Clinicalanalysisofperitonealdialysis relatedperitonitiswith Acinetobacterbaumanni ZhaoHongjing,ZhangWei,WuYonggui,etal (DeptofNephrology,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract 7peritonealdialysis relatedperitonitiswitha.baumanniepisodeswerereviewedretrospectivelyforlast threeyearsintheperitonealdialysiscenterofthefirstafiliatedhospitalofanhuimedicaluniversity.bysum minguptherelevantdataandreferingtotherelatedliteratureathomeandabroad,wefoundthatamongthose7ca ses,2wereinvolvedinmulti drugresistant(mdr)a.baumanni,and1wasinvolvedinacarbapenem resistant strain.althemdrbacterialinfectionsfailedtreatment.earlycatheterremovalmayhelpdecreasethemortality. Keywords peritonitis;acinetobacterbaumanni;multi drugresistance;peritonitistreatment

156 1182 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 后 路 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 治 疗 胸 腰 椎 后 凸 畸 形 李 路, 陈 银 河, 杨 庆 国, 申 才 良, 尤 涛, 张 银 顺, 李 伟, 王 磊, 贾 金 龙 摘 要 回 顾 性 分 析 后 路 单 节 段 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 (PSO) 治 疗 20 例 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 患 者 的 临 床 疗 效 比 较 术 前 术 后 及 末 次 随 访 时 后 凸 Cobb 角 疼 痛 视 觉 模 拟 评 分 (VAS) Oswestry 功 能 障 碍 指 数 (ODI) 评 分 通 过 Frankel 分 级 评 分 评 价 患 者 神 经 功 能 恢 复 情 况 术 后 Cobb 角 VAS 评 分 和 ODI 评 分 分 别 与 术 前 相 比, 差 异 均 有 统 计 学 意 义 (P <0 05) 末 次 随 访 时 临 床 症 状 和 神 经 功 能 获 得 较 大 改 善 后 路 单 节 段 PSO 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 是 一 种 安 全 有 效 术 式 关 键 词 胸 腰 椎 ; 创 伤 性 后 凸 畸 形 ; 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 中 图 分 类 号 R683.2;R321.6;R 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 (2014) 胸 腰 椎 骨 折 若 未 及 时 治 疗 或 治 疗 方 式 不 当, 可 能 出 现 胸 腰 部 后 凸 畸 形 或 伴 神 经 功 能 障 碍 等 对 于 保 守 治 疗 无 效 的 疼 痛 后 凸 渐 进 性 加 重 或 神 经 症 状 加 重 可 行 手 术 治 疗 矫 形 手 术 分 为 前 路 后 路 前 后 路 联 合 等 术 式 现 回 顾 性 分 析 后 路 单 节 段 经 椎 弓 根 椎 体 截 骨 术 (pediclesubtractionosteotomy,pso) 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 的 临 床 疗 效, 现 报 道 如 下 1 材 料 与 方 法 1.1 一 般 资 料 2009 年 6 月 ~2012 年 6 月 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 科 收 治 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 患 者 20 例, 男 5 例, 女 15 例 ; 年 龄 33~66(49 3± 11 7) 岁 受 伤 原 因 : 车 祸 伤 2 例, 高 处 坠 落 伤 4 例, 重 物 砸 伤 1 例, 摔 伤 13 例 既 往 治 疗 方 式 :18 例 曾 行 保 守 治 疗 ;2 例 曾 行 后 路 内 固 定 椎 板 减 压 术, 均 为 取 出 内 固 定 后 出 现 渐 进 性 后 凸 畸 形 受 伤 至 手 术 时 间 3 个 月 ~34 年 患 者 就 诊 时 均 有 不 同 程 度 胸 腰 部 疼 痛 或 神 经 受 压 症 状 损 伤 节 段 T 12 5 例 L 1 9 例 L 2 6 例 术 前 胸 腰 椎 后 凸 Cobb 角 为 (35 2± 接 收 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( 编 号 : ) 作 者 单 位 : 安 徽 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 骨 三 科, 合 肥 作 者 简 介 : 李 路, 男, 硕 士 研 究 生 ; 杨 庆 国, 男, 教 授, 主 任 医 师, 硕 士 生 导 师, 责 任 作 者,E mail:[email protected] 对 本 文 具 有 同 等 贡 献 6 1), 疼 痛 视 觉 模 拟 评 分 (visualanalogscale, VAS) 为 (6 4±0 5) 分,Oswestry 功 能 障 碍 指 数 (os westrydisabilityindex,odi) 为 (55 9±10 7) 分 术 前 Frankel 分 级 评 分,C 级 1 例,D 级 11 例,E 级 8 例 患 者 术 前 均 拍 摄 站 立 脊 柱 全 长 正 侧 位 X 线 片, 应 用 Cobb 法 测 量 脊 柱 后 凸 角 度, 行 CT 和 MRI 了 解 是 否 伴 有 椎 管 狭 窄 和 脊 髓 压 迫 1.2 方 法 手 术 方 法 患 者 均 行 气 管 插 管 全 身 麻 醉, 俯 卧 位 于 脊 柱 手 术 床 上 手 术 全 程 应 用 体 感 诱 发 电 位 和 动 作 诱 发 电 位 以 及 唤 醒 试 验 监 护 采 用 后 正 中 入 路, 显 露 目 标 椎 体 及 其 邻 近 上 下 位 椎 体 双 侧 椎 板 及 关 节 突 达 横 突 尖 部 在 C 臂 X 线 透 视 机 定 位 下 先 在 截 骨 椎 邻 近 上 下 一 或 两 个 椎 体 置 入 单 向 椎 弓 根 螺 钉 切 除 目 标 椎 体 棘 突 椎 板 关 节 突 横 突 和 肋 骨 头, 应 用 Cobb 剥 离 器 精 确 剥 离 椎 体 两 侧 骨 膜, 并 注 意 保 护 相 应 节 段 神 经 根 及 大 血 管 保 留 椎 弓 根 内 侧 缘 骨 皮 质, 用 骨 刀 切 除 其 余 部 分 椎 弓 根, 保 留 椎 体 前 方 骨 皮 质 以 作 截 骨 铰 链, 保 留 椎 体 后 侧 壁 以 保 护 硬 脊 膜, 用 骨 刀 刮 匙 或 高 速 磨 钻 切 除 椎 体 内 松 质 骨, 根 据 术 前 后 凸 Cobb 角 设 计 截 骨 平 面 向 椎 体 前 方 做 楔 形 截 骨, 并 透 视 探 查 截 骨 深 度 保 持 截 骨 面 上 下 椎 间 盘 的 完 整 性, 双 侧 交 替 进 行, 切 除 对 侧 时 一 侧 用 临 时 棒 固 定 最 后 切 除 椎 弓 根 内 侧 壁 和 椎 体 后 壁 切 除 后 壁 时 注 意 分 离 硬 膜 囊 和 椎 体 后 壁, 避 免 神 经 根 和 硬 膜 囊 过 度 牵 拉, 并 用 电 凝 纱 布 明 胶 海 绵 仔 细 止 血 用 咬 骨 钳 去 除 椎 体 后 缘 皮 质, 确 保 神 经 根 和 硬 膜 囊 周 围 无 皮 质 骨 残 留 放 置 连 接 棒, 用 加 压 装 置 将 螺 钉 加 压 靠 拢, 使 截 骨 面 对 合, 最 后 锁 紧 内 固 定 装 置, 再 次 透 视 检 查 畸 形 矫 正 情 况 后 方 椎 板 及 小 关 节 去 皮 质 后 进 行 后 外 侧 植 骨 融 合, 放 置 引 流 管 关 闭 切 口 术 后 处 理 术 后 常 规 应 用 抗 生 素 预 防 感 染, 留 置 引 流 管 24~48h 或 引 流 量 少 于 50ml 后 拔 除, 复 查 脊 柱 X 线 片 观 察 内 固 定 位 置 以 及 是 否 发 生 松 动 移 动 或 断 裂 等, 测 量 术 后 Cobb 角 以 评 估 后 凸 畸 形 矫 正 程 度 嘱 患 者 床 上 行 腰 背 肌 及 下 肢 主 被 动 功 能 锻 炼, 术 后 2 周 在 硬 质 腰 围 保 护 下 坐 立 及 下 床 活 动, 逐 步 恢 复 日 常 生 活,3 个 月 内 避 免 弯 腰 及 腰 部

157 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1183 剧 烈 活 动 1.3 疗 效 判 定 以 VAS 评 分 和 ODI 评 分 评 估 患 者 腰 腿 痛 程 度 及 其 功 能, 通 过 Frankel 分 级 评 分 评 价 患 者 神 经 功 能 变 化 影 像 学 评 估 包 括 后 凸 Cobb 角 植 骨 融 合 和 内 固 定 有 无 松 动 断 裂 等 情 况 1.4 统 计 学 处 理 采 用 SPSS17 0 统 计 软 件 分 析, 数 据 以 x±s 珋 表 示, 对 手 术 前 后 及 末 次 随 访 时 的 Cobb 角 VAS 评 分 及 ODI 评 分, 采 用 配 对 t 检 验 进 行 分 析 2 结 果 2.1 治 疗 效 果 20 例 患 者 均 行 后 路 单 节 段 PSO, 截 骨 水 平 分 别 位 于 T 12 5 例 L 1 9 例 L 2 6 例 手 术 时 间 (252±54)min 术 中 失 血 量 (1353±413) ml 1 例 术 后 有 单 侧 下 肢 神 经 根 性 症 状, 予 以 脱 水 营 养 神 经 药 物 等 治 疗 2 周 恢 复 余 未 发 生 明 显 手 术 相 关 并 发 症 所 有 患 者 切 口 Ⅰ 期 愈 合 随 访 时 间 (21 1±7 8) 个 月 典 型 病 例 影 像 学 资 料 见 图 影 像 学 评 估 术 后 Cobb 角 为 (5 6±1 2), 末 次 随 访 Cobb 角 为 (6 4±1 2), 术 后 平 均 矫 正 角 度 为 (29 6±4 6), 术 后 Cobb 角 与 术 前 Cobb 角 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (t=26 5,P<0 05) 末 次 随 访 时 均 达 骨 性 融 合, 无 假 关 节 形 成 内 固 定 松 动 及 断 裂 等, 矫 正 度 未 见 明 显 丢 失 2.3 功 能 评 估 术 后 VAS 评 分 为 (2 8±0 4) 分, 末 次 随 访 时 为 (1 7±0 5) 分, 术 后 VAS 评 分 与 术 前 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (t=31 1,P<0 05) 术 后 ODI 评 分 为 (23 6±5 8) 分, 末 次 随 访 时 为 (8 5± 6 6) 分, 术 后 ODI 评 分 与 术 前 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (t=16 0,P<0 05) 术 后 胸 腰 部 疼 痛 及 下 肢 症 状 均 较 术 前 明 显 改 善, 运 动 及 感 觉 功 能 有 不 同 程 度 恢 复 末 次 随 访 时 Frankel 分 级 评 分,D 级 4 例 E 级 16 例, 见 表 1 术 前 分 级 表 1 手 术 前 末 次 随 访 神 经 功 能 Frankel 分 级 评 估 ( 例 ) 例 数 末 次 随 访 分 级 A 级 B 级 C 级 D 级 E 级 A 级 B 级 C 级 D 级 E 级 合 计 讨 论 手 术 目 的 旨 在 矫 正 后 凸 畸 形 稳 定 受 累 节 段 椎 体 解 除 神 经 压 迫 恢 复 神 经 功 能 或 预 防 可 能 发 生 的 神 经 损 害 等, 有 前 路 前 后 路 联 合 后 路 术 式 可 供 选 择 后 路 术 式 又 有 经 关 节 突 截 骨 术 (smith petersen osteotomy,spo) 和 全 椎 体 切 除 术 (vertebralcolumn resection,vcr) 等 单 节 段 SPO 可 矫 正 9 3 ~ 10 7 [1], 适 用 于 后 凸 角 度 较 小 的 后 凸 畸 形 ;VCR 的 矫 正 能 力 虽 大, 因 术 中 失 血 量 并 发 症 较 多, 较 少 适 用 于 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 患 者 单 节 段 PSO 是 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 (Cobb 角 <55 ) 的 较 佳 术 式 本 研 究 中 患 者 均 采 用 单 节 段 PSO 治 疗, 术 前 后 凸 角 为 (35 2±6 1), 术 后 Cobb 角 为 (5 6±1 2), 术 后 平 均 矫 正 角 度 为 (29 6±4 6), 与 Kimetal [2] 和 Zengetal [3] 的 矫 形 结 果 类 似 而 Xietal [4] 通 过 后 移 楔 形 截 骨 尖 部 和 切 除 病 椎 后 上 部 终 板 等 途 径 增 大 截 骨 角 度, 最 大 矫 正 度 达 56, 但 在 闭 合 截 骨 面 时 可 能 存 在 明 显 的 短 缩 堆 积 或 扭 曲 引 起 神 经 损 伤 的 风 险 双 节 段 PSO 平 均 矫 正 (67 9 图 1 患 者 男,38 岁,L 1 陈 旧 性 骨 折 1 年, 有 严 重 腰 背 痛 A: 术 前 Cobb 角 39 ;B: 后 路 经 椎 弓 根 截 骨 术 后, 后 凸 畸 形 矫 正 ;C: 术 后 1 年 随 访 X 线 片 示 无 明 显 矫 正 丢 失 和 内 固 定 松 动 ;D: 术 后 1 年 CT 矢 状 位 重 建 示 截 骨 椎 体 与 上 位 椎 体 已 形 成 骨 桥 ;E: 术 后 15 个 月 后 取 出 内 固 定,X 线 片 示 无 明 显 矫 正 丢 失

158 1184 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) ±5 5) [5], 虽 可 获 得 较 大 矫 正 度 数, 但 术 中 失 血 量 多 风 险 大, 也 较 少 适 用 PSO 的 主 要 并 发 症 包 括 术 中 硬 脊 膜 撕 裂 神 经 血 管 损 伤, 术 后 硬 脊 膜 外 血 肿 麻 痹 性 肠 梗 阻 切 口 感 染, 内 固 定 松 动 断 裂 假 关 节 形 成 渐 进 性 后 凸 畸 形 等 [6] 截 骨 的 上 下 椎 板 和 神 经 根 管 需 充 分 减 压, 可 防 止 闭 合 截 骨 面 时 引 起 神 经 受 压 术 中 注 意 保 护 椎 体 外 血 管, 可 防 止 出 血 过 多 先 在 截 骨 椎 邻 近 上 下 一 或 两 个 椎 体 单 侧 置 入 椎 弓 根 螺 钉, 并 于 一 侧 预 置 棒 临 时 固 定, 可 防 止 截 骨 区 移 位 损 伤 神 经 血 管 组 织 本 研 究 中 1 例 术 后 有 单 侧 下 肢 神 经 根 性 症 状, 考 虑 系 术 中 过 度 牵 拉 刺 激 神 经 根 所 致, 予 以 脱 水 营 养 神 经 药 物 等 治 疗 2 周 恢 复, 其 余 患 者 未 发 生 明 显 手 术 相 关 并 发 症 PSO 手 术 要 求 较 高, 术 中 采 用 体 感 诱 发 电 位 和 动 作 诱 发 电 位 以 及 唤 醒 试 验 监 护 等, 在 一 定 程 度 上 可 降 低 手 术 风 险 和 降 低 并 发 症 的 发 生 采 用 PSO 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形 可 获 满 意 矫 正, 平 均 矫 正 28 ~42, 长 期 随 访 矫 正 度 平 均 丢 失 1.6 ~7 0 [2-3] 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 伤 椎 上 的 椎 间 盘 可 能 已 严 重 退 变 并 伴 脊 柱 不 稳 [7], 行 PSO 切 除 伤 椎 的 上 位 终 板 时 若 保 留 其 上 的 椎 间 盘, 闭 合 截 骨 区 时 椎 间 盘 紧 邻 截 骨 椎 体 的 松 质 骨, 椎 间 盘 可 能 会 陷 入 松 质 骨 内 以 致 骨 性 融 合 不 佳, 可 能 是 后 期 疼 痛 的 原 因 [8] 本 研 究 末 次 随 访 时 后 凸 Cobb 角 VAS 评 分 ODI 评 分 Frankel 分 级 评 分 均 较 术 前 有 所 改 善 后 凸 矫 正 度 无 明 显 丢 失, 临 床 症 状 和 神 经 功 能 均 有 较 大 改 善 本 研 究 的 手 术 治 疗 和 随 访 结 果 表 明, 后 路 单 节 段 PSO 治 疗 陈 旧 性 胸 腰 椎 骨 折 后 凸 畸 形, 后 凸 矫 正 度 高, 矫 正 度 丢 失 少, 临 床 效 果 满 意 不 足 之 处 即 例 数 较 少 中 短 期 临 床 疗 效, 尚 需 长 期 随 访 观 察 其 后 凸 矫 正 效 果 参 考 文 献 [1] KimKT,ParkKJ,LeeJH.Osteotomyofthespinetocorectthe spinaldeformity[j].asianspinej,2009,3(2): [2] KimKT,LeeSH,SukKS,etal.Outcomeofpediclesubtrac tionosteotomiesforfixedsagitalimbalanceofmultipleetiologies: aretrospectivereview of140 patients[j]. Spine(PhilaPa 1976),2012,37(19): [3] ZengY,ChenZ,SunC,etal.Posteriorsurgicalcorectionof postraumatickyphosisofthethoracolumbarsegment[j].jspinal DisordTech,2013,26(1): [4] XiYM,PanM,WangZJ,etal.Corectionofpost traumatictho racolumbarkyphosisusingpediclesubtractionosteotomy[j].eurj OrthopSurgTraumatol,2013,23Suppl1:S [5] ZhangHQ,HuangJ,GuoCF,etal.Two levelpediclesubtrac tionosteotomyforseverethoracolumbarkyphoticdeformityinanky losingspondylitis[j].eurspinej,2014,23(1): [6] AuerbachJD,LenkeLG,BridwelKH,etal.Majorcomplica tionsandcomparisonbetween3 columnosteotomytechniquesin 105consecutivespinaldeformityprocedures[J].Spine(PhilaPa 1976),2012,37(14): [7] SchnakeKJ,KandzioraF.Corectionofpostraumatickyphosisof thethoracolumbarspinewithmodifiedpediclesubtractionosteoto my[j].eurspinej,2010,19(12): [8] ZhangX,ZhangX,ZhangY,etal.Modifiedposteriorclosing wedgeosteotomyforthetreatmentofpostraumaticthoracolumbar kyphosis[j].jtrauma,2011,71(1): Treatmentofthoracolumbarkyphosisusingposterior pediclesubtractionosteotomy LiLu,ChenYinhe,YangQingguo,etal (DeptofOrthopaedics,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei ) Abstract Toretrostectivelyevaluateandanalyzetheclinicalefectonposteriorsingle levelpediclesubtractionos teotomyfortreatingpost traumaticthoracolumbarkyphosisoftwentypatients.thekyphosiscobbangle,visualana logscale(vas)scoreandoswestrydisabilityindex(odi)scoreofpost operationandlastfolow upwerecom paredwiththatofpreoperation.toevaluateclinicalsymptomsandneurologicalfunctionbyfrankelgradescore. PostoperativeCobbangle,VASscoreandODIscoresweresignificantlydiferentcomparedwithpreoperative(P< 0 05).Clinicalsymptomsandneurologicalfunctionamelioratedatlastclinicalexamination.Theposteriormono levelpediclesubtractionosteotomyfortreatmentofpost traumaticthoracolumbarkyphosisisasafeandefectivepro cedure. Keywords thoracolumbar;post traumatickyphosis;pediclesubtractionosteotomy

159 安徽医科大学学报 Ａｃ ａｕｎ ｖ ｒ ｓ ａ ｓｍ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ １ ４Ａｕ ｇ ４ ９ ８ １１８５ 综 述 解离素 金属蛋白酶 １ ７活性调控机制的研究进展 朱可馨１综述 王 冰２ 王志成３审校 摘要 血小板在发生活化或凋亡的同时伴随有黏附受体糖 蛋白 ＧＰ Ⅰｂ α酶切 ＧＰⅠｂ α酶切作为血小板发生活化或 凋亡的一个重要生物标志物 目前 ＧＰⅠｂ α酶切主要由解 离素 金属蛋白酶 １ ７ ＡＤＡＭ１ ７ 所介导 ＡＤＡＭ１ ７是锌离 子依赖的金属蛋白酶 属于 ａ ｄ ａ ｍａ ｌ ｙ ｓ ｎ蛋白家族 与其他金 属酶密切相关 现就近年来 ＡＤＡＭ１ ７的结构 功能以及活 性调节等方面的研究进行综述 关键词 金属蛋白酶 血小板 酶切 中图分类号 Ｒ３ ４ Ｒ３ ３ １ １ ４ ３ 文献标志码 Ａ 文章编号 １ １ ４ ９ ２ ２ １ ４ ８ １ １ ８ ５ ４ 图 １ ＡＤＡＭ１７不同结构域及其功能示意图 １ ＡＤＡＭ１７结构 ＡＤＡＭ１７由 ８２ ４个氨基酸残基组成的 Ⅰ 型跨膜 越多的底物被发现 ＡＤＡＭ１７底物包括表皮生长因 蛋白 编码基因定位在染色体 ２ｐ ２５ １ ＡＤＡＭ１７具 子受体配体 促炎症细胞因子 黏附分子 淀粉前体 有显著的结构特点 含有多个结构域 见图 １ 从 Ｎ 蛋白等 ２ ３ 端开始包括 ① 信号肽 １ １ ７位氨基酸残基 ② 前域 １８ ２ １ ４位氨基酸残基 ③ 金属蛋白酶或催 ２ ２ 调节的膜 内 蛋 白 水 解 ｒ ｇｕｌ ａ ｄ ｎ ｒ ａｍ ｍ 化域 ２１５ ４７ ３位氨基酸残基 ④ 解离素域 ４ ７ ４ ５７２位氨基酸残基 ⑤ 表皮生长因子样域 ５ ７ ３ ＡＭ１７或其他蛋白酶酶切以后 跨膜域能被进一步 ６２ ⑥ 半胱氨酸富含域 ６ ３ ６７ １位氨基酸残 蛋白胞外域首先在 α酶切位点被 ＡＤＡＭ１７或 ＡＤ ＡＭ１酶切后 接着在膜内被由多个蛋白酶组成的 ７２ ６９４位氨基酸残基 ⑧ 胞质 基 ⑦ 跨膜域 ６ ＲＩ Ｐ 有些膜蛋白胞外域被 ＡＤ ｂｒ ａｎｐｒ ｏ ｏｌ ｙｓ ｓ 水解酶切 称为 ＲＩ Ｐ ４ Ｃｈｒ ｓ ａ ｎ ５ 研究发现 Ｎｏ ｃ ｈ 域 ６ ９５ ８２４位氨基酸残基 ２ 分泌酶 如早老蛋白 ｐｒ ｓ ｎ ｌ ｎ 所酶切 被 γ 分泌 γ 酶酶切以后剩余的胞内部分被转移到细胞核 调节 ２ ＡＤＡＭ１７功能 不同基因的转录 ２ ２ １ 酶切膜蛋白胞外域 ＡＤＡＭ１７最重要的功能 是水解酶切各种跨膜蛋白的胞外域 酶切位点通常 ３ ＡＤＡＭ１ ７活性调节 位于胞外域的近膜处 ２ 目前被证实的 ＡＤＡＭ１ ７ ３ １ ＡＤＡＭ１７不同结构域对 ＡＤＡＭ１７活性调节 底物已超过 ５个 而且随着研究的深入还会有越来 ３ １ １ 前域 ＡＤＡＭ１ ７前域能抑制 ＡＤＡＭ１ ７金属 蛋白酶域的酶活性 有研究 ６ 表明 ＡＤＡＭ１７解离 ２１ ４ ４ １ ４接收 基金项目 上海市教委科技创新项目 编号 １２ＹＺ６８ 上海市自然 科学基金 编号 １ ２ＺＲ１ ４２９９ １ 上海中医院大学中药学院 上海 ２１２ ３ 作者单位 ７前域在细胞 素域能提高前域的抑制功能 ＡＤＡＭ１ 内高尔基体网络被蛋白原转化酶家族成员 ｆ ｕｒ ｎ在 金属蛋白酶域之前的 ４个氨基酸残基 精氨酸 缬 ２ 氨酸 赖氨酸 精氨酸 处酶切 ６ ３ ３ １ ２ 催化域或金属蛋白酶域 ＡＤＡＭ１ ７催化域 上海中医药大学教学实验中心 上海 ２１２ ３ 上海市中医医院实验中心 上海 ２ ７１ 作者简介 朱可馨 女 硕士研究生 ｍａ ｌ ａ ｈｗｚ ｃ １ ２６ 王志成 男 助理研究员 责任作者 Ｅ ｃ ｏ ｍ 王 冰 女 副教授 责任作者 Ｅ ｍａ ｌ ａ ｎｎ ａ ｂ ｌ ｃ ｎ ｓ ｎａ ｃ ｏ ｍ 含有典型的锌离子螯合序列 ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ Ｘ代 表任意氨基酸残基 负责加工膜结合的蛋白 例 如 肿 瘤 坏 死 因 子 α ｕｍｏ ｒｎ ｃ ｒ ｏ ｓ ｓｆ ａ ｃ ｏ ｒ α ＴＮＦα 使用突变分析研究显示 金属蛋白酶域第

160 1186 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 225 位 半 胱 氨 酸 和 435 位 蛋 氨 酸 以 及 解 离 素 域 第 600 位 半 胱 氨 酸 残 基 对 于 ADAM17 催 化 活 性 是 必 需 的 [7] 第 435 位 蛋 氨 酸 残 基 对 于 ADAM17 活 性 中 心 的 重 要 性 在 M435I,M435L 和 M435S 突 变 研 究 中 进 一 步 被 证 实 [8] 金 属 蛋 白 酶 组 织 抑 制 剂 3(tisueinhibitorsof metaloproteinases,timp 3) 是 ADAM17 天 然 的 抑 制 剂, 能 结 合 ADAM17 催 化 域 然 而,TIMP 3 抑 制 效 果 受 到 ADAM17C 端 组 分 ( 解 离 素 域 和 半 胱 氨 酸 富 含 域 ) 的 影 响, 这 些 C 端 组 分 能 明 显 削 弱 TIMP 3 对 ADAM17 催 化 域 的 抑 制 活 性 [4] Janesetal [9] 研 究 TIMP 3 与 ADAM17 催 化 域 结 合 构 成 的 复 合 物 的 晶 体 结 构 发 现,TIMP 3 伸 展 到 ADAM17 表 面 独 特 的 疏 水 袋, 通 过 两 个 亮 氨 酸 残 基 有 效 的 将 TIMP 3 结 合 到 ADAM17 催 化 域 解 离 素 域 目 前 能 与 ADAM17 解 离 素 域 结 合 的 整 合 素 是 α5β1,adam17 能 抑 制 α5β1 介 导 的 细 胞 迁 移 [10] 然 而,α5β1 结 合 ADAM17 解 离 素 域 在 体 内 的 生 理 意 义 以 及 是 否 影 响 ADAM17 酶 切 活 性 目 前 尚 不 明 确 [11] 半 胱 氨 酸 富 含 域 有 报 道 表 明,ADAM17 半 胱 氨 酸 富 含 域 对 于 IL 1R I 胞 外 域 的 酶 切 是 必 需 的, 而 对 于 TNFα 或 p75tnfr 胞 外 域 酶 切 不 是 必 需 的 ADAM17 解 离 素 / 半 胱 氨 酸 富 含 域 含 有 2 个 高 度 保 守 邻 近 的 半 胱 氨 酸 模 序 (CXXC,X 代 表 2 个 其 他 氨 基 酸 ),CXXC 模 序 在 其 他 蛋 白 中 已 被 证 实 受 到 氧 化 - 还 原 修 饰 [2] 在 任 何 一 个 模 序 中, 使 用 丙 氨 酸 代 替 半 胱 氨 酸, 明 显 抑 制 ADAM17 活 性 [4], 表 明 半 胱 氨 酸 富 含 域 在 调 节 ADAM17 活 性 中 发 挥 重 要 作 用 [11] 跨 膜 域 过 表 达 截 断 型 ADAM17 研 究 显 示, 在 佛 波 酯 (phorbol12 myristate 13 acetate,pma) 刺 激 的 细 胞, 只 有 表 达 具 有 跨 膜 域 的 ADAM17 才 能 有 效 酶 切 TNFα, 表 明 跨 膜 域 对 于 ADAM17 的 活 性 非 常 重 要 胞 内 域 ADAM17 胞 内 域 是 由 脯 氨 酸 富 含 的 130 个 氨 基 酸 残 基 组 成, 含 有 1 个 潜 在 的 跨 膜 域 近 端 酪 氨 酸 磷 酸 化 位 点 DKKLDKQYESL, 和 1 个 SH3 结 合 位 点 ( 第 731~738 位 氨 基 酸 残 基 ) [2] 有 [11] 研 究 显 示 ADAM17 胞 内 域 对 于 PMA 诱 导 的 AD AM17 底 物 的 酶 切 不 是 必 需 的 PMA 是 诱 导 金 属 蛋 白 酶 活 化 强 的 诱 导 剂, 对 于 研 究 ADAMs 酶 活 性 改 变 是 很 好 的 工 具 但 是,PMA 不 是 生 理 性 诱 导 剂, 因 此 需 要 进 一 步 研 究 在 生 理 性 诱 导 剂 刺 激 条 件 下, 胞 质 域 对 ADAM17 酶 活 性 的 影 响 3.2 翻 译 后 修 饰 对 ADAM17 活 性 调 节 ADAM17 最 重 要 的 翻 译 后 修 饰 是 在 高 尔 基 体 网 络 进 行 的 前 域 酶 切, 导 致 ADAM17 成 熟 [2] 其 他 翻 译 后 修 饰 包 括 ADAM17 的 糖 基 化 和 磷 酸 化 在 成 熟 的 ADAM17 有 6 个 潜 在 的 N 连 接 糖 基 化 位 点 [2], 这 表 明 糖 基 化 可 能 是 重 要 的 ADAM17 活 化 的 调 节 机 制 ADAM17 分 子 量 为 130ku 是 ADAM17 糖 基 化 形 式 [2] 然 而, 到 目 前 为 止 还 不 清 楚 ADAM17 糖 基 化 怎 样 影 响 ADAM17 活 化 和 转 运 另 一 个 重 要 的 翻 译 后 修 饰 是 磷 酸 化 ADAM17 胞 质 域 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 的 磷 酸 化 已 进 行 广 泛 的 研 究 但 是, 不 同 研 究 小 组 得 到 的 结 果 不 同, 有 的 甚 至 相 反 Waheed etal [12] 研 究 发 现, 在 CHO 和 HEK293 细 胞 株,PMA 和 表 皮 生 长 因 子 (epidermal growthfactor,egf) 刺 激 能 诱 导 ADAM17 在 735 位 苏 氨 酸 残 基 发 生 磷 酸 化, 磷 酸 化 由 有 丝 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 ERK 催 化, 同 时 伴 有 跨 膜 蛋 白 TrkA 神 经 [13] 营 养 因 子 受 体 酶 切 增 加 其 他 研 究 显 示,PMA 和 EGF 诱 导 ADAM17 在 819 位 丝 氨 酸 残 基 而 不 是 苏 氨 酸 残 基 ( 或 酪 氨 酸 残 基 ) 磷 酸 化, 磷 酸 化 由 ERK 催 化 ; 同 时 发 现 生 长 因 子 刺 激 能 诱 导 ADAM17 在 791 位 丝 氨 酸 残 基 脱 磷 酸 [13] 然 而, 很 少 有 报 道 关 于 非 PMA 刺 激 介 导 的 ADAM17 磷 酸 化 Adrain etal [14] 研 究 发 现, 在 癌 细 胞 系,G 蛋 白 偶 联 受 体 (G proteincoupledreceptor,gpcr) 刺 激 物 胃 泌 素 释 放 肽 能 诱 导 Src PI3K PDK1 信 号 通 路 活 化, 磷 酸 肌 醇 依 赖 的 蛋 白 激 酶 1(phosphoinositide dependentkinase 1,PDK1) 能 直 接 磷 酸 化 ADAM17 的 苏 氨 酸 和 丝 氨 酸 残 基, 但 是,ADAM17 胞 内 域 具 体 磷 酸 化 位 点 和 胞 内 域 在 ADAM17 活 性 中 的 具 体 作 用 需 要 进 一 步 研 究 在 HEK293 细 胞 系, 另 一 个 GPCR 刺 激 物 卡 巴 可 能 诱 导 ADAM17735 位 苏 氨 酸 残 基 和 702 位 酪 氨 酸 残 基 发 生 磷 酸 化 Yinetal [15] 研 究 发 现, 通 过 GPCR 活 化 信 号 通 路, 创 伤 三 磷 酸 腺 苷 (adenosine triphosphate,atp) 或 溶 血 磷 脂 酸 (lysophosphatidic acid,lpa) 处 理 的 角 膜 上 皮 细 胞 能 诱 导 ERK 依 赖 的 ADAM17 丝 氨 酸 磷 酸 化 上 述 这 些 研 究 结 果 有 些 是 相 反 的, 可 能 原 因 是 研 究 者 采 用 的 是 仿 真 系 统 : 过 表 达 ADAM17 的 转 化 或 转 染 细 胞, 以 及 主 要 使 用 非 生 理 性 诱 导 剂 PMA 来 研 究 ADAM17 磷 酸 化 过 程 另 一 种 可 能 原 因 是 ADAM17 在 不 同 的 残 基 发 生 磷 酸 化 取 决 于 细 胞 类 型 和 刺 激 因 此, 为 了 更 好 的 理 解 这 种 现 象, 今 后 在 研 究 ADAM17 翻 译 后 修 饰

161 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 1187 时, 最 好 采 用 原 代 未 转 染 的 细 胞, 而 且 也 要 使 用 生 理 性 刺 激 物 来 代 替 PMA 3.3 ADAM17 胞 内 转 运 对 其 活 性 调 节 与 翻 译 后 修 饰 一 样,ADAM17 胞 内 转 运 可 能 也 调 控 其 酶 切 活 [2] 性 最 近 研 究 表 明, 在 furin 酶 切 ADAM17 前 域 期 间 和 酶 切 之 后, 活 化 的 ADAM17 定 位 在 胆 固 醇 富 含 的 膜 性 微 区, 这 种 膜 性 微 区 称 为 脂 筏 定 位 在 脂 筏 的 活 化 ADAM17 在 空 间 上 与 其 底 物 分 离, 因 此 从 空 间 上 限 制 其 活 性 [16] 同 时 发 现, 将 细 胞 膜 胆 固 醇 消 耗 后 能 增 加 ADAM17 酶 切 底 物 的 活 性, 表 明 在 细 胞 膜 表 面 ADAM17 酶 切 活 性 可 能 受 到 胆 固 醇 运 转 [17] 的 调 节 最 近 有 报 道 表 明, 高 密 度 脂 蛋 白 (high densitylipoproteins,hdls) 能 改 变 脂 筏 结 构, 进 而 活 化 ADAM17, 引 起 ADAM17 底 物 的 酶 切 增 加 另 外,ERK 依 赖 的 ADAM17 胞 内 域 735 位 苏 氨 酸 残 基 磷 酸 化 对 于 ADAM17 在 成 熟 过 程 中 转 运 到 分 泌 通 路 是 必 需 的 [18] Ebsenetal [19] 研 究 发 现, 使 用 PMA,ADAM17 在 细 胞 表 面 表 达 减 少, 认 为 是 AD AM17 内 化 和 降 解 的 结 果 相 反, 其 他 研 究 小 组 研 [20] 究 发 现,PMA 刺 激 并 不 引 起 ADAM17 在 细 胞 中 重 新 分 布, 但 能 减 少 细 胞 内 总 的 ADAM17 含 量 尽 管 这 方 面 的 研 究 报 道 很 多, 但 是 目 前 对 于 调 控 AD AM17 转 运 的 机 制 还 不 清 楚 4 ADAM17 与 人 类 疾 病 ADAM17 涉 及 许 多 人 类 的 疾 病, 包 括 癌 症 败 血 症 糖 尿 病 多 发 性 硬 化 症 老 年 性 痴 呆 等 4.1 内 毒 素 休 克 和 败 血 症 在 脑 膜 炎 双 球 菌 或 脂 多 糖 (lipopolysaccharide,lps) 刺 激 的 单 核 细 胞, 其 表 面 TNF α 的 量 迅 速 减 少, 表 明 ADAM17 在 败 血 症 中 发 挥 重 要 的 作 用 [21] 脑 膜 炎 患 者 的 血 液 和 腹 水 中 ADAM17 活 性 增 加, 同 时 分 叶 核 中 性 粒 细 胞 表 面 [22] TNFα 和 L 选 择 素 减 少 而 且, 最 近 研 究 显 示, 在 骨 髓 细 胞 缺 乏 ADAM17 活 性 的 小 鼠, 通 过 抑 制 循 环 中 TNFα 的 量, 能 减 少 内 毒 素 休 克 引 起 小 鼠 的 致 死 率, 表 明 ADAM17 在 内 毒 素 休 克 中 的 作 用 4.2 多 发 性 硬 化 症 ADAM17 也 涉 及 神 经 炎 症 性 疾 病, 如 多 发 性 硬 化 症 (multiplesclerosis,ms) 在 急 性 MS 患 者, 外 周 单 核 细 胞 ADAM17 活 化 增 加 而 且, 采 用 免 疫 组 化, 对 死 于 MS 患 者 的 尸 体 进 行 研 [23] 究 显 示,ADAM17 和 TNFR2 存 在 活 化 MS 斑 块, 同 时, 患 者 脑 脊 液 中,ADAM17 和 可 溶 性 TNFR2 含 量 增 加 在 急 性 MS 损 伤, 内 皮 细 胞, 小 胶 质 细 胞, 星 形 胶 质 细 胞 的 ADAM17 表 达 增 加 ADAM17 在 MS 中 的 作 用 可 能 是 通 过 酶 切 酪 氨 酸 激 酶 Axl 和 Mer 诱 饵 受 体, 促 进 斑 块 形 成, 改 变 生 长 因 子 信 号 和 延 长 损 伤 活 动 [24], 然 而, 这 种 可 能 性 需 要 进 一 步 验 证 4.3 老 年 性 痴 呆 ADAM17 在 老 年 性 痴 呆 中 扮 演 重 要 角 色,ADAM17 作 为 α 分 泌 酶 酶 切 淀 粉 样 前 体 蛋 白 (amyloidprecusorprotein,app) 产 生 可 溶 性 APPsα,APPsα 不 参 与 构 成 细 胞 外 老 年 斑 如 果 APP 被 β 分 泌 酶 所 酶 切, 产 生 β 淀 粉 样 多 肽 (Aβ 多 肽 ),Aβ 多 肽 是 构 成 细 胞 外 老 年 斑 的 主 要 成 分 在 老 年 痴 呆 患 者 大 脑 淀 粉 样 斑 块 周 围, 观 察 到 小 胶 质 细 胞 和 星 形 胶 质 细 胞 活 化, 以 及 增 加 的 炎 症 介 质, 证 实 Aβ 多 肽 能 诱 导 炎 症 [25] ADAM17 定 位 在 脑 部 [26] 含 有 淀 粉 样 斑 块 的 区 域 最 近 研 究 显 示, 能 调 节 ADAM17 活 性 的 ADAM17 胞 内 域 结 合 蛋 白 FHL2 对 于 APPsα 的 形 成 也 是 必 需 的 4.4 恶 性 肿 瘤 ADAM17 通 过 酶 切 肿 瘤 生 长 过 程 中 必 需 的 生 长 因 子 而 参 与 癌 症 的 形 成 已 发 现, 肿 瘤 组 织 ADAM17 活 性 升 高, 伴 有 组 织 中 表 皮 生 长 因 子 配 体 酶 切 增 加, 能 促 进 肿 瘤 恶 性 程 度 的 发 展 ADAM17 在 各 种 恶 性 肿 瘤 中 的 作 用, 目 前 了 解 最 深 入 的 是 乳 腺 癌 在 乳 腺 癌,ADAM17 过 表 达 与 TGFα 表 达 肿 瘤 级 数 和 转 移 相 关 联, 而 且 ADAM17 活 化 增 加 预 示 着 乳 腺 癌 患 者 存 活 期 缩 短 [27] 在 乳 腺 癌 转 移 的 患 者, 血 清 中 能 检 测 到 乳 腺 癌 标 志 物 nectin 4,nectin 4 是 被 ADAM17 所 酶 切 体 外 实 [28] 验 显 示,ADAM17 诱 导 乳 腺 癌 细 胞 增 殖 转 移 是 通 过 活 化 EGFR PI3K AKT 信 号 通 路 而 且, 通 过 小 RNAs 干 扰 技 术 干 扰 ADAM17 活 性 后, 乳 腺 癌 细 胞 恶 性 表 型 能 恢 复 到 正 常 表 型, 进 一 步 表 明 ADAM17 在 乳 腺 癌 中 的 重 要 病 理 生 理 作 用 5 结 语 ADAM17 表 达 在 大 多 数 哺 乳 动 物 细 胞, 在 调 控 生 理 性 和 病 理 性 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 ADAM17 作 为 重 要 的 sheddase, 对 于 正 常 哺 乳 动 物 的 发 育 和 正 常 生 命 的 维 持 是 必 需 的 鉴 于 ADAM17 的 重 要 作 用, 研 究 ADAM17 活 化 机 制 就 显 得 非 常 重 要 例 如 : 怎 样 做 到 一 种 药 物 只 针 对 癌 症 细 胞 的 ADAM17, 而 不 影 响 其 他 正 常 组 织 细 胞 的 ADAM17 功 能? 虽 然 一 些 ADAM17 特 异 性 抑 制 药 物 能 特 异 性 抑 制 ADAM17 活 性 而 不 抑 制 其 他 金 属 蛋 白 酶 活 性, 但 是 其 副 作 用 还 是 非 常 大 的 由 于 ADAM17 具 有 双 重 特 性 ( 既 能 促 进 细 胞 增 殖 又 能 抑 制 细 胞 增 殖 ), 所 以

162 1188 安 徽 医 科 大 学 学 报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014Aug;49(8) 有 些 效 果 可 能 对 于 某 些 组 织 或 疾 病 是 有 利 的, 但 对 其 他 组 织 是 有 害 的 因 此,ADAM17 活 性 必 需 在 细 胞 所 处 的 特 定 环 境 下 进 行 考 虑, 这 主 要 取 决 于 与 ADAM17 信 号 通 路 相 连 的 其 他 信 号 通 路 和 分 子 在 不 同 组 织 细 胞 所 处 的 环 境 下, 对 ADAM17 活 化 影 响 是 不 同 的 总 之, 理 解 体 内 ADAM17 活 性 调 控 的 机 制 对 于 与 ADAM17 有 关 疾 病 的 治 疗 具 有 重 要 意 义 参 考 文 献 [1] Rose JohnS.ADAM17,shedding,TACEastherapeutictargets [J].PharmacolRes,2013,71(5): [2] EdwardsDR,HandsleyMM,PenningtonCJ.TheADAMmetal loproteinases[j].molaspectsmed,2008,29(5): [3] MenqhiniR,FiorentinoL,CasaqrandeV,etal.TheroleofAD AM17inmetabolicinflammation[J].Atherosclerosis,2013,228 (1):12-7. [4] GoozM.ADAM 17:theenzymethatdoesital[J].CritRev BiochemMolBiol,2010,45(2): [5] ChristianLM.TheADAM family:insightsintonotchproteolysis [J].Fly(Austin),2012,6(1):30-4. [6] LiX,YanY,HuangW,etal.TheregulationofTACEcatalytic functionbyitsprodomain[j].molbiolrep,2009,36(4): [7] TapeCJ,WilemsSH,DombernowskySL,etal.Cros domain inhibitionoftaceectodomain[j].procnatlacadsciusa, 2011,108(14): [8] PerezL,KeriganJE,LiX,etal.Substitutionofmethionine435 withleucine,isoleucine,andserineintumornecrosisfactoralpha convertingenzymeinactivatesectodomainsheddingactivity[j]. BiochemCelBiol,2007,85(1): [9] JanesPW,SahaN,BartonW A,etal.Adam meetseph:an ADAM substraterecognitionmoduleactsasamolecularswitchfor ephrincleavageintrans[j].cel,2005,123(2): [10] GoozP,DangY,HigashiyamaS,etal.Adisintegrinandmet aloenzyme(adam)17activationisregulatedbyα5β1integrin inkidneymesangialcels[j].plosone,2012,7(3):e [11] LiX,PerezL,FanH.InhibitoryroleofTACE/ADAM17cytotail inproteinectodomainshedding[j].worldjbiolchem,2011,2 (11): [12] WaheedF,DanQ,AmoozadehY,etal.Centralroleoftheex changefactorgef H1inTNF α inducedsequentialactivationof Rac,ADAM17/TACE,andRhoAintubularepithelialcels[J]. MolBiolCel,2013,24(7): [13] LiX,PerezL,FanH.InhibitoryroleofTACE/ADAM17cytotail inproteinectodomainshedding[j].worldjbiolchem,2011,2 (11): [14] AdrainC,ZetlM,ChristovaY,etal.Tumornecrosisfactorsig nalingrequiresirhom2topromotetrafickingandactivationofta CE[J].Science,2012,335(6065): [15] YinJ,YuFS.ERK1/2mediatewounding andg protein cou pledreceptorligands inducedegfractivationviaregulatingad AM17andHB EGFshedding[J].InvestOphthalmolVisSci, 2009,50(1): [16] TelierE,CanaultM,RebsomenL,etal.Thesheddingactivity ofadam17issequesteredinlipidrafts[j].expcelres, 2006,312(20): [17]TelierE,CanaultM,PoggiM,etal.HDLsactivateADAM17 dependentshedding[j].jcelphysiol,2008,214(3): [18]SoondSM,EversonB,RichesDW,etal.ERK mediatedphos phorylationofthr735intnfalpha convertingenzymeanditspo tentialroleintaceproteintraficking[j].jcelsci,2005, 118(Pt11): [19]EbsenH,SchroderA,KabelitzD,etal.Diferentialsurfaceex presionofadam10andadam17onhumantlymphocytesand tumorcels[j].plosone,2013,8(10):e [20] GuoS,PengM,ZhaoQ,etal.RoleofADAM10andADAM17 incd16bsheddingmediatedbydiferentstimulators[j].chin MedSciJ,2012,27(2):73-9. [21]YousefAA,SulimanGA.Thepredictiveprognosticvaluesofser umtnf αincomparisontosofascoremonitoringincriticaly I patients[j].biomedresint,2013,2013: [22]Becker PaulyC,Rose JohnS.TNFαcleavagebeyondTACE/AD AM17:matrixmetaloproteinase13isapotentialtherapeutictarget insepsisandcolitis[j].embomolmed,2013,5(7): [23]WarenKM,ReevesTM,PhilipsLL.MT5 MMP,ADAM 10, andn cadherinactinconcerttofacilitatesynapsereorganization aftertraumaticbraininjury[j].jneurotrauma,2012,29(10): [24]WeingerJG,OmariKM,MarsdenK,etal.Up regulationofsol ubleaxlandmerreceptortyrosinekinasenegativelycorelates withgas6inestablishedmultiplesclerosislesions[j].am J Pathol,2009,175(1): [25]PlutaR,Furmaga JablonskaW,MaciejewskiR,etal.Brainis chemiaactivatesβ andγ secretasecleavageofamyloidprecursor protein:significanceinsporadicalzheimer sdisease[j].mol Neurobiol,2013,47(1): [26] TanahashiH,YoshiokaK.RNAinterferencesilencingofDRAL afectsprocesingofamyloidprecursorprotein[j].neuroscilet, 2008,439(3): [27] McGowanPM,McKiernanE,BolsterF,etal.ADAM 17pre dictsadverseoutcomeinpatientswithbreastcancer[j].annon col,2008,19(6): [28] DufyM J,MuloolyM,O DonovanN,etal.TheADAMsfamily ofproteases:new biomarkersandtherapeutictargetsforcancer [J].ClinProteomics,2011,8(1):9.