第 36 卷第 4 期 2015 年 10 月 DOI: /j 水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.36,No.4 Oct COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用产久林 1,

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1 第 36 卷第 4 期 2015 年 10 月 DOI: /j 水生态学杂志 JournalofHydroecology Vol.36,No.4 Oct COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用产久林 1, 姜华鹏 1, 刘一萌 2, 胡星星 1, 王丛丛 1,3 1,3,4,5, 许强华 (1. 上海海洋大学海洋科学学院, 上海 ;2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 ; 3. 大洋渔业资源可持续开发省部共建教育部重点实验室, 上海 ; 4. 国家远洋渔业工程技术研究中心, 上海 ;5. 远洋渔业协同创新中心, 上海 ) 摘要 : 针对裂腹鱼种类繁多种间形态学差异不明显的特点, 利用分子标记对高原裂腹鱼进行准确的物种鉴定具有重要价值对采集的 60 尾高原裂腹鱼进行了 COⅠ 和 16SrRNA 基因的部分序列测定, 并通过 GenBank 数据库进行鱼种鉴定 ; 运用邻接法 (NJ) 构建系统发育树, 对实验鱼进行群系划分 ; 通过 DNASP 软件分析比较实验鱼 COⅠ 和 16SrRNA 基因的序列变异 ; 依据 MEGA6.0 的 Kimura 2 parameter 模型计算实验鱼的种内遗传距离和种间遗传距离, 并对 COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的适用性进行探讨结果表明, 采集的样本包含 3 属 5 种裂腹鱼, 分别为尖裸鲤属的尖裸鲤 (Oxygymnocyprisstewarti) 裸鲤属的软刺裸鲤 (Gymnocyprisdobu la) 裂腹鱼属的拉萨裂腹鱼 (Schizothoraxwaltoni) 巨须裂腹鱼 (Schizothoraxmacropogon) 和异齿裂腹鱼 (Schizotho raxoconnori) 在 COⅠ 基因构建的系统发育树中,5 种高原裂腹鱼均形成独立的一支, 而 16SrRNA 基因不能准确地对裂腹鱼属的 3 个鱼种实现区分研究显示,5 种高原裂腹鱼 COⅠ 基因核苷酸的变异水平 (P i ) 和单倍型多样性指数 (H d ) 均高于 16SrRNA 基因 ;COⅠ 基因计算得到实验鱼种间遗传距离和种内遗传距离平均值分别为和 0.002, 种内和种间的最大遗传差异约为 13 倍 ;16SrRNA 基因得出结果为和 0.005, 而种内和种间的最大遗传差异约为 6 倍综合 COⅠ 和 16SrRNA 基因能有效鉴定高原裂腹鱼物种, 而在单个基因的选择上, COⅠ 基因具有更高的适用性关键词 :COⅠ;16SrRNA; 高原裂腹鱼 ; 物种鉴定中图分类号 :Q789 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) 裂腹鱼 (Schizothoracinae) 仅分布于亚洲中部高原地区, 是具有重要经济价值和科研价值的鲤科鱼类, 因其两侧臀鳞的独特形态, 使其在腹部形成裂缝, 故称裂腹鱼 ; 该类群鱼类分为 11 属, 其中在中国境内普遍分布的有 10 属, 只有裂鲤属 (Schizo cypris) 仅分布于巴基斯坦和阿富汗 ( 武云飞和吴翠珍,1992; 代应贵和肖海,2011) 在鱼类的物种鉴定方法中, 形态学鉴别是经典的方法, 但对样本形态的完整性有很高的要求, 当样本在采集和运输时遭到损坏, 就会导致鉴定结果不准确本次研究的裂腹鱼样本采集于青藏高原, 在运输过程中会不同程度地对鱼体产生损伤, 形态学的方法可能导致鉴定结果不准确相比于形态学方收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( ); 教育部科学技术研究项目 (213013A); 上海市教育发展基金会和上海市教育委员会曙光计划 (13SG51); 上海市教委水产学一流学科项目作者简介 : 产久林,1990 年生, 男, 硕士研究生, 研究方向为海洋生物分子遗传学 E mail: @qq.com 通信作者 : 许强华, 博士, 教授 E mail:qhxu@shou.edu.cn 法,DNA 分子标记方法对样本形态没有苛刻要求, 且操作简便结果准确, 该方法作为一种新的鉴定手段, 已被广泛应用于鱼类的物种鉴定中, 尤其是在保护生物学和生物多样性调查等领域 (Witetal, 2006) 线粒体 DNA(MtDNA) 作为一种常用的分子标记, 已在动物的系统进化分析物种鉴定和种群结构等研究中得到广泛应用 ( 程汉良等,2007;Chenet al,2009; 陈军等,2010) 对于 DNA 分子标记的目的基因选取也要符合两个方面的要求 : 一方面该基因应该足够保守, 这样才能对其进行大量扩增 ; 另一方面该基因也应具有足够的变异, 从而对不同物种 DNA 序列进行区分, 实现物种鉴定因此, 在基于 DNA 分子标记的物种鉴定中, 选择有效的目的基因是至关重要的 (Savolainenetal,2005) 目前,Mt DNA 的 COⅠ 和 16SrRNA 基因是动物界物种鉴定中最常用的目的基因 ; 然而, 对于不同物种, 这 2 种分子标记的适用性也不同陈双雅等 (2012) 利用 COⅠ 基因和 16SrRNA 基因对石斑鱼的鉴定中发现 COⅠ 基因较 16SrRNA 基因有更高的分辨率 ; 刘萍

2015 年第 4 期产久林等,COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用 99 等 (2013) 利用 COⅠ 基因和 16SrRNA 基因对中华虎头蟹进行系统进化分析时发现 COⅠ 基因片段比 16SrRNA 基因片段具有较大的变异, 更适于其种群的遗传多样性分析 ; 然而, 利用这 2 种基因在高原裂腹鱼物种鉴定方面的研究还未见报道

2 2015 年第 4 期产久林等,COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用 99 等 (2013) 利用 COⅠ 基因和 16SrRNA 基因对中华虎头蟹进行系统进化分析时发现 COⅠ 基因片段比 16SrRNA 基因片段具有较大的变异, 更适于其种群的遗传多样性分析 ; 然而, 利用这 2 种基因在高原裂腹鱼物种鉴定方面的研究还未见报道由于本文中所获得的大多数样本保存不完整, 无法进行正常的形态学鉴定, 因此本研究利用 MtDNA 的 COⅠ 和 16SrRNA 分子标记, 针对采集的高原裂腹鱼样本进行物种鉴定, 同时对这 2 种分子标记在裂腹鱼物种鉴定的有效性进行了比较 1 材料与方法 1.1 材料实验裂腹鱼样本取自西藏自治区拉萨市 (29.66 N;91.12 E) 亚东县 (27.96 N;89.39 E) 羊卓雍措湖 - 羊湖 (29.00 N;90.41 E) 2012 年 8 月和 2013 年 5 月 9 月共采集 3 次, 样本共 200 余尾, 随机取 60 尾, 以 S-N 编号, 剪尾鳍置于 -80 冰箱保存, 并提取基因组 DNA 1.2 方法总 DNA 提取取保存备用尾鳍组织约 20mg, 切碎或置于有液氮的研钵中研磨, 然后转入 1.5mLEP 管中, 用常规 SDS/ 蛋白酶 K 消化酚 - 氯仿抽提乙醇沉淀总 DNA(Sambrooketal,2008) COⅠ 和 16SrRNA 的 PCR 扩增和测序 PCR 扩增使用的引物为生工合成, 引物序列见表 1 50μL 反应体系为 :5μL 的 10 Bufer,2.5μL 的 dntps, 上下游引物各 1μL,Taq 酶 0.25μL,DNA 模板 2μL 反应条件为 :95 5min; 30s; 56 30s;72 1min,35 个循环 ;72 10min 试剂均购于 TAKARA 生物公司 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后, 送生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司测序表 1 引物序列 Tab.1 Primersequences 基因引物序列 (5-3 ) 产物长度 /bp 16SrRNA CCGGTCTGAACTCAGATCACGT CGCCTGTTTATCAAAAACAT 572 COⅠ TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 序列分析将所测序列经比对后, 得到 CO Ⅰ 基因序列长为 650bp,16SrRNA 基因序列长为 520bp, 两者均去除了序列两端的引物通过 Gen Bank 核酸数据库进行对比分析 (htp://ncbi.nlm. nih.gov/blast), 找出可信度最大的物种, 综合数据完成鱼种的鉴定利用 DNASP 软件计算基因片段单倍型分布和核苷酸多样度 ;CLUSALX(Thompson etal,1997) 和 MEGA6.0 软件对比分析测序所得序列并构建 NJ 系统发育树 ; 依据 Kimura 2 parameter 模型计算种间和种内的遗传距离 (Kumaretal, 2004) 2 结果与分析 2.1 裂腹鱼基因组 DNA 提取和 PCR 扩增从裂腹鱼样本中提取片段完整的基因组 DNA 利用 COⅠ 和 16SrRNA 引物进行 PCR 扩增, 获得特异性条带, 产物电泳结果如图 1 所示 (M 表示 marker;1~5 泳道为 COⅠ 基因 ; 6~10 泳道为 16SrRNA 基因 ) 图 1 COⅠ 和 16SrRNA 基因的琼脂糖凝胶电泳 (M indicatesthemarker;1-5linesindicatethecoⅠ gene; 6-10linesindicatethe16SrRNAgene) Fig.1 ElectrophoresispaternofCOⅠand 16SrRNAgenePCRproducts 2.2 序列测定和物种鉴定针对每条鱼每种基因送测 3 次, 选择其中 2 次测序完全相同的序列进行后续比较分析测序数据比对结果显示,60 尾裂腹鱼包含 3 属 5 种,7 尾尖裸鲤 (Oxygymnocyprisstewarti) 为尖裸鲤属,3 尾巨须裂腹鱼 (Schizothoraxmacropogon) 17 尾拉萨裂腹鱼 (Schizothoraxwaltoni) 和 13 尾异齿裂腹鱼 (Schizo thoraxoconnori) 为裂腹鱼属,20 尾软刺裸鲤 (Gymno cyprisdobula) 为裸鲤属在 GenBank 中的比对结果如表 2 所示 (5 类鱼种任取 1 尾作为示例 ) 结果显示,COⅠ 能对 5 种裂腹鱼进行有效鉴定, 且均具有单一的鉴定结果 ;16SrRNA 能有效地对尖裸鲤软刺裸鲤和巨须裂腹鱼进行鉴定, 但对裂腹鱼属的 2 种裂腹鱼不能进行有效区分 2.3 COⅠ 和 16SrRNA 基因序列的系统发育系统发育树的构建对 COⅠ 和 16SrRNA 的基因序列绘制 NJ 系统发育树, 树中各分支节点上的数值表示节点支持率 COⅠ 基因序列制作的发育树如图 2 所示,5 种裂腹鱼被明显地划分成 5 个独立群系, 并能与 GenBank 鉴定的结果一一对应 16SrRNA 基因序列绘制发育树见图 3, 软刺裸鲤和尖裸鲤均形成独立群系, 但拉萨裂腹鱼异齿裂腹鱼

3 100 第 36 卷第 4 期水生态学杂志 2015 年 10 月样品编号表 2 样品在 GenBank 序列号以及鱼种的名称 Tab.2 SequencenumberandthecorrespondingspeciesofthesamplesinGenBank GenBank 序列号 COⅠ 相似度 /% 16SrRNA 相似度 /% 综合序列号鉴定结果 S1 KF KF KF 尖裸鲤 S12 KC KC KC 巨须裂腹鱼 S30 JX S52 KC KC JX KC KC JX KC 拉萨裂腹鱼异齿裂腹鱼 S57 KC KC KC 软刺裸鲤图 2 COⅠ 基因的系统发育树 Fig.2 Phylogenetictreeofthe60Schizothoraxindividuals basedoncoⅠgenesequences Fig.3 图 3 16SrRNA 基因的系统发育树 Phylogenetictreeofthe60Schizothoraxindividuals basedon16srrnagenesequences

4 2015 年第 4 期产久林等,COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用 101 和巨须裂腹鱼的群系区分不明显 CO1 和 16SrRNA 基因的序列变异利用异数 ;H 表示单倍型数 ;H d 表示单倍型多样性指数 ; P i 表示核苷酸多样性指数从表 3 中 P i 的数值可 DNASP 软件对 2 个基因序列的变异指数和单倍型差异进行了分析, 分析结果见表 3 表 3 中 N 表示样本数量 ;S 表示多态位点数 ;K 表示平均核苷酸差以得出,COⅠ 基因的核苷酸变异水平要明显高于 16SrRNA 基因 ;COⅠ 基因的单倍型多样性指数也高于 16SrRNA 基因表 3 COⅠ 基因和 16SrRNA 基因的遗传多样性参数 Tab.3 GeneticdiferentiationoftheCOⅠ geneand16srrnageneforthefiveschizothoraxspecies 鱼名 COⅠ 16SrRNA N S K H H d P i N S K H H d P i 尖裸鲤软刺裸鲤拉萨裂腹鱼巨须裂腹鱼异齿裂腹鱼遗传距离 5 种裂腹鱼的 COⅠ 基因序列遗 5 种裂腹鱼 16SrRNA 基因序列的遗传距离如传距离如表 4 所示, 其种内遗传距离均小于 0 010, 表 5 所示, 其种内遗传距离均小于 0.010, 平均值为平均值为属内种间遗传距离均大于 0.02, 属内种间遗传距离均大于 0.02, 平均值为平均值为 0.025; 其中尖裸鲤属和裸鲤属的属间遗 0 026; 其中尖裸鲤属和裸鲤属的属间遗传距离为传距离为 0.085~0.092, 尖裸鲤属和裂腹鱼属为 0 030~0 042, 尖裸鲤属和裂腹鱼属为 0 055~ 0 153~0.201, 裸鲤属和裂腹鱼属为 0 143~ 0 075, 裸鲤属和裂腹鱼属为 0.057~0.077 裂腹 0 186, 裂腹鱼属的属内种间遗传距离在 0 022~ 鱼属的属内种间遗传距离为 0 020~0 034; 与显然, 尖裸鲤属与裸鲤属的属间遗传距离 COⅠ 基因的分析结果相似, 尖裸鲤属与裸鲤属的属 (0 0850~0 092) 要小于其与裂腹鱼属的属间距离间遗传距离 (0.030~0.042) 要小于其与裂腹鱼属 (0 153~0 201;0 143~0 186) 的属间距离 (0.055~0.075;0.057~0.077) 表 4 5 种裂腹鱼 COⅠ 基因序列的遗传距离 Tab.4 GeneticdistancesofCOⅠgenebetweenthefiveSchizothoraxspecies 序号注 : 用于遗传距离分析的样本均根据鱼种鉴定结果随机选取 1~3 代表 3 尾不同的尖裸鲤个体 ;4~6 代表 3 尾不同的巨须裂腹鱼个体 ;7 ~9 代表 3 尾不同的拉萨裂腹鱼个体 ;10~12 代表 3 尾不同的异齿裂腹鱼个体 ;13~15 代表 3 尾不同的软刺裸鲤个体 Note:Thesamplesusedforgeneticdistanceanalysiswereselectedrandomlybasedontheresultsofspeciesidentification.1-3referto3Oxygymno cyprisstewartiindividuals;4-6referto3schizothoraxmacropogonindividuals;7-9referto3schizothoraxwaltoniindividuals;10-12referto3 Schizothoraxoconnoriindividuals;13-15referto3Gymnocyprisdobulaindividuals.

5 102 第 36 卷第 4 期水生态学杂志 2015 年 10 月表 5 5 种裂腹鱼 16SrRNA 基因序列的遗传距离 Tab.5 Geneticdistancesof16SrRNAgenebetweenthefiveSchizothoraxspecies 序号注 : 用于遗传距离分析的样本均根据鱼种鉴定结果随机选取 1~3 代表 3 尾不同的尖裸鲤个体 ;4~6 代表 3 尾不同的巨须裂腹鱼个体, 7~9 代表 3 尾不同的拉萨裂腹鱼个体,10~12 代表 3 尾不同的异齿裂腹鱼个体,13~15 代表 3 尾不同的软刺裸鲤个体 Note:Thesamplesusedforgeneticdistanceanalysiswereselectedrandomlybasedontheresultsofspeciesidentification.1-3referto3Oxygymno cyprisstewartiindividuals;4-6referto3schizothoraxmacropogonindividuals;7-9referto3schizothoraxwaltoniindividuals;10-12referto3 Schizothoraxoconnoriindividuals;13-15referto3Gymnocyprisdobulaindividuals. 3 讨论 3.1 裂腹鱼 COⅠ 和 16SrRNA 基因序列在数据库的鉴定 GenBank 数据库是美国国家生物技术信息中心 (NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI) 建立的 DNA 序列数据库, 主要是由科研人员直接提供或来源于大规模基因组测序计划, 其中包含了多种生物的核苷酸序列, 是进行序列比对最常用的数据库, 由于无法判别库中数据是否具有鱼种代表性, 因此有可能会使鉴定结果有不可避免的偏差 DNA 条形码概念由 Hebert 等 (2003a) 首次提出, 是指生物体内能够代表该物种的标准的有足够变异的易扩增且相对较短的 DNA 片段近年来, 有关 DNA 条形码的研究持续升温, 一系列 DNA 条形码计划正在世界各地进行 ; 其优点是以 DNA 序列为检测对象, 其在个体发育过程中不会改变, 结果准确性高, 特定的物种具有特定的 DNA 序列信息, 而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差然而, 对于 DNA 条码在能否解决关系非常近的物种问题上一直存在较大的争议 ( 陈双雅等, 2012; 肖金花等,2004); 因此仅用一个基因对某些属内种间序列差异小亲缘关系近的鱼种进行鉴定, 可能会导致结果不准确, 同时使用多个分子标记进行分析会增加结果的可靠性本研究中,COⅠ 和 16SrRNA 基因序列在 Gen Bank 中比对得到的相似性均没有达到 100%, 而 16SrRNA 基因在拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼的鉴定上出现了分歧原因可能是 MtDNA 具有一定程度的变异, 导致测定所得序列不可能与数据库中的序列完全匹配, 从而造成相似度无法达到 100% 在这种情况下, 可以选择利用多个基因来区分近缘物种鉴于目前的实验结果, 建议同时对裂腹鱼 COⅠ 和 16SrRNA 两个基因进行序列测定, 然后在 Gen Bank 数据库进行搜索, 再综合两者的结果完成鱼种鉴定工作 3.2 利用 COⅠ 和 16SrRNA 基因进行物种鉴定的有效性比较属内种间和种内遗传距离的大小是物种鉴定的一个重要手段, 也作为物种鉴别的一个主要标准, 较大的种间序列差异决定了物种鉴定时的准确性 Hebert 等 (2003a) 指出,0.02 是种间和种内遗传距离的一个分水岭, 最小种间遗传距离需大于 0.02, 当种间遗传距离和种内遗传距离的差异达 10 倍以上时,COⅠ 基因才能被有效地用于物种鉴定多年来, 此观点在许多物种研究中得到了验证 ( 彭居俐等,2009; 周晓犊等,2010) 本次研究的高原裂腹鱼, 其 COⅠ 序列间的变异情况符合上述标准, 种内的遗传距离均小于 0.02( 最大值为 0.012); 种间遗传距离均大于 0.02( 最小值为 0.022, 出现于裂腹鱼属内种间 ); 种间和种内遗传距离差异最小的是裂腹鱼属 3 种鱼类, 其种内和种间的遗传差异约为 13

6 2015 年第 4 期产久林等,COⅠ 和 16SrRNA 基因在高原裂腹鱼物种鉴定中的应用 103 倍 ; 由此可见 COⅠ 基因序列适用于高原裂腹鱼的物种鉴定相比于 COⅠ 基因,16SrRNA 基因在物种鉴定中的应用并没有相应的标准由于 16SrRNA 基因序列具有较高的保守性, 导致其缺乏足够的序列变异来对相关物种进行有效的区分和鉴定有研究发现,16SrRNA 序列在种内和属内种间的遗传变异均很小, 序列重叠的现象在两者间普遍存在, 一些亲缘关系近的物种甚至会出现序列共享现象 (Cawthorn etal,2011); 因此,16SrRNA 序列不适于区分和鉴别一些近缘种, 同时给种水平的物种鉴定带来困难然而, 在另外一些动物类群中,16SrRNA 序列却被证明在属水平上有相对较高的变异水平和较好的分辨能力 (Cawthornetal,2011) 本次研究中, 虽然 5 种高原裂腹鱼的种内和种间遗传距离均能以 0.02 作为分水岭, 但种内和种间遗传距离差异并不显著, 最大倍数约为 6 倍与 COⅠ 基因的数据相比, 本次研究发现 16SrRNA 基因的种间平均遗传距离为 0 026, 大于 COⅠ 基因的由此可见,16S rrna 能作为高原裂腹鱼属水平上的物种鉴别, 而对于种水平上的鉴定值得考量本研究中,COⅠ 和 16SrRNA 基因序列的 NJ 系统发育树显示了基本一致的拓扑结构 ; 其中软刺裸鲤和尖裸鲤聚为一个大的群系, 并且各自均能独立聚为一支, 说明 COⅠ 和 16SrRNA 基因均能对尖裸鲤和软刺裸鲤进行准确区分, 且这 2 鱼种有很近的亲缘关系对于 3 种裂腹鱼,COⅠ 基因也能将其准确的区分, 而 16SrRNA 基因的进化树只能将裂腹鱼属系统归为一个大支, 不能明确的将种分开, 这可能与基因的变异速率有关基因的保守性越强变异速率越慢, 对于亲缘关系密切的物种就越难区分, 这与表 3 得到的结果相符合以上研究显示,16S rrna 基因序列更为保守, 变异速率比 COⅠ 基因低, 表明 COⅠ 基因在裂腹鱼物种鉴定上的适用性要高于 16SrRNA 基因因此, 而对于亲缘关系密切的物种, 选择 COⅠ 基因可能更为合适参考文献陈军, 李琪, 孔令锋, 等基于 COⅠ 序列的 DNA 条形码在中国沿海缀锦蛤亚科贝类中的应用分析 [J]. 动物学研究,31(4): 陈双雅, 王嘉鹤, 陈伟玲, 等 SrRNA 基因和 COⅠ 基因序列分析在石斑鱼物种鉴定中的应用 [J]. 生物技术通报,(10): 程汉良, 夏德全, 吴婷婷, 等种帘蛤科贝类及 4 个地理种群文蛤线粒体 COⅠ 基因片段序列分析 [J]. 海洋学报,29(5): 代应贵, 肖海裂腹鱼类种质多样性研究综述 [J]. 中国农学通报,27(32): 刘萍, 段亚飞, 毛智超, 等中华虎头蟹线粒体 16S rrna 和 COⅠ 基因的序列比较及其系统进化分析 [J]. 水产学报,37(10): 彭居俐, 王绪祯, 王丁, 等基于线粒体 COⅠ 基因序列的 DNA 条形码在鲤科属鱼类物种鉴定中的应用 [J]. 水生生物学报,33(2): 武云飞, 吴翠珍青藏高原鱼类 [M]. 成都 : 四川科技出版社. 肖金花, 肖晖, 黄大卫生物分类学的新动向 -DNA 条形编码 [J]. 动物学报,50(5): 周晓犊, 杨金权, 唐文乔, 等基于线粒体 COⅠ 基因 DNA 条形码的中国鲚属物种有效性分析 [J]. 动物分类学报,35(4): CawthornDM,SteinmanHA,WithuhnRC.2011.Evalua tionofthe16sand12srrnagenesasuniversalmarkers fortheidentificationofcommercialfishspeciesinsouthaf rica[j].gene,491(1): ChenAH,LiZX,FengGN.2009.Phylogeneticrelationships ofthegenusmeretrix(molusca:veneridae)basedonmi tochondrialcoⅠ genesequences[j]. ZoologicalRe search,30(3): HebertPDN,CywinskaA,BalSL,etal.2003.Biologicali dentificationsthroughdna barcodes[j].procr SocB, 270: KumarS,TamuraK,NeiM.2004.MEGA3:integratedsoft wareformolecularevolutionarygeneticsanalysisandse quencealignment[j].briefingsinbioinformatics,5: SambrookJ,RuselDW,HuangPT.2008.TheCondensed Pro tocolsfrom MolecularCloning:A LaboratoryManual [M].ChemicalIndustryPres:693. SavolainenV,CowanRS,VoglerAP,etal.2005.Towards writingtheencyclopediaoflifeanintroductiontodnabar coding[j].philtransrsocb,360: ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,etal.1997.The ClustalXwindowsinterface:Flexiblestrategiesformultiple sequencesalignmentaidedbyqualityanalysistools[j]. NucleicAcidsRes,25(24): WitJDS,TherlofDL,HebertPDN.2006.DNAbarcoding revealsextraordinarycrypticdiversityinanamphipodgenus implicationsfordesertspringconservation[j].molecular Ecology,15: ( 责任编辑万月华 )

7 104 第 36 卷第 4 期水生态学杂志 2015 年 10 月 ApplicationofCOⅠ and16srrnageneforidentificationof TibetanPlateauSchizothoraxSpecies CHANJiu lin 1,JIANGHua peng 1,LIUYi meng 2,HUXing xing 1,WANGCong cong 1,3,XUQiang hua 1,3,4,5 (1.ColegeofMarineSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai ,P.R.China; 2.ColegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai ,P.R.China; 3.KeyLaboratoryofSustainableExploitationofOceanicFisheriesResources, MinistryofEducation,Shanghai ,P.R.China; 4.NationalEngineeringResearchCenterforOceanicFisheries,Shanghai ,P.R.China; 5.ColaborativeInnovationCenterforDistant waterfisheries,shanghai ,P.R.China) Abstract:TheplateauSchizothoraxspeciesaredistributedprimarilyontheTibetanplateauandadjacentwaters. Schizothoraxspecieshavewidevarietiesandposeshighscientificandeconomicvalue,butthemorphological diferencesbetweenspeciesarenotobvious.therefore,theabilitytoidentifyplateauschizothoraxspeciesusing molecularmarkerswouldbeveryuseful.inthisstudy,60schizothoraxindividualscolectedfromthetibetanplat eauwereidentifiedbasedontheir16srrnaandcoⅠ basesequences.basedonourresults,theefectivenesof usingthetwogenesforidentifyingplateauschizothoraxspecieswasexamined.the60schizothoraxsamplesforthe studywereselectedfrom200schizothoraxcolectedinaugust,2012andmayandseptember,2013andlabeleds1 -S60.The16SrRNAandCOⅠ genesofthe60fishwereextractedandamplifiedusingpcr.thepcrproducts of16srrnaandcoⅠ geneswerethensequencedandthesequenceswereusedforspeciesidentificationbycom parisonwiththegenbankdatabase.resultsindicatethatthe60schizothoraxwerefrom3generaand5species: Oxygymnocyprisstewarti,Gymnocyprisdobula,Schizothoraxwaltoni,SchizothoraxmacropogonandSchizothorax oconnori.phylogenetictreesofthe60schizothorax,basedoncoⅠ and16srrnabasesequences,wereconstruc tedusingtheneighbor joiningmethod.thephylogenetictreesshowthatthefiveplateauschizothoraxspeciesre spectiveluyformanindependentcladebasedoncoⅠ basesequences,butthe16srrnasequencefailedtosepa ratethreeschizothoraxspecies.thenucleotidediversity(p i )andhaploidtypediversity(h d )ofthecoⅠ gene, measuredbydnaspsoftware,werehigherthanthoseofthe16srrnagene.inaddition,theinterspecificandin traspecificgeneticdistancesofthetwogeneswerecalculatedbykimura 2 parametermodelfrommega6.0.the averageinterspecificandintraspecificgeneticdistancesofcoⅠ geneforthefiveschizothoraxspecieswere0.025 and0.002andthelargestgeneticdiferencebetweenthemwasaboutafactorof13.however,theaverageinterspe cificandintraspecificgeneticdistancesof16srrnagenewere0.026and0.005andthelargestgeneticdiference wasaboutafactorof6.inconclusion,speciesidentificationofplateauschizothoraxcanbeaccomplishedefectively bycombiningthecoⅠ and16srrnagenesandthecoⅠ geneismoresensitivethanthe16srrnagenefordis criminatingamongthecloselyrelatedplateauschizothoraxspecies. Keywords:COⅠ;16SrRNA;plateauSchizothoraxfish;speciesidentification

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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