超級細菌的 NDM-1 抗藥基因 投稿類別 : 生物類 篇名 : 超級細菌的 NDM-1 抗藥基因 作者 : 龔熙鈞 國立台中二中 二年十二班 指導老師 : 陳榮銘老師 1

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1 投稿類別 : 生物類 篇名 : 作者 : 龔熙鈞 國立台中二中 二年十二班 指導老師 : 陳榮銘老師 1

2 壹 前言 自 20 世紀盤尼西林被發現後, 抗生素被人類廣泛的應用在醫治因細菌感染所造成的疾病上 但在抗生素的挑選作用下, 具有抵抗能力的突變種存活下來, 隨著細菌的大量繁殖以及人類對抗生素的濫用, 存活細菌的抗藥能力也逐漸增加 超級細菌的出現, 使抗生素失去原本的效力, 人類對細菌的最後防線幾乎宣告終結 超級細菌是對同時帶有多種抗藥能力的細菌總稱, 細菌對特定藥物的抵抗能力取決於其抗藥性基因的種類, 而這些抗藥性基因又可透過質體或跳躍子於不同細菌體間傳播, 使原本不具抗藥能力的細菌, 接受了這些基因而產生突變, 對藥物產生了抵抗的能力 以近兩年在印度馬德里發現的超級細菌為例, 就是因為原本不帶抗藥性的細菌獲得一個盤尼西林類抗生素的抗藥基因 NDM-1 所產生的 (1, 2, 3) 目前認為帶有 NDM-1 基因的菌可能已經存在自然界很長一段時間, 根據此現象推論, 這些超級細菌所帶的抗藥基因 NDM-1, 可能來自於他種細菌, 相近 NDM-1 的基因也可能存在其他非致病性的細菌 本論文的目的是將 NDM-1 蛋白序列利用資訊軟體進行分析, 同時將 NDM-1 與其他細菌的基因做比較, 以發現帶有相近基因的細菌種類 貳 正文 一 抗生素簡介 抗生素是一種具有抑菌作用甚至可殺菌的化學物質, 可經由萃取微生物代謝物質或人工合成取得, 通常被用來治療因細菌感染而引發的疾病 (4) 最早的抗生素出現在 20 世紀, 是由英國微生物學家亞歷山大 佛萊明在青黴菌所製造的物質中發現的盤尼西林 (4) 不同的抗生素擁有不同的運作機制來影響細菌的 2

3 增長, 主要有四種方式, 分別是抑制細菌細胞壁的合成 破壞細胞膜 抑制蛋白質的生成或是阻礙細菌 DNA 的轉錄及轉譯 盤尼西林是破壞細菌細胞壁以達到滅菌作用, 因動物體細胞並無細胞壁, 故使用於人體治療相對來說安全性較高 (4) 除了醫療的用途, 抗生素也被畜牧養殖業廣泛的應用, 加入飼料中防止因同種大量飼養所產生的傳染疾病或是促進生長 (4) 二 抗藥菌株的發現 縱使抗生素能對細菌產生一定的殺傷力, 仍有一些突變的菌種能從中存活 若在抗生素治療中, 因感覺症狀消失而中斷投藥, 未能完成完整的療程時, 這些存活的細菌便趁機大量繁殖, 填補空缺 一旦這些突變菌種占有優勢並大量散播, 便會造成藥物的失效 (1) 在一種抗生素被發現後, 通常跟隨而來發現的, 便是對此抗生素有抵抗能力的菌種 這是藥物對細菌產生的選擇作用, 使得能在新環境中的突變種取得優勢 這些突變的細菌通常被發現帶有抗藥性基因 (1) 西元 2009 年於印度發現的超級細菌, 便是一群帶有能抵抗多種抗生素的抗藥性基因 -NDM-1 的細菌 他們甚至能抵抗到目前為止人類發現最有效的盤尼西林類抗生素, 也宣告人類最後防線的瓦解 (1) NDM-1 這種抗藥基因可以讓帶有此基因的細菌生產一種酵素, 而這種酵素能幫助分解盤尼西林類抗生素而使得細菌具抗藥性 (2) 三 抗藥基因的傳遞 細菌的抗藥性取決於所帶有的抗藥性基因種類, 抗藥性基因則可透過細菌間質體的交換而取得 超級細菌所帶有的抗藥基因 NDM-1 為一種可水解多種抗生素, 容易複製, 更能跨越不同菌種生存的基因 此基因遍存在於各種格蘭氏陰 3

4 性細菌, 尤其是腸內菌屬的細菌 由於抗生素原本就不易進入這種具雙層膜的細 菌內, 使獲得此基因的細菌更難以應付 (5) 四 實驗步驟與結果 1. 找到 NDM-1 蛋白的序列 本論文使用的資料來源是美國國家生物科技資訊中心 (National Center for Biotechnology Information), 簡稱 NCBI, 的資料庫, 網址如下 : 進入資料庫網頁後, 在搜尋欄選擇蛋白 (protein), 並輸入 NDM-1 查詢 查詢的結果共有 744 筆相關資料 我們選擇了來自 Swiss-Prot ( 為一個大型蛋白質資料庫 ): C7C422.1 中 GI ( 基因編號 ): 的資料 經查詢後, 得知這個基因的來源是一位瑞典籍的病人在印度新德里旅遊途中, 感染了由耐碳青黴烯 (carbapenem) ( 一種盤尼西林類的抗生素 ) 克雷白氏肺炎菌 (carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae) 所引發的尿道炎 後來科學家們從這種細菌中分離出了一種當時未知的金屬 -β- 內酰胺酶 (metallo-beta-lactamase) 並命名為 NDM-1 而這種蛋白被發現能水解盤尼西林類抗生素, 是讓克雷白氏肺炎菌 (Klebsiella pneumoniae) 具抵抗碳青黴烯的主要原因 (6) 查詢後取得 NDM-1 蛋白序列如下 : 共有 270 個胺基酸 >NDM-1 melpnimhpvaklstalaaalmlsgcmpgeirptigqqmetgdqrfgdlvfrqlapnvwqhtsyldmpgfgavasnglivrd ggrvlvvdtawtddqtaqilnwikqeinlpvalavvthahqdkmggmdalhaagiatyanalsnqlapqegmvaaqhsltfa angwvepatapnfgplkvfypgpghtsdnitvgidgtdiafggclikdskakslgnlgdadtehyaasarafgaafpkasmiv mshsapdsraaithtarmadklr 4

5 2. 分析 NDM-1 蛋白, 利用各學術網站所提供的分析工具對 NDM-1 蛋白的性質 進行分析 2.1 分子量 (Molecular weight/mw) 與等電點 (Isoelectric point/pi) 分析 首先分析其蛋白的分子量 (Molecular weight/mw) 與等電點 (Isoelectric point/pi) 等電點為蛋白的帶電性, 數值小於 6 定義為酸性蛋白, 大於 8 為鹼性蛋白, 介於 6-8 則定義為中性 我們使用的工具為 Compute pi/mw tool (7), 是一個可根據使用者輸入的序列計算出蛋白質分子量與等電點的工具 網址如下 : 經由輸入 NDM-1 蛋白的序列計算後得知 NDM-1 的分子量 (Molecular weight) 為 , 等電點 (Isoelectric point) 數值是 5.88, 為一種酸性蛋白, 帶有較多的負電, 容易與帶正電的金屬結合 2.2 訊號序列 (Signal Peptide) 分析 接下來分析 NDM-1 蛋白的訊號序列 (Signal Peptide) 訊號序列是在新的分泌性蛋白或膜蛋白合成時, 接在其胺基酸序列前端 (N 端 ) 的訊號, 用來指引被製造出來蛋白質的去處, 這段訊號就稱為訊號序列 這段訊號序列通常會在蛋白質送出前被酵素切除 (8) 我們使用的分析工具為 SignalP 4.0 Server (9), 網址如下 : 它能根據輸入的序列預測蛋白送出前被切割的位置 ( 即訊號序列大約的位置 ) 經分析後的結果如圖一: 5

6 圖一 : 利用 SignalP 4.0 Server 分析 NDM-1 蛋白訊號序列所得的圖 ( 圖片來源 : 是由 C S Y 三種不同演算方法計算獲得此圖表, 根據結果得知它的切割點大約位在第 個胺基酸之間 2.3 NDM-1 蛋白的結構分析 我們使用的分析工具是一個由國家生物技術信息中心 (NCBI) 建立的資料 庫, 用以分析蛋白質的保留性區域 (Conserved Domains) (10) 保留性區域是蛋白 序列中與其他特定蛋白有相似特徵, 並預測能產生相同的作用的片段, 網址如下 : 經分後得知 NDM-1 蛋白擁有 與 Metallo-beta-lactamase superfamily 相似的序列, 故同屬 Lactamase Beta super family 此類蛋白的結構如圖二 6

7 圖二 : Metallo-beta-lactamase superfamily 的立體結構 ( 圖片來源 : 2.4 尋找目前已定序的細菌基因中, 含有 NDM-1 類似基因者 我們使用國家生物技術信息中心 (NCBI) 資料庫中的 Blast 工具來比對 NDM-1 基因與已定序的細菌基因中是否有相似序列,Blast 微生物基因比對的網址如下 : 目前已經定序的細菌共有 1861 種 比對結果如圖三, 我們發現在自然界其他細菌的基因序列中, 也能找到與 NDM-1 基因類似的序列 其中 beta-lactamase II 基因擁有高度相似基因排序, 其相似程度達 56% 7

8 圖三 : 將 NDM-1 蛋白和已經知道的微生物基因組中蛋白做比對所得結果 ( 圖片來源是 從圖中可以看到, 其中最接近的是 Erythrobacter litoralis HTCC2594 這個環境中的細菌 它帶有一個 NDM-1 相關的 beta-lactamase II 基因, 和 NDM-1 有 56% 的相同度,70% 的相似度 參 結論 8

9 經不斷的比對後, 我們找到了自然界中有與 NDM-1 高度相似的基因, 而在其他的不同的基因序列中也比對出相似的片段 這些基因片段可能藉由質體的交換在不同菌體間傳遞 這也證明了具致病能力的菌體, 可能藉由質體的交換過程, 從原本對人類無害的菌體中取得抗藥基因, 突變為難對付的抗藥性菌種, 進而使得原先有效的抗生素失去效力 我們在使用抗生素時要非常小心, 不要讓這些具有抗藥性的細菌有大量繁殖的機會 肆 引註資料 1. 麥肯納 (Maryn McKenna)(2011) 難以阻擋的抗藥性 科學人雜誌 112 取 自 2. 劉惠敏 (2010) 超級細菌解析 / 超級細菌天不怕地不怕? 聯合報 11 月 1 日 取自 3. 張上淳 (2009) 抗藥性細菌有多流行? 科學人雜誌 90 取自 4. 抗生素 維基百科 取自 5. 呂俊毅 (2010) NDM-1 不是細菌名稱 取自 %B8%80%E7%A8%AE%E7%B4%B0%E8%8F%8C%E5%90%8D%E7%A8%B1/ 9

10 6. Yong D, Toleman MA, Giske CG, Cho HS, Sundman K, Lee K, Walsh TR. (2009) Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother., 53(12), Bjellqvist, B.,Hughes, G.J., Pasquali, Ch., Paquet, N., Ravier, F., Sanchez, J.-Ch., Frutiger, S. & Hochstrasser, D.F. (1993) The focusing positions of polypeptides in immobilized ph gradients can be predicted from their amino acid sequences. Electrophoresis, 14, 林玟娟 李冠群 (2009) 蛋白質 Where are you going? 淺談訊號序列 Signal Peptide 高瞻計畫中學教學資源平台 取自 9. Thomas Nordahl Petersen, Søren Brunak, Gunnar von Heijne & Henrik Nielsen (2011) SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods, 8, Marchler-Bauer A, Lu S, Anderson JB & Chitsaz F et al. (2011), CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Res., 39(D),

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