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衡彩果
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1 doi: /j.issn 利用条件错误发现率方法识别欧洲人群炎症性肠病相关位点夏鑫, 吕万强, 张蔷, 刘会敏, 张卫东郑州大学公共卫生学院流行病学教研室郑州关键词欧洲人群 ; 溃疡性结肠炎 ; 克罗恩病 ; 条件错误发现率 ; 炎症性肠病中图分类号 R394.5 摘要目的 : 利用更高效的数据分析方法识别更多与炎症性肠病相关的遗传变异位点方法 : 炎症性肠病的全基因组关联研究 (GWAS) 汇总数据来源于国际炎症性肠病遗传学联合会官网, 其中, 溃疡性结肠炎 (UC) 相关的 GWASmeta 汇总数据涉及个对照和 6968 个病例 ; 克罗恩病 (CD) 相关的 GWASmeta 汇总数据涉及个对照和 5956 个病例首先利用条件 Q Q 图和条件真实发现率 (TDR) 图评估疾病之间多效性富集程度 ; 再计算 SNPs 的条件错误发现率 (cfdr) 和联合的条件错误发现率 (ccfdr), 以 0.01 为显著性阈值筛选与疾病相关的遗传位点结果 : 一共识别了 43 个新位点和 UC 相关 ;86 个新位点和 CD 相关 ;22 个新位点与 UC 和 CD 都相关结论 : 新识别的这些遗传位点为研究 UC 和 CD 的遗传和致病机制提供了新的线索 Improveddetectionoflociasociatedwithinflammatoryboweldiseasein EuropeanpopulationsusingthecFDRmethod XIAXin,LYUWanqiang,ZHANGQiang,LIUHuimin,ZHANGWeidong DepartmentofEpidemiology,SchoolofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou Keywords Europeanpopulations;ulcerativecolitis;crohn sdisease;conditionalfalsediscoveryrate;inflammatory boweldisease Abstract Aim:Toidentifymorelociassociatedwithinflammatoryboweldisease(IBD)byusingthecost efective analyticalmethods.methods:theibd relatedgenomewideassociationstudy(gwas) metasummarydatasetswere 基金项目河南省科技攻关计划基金资助项目 ( ) 作者简介张卫东, 通信作者, 男,1963 年 10 月生, 博士, 教授, 研究方向 : 感染性疾病与分子流行病学临床流行病学,E mail:imooni@163.com

2 590 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期 downloadedfrom theoficialwebsiteoftheinternationalinflammatoryboweldiseasegeneticsconsortium.theulcerative colitis(uc)relatedgwasmetasummarydataincluding20464controlsand6968cases,andthecrohn sdisease(cd) relatedgwasmetasummarydatainvolving14927controlsand5956caseswerecolected.firstly,weusedthecondition alquantile quantile(q Q)plotsandtheconditionaltruediscoveryrate(TDR)plotstoassessthedegreeofthepleiotropic enrichmentbetweenthesetwodiseases.thenwecalculatedtheconditionalfalsediscoveryrate(cfdr)andconjunction cfdr(ccfdr)foreachsnp,ifthecfdrorccfdrofasnpwassmalerthanthesignificantthreshold(0.01),thesnp wasassociatedwiththedisease.results:atotalof43novellociforucand86novellociforcd wereidentifiedwitha significantthresholdofcfdr<0.01.and22novellociwereidentifiedforbothucandcd.conclusion:thesenovelloci provideusnovelinsightsintotheetiologyofucandcd. 炎症性肠病 (inflammatoryboweldisease,ibd) 是一种累及回肠直肠结肠的一种特发性肠道炎症性疾病近年来,IBD 的全球发病率一直在上升, 在 18~20 岁的欧洲后裔中, 每 10 万人中有 100~150 人发病 [1] IBD 主要包括溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis,uc) 和克罗恩病 (crohn sdisease,cd) [2] CD 一般情况下累及回肠和结肠, 有些情况下可能影响肠道的任何区域 [3] UC 主要累及结肠黏膜下层和直肠 [4 5] 两种疾病均有各自的临床特点, 同时又有着某种共同的发病机制遗传流行病学数 [1,3,5] 据表明,IBD 发病的易感性是可遗传的, 迄今为止, 已经超过有 200 个基因被识别为 IBD 的潜在致病基因 2015 年的一项跨种族全基因组关联研究 (genomewideassiciationstudy,gwas) 的 meta 分析识别出了 38 个与这两种疾病都相关的遗传位点, 但这些位点仅能分别解释 CD 和 UC 遗传度的 13.1% 和 8.2% [1] 本研究利用更加高效的统计方法条件错误发现率 (conditionalfalsediscovery rate,cfdr) 方法识别更多与欧洲人群 IBD 相关的遗传变异位点 1 材料与方法 1.1 数据集来源汇总数据集由国际炎症性肠病遗传学协会在其官网上发布, 下载地址为 htps:// 最新的数据集为 LatestcombinedGWASandImmunochiptrans ancestrysummarystatistics, 该数据来源于欧洲人群, CD 数据集来自 7 个 GWAS 数据的 meta 分析汇总数据 ;UC 数据集来自 8 个 GWAS 数据的 meta 分析汇总数据 [1] CD 相关的 meta 分析涉及 5956 个病例和个对照 ;UC 相关的 meta 分析涉及 6968 个病例和个对照 [1] 1.2 数据集的处理首先整合数据, 保留 UC 和 CD 数据集中均有包含的单核苷酸多态性 (SNP) 位点, 最终得到个 SNPs, 对于每条染色体以每 50 个相邻的 SNPs 为单位, 以 HapMapPhase3 为参照, 以欧洲人群的基因库作为对照, 计算 SNPs 两两之间的 LD 值 (r 2 ), 如果 r 2 大于 0.2, 就删除掉 MAF 较小的那个 SNP, 重复上面的删减过程, 直到剩下的 SNPs 之间不再有强连锁现象, 最终剩余个 SNPs 由于在 meta 分析之前,GWAS 分析已经对这些 SNPs 进行了相应的质量控制 [1], 因此, 在本研究中不再考虑质量控制问题 1.3 FDR 方法的简介假设同时研究的两个疾病分别为疾病 i 和疾病 j, 则某 SNP 与疾病 i 相关的 cfdr 被定义为该 SNP 所对应的 p i 和 p j 值均小于预先设定的阈值 p 0i 和 p 0j, 且在真实情况下 SNPs 与疾病 i 是没有关联的概率值, 表示为 cfdr(p i p j )= Pr(H 0i p i p 0i,p i p 0j ) 其中,p i 代表某个 SNP 与疾病 i 之间关联强度假设检验的 P 值 ;p j 代表了该 SNP 与疾病 j 之间关联强度假设检验的 P 值,H 0i 表示真实情况下该 SNP 与疾病 i 的发生没有关系 [6] 将 ccfdr 定义为 cfdr(cd UC) 和 cfdr(uc CD) 中较大的一个 [6] 如果某个 SNP 的 ccfdr 小于设定的阈值, 就代表这个 SNP 和两个表现型均相关 1.4 多效性的评估和曼哈顿图利用分层 Q Q 图和分层 TDR 图对 UC 和 CD 之间的多效性富集程度进行评估分层标准,p j 1( 即所有的 SNPs 都纳入的一组 ),p j 0.1,p j 0.01,p j 0.001,p j 如果图中的散点向左偏离对角线则说明 UC 和 CD 之间存在多效性富集现象, 而且偏离的程度越大, 说明富集程度越强以轴遗传变异位点的位置信息为 x, 以 -log 10 cfdr 或 -log 10 ccfdr 为 y 轴作曼哈顿图以 y=2 为基准线, 基准线以上的散点对应的遗传变异位点为与疾病相关的 SNPs 1.5 统计学处理 cfdr 以及 ccfdr 的计算和曼哈顿图的绘制均使用 R3.42,SNPs 的标注和修剪均使用 Plink1.07, 数据分析操作过程均在 Ubuntu16.04 下完成

3 ＪｏｕｒｎａｌｏｆｚｈｅｎｇｚｈｏｕｕｎｖｅｒｓｔｙＭｅｄｃａｌｓｃｅｎｃｅｓＳｅｐ２０１８Ｖｏｌ５３Ｎｏ５明ＵＣ和ＣＤ之间存在很强的多效性富集现２结果２１５９１象图１ＣＤ显示与ＣＤ或ＵＣ相关的多效多效性的评估见图１图１ＡＢ显示随着与条件疾病对应Ｐ值的减小ＳＮＰｓ对性富集程度最强的分层分层条件为００００１ＴＤＲ也最大应的散点向左偏离对角线的程度逐渐增大表Ａ以ＣＤ为条件的ＵＣ分层ＱＱ图Ｂ以ＵＣ为条件的ＣＤ分层ＱＱ图Ｃ以ＣＤ为条件的ＵＣ分层ＴＤＲ图Ｄ以ＵＣ为条件的ＣＤ分层ＴＤＲ图图１分层ＱＱ图和分层ＴＤＲ图２２ＵＣ相关位点识别结果有１３０个ＳＮＰｓ位点其中有５个新发现的ＳＮＰｓ被报道与类的ｃｆｄｒＵＣＣＤ小于００１分别位于２１条风湿性关节炎ＲＡ或银屑病相关１１１３这常染色体上图２有８７个ＳＮＰｓ已被报道１３０个ＳＮＰｓ一共被标注了１４４个基因有７０和ＵＣ相关７１０４３个ＳＮＰｓ是新发现的关联个基因被报道与ＵＣ相关联１１４纵坐标以ＣＤ为条件与ＵＣ相关的ＳＮＰｓ的ｌｏｇ１０ｃｆｄｒ横坐标常染色体编号以及对应的位置红线以上的点ｃｆｄｒ小于００１的ＳＮＰｓ图２以ＣＤ为条件的ＵＣ的曼哈顿图２３ＣＤ相关位点识别结果有１７４个ＳＮＰｓ６个新发现的ＳＮＰｓ被报道与乳糜泻类风湿的ｃｆｄｒＣＤＵＣ小于００１分别位于２２条性关节炎ＲＡ或多发性硬化ＭＳ相常染色体上图３有８８个ＳＮＰｓ已被报道关２４１５这１７４个ＳＮＰｓ一共被标注了１９０和ＣＤ是相关８６个ＳＮＰｓ是新发现的关联位个基因有８２个基因被报道与ＣＤ相关点有５７个ＳＮＰｓ被报道与ＣＤ疾病相关剩联１１６余的８６个ＳＮＰｓ是新发现的遗传位点其中有

4 ５９２郑州大学学报医学版２０１８年９月第５３卷第５期纵坐标以ＵＣ为条件下与ＣＤ相关的ＳＮＰｓ的ｌｏｇ１０ｃｆｄｒ横坐标常染色体编号以及对应的位置红线以上的点ｃｆｄｒ小于００１的ＳＮＰｓ图３以ＵＣ为条件的ＣＤ的曼哈顿图２４ＵＣ和ＣＤ同有相关位点分析结果共ＲＡ或银屑病Ｐｓｏｒａｓｓ有关这７５个多效有７５个多效性ＳＮＰｓ与ＵＣ和ＣＤ均有关分性的ＳＮＰｓ被标注了８７个基因其中有３６个别位于１９条染色体上图４其中有２２个基因与这两种疾病都相关１３１６１７有１１个ＳＮＰｓ是新识别的和５３个ＳＮＰｓ已经被报新识别的ＳＮＰｓ被标注到了与ＵＣ和ＣＤ都相道１８１３１６有３个新识别的ＳＮＰｓ被报道与关的基因上见表１纵坐标与ＵＣ和ＣＤ均相关的ＳＮＰｓ的ｌｏｇ１０ｃｃｆｄｒ横坐标常染色体编号以及对应的位置红线以上的点ｃｃｆｄｒ小于００１的ＳＮＰｓ图４ＣＤ和ＵＣ的联合曼哈顿图

5 JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Sep Vol.53 No 表 1 新识别的 UC 和 CD 共相关位点编号 RS 编号基因位置常染色体碱基对位置基因基因类型 1 rs 内含子区域 chr BACH2 新发现 2 rs 内含子区域 chr SMAD3 已报道 3 rs 内含子区域 chr ADAD1 新发现 4 rs UTR3 chr MFSD13A 新发现 5 rs 非编码 RNA 内含子区域 chr TET2 AS1 新发现 6 rs 内含子区域 chr OSMR 已报道 7 rs 内含子区域 chr CCNY 已报道 8 rs 内含子区域 chr CUL2 已报道 9 rs 基因间区域 chr LINC00548,LINC00598 新发现, 新发现 10 rs 基因间区域 chr LINC00603,PTGER4 新发现, 已报道 11 rs 非编码 RNA 内含子区域 chr LOC 已报道 12 rs 非编码 RNA 内含子区域 chr LOC 已报道 13 rs 内含子区域 chr NOTCH1 已报道 14 rs6563 UTR3 chr NOTCH1 已报道 15 rs 内含子区域 chr RBM6 新发现 16 rs 基因间区域 chr SLC7A10,CEBPA 已报道, 已报道 17 rs 基因间区域 chr SOCS1,TNP2 新发现, 新发现 18 rs 基因间区域 chr TRPC3,KIAA1109 新发现, 已报道 19 rs 内含子区域 chr TTLL10 新发现 20 rs # 内含子区域 chr PSORS1C1 新发现 21 rs # 内含子区域 chr NFKBIL1 新发现 22 rs # 基因间区域 chr TNXB,ATF6B 新发现, 新发现 #: 被报道和 RA 或银屑病相关 3 讨论利用 cfdr 新识别的 SNPs 中有一部分被标注在和 IBD 相关的基因上, 有些 SNPs 位于基因间或非编码区, 有些 SNPs 是位于疾病相关基因的编码区甚至是 UTR3 或 UTR5, 如果这些位点发生突变, 影响基因表达的可能性就会很大, 那么这一部分的 SNPs 和疾病真实相关的可能性就会很大, 这个结果也从侧面证明了 cfdr 方法的可靠性例如, 本研究中一个和 CD 相关的 SNPrs , 它的 cfdr=0.0088, 位于 CHR6 的 BP 为 , 且被标注在基因 TAGAP (GeneID:117289) 的 UTR5 区域, 该基因和一些自身免疫性疾病是相关的, 如类风湿关节炎 (Rheumatoid Arthritis,RA), 乳糜泻和多发性硬化 [18 19], 而且这个基因被报道和 CD 是相关的 [20], 如果该位点发生突变, 很可能通过影响基因 TAGAP 的表达进而对疾病的发生造成影响, 且该基因同时和一些自身免疫性疾病相关, 这与临床数据显示的 IBD 常伴有一些自神免疫性疾病相符合同时进一步证明使用的 cfdr 分析方法可以更加有效的识别与疾病相关的位点另外, 有两个 SNPrs 和 SNPrs6563 在本研究中被识别出与 CD 和 UC 都相关, 它们对应的 ccfdr 分别为和 , 这两个位点均位于 CHR9 上,BP 分别为和 , 两者的 LD 度量 r 2 =0.032 且 rs 位于基因 NOTCH1(Gene ID:4851) 的内含子区域,rs6563 位于该基因的 UTR3 区域而对于基因 NOTCH1 而言, 它是编码了 NOTCH 家族的单通道跨膜受体 [21 22] ;NOTCH 信号通路是一种高度保守的细胞间信号通路, 它在及时的细胞谱系规范中扮演着重要的角色, 包括内分泌和外分泌腺的胰腺和来自共同的淋巴细胞前体 T 细胞谱系 [23 24] 血统继承, 而且有研究表明 NOTCH 信号通路的失调或故障会对肠道的健康造成很大的影响而且这个基因在之前的研究中已被报道与 UC 和 CD 都相关 [25] 本研究通过使用 cfdr 方法, 识别出了 22 个与两个疾病都相关的遗传位点, 这些新发现为探索 UC 和 CD 同有的致病机制提供了新的见解, 并为进一步的实验研究提供了可能的线索但本研究也存在一定的局限性 : 首先, 由于缺乏详细的个人样本数据, 没有多效性位点对表型影响方向的信息 ; 此外, 因为无法获得样本的临床数据资料, 无法将识别的遗传位点与临床结果联系起来 ; 最后, 因为本研究中使用的是汇总数据的一个子集, 所以研究的结果中并没有包含发现所有之前已报道的与 CD 和 UC 有关的位点和基因, 且由于在对 SNPs 进行修剪的过程中, 删除掉了那些具有较小 MAF 的 SNPs, 这会削弱 cfdr 方法对罕见变异的识别能力因此, 我们

6 594 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期的这些新发现还需要更多的临床数据资料和对应的生物实验研究来做进一步验证总之, 通过利用 cfdr 方法将 UC 和 CD 的 GWAS 数据进行二次挖掘, 研究发现 UC 和 CD 之间的存在很强的多效性富集现象, 并且识别出 22 个两者共有的多效性遗传位点这些识别出的 UC 和 CD 之间的多效性遗传位点, 可能会为研究这两个疾病之间共同的遗传机制供新的见解或线索参考文献 [1] LIUJZ,VANSOMMERENS,HUANGH,etal.Association analysesidentify38 susceptibility lociforinflammatory boweldiseaseandhighlightsharedgeneticriskacrosspop ulations[j].natgenet,2015,47(9):979 [2] PODOLSKYDK.Inflammatoryboweldisease[J].NEnglJ Med,2002,347(6):417 [3] KANN BR.CrohnDisease[J].ClinColonRectalSurg, 2013,26(2):65 [4] LOW D,NGUYEN DD,MIZOGUCHIE.Animalmodelsof ulcerativecolitisand theirapplication in drug research [J].DrugDesDevelTher,2013,7:1341 [5] DANESES,FIOCCHIC.Ulcerativecolitis[J].N EnglJ Med,2011,365(18):1713 [6] ANDREASSENOA,THOMPSONWK,SCHORKAJ,etal. Improved detection ofcommon variantsassociated with schizophrenia and bipolar disorder using pleiotropy in formedconditionalfalsediscoveryrate[j].plosgenet, 2013,9(4):e [7] JOSTINSL,RIPKES,WEERSMA RK,etal.Host microbe interactionshaveshapedthegeneticarchitectureofinflam matoryboweldisease[j].nature,2012,491(7422):119 [8] MCGOVERN DP,GARDET A,T?RKVIST L,etal.Ge nome wideassociationidentifiesmultipleulcerativecolitis susceptibilityloci[j].natgenet,2010,42(4):332 [9] FESTENEA,STOKKERSPC,VANDIEMENCC,etal.Ge neticanalysisinadutchstudysampleidentifiesmoreulcer ativecolitissusceptibilitylociandshowstheiradditiverole indiseaserisk[j].am JGastroenterol,2010,105(2):395 [10]STALEY JR,BLACKSHAW J,KAMAT MA,etal.Phe noscanner:adatabaseofhumangenotype phenotypeasso ciations[j].bioinformatics,2016,32(20):3207 [11]OKADAY,WUD,TRYNKAG,etal.Geneticsofrheuma toidarthritiscontributestobiologyanddrugdiscovery[j]. Nature,2014,506(7488):376 [12]FENGBJ,SUNLD,SOLTANI ARABSHAHIR,etal.Mul tiplelociwithinthemajorhistocompatibilitycomplexcon ferrisk ofpsoriasis[j].plos Genet,2009,5(8): e [13]ANDERSON CA,BOUCHER G,LEESCW,etal.Meta a nalysisidentifies29additionalulcerativecolitisriskloci, increasingthenumberofconfirmedassociationsto47[j]. NatGenet,2011,43(3):246 [14]KIM K,BANGSY,LEEHS,etal.High densitygenotyping ofimmunelociinkoreansandeuropeansidentifieseight new rheumatoidarthritisriskloci[j].annrheum Dis, 2015,74(3):e13 [15]InternationalMultipleSclerosisGeneticsConsortium,Wel cometrustcasecontrolconsortium,sawcer S,etal. Geneticriskandaprimaryroleforcel mediatedimmune mechanismsinmultiplesclerosis[j].nature,2011,476 (7359):214 [16]FRANKE A,MCGOVERN DP,BARRETTJC,etal.Ge nome widemeta analysisincreasesto71 thenumberof confirmedcrohn'sdiseasesusceptibilityloci[j].natgen et,2010,42(12):1118 [17]LIBIOULLEC,LOUISE,HANSOULS,etal.NovelCrohn diseaselocusidentifiedbygenome wideassociationmaps toagenedeserton5p13.1andmodulatesexpressionof PTGER4[J].PLoSGenet,2007,3(4):e58 [18]CHATZIKYRIAKIDOUA,VOULGARIPV,LAMBROPOU LOSA,etal.ValidationoftheTAGAPrs212389polymor phism inrheumatoidarthritissusceptibility[j].jointbone Spine,2013,80(5):543 [19]EYRES,HINKSA,BOWESJ,etal.Overlappinggenetic susceptibility variants between three autoimmune disor ders:rheumatoidarthritis,type1diabetesandcoeliacdis ease[j].arthritisresther,2010,12(5):r175 [20]CONNELLYTM,BERGAS,HARRISLR,etal.T celacti vationrhogtpase activatingproteinexpressionvarieswith inflammationlocationandseverityincrohn'sdisease[j].j SurgRes,2014,190(2):457 [21]CONNELLYTM,SEHGALR,BERGAS,etal.Mutationin TAGAPisprotectiveofanalsepsisinileocolicCrohn'sdis ease[j].discolonrectum,2012,55(11):1145 [22]SIEBELC,LENDAHLU.Notchsignalingindevelopment, tissuehomeostasis,anddisease[j].physiolrev,2017,97 (4):1235 [23]MURTAUGH LC,STANGER BZ,KWAN KM,etal.Notch signalingcontrolsmultiplestepsofpancreaticdiferentia tion[j].procnatlacadsciusa,2003,100(25):14920 [24]LAKYK,FOWLKESBJ.NotchsignalinginCD4andCD8T celdevelopment[j].curopinimmunol,2008,20(2):197 [25]DELANGEKM,MOUTSIANASL,LEEJC,etal.Genome wideassociationstudyimplicatesimmuneactivationofmul tipleintegringenesininflammatoryboweldisease[j].nat Genet,2017,49(2):256 ( 收稿责任编辑赵秋民 )

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