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1 心肌细胞的分离与培养技术 基础部生理学教研室 郭海涛

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7 心脏功能研究的不同水平 整体水平 器官和系统水平 细胞和分子水平

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9 1955 年, 对鸡胚心 肌组织分 离并以单 个细胞的 形式保存 于培养基 中

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11 乳鼠心肌细胞的分离与培养

12 一 材料 第四军医大学 乳鼠 : 1~3 d

13 液体 : 培养基 小牛血清 消化酶 缓冲液及 75% 酒精等

14 物品 : 眼科剪 眼科镊 (4 套 ) 培养皿 (2 套 ) 烧杯 离心管 滴管 烧瓶及烧瓶及搅拌子等

15 超净台 台面 : 磁力搅拌器 培养箱 其它 : 离心机 血细胞计数板

16 二 分离与培养 第四军医大学 75% 酒精 取出心脏 4 PBS

17 冲洗及剪碎心脏 第四军医大学 酶 4 3 PBS mm 3

18 心肌消化及细胞收集 第四军医大学 10 min 60~80 rpm 培养基 + 血清 培养基 + 血清 10 min 1000 rpm

19 细胞接种 第四军医大学 培养基 + 血清

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21 三 纯化 第四军医大学 心肌的细胞组成 心肌细胞 间质细胞

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23 1 差速贴壁法 第四军医大学 原理 : 贴壁生长的速度不同 方法 : 贴壁 h, 将未贴壁的细胞重新接种 优点 : 操作简便 时间短 对细胞影响小 分离纯度高等 2 化学试剂抑制法 原理 : 对成纤维细胞有抑制作用, 对心肌细胞不明显 药物 : 溴脱氧尿苷 (Brdu) 阿糖胞苷(Ara2C) 等 缺点 : 对心肌细胞也有一定影响

24 3 密度梯度离心法 :PercollP 第四军医大学 原理 :Percoll P 密度梯度 方法 :Percoll+ 细胞, 离心 (1200 g/min, 20 min) 优点 : 富集形态和活力良好的细胞 4 流式细胞仪法 原理 : 细胞特异性抗原 方法 : 细胞与特异性抗体结合, 流式细胞分选 优点 : 敏感 准确等

25 5 免疫磁珠 第四军医大学 原理 : 心肌细胞特异性抗原 方法 : 磁珠表面偶联抗体 优点 : 简便易行 分离纯度高 保留细胞活性等

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27 四 鉴定 第四军医大学 1. 形态观察倒置显微镜 细胞形态 : 未贴壁呈圆形 ; 贴壁后呈梭形 多角 形, 胞核 1~2 个 呈圆形 具有 1~2 清晰的核仁, 细胞大小均匀, 生长迅速

28 图 1 未贴壁时心肌细胞呈圆形 ( 10) 图 2 24 h 后心肌细胞贴壁伸出伪足, 呈多角形 ( 40) 图 3 心肌细胞连成片 ( 10)

29 四 鉴定 第四军医大学 1. 形态观察倒置显微镜 细胞形态 : 未贴壁呈圆形 ; 贴壁后呈梭形 多角 形, 胞核 1~2 个 呈圆形 具有 1~2 清晰的核仁, 细胞大小均匀, 生长迅速 搏动 : 频率 130~150 次 / 分 单个细胞自行蠕动 ; 当生长成片后可见呈岛屿状搏动

30 四 鉴定 第四军医大学 1. 形态观察倒置显微镜 细胞形态 : 未贴壁呈圆形 ; 贴壁后呈梭形 多角 形, 胞核 1~2 个 呈圆形 具有 1~2 清晰的核仁, 细胞大小均匀, 生长迅速 搏动 : 频率 130~150 次 / 分 单个细胞自行蠕动 ; 当生长成片后可见呈岛屿状搏动

31 四 鉴定 第四军医大学 1. 形态观察 倒置显微镜 细胞形态 : 未贴壁呈圆形 ; 贴壁后呈梭形 多角形, 胞核 1~2 个 呈圆形 具有 1~2 清晰的核仁, 细胞大小均匀, 生长迅速 搏动 : 频率 130~150 次 / 分 单个细胞自行蠕动 ; 当生长成片后可见呈岛屿状搏动 透射电镜 细胞完整, 胞膜皱褶整齐, 细胞中肌丝 线粒体清晰 分布均匀, 细胞核完整

32 2. 心肌细胞纯度

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34 2. 心肌细胞纯度 免疫细胞化学 α- 横纹肌肌动蛋白 (α-sarcomeric actin,α-sa) 心肌肌钙蛋白 T(cardiac troponin T, ctnt) α- 肌球蛋白重链 (α-myosin heavy chain, α- MHC) GATA-4: : 与核酸序列 GATA 结合的细胞核转录 因子

35 3. 心肌细胞成活率测定 04% 台盼蓝染色 (1:9) 0.4% 台盼蓝染色 (1:9) 免疫细胞化学肌动蛋白胞浆阳性表达等

36 四 注意事项 第四军医大学 培养基 ph 值 : 7.0~7.4, 大部分培养基应放在 -20 保存, 少部分在 4 消化酶的选择 胰蛋白酶 胶原酶加透明质酸酶 消化程度 : 过度 : 肌原蛋白萎缩, 细胞死亡率增加或贴壁能力减弱 不足 : 细胞易聚集成团状 细胞 接种密度 : 过多 : 细胞易发生营养不良 过少 : 心肌细胞黏附延展后不能相互接触

37 心肌细胞接种密度 形态学观测 : /L 以下 提取 mrna 或蛋白 :5x 10 8 /L ~ 6x 10 8 /L 细胞搏动 : 大于 /L

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39 成年大鼠心肌细胞 的分离与培养 1976 年, 首次提出有效分离活的成熟心室肌细胞的方法 1977 年, 首次培养了成熟心肌细胞

40 冠状循环 第四军医大学

41 Langendorff 灌流装置 (1897): 发现冠状循环的重要作用

42 一 材料 第四军医大学 成年大鼠 :150~200 g

43 液体 : 戊巴比妥钠 无 Ca 2+ 液 保存液 物品 :Langendorff 灌流装置

44 二 分离与培养 第四军医大学 复钙

45 纯化 : 心肌细胞和其他细胞 1 梯度离心 Ficoll 分离液 显著提高成熟心肌细胞的杆状细胞率 2 差速贴壁法 3 化学试剂抑制法 培养方法 : 去分化法向胎儿表型的逆转 快速吸附法保持急性分离心肌细胞的柱形 纹状形态

46 三 鉴定 第四军医大学 1. 形态观察 倒置显微镜 细胞形态 : 棒状, 横纹清晰 搏动 : 可见 / 不可见 立体相差倒置显微镜

47 2. 心肌细胞纯度 免疫细胞化学 α- 横纹肌肌动蛋白 (α-sarcomeric actin,α-sa) 心肌肌钙蛋白 T(cardiac troponin T, ctnt) α- 肌球蛋白重链 (α-myosin heavy chain, α- MHC) GATA-4: : 与核酸序列 GATA 结合的细胞核转录 因子

48 3. 存活率观察 04% 0.4% 台盼蓝染色 (1:9) 染色 心肌细胞 胞核 线粒体 肌动蛋白 \ 肌原蛋白 (actin\myosin) A 带 I 带和 Z 线

49 四 注意事项 第四军医大学 钙浓度 分离时 : 低钙溶液破坏细胞间连接, 不应低于 ~ mol/l 分离后 : 梯度复钙到正常浓度, 使闰盘处破裂的肌膜得到修复 保存 心肌细胞分离后保存在含 2% 白蛋白的高钾低钙溶液中, 有效保护细胞膜功能

50 污染 念珠菌污染 支原体污染

51 培养心肌细胞的优缺点 第四军医大学 优点 损伤修复 培养的心肌细胞易于固定, 适用于电镜观察 不受神经体液因素的影响, 可直接观察其他因素对心肌细胞的收缩活动的影响 是用膜片钳测量单一离子通道电流的较好模型 分子生物学技术在单个心肌细胞内对蛋白质表达进行调控 利于对新药进行筛选 缺点心肌细胞特征易改变

52 小 结 第四军医大学 乳鼠心肌细胞分离和培养 大鼠心肌细胞分离和培养 其他 : 不论什么方法, 无菌操作是关键分离方法还有组织块法

53 生理学学科专业网站网址 : 第四军医大学

54 生理学学科专业网站网址 : 第四军医大学

55 生理学学科专业网站网址 : 第四军医大学

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