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挂焚阳
5 years ago
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1 转录组数据解析与挖掘生工生物高通量测序部

01 PART ONE 转录组测序的背景目录 02 03 PART TWO PART

2 01 PART ONE 转录组测序的背景目录 PART TWO PART THREE 相关文献解读转录组数据分析中的关键点 04 PART FOUR 转录组测序之后的工作

3 01 Part One 转录组测序的背景

4 转录组测序表达谱测序小 RNA 测序 LncRNA 测序

5 背景广义特定细胞在某一功能状态下全部转录本的总和具有特定的空间性和时间性特征狭义转录组是指直接参与翻译蛋白质的 mrna 总和有参转录组所研究物种有参考基因组无参转录组所研究物种没有参考基因组需要先 de novo 组装出一个参照

6 项目整体思路目标基因挖掘目标基因表达分析目标基因功能分析共表达分析蛋白相互作用目标基因挖掘实验组对照组实验处理后期验证整体水平分析表达定位功能其他水平整体表达水平分析整体差异表达分析差异基因聚类分析差异基因功能富集

数据分析基本原则全部基因目标基因挖掘已有研究表明的关键代谢通路功能基因 4 3 2 1 差异表达基因差异倍数共有或特有的差异基因

7 数据分析基本原则全部基因目标基因挖掘已有研究表明的关键代谢通路功能基因差异表达基因差异倍数共有或特有的差异基因表达模式相近的差异基因显著富集的功能或通路蛋白互作网络的关键节点目标表达模式目标基因分析目标基因集表达水平 (FPKM) 表达水平功能分析 (GO/KEGG) 等

8 02 Part Two 相关文献解读

9 文献解读 R N A - S e q 解析苓桂术甘汤改善非酒精性脂肪肝病的机理 Normal 正常老鼠 ( 喂食正常饮食食物 ) NAFLD 非酒精脂肪肝病老鼠 ( 喂食高脂肪食物 ) LGZG 苓桂术甘汤喂养老鼠 ( 喂食高脂肪食物 + 苓桂术甘汤 )

10 文章整体思路 Normal LGZG NAFLD 肝脏组织 RNA-seq 差异分析两比较组共有差异基因聚类分析 GO 分析 KEGG 分析 PPI 分析

11 测序及数据分析过程

12 结果展示共有显著差异基因挖掘 NAFLD vs Normal LGZG vs NAFLD

13 结果展示共有显著差异基因表达模式分析大部分基因在两比较组中表达模式相反

14 结果展示关注通路中显著差异基因表达聚类通过前期文献调研查找已报道与研究目的相关的代谢通路发现所关注通路中基因在两比较组中表达模式

15 结果展示 GO 富集分析解析目标差异基因集参与的生物学功能

16 结果展示 KEGG Pathway 富集分析

17 结果展示共有显著差异基因蛋白互作分析 23 个共有显著差异基因编码蛋白 Foxo1 Foxo3 PIK3R1 FN1 PIK3R1 BCL2L11 COL3A1

18 小结文章局限性样本差异 NAFLD 与年龄和性别有关, 但是在目前研究对象是 5 周大小的雄鼠后续可能需要在不同年龄及性别鼠中对得到的候选基因做进一步验证转录后修饰由于转录后修饰的存在 ( 如磷酸化泛素化乙酰化糖基化和酯化等 ), 并不知道这些差异表达基因的蛋白功能具体如何后续还需对候选基因编码蛋白的功能做进一步研究

19 03 Part Three 转录组数据分析中的几个关键点定量 ( 即表达量的计算 ) 差异分析及显著差异基因筛选注释及富集分析

20 3-1 表达量的计算

21 表达量的计算 Reads per Kilobase Million Fragments per Kilobase Million Transcripts per Kilobase Million

22 RPKM FPKM 和 TPM 异同点 1 测序深度标准化, 得到 reads/fragments per million 相同点基于对基因长度和测序深度均一化 1 直接除以基因长度, 得到 reads per kilobase 2 基因长度的标准化, 直接除以基因长度即可 RPKM/FPKM 不同点 TPM 在进行均一化计算时与 RPKM/FPKM 先后顺序不一样 2 标准化测序深度时, 总 reads 数要用第一步中除过基因长度的数值 TPM 均一化先后顺序的不同将对结果产生影响

23 表达量计算的一个重要事实同一个物种无论组织无论样本量只要基因数量相同转录本丰度的均值是一致的 TPM 的计算结果可以保证这一恒等关系 FPKM 和 RPKM 的计算结果无法保证这一恒等关系

24 举例说明 RPKM 计算

25 举例说明 TPM 计算

26 举例说明 RPKM 计算 TPM 计算每个样本的 TPM 的总和相同,TPM 数值能体现出比对上某个基因的 reads 的比例, 使得该数值可以直接进行样本间的比较基于 RPKM 的计算方法不适于直接进行样本间比较

27 举例说明 TPM 的计算方法可以保证这一恒等关系成立!

28 基于表达水平分析内容表达量统计测序饱和度分析重复相关性检查共表达韦恩图共表达韦恩分析 PCA 主成份分析 NMDS 非度量多维尺度分析样本间距离热图 Anosim 组间相似性分析 PCoA 主坐标分析层次聚类树分析样本间距离箱型图

29 3-2 差异表达分析

负二项分布 DEseq Shrinkage variance 有生物学重复以 read count 作为初始输入 edger 负二项分布 TMM2 NOISeq 无 RPKM Empirical Bayes estimation & an

30 差异分析软件假定分布标准化方法适用性 bayseq 负二项分布 Internal Empirical Bayesian estimate of posterior likelihood Cuffdiff 负二项分布 Internal Unknown 目前不推荐 DEGseq 二项分布 None Random sampling model using Fisher's exact test and the likelihood ratio test 无生物学重复 DESeq2 负二项分布 DEseq Shrinkage variance 有生物学重复以 read count 作为初始输入 edger 负二项分布 TMM2 NOISeq 无 RPKM Empirical Bayes estimation & an exact test analogous to Fisher s exact test but adapted to overdispersed data Non-parametric test based on signal tonoise ratio 有生物学重复

31 显著差异基因筛选基于 Fold Change 值基于 q-value 值两个样品中同一基因表达水平的变化倍数对每个基因进行 p-value 计算用 FDR 错误控制法对 p-value 作多重假设检验矫正假阳性的出现概率只为某一次检验负责衡量错误发现率的指标从 p-value 校正计算后得到为所有次数的检验负责差异倍数 Fold Change > 2 可有效控制假阳性出现次数阈值 q-value < 0.001

32 得到差异表达基因后该怎么做? 显著差异基因表达模式分析目标表达模块基因集富集分析目标基因集蛋白互作分析核心基因 / 关键节点基因

33 显著差异基因表达模式分析有效地发现不同基因间表达上的共同点推测基因功能的相似性获得符合一定生物学预期的基因集适合多个连续型样本特点 ( 关注基因时空动态变化规律的研究 )

34 3-3 注释及富集分析

35 注释及富集分析

36 1. 数据注释 GO 注释差异基因 GO 功能注释从三方面对基因及其产物予以注释 Biological Processes 生物学过程 Cellular Components 细胞组分 Molecular Functions 分子功能 GO 基本单位 :term GO term 间关系 is_a: part_of : 部分包含 regulates: 调控关系

37 1. 数据注释 GO 注释结果展示将所有基因映射到 GO 数据库中各 GO term 统计注释到相应 GO term 上的基因数目及其中的差异基因数目

38 1. 数据注释 GO 注释结果展示虚线表示差异基因实线表示所有基因计算注释到相应 GO term 中的所有基因数目及其占所有基因的比例计算注释到相应 GO term 中的差异基因数目及其占所有差异基因的比例

39 1. 数据注释 KEGG 注释 1 KEGG 有关生物系统较完善的数据库, 整合了基因组化学物质和系统功能信息 2 KEGG Genes 搜集了所有已知的完整的基因组的基因蛋白序列, 包含每个基因的最低限度信息 3 KEGG ORTHOLOG KEGG ORTHOLOG 系统将各个 KEGG 注释系统联系在一起, 可完成新测序物种的基因组或转录组的功能注释

40 1. 数据注释 KEGG 通路图将差异基因在对应的通路上进行标注直观全面地了解代谢途径 KEGG 通路图直观地反映基因表达差异对代谢通路的影响利用图形展示代谢途径及各种途径之间的关系

41 注释及富集分析

42 2. 数据挖掘基因富集分析分析基因表达信息的一种方法将基因按照先验知识, 也就是对基因组注释信息进行分类找出表达水平有差异的基因集提高了研究的可靠性, 能够识别出生物现象最相关的生物学途径方法一般采用超几何分布 ( 不放回抽样 ) 或 Fisher 精确检验的方法, 对基因进行富集分析

43 2. 数据挖掘超几何分布富集方法超几何分布计算公式 p-value q-value GO terms 富集度统计学的分析定位差异基因最可能相关的 GO term N: 所有基因中具有 GO 注释的基因数目 n:n 中差异表达基因的数目 M: 所有基因中注释为某特定 GO term 的基因数目 m: 注释为某特定 GO term 的差异表达基因数目阈值 :Corrected p-value < 0.05 差异表达基因也可以对差异基因的 KEGG 通路进行富集分析 Pathway 分析的结果更显得直接

44 2. 数据挖掘 KEGG 通路图

45 2. 数据挖掘 KEGG 通路图

2. 数据挖掘富集分析工具 DAVID Gene ID Conversion 转换基因名称 04 03 Functional Annotation 基因功能注释

基于基因共同的注释信息, 采用模糊聚类算法, 将功能相关的基因聚到一起作为一个单元, 在生物学网络水平上去研究这些基因群对聚类结果打分, 分值越高,

46 2. 数据挖掘富集分析工具 DAVID Gene ID Conversion 转换基因名称 Functional Annotation 基因功能注释 Gene Name Batch Viewer 将基因 ID 翻译成基因名称 Gene Functional Classification 基于基因共同的注释信息, 采用模糊聚类算法, 将功能相关的基因聚到一起作为一个单元, 在生物学网络水平上去研究这些基因群对聚类结果打分, 分值越高, 代表该组内的基因在基因列表越重要 DAVID 生物信息数据库, 整合了生物学数据和分析工具, 为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息, 帮助用户从中提取生物学信息

47 2. 数据挖掘 DAVID 软件结果示例

48 2. 数据挖掘不同分析工具侧重点不同 DAVID 各项分析工具的选择指示图

49 注释及富集分析

50 3. 结果展示基因功能富集分析输出的结果是排序后显著富集的基因功能集, 并对相似度较高的基因功能集进行去冗余 Pvalue 值和 Qvalue 值越小, 富集越显著获得显著富集 GO term

51 3. 结果展示得到显著富集 KEGG pathway 获得显著富集基因集

52 3. 结果展示对得到的目标基因集做更深层次分析蛋白互作网络功能 - 功能互作网络功能 - 基因互作网络

53 04 Part Four 接下来要做的工作

54 接下来可以做什么? 转录因子对获得的候选基因进行相关研究上游基因关键基因下游基因对其编码蛋白进行相关研究 : 表达定位和功能解析上下游, 深入研究调控机制通过 KEGG 中通路图来直接查看上下游但 KEGG 中的代谢网络基因产物基本是蛋白, 且网络复杂, 增加了判断上下游基因的难度通过相关网站进行预测分析基因的启动子等转录调控区域, 预测能与该基因结合的转录因子等文献调研看看文献中做了哪些其他工作

55 通过 KEGG 中通路图来直接查看上下游

56 PI3K-Akt signaling pathway

57 AMPK signaling pathway

58 转录组文章现状 NCBI PubMed 文章数量增多文章分数下降转录组数据 + 简单实验类文章 IF < 5 BMC 系列 plos one 及 SR 等相关杂志 ( IF 2~5 ) 想发更高水平文章该怎么办?

59 想发更高水平文章该怎么办? 转录组数据 + 复杂严谨的实验公共数据库获取有用数据进行深入分析转录组数据 + 其他组学数据 I F

60 多组学贯穿分析转录组类文章趋势, 助力高水平文章 DNA DNA 甲基化 Chip-seq RNA RNA-seq Protein Metabolite 蛋白组代谢组多个组学关联分析解析更深层次的调控机制

61 Thank you!

数字基因表达谱项目总结报告 2 目一项目信息... 3 二技术方法与流程实验流程信息分析流程... 4 三结果与分析基础数据分析信息分析流程图测序数据基本概况

数字基因表达谱项目总结报告 2 目一项目信息... 3 二技术方法与流程实验流程信息分析流程... 4 三结果与分析基础数据分析信息分析流程图测序数据基本概况数字基因表达谱项目总结报告 1 数字基因表达谱项目总结报告 2012 年 1 月 1 日本报告涉及到公司商业秘密, 请确保本报告内容仅供您个人科研使用, 并承担保密责任若擅自向任何第三人或者公司泄露本报告的内容, 根据国家有关法律法规, 公司将有权追究法律责任. 数字基因表达谱项目总结报告 2 目一项目信息... 3 二技术方法与流程... 4 2.1. 实验流程... 4 2.2. 信息分析流程...