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乐烷僻卫
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1 生物信息学第十一章转录组与转录调控分析 (2)

2 基因集富集分析 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 考虑所有的基因而不仅是差异表达基因根据差异表达水平将所有基因排序发现基因集里的基因是否倾向于分布在所有基因列表的前部 ( 上调 ) 或后部 ( 下调 ) 计算流程 : 计算一个富集分值 (Enrichment score, ES) 根据 ES 分值估计统计显著性针对多重检验进行校正

3 GSEA 的输入基因表达数据 D, 包括 N 个基因和 k 个样本排序产生基因列表 L 上调 - 不变 - 下调差异表达基因的 p-value 用指数 p 来控制每一步的权重 p=0, 标准 Kolmogorov Smirnov 统计 p=1,gsea 软件独立的基因集 S, 如 GO, KEGG 包括 N H 个基因

4 Enrichment Score ES(S) 基因集 D 排序为 L= {g 1,..., g N },r(g j ) = r j 对基因列表 L, 计算每一个位置 i 以上, 包括在基因集 S 中的 ( hits ) 部分, 以及不在 S 中的 ( misses ) 部分 ES = P hit -P miss 的最大值

5 ES 计算 : 实例基因列表 Gene E-ratio 基因集 S= 1, 3, 4, 5 P hit (S, 1) = 5/5=1 P miss (S, 1) = 0 P hit (S, 2) = 5/5=1 P miss (S, 2) =0.33 P hit (S, 3) = 1 + 4/(5+4) =1.44 P miss (S, 3) =0.33 P hit (S, 4) = /(5+4+3)=1.69 P miss (S, 4) = 0.33 ES(1) = 1 ES(2) = 0.67 ES(3) = 1.11 ES(4) = 1.36

6 ES 计算 : 实例基因列表 Gene E-ratio 基因集 S= 1, 3, 4, 5 P hit (S, 5) = /( )=1.8 P miss (S, 5) = 0.33 ES(5) = 1.47 P hit (S, 6) = 1.8 ES(6) = 1.14 P miss (S, 6) = 0.66 P hit (S, 7) = 1.8 ES(7) = 0.8 P miss (S, 7) = 1

7 显著性估算计算 ES 的显著性 : 与 ES NULL 比较将原数据的 p-value 取出, 随机分给每个基因, 重新排序重新计算 ES 值, 重复 1,000 次置换 (Permutation), 建立 ES NULL 分布的直方图估算 p-value = 大于或等于 ES 的个数 / 总数 Null distribution of enrichment scores Actual ES

8 GSEA 算法总结

9 Kolmogorov Smirnov 检验 GSEA, p = 0, 不考虑 p-value 的权重非参检验方法 (Nonparametric test) 检验分布是否符合正态分布两样本的 Kolmogorov Smirnov 检验差异最大的值算显著性

10 基因调控网络早期观点 : 表达谱相似的基因可能存在功能上的关联, 可能相互作用 ( 直接作用 ) 当前的观点 : 表达谱相似的基因可能具有共同的调控元件 ( 基因 UTR 区域存在共同的启动子 ), 能够被同一个上游因子所调控

11 相关系数 : 基因共表达网络与光合效率和气孔发育相关的基因 :ERL2 在 Wild-type 中与之显著相关, 但在 Mutant 中显著不相关的基因 Wild-type Mutant ERL2 SKP1 Unknown ChS1

12 相关系数 : 基因共表达网络

13 Microarray: 工具 & 数据库

14 GEO - NCBI

15 Array Express - EMBL

16 SMD - Stanford

17 RNA-Seq 分析流程分离纯化所有的 mrna 利用反转录酶将 mrna 转变成 cdna cdna 测序将序列映射到基因组上序列检测到越多, 则表达越高 RNA-Seq 数据分析 : 挑战! 将读段映射到参考基因组上定量已知的基因发现新的转录本定量可变剪切异构体

18 RNA-Seq 数据 : 序列读段 FASTQ: Illumina 测序读段文件 Line 1: Line 2: Line 3: Line TNTCTGTGTCCTGGGGCATCAATGATAGTCACATAGTACTTGCTGGTCTCAAATTTCCACAAGGAGATATCAATGG +EAS042_0001:1:1:1061:20798#0/1 ab\^^y]a^]cde`daayaaa_bc\\`b^y\a\aauqy\]a\`aa\w ]HVZ]VQF^[`UH]\J^F^T^\\I] Line 1 EAS042_0001 the unique instrument name 1 flowcell lane 1 tile number within the flowcell lane #0 'x'-coordinate of the cluster within the tile 'y'-coordinate of the cluster within the tile index number for a multiplexed sample (0 for no indexing) Line 2: 原始序列 Line 3: +? Line 4: 序列的质量分值 -5 ~ 62 使用 ASCII 59 ~ 126 /1 the member of a pair, /1 or /2 (paired-end or mate-pair reads only)

19 RNA-Seq 分析流程 Poly(A) end-reads 样品准备高通量测序数据分析 : 读段映射可视化重头组装定量

20 RNA-Seq vs. DNA 芯片 RNA-seq 可以发现新的转录本和可变剪切异构体,DNA 芯片只能检测已知转录本的表达 RNA-Seq 比全基因组铺瓦芯片的解析度更高 : 单个碱基 RNA-Seq 相同的实验流程可以做不同的分析单核苷酸多态性 (SNP 芯片 ) 外显子连接点 ( 连接点芯片 ) 基因融合 ( 基因融合芯片 )

21 RNA-Seq 的优势转录组分析方法 :RNA-Seq 比其他方法更有优势

22 RNA-Seq vs. DNA 芯片营养丰富的培养基里的芽殖酵母仅在中等表达时, 两者有较高一致性基因表达低或者高的时候, 关联性差 DNA 芯片的对基因表达低或高的检测不够敏感

23 RNA-Seq 的问题 : 建库 mrna 与 cdna 碎裂的不同利用 oligo-dt 引物得到的 cdna 更倾向于获得转录本的 3 端 RNA 碎裂在 5 和 3 端都较少

24 RNA-Seq 的准确性 HiSeq 2000 和 SOLiD 测序分析结果 HuGene2:Affymetrix 芯片数据利用 qpcr (Taqman 或 PrimePCR) 验证表达水平不同方法一致性较高

25 RNA-Seq 数据 : 基因模型基因 C17orf45 Bioinformatics, (ENSG ) 2018, HUST 的结构

26 RNA-Seq 数据的归一化不同样本之间比较 : 测序深度不同不同基因之间 : 表达相同时序列越长读段越多 RPKM (The number of reads per kilobase of transcript per million mapped reads) 每百万可映射读段每千 kb 的读段数例如, 测序 10 7 读段,8*10 6 可映射 (N) 1kb 转录本 (L), 总共有 1000 个读段 (C) RPKM = 1000/(1 * 8) = 125 Multiread ( 多重定位读段 ) 计数时需要除以定位个数

27 归一化的 RNA-Seq 数据技术重复的结果一致性较高体外合成的转录本加入样本中检测 RPKM 与加入量线性相关

28 多重定位读段 RNA-Seq vs. DNA 芯片不考虑多重定位读段造成部分基因 RPKM 值偏低考虑多重定位读段提高与芯片结果的线性关系

29 归一化 : 不同样本之间的比较不同样本相同基因的比较不需要考虑长度因素 Y gk : 基因 g 的读段数目,N k : 读段总数

30 差异表达基因分析

31 λ < 10: 有偏分布 λ < 10: 近似为正态分布差异表达基因分析利用 Fisher s exact test qpcr 与芯片结果拟合更好!? R=0.86 R=0.82

32 二次泊松分布? TSPM: two-stage Poisson model 测序可以看成是泊松过程建库也可以近似看成是泊松过程两者的 λ 不同, 需要分别估计 mrna 分子读段接头连接扩增测序

33 负二项分布 :DESeq NB: Negative Binomial (Pascal) Distribution 每次试验的成功率 p, 失败率 1-p 经历 r 次失败后观察到 k 次成功事件, 则 RNA-Seq 数据的归一化总共 m 个样本基因 i 在样本 j 中检测到 K ij 个读段样本 j 的采样深度 s j

34 负二项分布 :DESeq RNA-Seq 数据的归一化总共 m 个样本基因 i 在样本 j 中检测到 K ij 个读段样本 j 的采样深度 s j 样本 j 的条件 p(j) q ip 基因 i 在条件 p 下的平均归一化表达量用最大似然性估算 (MLE) 获得

35 DESeq: 差异表达基因分析两样本的 p-value 计算 p(a, b) = Pr(K ia = a) Pr(K ib = b) K is = K ia + K ib

36 负二项分布 vs. 泊松分布 DESeq ( 橙 ),EdgeR ( 橙虚线 ), 泊松 ( 紫 ) NB 估算的方差更大

37 负二项分布 vs. 二次泊松分布 DESeq 和 EdgeR 的重合较高 :NB 分布 TSPM ( 二次泊松 ) 与其他工具重合较低

38 RNA-Seq 差异表达基因分析工具目前最好 :DESeq 和 EdgeR DESeq: EdgeR: R 语言 + Bioconductor 实现

39 可变剪切 AS, Alternatively Splicing 92 94% 的人类多外显子基因存在可变剪切现象 Major isoform vs. minor isoform 86% 包括至少有一个次要异构体 ( 比例 15%) SLC25A3 基因

40 果蝇 Dscam 基因的可变剪切 12*48*33*2=38,016 个不同的异构体果蝇 : ~250,000 个神经元轴突导向 (Axon guidance) 调控神经发育神经元之间的连接

41 可变剪切的类型 8 种类型仅统计外显子上的读段数不全面

42 可变剪切的组织特异性脑的可变剪切特异性最高不同个体之间存在差异细胞系有特别的剪切模式

43 可变剪切鉴定 :Cufflinks 用 Bowtie ( 领带 ) 将所有读段映射到基因组上不能完美匹配的, 用 TopHat ( 礼帽 ) 发现剪切位点

44 可变剪切鉴定 :Cufflinks OLC 算法 (Overlap graph) 读段是图中的结点, 若可以匹配则置边用 OLC 算法计算多条路径用最大似然性方法估算每个异构体的表达水平

45 可变剪切鉴定 :Scripture DBG 算法 (Connectivity graph) 单个碱基是结点, 边是两个读段共有的序列用 DBG 算法算出多个路径 Cuffdiff: 利用双端测序数据校正不同异构体的比例 RPKM 归一化表达

46 常用的 RNA-Seq 分析软件

47 表观遗传学 (Epigenetics) Dolly Ian Wilmut 多莉 : 生于 1996 年 7 月 5 日, 死于 2003 年 2 月 14 日

48 Dr. Evil Dr. Evil s Clone Mini Me Dr. Evil

49 The calico cat? Rainbow Allie Copy Cat

50 PEV: 位置效应斑 Position Effect Variegation white 基因 vs. 转座子

51 表观遗传学基因的 DNA 序列不发生改变的情况下, 基因的表达水平与功能发生改变, 并产生可遗传的表型特征 : (1) 可遗传 ;(2) 可逆性 ;(3) DNA 不变表观遗传学机制 : DNA 甲基化组蛋白修饰 MicroRNA 染色质重塑

52 Waddington's epigenetics 基因型表型

53 DNA 甲基化 SAH, S-adenosylhomocysteine; SAM, S-adenosylmethionine

54 DNA 甲基化

55 叶酸 : 很重要?

56 DNA 甲基化 vs. 转座子叶酸 : 很重要 IAP: intracisternal A particle 非甲基化 : 异常表达 Agouti 甲基化 : 正常表达

57 组蛋白的共价修饰

58 Paramutation 一个沉默的基因常常导致等位基因也发生沉默 maize P-rr gene:myb 转录因子

59 Paramutation 分子机理 (RNA-mediated trans-induction of chromatin):rna 参与调控

60 染色质重塑染色质 (Chromatin): 染色体上高度致密的部分, 通常不表达基因

61 ChIP-Seq 转录因子组蛋白等与 DNA 结合 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 结合高通量测序

62 ChIP-Seq 的读段分布不同蛋白质与 DNA 结合的模式不同 A. 转录因子 ;B. RNA 聚合酶和组蛋白质等

63 ChIP-Seq 校正测序读段的双峰校正为单峰例如,CTCF 结合双峰的校正

64 常见的 ChIP-Seq 数据分析工具

65 不同软件结果获得的峰不同人类三个转录因子 NRSF (neuron-restrictive silencer factor) GABP (growthassociated binding protein) FoxA1 (hepatocyte nuclear factor 3α)

66 qpcr 验证 NRSF: 大致相当 GABP:SISSRS 和 CisGenome 较差

67 DNA 甲基化的检测 : 芯片

68 MethylC-seq: Bisulfite Modification 重亚硫酸盐测序 : 非甲基化的 C 将被测序成 T, 反链为 A

69 Methyl-Seq 技术 Bisulfite-based MethylC-seq Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) Enrichment-based Methylated DNA immunoprecipitation sequencing (MeDIP-seq) Methylated DNA binding domain sequencing (MBD-seq) MethylC-seq 全基因组覆盖度高, 测 CpG 岛其他方法有优势

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<4D F736F F F696E74202D20B2E2D0F2B6C1B6CEBBD8CCFBBACDD7AAC2BCB5F7BFD82E > 生物信息学引论测序读段回帖和转录调控薛宇华中科技大学生命科学与技术学院课程相关资料教师 : 薛宇, 华科东校区东 11 楼 618# E-mail: [email protected] 课件下载 : http://xue.biocuckoo.org References: MIT OCW:Foundations of Computational and Systems Biology http://ocw.mit.edu/courses/biology/7-91j-foundations-ofcomputational-and-systems-biology-spring-2014/index.htm