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1 第 8 卷第 9 期食品安全质量检测学报 Vol. 8 No 年 9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep., 2017 高效液相色谱法测定减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的含量刘春霖, 刁飞燕, 谢强胜, 董 * 蓬, 李启艳 ( 山东省食品药品检验研究院, 济南 ) 摘要 : 目的建立一种用于测定减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的高效液相色谱 (high performance liquid chromatography, HPLC) 检测方法方法采用 ZORBAX SB-C 18 柱 (4.6 mm 150 mm, 5 μm), 以乙腈 -0.1% 磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱, 流速为 1.0 ml/min, 柱温为 40, 二极管阵列检测器进行检测, 检测波长为 254 nm 结果番泻苷 A 番泻苷 B 分别在 2.050~20.50 μg/ml(r=0.9999) 1.803~18.03 μg/ml(r=0.9993) 范围内呈良好线性关系, 定量限分别为 μg/kg; 平均回收率分别为 96.8% 95.1%, 相对标准偏差分别为 1.3% 2.3% 结论该方法简单可行, 结果准确可靠, 适用于减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 含量的测定关键词 : 高效液相色谱法 ; 减肥类保健食品 ; 番泻苷 A; 番泻苷 B Determination of sennoside A and sennoside B in slimming health foods by high performance liquid chromatography LIU Chun-Lin, DIAO Fei-Yan, XIE Qiang-Sheng, DONG Peng, LI Qi-Yan * (Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan , China) ABSTRACT: Objective To establish a method for the determination of sennoside A and sennoside B in slimming health foods by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods Samples were separated on a ZORBAX SB-C 18 column (4.6 mm 150 mm, 5 μm). The mobile phase was composed of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid with gradient elution. The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was 40. The samples were detected with diode array detector, and the detection wavelength was 254 nm. Results Sennoside A and sennoside B had good linear relationships in the ranges of 2.050~20.50 μg/ml (r=0.9999) and 1.803~18.03 μg/ml (r=0.9993), respectively. The limits of quantification (LOQ) were 30 μg/kg and 27 μg/kg. The average recoveries were 96.8% and 95.1%, and the relative standard deviations (RSDs) were 1.3% and 2.3%. Conclusion The method is simple, specific and accurate, which is suitable for determination of sennoside A and sennoside B in slimming health foods. KEY WORDS: high performance liquid chromatography; slimming health foods; sennoside A; sennoside B * 通讯作者 : 李启艳, 副主任药师, 研究方向为保健食品质量控制 @163.com *Corresponding author: LI Qi-Yan, Associate Chief Pharmacist, Shandong Institute for Food and Drug Control, No. 2749, the New Lok Street, High-tech District, Jinan , China @163.com

2 3348 食品安全质量检测学报第 8 卷 1 引言番泻叶为豆科植物狭叶番泻 (Cassia angustifolia Vahl) 或尖叶番泻 (Cassia acutifolia Delile) 的干燥小叶, 具有泻热行滞通便利水等药理作用 [1], 番泻叶是最早用作泻药和减肥药的植物之一 [2], 主要含有蒽醌类和黄酮类成分 [3], 而番泻苷 A 和番泻苷 B 等蒽醌类成分是其药理作用的主要活性成分 [4,5] 番泻叶近年来用于减肥类保健食品, 具有抗菌 [6,7] [8] 排毒养颜减肥等功效但番泻叶药性较为猛烈, 应严格控制使用人群及用量 ; 而且长期服用添加番泻叶的减肥类保健食品, 会使肠壁神经感受细胞的应激性降低, 可能会导致顽固性便秘等问题目前国内尚无保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的检测标准参考相关研究发现, 番泻苷 A 番泻苷 B 的测定方法主要包括薄层扫描法 [9] 高效毛细管电泳法 [10] 紫外分光光度法 [11] [12-15] 高效液相色谱法等薄层扫描法只能定性鉴别, 无法准确定量由于保健食品基质复杂, 如采用紫外分光光度法检验, 因杂质干扰, 可能使测定结果偏高 [8] 因此本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC) 对样品进行测定, 经验证, 该方法简便准确, 可用于减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的测定 2 材料与方法 2.1 材料与试剂茶剂 14 批, 胶囊剂 9 批, 片剂 1 片, 饮品 1 批, 购于药店及超市乙腈 ( 色谱纯, 德国 Merker 公司 ); 磷酸 ( 优级纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司 ); 乙醇 ( 分析纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司 ); 碳酸氢钠 ( 优级纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司 ); 超纯水 ( 美国 Millipore 公司 ); 番泻苷 A (98.2%, 批号 : A , 上海安谱实验科技股份有限公司 ); 番泻苷 B (98.0%, 批号 : V , 上海安谱实验科技股份有限公司 ) 2.2 仪器与设备 Mettler Toledo MS 电子天平 ( 美国梅特勒 - 托利多公司 ); Waters e2695 高效液相色谱仪 ( 配 Waters 2998 二极管阵列检测器, 美国 Waters 公司 ); KQ-500DE 数控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ); BPZ-6063 真空干燥箱 ( 上海一恒科学仪器有限公司 ) 2.3 试验方法色谱条件色谱柱 : Agilent ZORBAX SB-C 18 色谱柱 (150 mm 4.6 mm, 5 µm); 流动相 : 0.1% 磷酸水溶液 (A), 乙腈 (B); 梯度洗脱程序 : 0~5 min, 90%A; 5~13 min, 90%A~87%A; 13~26 min, 87%A~83%A; 26~32 min, 83%A~78%A; 32~32.1 min, 78%A~90%A; 32.1~35 min, 90%A 流速: 1.0 ml/min; 柱温 : 40 ; 检测波长 : 254 nm; 检测器 : 二极管阵列检测器 ; 进样量 : 10 μl 溶液的配制 (1) 标准溶液的制备精确称取番泻苷 A 番泻苷 B 标准物质适量, 减压干燥 12 h, 分别置棕色量瓶中, 加 0.1% 碳酸氢钠溶液制成每 1 ml 含番泻苷 A 番泻苷 B 各 0.1 mg 的标准储备液分别准确吸取不同体积的番泻苷 A 番泻苷 B 标准储备液, 用 0.1% 碳酸氢钠溶液将其稀释成浓度分别为 μg/ml 的混合标准工作液 (2) 样品溶液的制备精密称取混合均匀的样品 0.2 g ( 若为片剂或茶剂, 需粉碎后混匀 ; 若为硬胶囊, 需取出 20 粒以上内容物研细混匀 ; 若为软胶囊, 需挤出 20 粒以上内容物混匀 ; 若为口服液, 混匀称取 ), 置 50 ml 具塞容量瓶中, 加入 0.1% 碳酸氢钠溶液 40 ml, 超声处理 1 h(40 ), 放冷, 用 0.1% 碳酸氢钠溶液定容至刻度, 摇匀, 3500 r/min 离心 5min, 取上清液过 0.45 μm 滤膜, 滤液供 HPLC 分析 3 结果与分析 3.1 波长的选择对番泻苷 A 番泻苷 B 标准溶液在 190~400 nm 紫外波长范围内进行扫描, 结果显示, 番泻苷 A 番泻苷 B 在 202 nm 处有最大吸收波长, 结果如图 1 所示实验比较了 nm 3 处波长的样品测定结果, nm 波长处的样品溶液色谱杂质峰较多, 影响目标化合物的测定结果, 故选择 254 nm 作为检测波长 3.2 流动相条件的优化实验比较了乙腈 -0.1% 磷酸水溶液乙腈 -0.1% 甲酸水溶液甲醇 -0.1% 磷酸水溶液乙腈 -0.1 mol/l 醋酸钠溶液 4 种流动相的分离效果结果显示, 样品溶液中番泻苷 A 番泻苷 B 在乙腈 -0.1% 磷酸水溶液条件下, 通过梯度洗脱程序能达到较好的分离效果, 故确定乙腈 -0.1% 磷酸水溶液为本研究的流动相条件 3.3 样品前处理条件的优化综合考虑番泻苷 A 番泻苷 B 理化性质, 实验比较了超声浸提水浴回流 3 种方法对番泻苷 A 番泻苷 B 提取效果的影响结果显示, 在超声条件下, 适当提高温度有助于番泻苷 A 番泻苷 B 的溶出, 但过高的温度会加快番泻苷 A 番泻苷 B 的降解 ; 超过 80 的浸提温度, 番泻苷 A 番泻苷 B 的含量逐渐下降 ; 100 水浴回流 1 h, 番泻苷 A 降解 30%, 番泻苷 B 降解 40% 40~60 条件下, 番泻苷 A 番泻苷 B 的含量无明显变化实验最终确定 40

3 第 9 期刘春霖, 等 : 高效液相色谱法测定减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的含量 3349 超声处理 60 min 为样品前处理条件 3.4 标准品与样品溶液图谱分别精密吸取项下的标准品溶液样品溶液各 10 μl, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 结果如图 2 图 3 所示, 样品溶液与标准品溶液具有相同保留时间的色谱峰, 样品溶液色谱峰具有较好的分离度, 满足实验分析要求 Fig. 1 注 : A: 番泻苷 A; B: 番泻苷 B 图 1 番泻苷 A 番泻苷 B 光谱扫描图 The UV spectra of sennoside A and sennoside B 图 2 标准溶液色谱图 (1: 番泻苷 B, 2: 番泻苷 A) Fig. 2 Chromatogram of standard sample (1: sennoside B, 2: sennoside A) 图 3 样品 ( 茶叶 ) 色谱图 (1 番泻苷 B, 2 番泻苷 A) Fig. 3 Chromatogram of tea sample (1: sennoside B, 2: sennoside A)

4 3350 食品安全质量检测学报第 8 卷 3.5 标准曲线与定量限分别取项下混合标准工作液, 按项下的色谱条件进行测定, 各组分以浓度 (X) 为横坐标, 峰面积 (Y) 为纵坐标绘制标准曲线, 得回归方程 : 番泻苷 A: Y= X , r=0.9999, 线性范围 : 2.050~20.50 μg/ml; 番泻苷 B: Y= X , r=0.9993, 线性范围 : 1.803~18.03 μg/ml 分别将番泻苷 A 番泻苷 B 标准储备液稀释至一定浓度, 以仪器的 10 倍信噪比确定定量限, 番泻苷 A 定量限为 30 μg/kg 番泻苷 B 定量限为 27 μg/kg 3.6 仪器精密度实验取番泻苷 A 浓度为 μg/ml 番泻苷 B 浓度为 μg/ml 的混合标准工作液 10 μl, 连续进样 6 次, 按上述色谱条件进行测定, 计算相对标准偏差 (RSD, %) 结果显示, 番泻苷 A 番泻苷 B 峰面积的 RSD 值分别为 0.92% 0.047%, 表明仪器精密度良好 3.7 稳定性实验取同一份样品溶液, 分别在 h 进样一次, 样品溶液中番泻苷 A 番泻苷 B 峰面积的 RSD 值分别为 1.8% 0.042%, 符合相关实验要求, 表明溶液在 24 h 内具有良好的稳定性 3.8 方法精密度和回收率实验取 2.3.2(2) 项下制备的阳性样品, 进行低中高 3 组加标回收率实验, 每组平行称取 3 份, 分别定量加入标准物质, 按上述色谱条件进行测定, 结果见表样品的测定取 25 批样品 ( 茶剂 14 批, 胶囊剂 9 批, 片剂 1 片, 饮品 1 批 ), 按 2.3.2(2) 项下方法对样品进行提取测定, 结果见表 2 Table 1 表 1 番泻苷 A 番泻苷 B 的回收率和相对标准偏差 (n=3) Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of sennoside A and sennoside B (n=3) 组分本底值 (μg) 加入量 (μg) 测得值 (μg) 回收率 (%) 平均回收率 (%) RSD(%) 番泻苷 A 番泻苷 B

5 第 9 期刘春霖, 等 : 高效液相色谱法测定减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的含量 3351 表 2 样品测定结果 (n=3) Table 2 Determination results of samples (n=3) 样品序号番泻苷 A (mg/g) 番泻苷 B (mg/g) ND ND ND ND ND ND 16 ND ND 17 ND ND 18 ND ND 19 ND ND 20 ND ND 21 ND ND 22 ND ND 23 ND ND 24 ND ND 25 ND ND 注 : ND 表示未检出, 样品 1~14 为茶剂, 15~23 为胶囊剂, 24 为片剂, 25 为饮品由表 2 可知, 12 批样品检出番泻苷 A 番泻苷 B, 检出样品中番泻苷 A 含量范围为 0.162~3.32 mg/g, 番泻苷 B 含量范围为 0.170~4.53 mg/g, 其中 5 批样品处方原料未含有上述成分, 疑似违规添加了含有番泻苷 A 番泻苷 B 成分的中药胶囊剂片剂饮品等样品均未检出番泻苷 A 番泻苷 B 4 结论本研究建立了高效液相色谱法测定减肥类保健食品中番泻苷 A 番泻苷 B 的含量在所测样品中, 胶囊剂片剂饮品均未检出番泻苷 A 番泻苷 B, 而茶剂样品中检出违规添加样品 5 批, 结果表明, 茶剂违规添加具有泻下作用成分的中药材问题比较突出含有番泻苷 A 番泻苷 B 这 2 种成分的中药材为刺激性泻药, 药性较为猛烈, 服用人群和服用量均需严格控制, 过量服用会对胃肠系统产生毒副作用, 但目前现行国家标准中没有相应的检验方法对其进行测定, 存在监管盲区, 故急需建立相应的补充检验方法, 解决现行标准的不足本研究为建立相关标准提供了技术依据参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 (2015 年版一部 )[M]. 北京 : 中国医药科技出版社, Pharmacopoeia commission of the People s Republic of China. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (edition 2015, volume 1) [M]. Beijing: China Medical Science Press, [2] 段文娟, 吴秋霞, 李月, 等. 高速逆流色谱分离纯化番泻叶中的苷类化合物 [J]. 山东科学, 2017, 30(1): Duan WJ, Wu QX, Li Y, et al. Separation and purification of glycosidic compounds from folium sennae by high-speed counter-current chromatography [J]. Shandong Sci, 2017, 30(1): [3] 杨建平, 刘晓燕, 曾正. 番泻叶的临床药理作用以及化学成分的研究进展 [J]. 药物与人, 2014, 27(3): Yang JP, Liu XY, Zeng Z. Senna s clinical research progress of pharmacological action and chemical composition [J]. Med People, 2014, 27(3): [4] 张苗, 顾燕. HPLC 法在测定番泻总苷胶囊中番泻苷 A B 含量中的应用 [J]. 现代医药卫生, 2015, 31(21): Zhang M, Gu Y. Application of HPLC method for determination of sennoside A and B contents in senna total glycosides capsules [J]. J Mod Med Health, 2015, 31(21): [5] 黄娟, 张靖, 徐文, 等. 番泻叶提取液中番泻苷 A 番泻苷 B 的稳定性考察 [J]. 中国医院药学杂志, 2014, 34(10): Huang J, Zhang J, Xu W, et al. Study on stabilities of sennoside A and sennoside B in the extract of sennae folium [J]. Chin Hosp Pharm J, 2014, 34(10): [6] Kamaraj C, Rahuman AA, Siva C, et al. Evaluation of antibacterial activity of selected medicinal plant extracts from south India against human pathogens [J]. Asian Pac J Trop Dis, 2012, 2: [7] Sharma R A, Bhardwaj R, Sharma P, et al. Antimicrobial activity of sennosides from Cassia pumila Lamk [J]. J Med Plants Res, 2012, 6(19): [8] 肖晶, 方从容, 杨杰, 等. HPLC 法同时测定保健食品中番泻苷 A 和番泻苷 B 的含量 [J]. 卫生研究, 2011, 40(3): Xiao J, Fang CR, Yang J, et al. Determination of sennoside A and sennoside B simultaneously in health food by HPLC [J]. J Hyg Res, 2011, 40(3): [9] 胡太德, 陈绍成. 通便灵胶囊质量标准的研究 [J]. 中成药, 2008, 30(8): Hu TD, Cheng SC. Quality standard for tongbianling capsule [J]. Chin Tradit Pat Med, 2008, 30(8):

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.