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1 HPV 分型定量检测在皮肤科 临床中的意义

2 缅怀霍金

3 HPV 简史 1. 小环状双链 DNA 病毒 2. 直径约 55nm 3. 无脂蛋白膜, 由核酸和蛋白衣壳组成 4. 基因组长度约 8kb 5. 高度的种属特异性, 自然宿主外从未 见有效感染

4 HPV 的结构 URR ( 上游调控区 ) 含启动子 增强子元件和病毒复制起点 E 区 (Early Genes) E1 病毒 DNA 复制 E2 病毒 DNA 复制及转录 E4 病毒释放 E5 免疫逃逸 E6 结合和降解抑癌蛋白 p53 E7 结合和降解抑癌蛋白 prb L 区 (Late Genes) L1 主要衣壳蛋白 L2 次要衣壳蛋白 de Sanjosé S, Brotons M, Pavón MA. The natural history of human papillomavirus infection[j]. Best Practice & Research Clinical Obstetrics &

5 HPV 基因分型 01 目前鉴定出超过 300 种 PV( 乳头状瘤病毒 ) 多种为 HPV 分为 5 个组, 其中最大的 3 个组是 Alpha, Beta( 蓝色 ) 和 Gamma( 绿色 ) Alpha 组 HPV 通常分为皮肤低风险型 ( 浅褐色 ), 粘膜低风险型 ( 黄色 ) 和与癌症相关的高风险型 ( 粉色 ) HPV 之间的进化关系 04 基于流行病学数据,Alpha 组中红色字体标记的型别为人类致癌型 Egawa N, Egawa K, Griffin H, et al. Human papillomaviruses; epithelial tropisms, and the development of neoplasia[j]. Viruses, 2015, 7(7):

6 HPV 感染可导致良性和恶性皮肤粘膜病变 ; 不同 HPV 亚型致癌危险性不同, 根据致癌危险性大小分为 : 高危型 : HPV ~ 53 等 低危型 : HPV ~ 44 等

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8 Schiller J T, Müller M. Next generation prophylactic human papillomavirus vaccines[j]. The Lancet Oncology, 2015, 16(5): e217-e225. 目录 CONTENTS HPV 可导致的疾病类型 肛门癌 阴茎癌 头颈癌 咽喉肿块 生殖器官湿疣 ( 椰菜花 ) 子宫颈癌 外阴癌及阴道癌 肛门癌 头颈癌 咽喉肿块 生殖器官湿疣 ( 椰菜花 )

9 疾病与 HPV 亚型的关系 疾病 扁平疣 ( 青年疣 ) 寻常疣 HPV 亚型 疣状表皮发育不良 尖锐湿疣 ~ 鲍温样丘疹病 宫颈上皮内瘤 浸润性宫颈癌 阴茎癌 女阴癌

10 HPV 的感染特点 普遍性 :80-85% 的有性生活史的女性 一过性 : 约 90% 在 1-2 年自然消失, 没有明显的临床表现 部分 HPV 型别的感染有地区差异 HPV45 型在非洲西部很常见, HPV39 和 59 型仅在美洲的中部和南部出现, HPV52,58 则在中国妇女中检出率较高 HPV 的型别与宫颈癌的病理类型有关 宫颈鳞状上皮细胞癌中 HPV16 为主 ( 占 51%) 宫颈腺癌和宫颈腺鳞细胞癌中 HPV18 分别占 56% 和 39% 10

11 HPV 在正常人群中的感染率 Lancet 2005; 366:

12 2010 年我们研究了以 2007 年 5 月 ~2009 年 12 月在桂林医学院附属医院皮肤科 妇科门诊就诊的 1661 例疑似 HPV 感染者为研究对象, 其中男 469 人, 女 1192 人, 年龄 18~65 岁, 平均年龄 28.4 岁 宫颈取材 1068 例, 外阴取材 575 例, 外阴 HPV-DNA 检查取材于肛周 86 例, 阴茎冠状沟 包皮 338 例, 女性大阴唇 151 例 所有病例均进行 HPV-DNA 分型检测 ( 包括高危型包括 : HPV MM4; 低危型包括 :HPV ) 黄熙, 姚军, 严文杰, 等. 外阴与宫颈 HPV 感染型别分析 [J]. 临床皮肤科杂志, 2012, 41(1):18-19.

13 在 1661 病例标本中检出 HPV 阳性病例 819 例, 阳性检出率为 49.31% 共检出 HPV-DNA 型别 18 种 在 1086 例宫颈脱落细胞标本中检出 HPV 阳性病例 477 例, 阳性检出率为 44.92%, 以 多见, 低危型别以 HPV 多见, 高危型以 HPV 16 HPV 58 HPV 18 多见 在 575 例外阴脱落细胞标本中检出阳性病例 342 例, 阳性检出率 59.49%, 以 HPV 多见, 低危型别 HPV6 检出率最高, 其次为 HPV11, 高危型别 HPV16 检出率最高 黄熙, 姚军, 严文杰, 等. 外阴与宫颈 HPV 感染型别分析 [J]. 临床皮肤科杂志, 2012, 41(1):18-19.

14 低危 外阴 宫颈 HPV-DNA 型 阳性例 阳性率 阳性例 阳性率 P 值 别 数 (%) 数 (%) 合计 黄熙, 姚军, 严文杰, 等. 外阴与宫颈 HPV 感染型别分析 [J]. 临床皮肤科杂志, 2012, 41(1):18-19.

15 高危 外阴 宫颈 HPV-DNA 型 阳性例数 阳性率 阳性例数 阳性率 P 值 别 (%) (%) MM 合计

16 外阴 HPV 感染的 HPV-DNA 型别分布较集中, 主要为 HPV ; 宫颈 HPV 感染的 HPV-DNA 各型别的分布虽然以 HPV16 18 为主, 但剩余型别与外阴 HPV 感染的 HPV-DNA 型别分布相比分布较分散 ; 提示外阴 HPV 感染的 HPV-DNA 型别与宫颈 HPV 感染的 HPV-DNA 型别相比较单一, 且趋于 HPV 低危型别的感染 黄熙, 姚军, 严文杰, 等. 外阴与宫颈 HPV 感染型别分析 [J]. 临床皮肤科杂志, 2012, 41(1):18-19.

17 尖锐湿疣 ( CA) 临床分为 : 临床 ( 典型 CA) 亚临床和潜伏 ( 隐 性 ) 感染 ; 流行病学资料表明亚临床感染为 HPV 感染的主要表现形式 ; HPV 亚临床感染与 CA 治疗后的高复发率和肛门 生殖器恶性 肿瘤的发生均有密切关系 HPV 亚临床感染的治疗是临床的一大挑战 Stanley M. HPV vaccines: are they the answer?[j]. British Medical Bulletin, 2008, 88(1):59-74.

18 生殖道 HPV 感染 高危型 HPV 通常没有症状, 为一过性并可自愈 90% 以上的病人两年内可痊愈 常见其他亚型继发或者合并感染 多重 HPV 亚型合并感染极为常见 自然免疫力差 感染后只有 50%-60% 的女性产生 HPV 抗体, 因此对同种基因型的 HPV 可再度感染!

19 HPV& 宫颈癌 约发现有 200 余种 HPV 高致病种类 HPV 等 HPV16/18 是导致宫颈癌的最主要型别 宫颈鳞癌 宫颈腺癌 Bosch F X, De Sanjosé S. Human papillomavirus and cervical cancer burden and assessment of causality[j]. JNCI Monographs, 2003, 2003(31): 3-13.

20 HPV 的检测方法 细胞学检查 感染组织中 HPV 蛋白的 检测 HPV 感染的 血清学检查 HPV 基因组 检测

21 HPV 的 DNA 检测技术 高 方法学灵敏度特异性技术特点 斑点印迹 (Dot blot) 中中有一定放射性 核酸印迹原位杂交 (southern blot hybridization) 原位杂交 (In Situ hybridization) 高高标准 麻烦, 不宜大规模使用 高中蜡块组织包埋内检测 HPV 杂交捕获 (HC HC2) 高中无放射性, 易使用, 高 低危型间有交叉反应, 且不能分型 普通多聚酶链反应 (PCR) 很高 中 取材容易, 但目前已应用试剂的只能检测少数单一型别, 如 等, 且由于技术上的问题存在假阳性

22 HPV 分型的主要方法 HOLOGIC Aptima - HPV16, 18/45 分型 (TMA, 转录介导的扩增 ) Roche Cobas HPV16, 18 型分型 ( 多重荧光 PCR) BD onclarity HPV 16,18,45,31,51,52 分型 ( 多重荧光 PCR) BMRT HPV( 硕世 )- 21 种 HPV 全分型 ( 多重荧光 PCR) 凯普 HPV 全分型 (PCR+ 斑点杂交 )

23 HPV 基因分型检测 PCR- 反向斑点杂交法

24 多重荧光 PCR 方法如何实现 HPV 分型 ( 硕世 ) 荧光 PCR 仪收集来自不同通道的荧光信号并报告型别 多重荧光 PCR 分型技术 ( 硕世分管分型 ) 传统分型技术 ( 传统 PCR+ 斑点杂交 ) PCR 扩增同步分型, 时间短 实时荧光 PCR 闭管扩增分型, 不易污染 每管仅扩增 3 种型别, 分型准确 传统 PCR 扩增 + 斑点杂交, 时间长 扩增产物开盖进行杂交, 易污染 所有靶标在同一管中扩增, 易竞争抑制

25 中国医科大学附属盛京院研究数据 硕世 HPV 检测与型别鉴定的金标准测序法比较, 一致性为 99.6%

26 2012 年欧洲尖锐湿疣治疗指南 2011 年 3 月欧洲的生殖器疣治疗小组在各资料库中进行广泛搜索, 检出相关系统性综述和随机对照试验 获得并分析 校对了原始数据, 制定出了 2012 年尖锐湿疣治疗指南 李蕾, 邹先彪, 解读 2012 年欧洲尖锐湿疣治疗指南, 实用皮肤病学杂志

27 硕世 21HPV 分型定量检测系统 采用多重荧光 PCR 定量技术, 可在 2.5 小时内快速 准确地区分受检样本中 21 种 HPV 基因亚型, 检测范围包括所有致癌型别以及 3 种低危型 HPV ; 同步对 21 种 HPV 亚型病毒载量进行标准化定量 系统组成 : 全自动核酸提取仪 实时荧光定量 PCR 仪 21HPV 分型定量检测试剂盒 HPV 分型定量报告软件 CFDA 批准 : 国械注准 , 苏械注准 , 专利号 :ZL

28 传统定量技术的局限性及解决方案 传统定量技术 ( 杂交捕获技术 ) 半定量技术, 无法对受试样本的细胞数进行定量, 无法排除由于不同细胞数量导致的偏差, 定量缺乏准确性 解决方案 多重荧光 PCR 技术 利用荧光信号实时监控 PCR 进行, 最后通过 CT 值和标准曲线对起始模板进行定量分析, 可实现定量的标准化和更为精确的定量 王轶英, 王悦, 孔北华,wenxin zheng,hpv 定量检测的临床意义与研究进展

29

30 Human TOP3 基因 ( 单拷贝基因 ) 细胞定量的可行性 TOP3 基因是人体可靠的单拷贝基因 细胞显微计数法验证了单拷贝基因测算细胞数可靠性 2010 bioperfectus file data Hanai R, Caron P R, Wang J C. Human TOP3: a single-copy gene encoding DNA topoisomerase III[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93(8):

31 HPV 感染后的可能结局 潜伏感染 亚临床感染 HPV 感染 良性病变 恶性病变 低危型 HPV 感染平均持续时间是 4.8 个月, 高危型 HPV 感染平均持续时间大概是 8 个月 HPV 感染的最常见的结局是没有明显的临床表现的亚临床感染, 绝大部分会被机体免疫力自动清除 Richardson,et al

32 生殖器疣诊治存在个性化临床需求 对具体部位 HPV 感染情况监控 治疗技术的发展 基于荧光定量 PCR 的 HPV 分型 + 定量检测 顽固性尖锐湿疣 ( 难治 易复发 )

33 北京大学深圳医院临床研究数据 2017 年中国妇产科临床杂志 HPV 16 HPV 52 HPV 58 硕世 21HPV 分型定量检测 : 不同程度宫颈病变病灶中 HPV 亚型病毒载量 吴瑞芳, 中国妇产科临床杂志,2017 年

34 中国医科大学附属盛京院研究数据 硕世 21HPV 分型定量检测 :HPV16 型和 18 型病毒载量与病变级别的关系 HPV16 型临床 cutoff 值为 16,600 copies /10,000 cells 时, 可预测 HPV16 型感染患者患有 CIN( 灵敏度为 74.6% 和特异性为 72.5%) Sun Z et al. Bmc Cancer, 2015.

35 光动力为主的综合治疗方案 1. 以微波 冷冻 手术等物理方法尽量去除可见病变 2. 以光动力疗法去除肉眼不可见的 HPV 亚临床感染 3. 局部环境 + 心里调试, 改善免疫状态 去除肉眼可见病变 去除肉眼不可见病变 改善免疫状态

36 临床应用 评估光动力治疗效果 理想情况 1. 治疗 1-2 周后 HPV 转阴, 或载量大大减少 2. 每月复查 1 次, 连续 3 次阴性后过 3 个月再查 1 次, 结果阴性, 提示治愈 不理想情况 1. 型别和量值无明显变化 2. 型别不变, 载量升高 3. 型别增多

37 患者基本信息 患者感染型别风险分层 阳性型别分开汇报, 并且单独提示载量及感染比率

38 HPV 分型定量检测在皮肤科的临床意义总结 有助于指导光动力疗程的全过程 有助于发现治疗过程中的不足和问题 有助于进行个体化精准治疗, 特别是 阴暗病例处理

39 谢谢!

材料 方法

材料 方法 生物技术通报 张发洲 杨慧兰 为了构建单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽 真核表达质粒 应用 技术从 株 的基因组中扩增 基因 并连接至真核表达载体 对阳性克隆进行菌落 酶切和测序鉴定后 成功构建了重 组质粒 用 转染试剂盒将重组质粒 转染至 细胞中 并用 及 检测其表达情况 结果显示 基因在 细胞中得到正确表达 真核表达质粒 的构建成功 为进 一步研究 对宿主细胞的影响奠定了基础 单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽

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