前言 本标准按照 GB/T 给出的规则编制 本标准由中国实验动物学会归口 本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草 本标准起草单位 : 中国医学科学院医学生物学研究所 中国食品药品检定研究

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1 ICS B 44 T/CALAS x-201x 实验动物树鼩微生物学等级及监测 Laboratory animal Microbiological standards and monitoring in tree shrew ( 征求意见稿 ) 201x-xx-xx 发布 201x-xx-xx 实施 1

2 前言 本标准按照 GB/T 给出的规则编制 本标准由中国实验动物学会归口 本标准由全国实验动物标准化技术委员会 (SAC/TC281) 技术审查 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草 本标准起草单位 : 中国医学科学院医学生物学研究所 中国食品药品检定研究院本标准主要起草人 : 孙晓梅 贺争鸣 代解杰 岳秉飞 巩薇 王淑菁 邢进 罕园园 付瑞 王文广 2

3 实验动物树鼩微生物学等级及监测 1 范围本标准规定了实验树鼩的微生物学等级分类 检测要求 检测程序 检测方法 检测规则 结果判定 检测结论等 本标准适用于实验树鼩微生物学等级监测 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件, 其随后所有的修改单 ( 不包括勘误的内容 ) 或修订版均不适用于本标准 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方, 研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 GB/T ~ 实验动物微生物学检测方法 GB/T 实验动物沙门菌检测方法 GB/T 实验动物皮肤病原真菌检测方法 GB/T 实验动物志贺菌检测方法 GB/T 实验动物金黄色葡萄球菌检测方法 GB/T GB/T GB/T 实验动物肺炎链球菌检测方法 实验动物小鼠肝炎病毒检测方法 实验动物兔轮状病毒检测方法 GB/T 实验动物空肠弯曲杆菌检测方法 GB/T GB/T GB/T 实验动物猕猴疱疹病毒 Ⅰ 型 (B 病毒 ) 检测方法 实验动物酶联免疫吸附实验 实验动物免疫荧光试验 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 实验树鼩 laboratory tree shrew 经人工饲育, 对其携带的微生物和寄生虫实行控制, 遗传背景明确或者来源清楚, 用于科学研究 教学 生产和检定以及其他科学实验的树鼩 3

4 3.2 普通级树鼩 conventional (CV) tree shrew 不携带所规定的人兽共患病病原和烈性传染病病原的树鼩 3.3 清洁级树鼩 clean (CL)tree shrew 除普通级树鼩应排除的病原外, 不携带所规定的对树鼩危害大和对科学研究干扰大的病原的树鼩 3.4 无特定病原体级树鼩 specific pathogen free (SPF) tree shrew 除清洁级树鼩应排除的病原外, 不携带所规定的潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的树鼩 4 实验树鼩等级分类实验树鼩微生物学等级分为普通级 清洁级和无特定病原体级 5 缩略语 IFA: 免疫荧光试验 ELISA: 酶联免疫吸附试验 PCR: 聚合酶链式反应 6. 检测要求 6.1 外观指标外观检查无异常 6.2 病原菌检测项目各等级实验树鼩病原菌检测项目见表 1 表 1 各等级实验树鼩病原菌检测项目动物等级病原菌检测要求 无 普 沙门氏菌 Salmonella spp. 特 清 通 皮肤病原真菌 Pathogenic dermal fungi 定 洁 级 病 级 疱疹病毒 Herpes virus 原 志贺氏菌 Shigella spp. 4

5 体 级 轮状病毒 Rotavirus 呼肠孤病毒 Reovirus 腺病毒 Adenovirus 肝炎病毒 Hepatitis virus 肺炎链球菌 Streptococcus pnemoniae 变形杆菌 Proteus spp. 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 空肠弯曲菌 Campylobaceter jejuni 必须检测项目 : 指在进行实验树鼩质量评价时必须检测的项目, 要求阴性 ; 必要时检测项目 : 指引进实验树鼩时或怀疑本病流行等必要时检测的项目 6.3 检测项目分类 必须检测项目 在进行实验树鼩质量评价时必须检测的项目, 要求阴性 必须检测项目用 表示 必要时检测项目申请生产许可证或为补充种源野外捕获的树鼩在引进饲养设施前和疑有本病流行时必须增加检测的项目 必要时检测项目用 表示 7. 检测程序 编号 外观检查 采样 * 耳后 背部毛发或皮屑 真菌检查 采血 血清抗体检查 鼻拭子 肛拭子 ( 或新鲜粪便 ) 细菌检查 检测 结果判定 5 检测报告

6 *: 结合临床症状和实验室检查结果, 需要进一步确证时, 可取特定样本进行检测 图 1 检测程序 8 检测规则 8.1 检测频率每三个月至少检测一次 8.2 采样 方式选择成年树鼩用于检测, 随机取样 方法 按真菌 病毒 细菌要求联合取样 采样方法按照标准 NY/T 541 进行 数量根据树鼩群体大小, 采样数量见表 2 表 2 采样数量群体大小 ( 只 ) 采样数量 * < ~500 >500 不少于 5 只 不少于 10 只 不少于 15 只 * 血液不少于 1ml/ 只 8.3 送检要求样本要求有明显标识, 安全送达实验室, 送检单应写明检品名称 品系 等级 数量及检测项目等内容 9 检测方法 9.1 沙门氏菌按 GB/T 的规定进行 9.2 皮肤病原真菌按 GB/T 的规定进行 9.3 志贺氏菌按 GB/T 的规定进行 6

7 9.4 金黄色葡萄球菌按 GB/T 的规定进行 9.5 肺炎链球菌按 GB/T 的规定进行 9.6 轮状病毒按 GB/T 的规定进行 9.7 空肠弯曲杆菌按 GB/T 的规定进行 9.8 疱疹病毒按 GB/T 的规定进行 9.9 肝炎病毒按 GB/T 的规定进行 9.10 呼肠孤病毒按附录 A 的方法进行 9.11 腺病毒按附录 B 的方法进行 9.12 变形杆菌按附录 C 的方法进行 10 结果判定 10.1 抗体检查疱疹病毒 轮状病毒和肝炎病毒经 ELISA 或 IFA 检测, 血清抗体阴性判为合格 10.2 病原体检查细菌 真菌经分离培养鉴定, 未见病原体判为合格 10.3 病原体核酸 PCR 检查呼肠孤病毒和腺病毒待检样品经核酸 PCR 检测, 无扩增目的条带判为合格 ; 待检样品有目的条带, 扩增到特异性条带判为阳性 对阳性检测结果, 选用同一种或另外一种方法重试, 如仍为阳性则判为阳性 判为不合格 11 判定结论按照申报的等级标准, 所有项目的检测结果均达到要求, 判为合格 7

8 附录 A 实验树鼩呼肠孤病毒 PCR 检测方法 A.1 材料 A.1.1 主要试剂总 RNA 提取试剂盒和 PCR 试剂盒 ; 树鼩呼肠孤病毒 PCR 检测引物 : 外围上游引物 TRV-F1: 5 - CCATGATACTGACTCAGTTTGGACCG -3 ; 外围下游引物 TRV-R1 : 5 - CACTAAGAAAATACCRCTAGTRCAWGCCAT -3 ; 内围上游引物 TRV-F2 : 5 - GATTAAGGCBCCWTTGGAGAAGTTTG -3 ; 内围下游引物 TRV-R2 : 5 - GACAAGGGCRTRRCTCCCATGTACAT -3 ; 扩增目的片段 513bp A.1.2 主要仪器 PCR 仪 高速离心机 恒温水浴箱 电泳仪 紫外分光光度计 凝胶成像系统 A.2 方法采用普通巢氏 RT-PCR 检测方法 A.2.1 样品取材用无菌棉签采取树鼩肛拭子, 或新鲜粪便保存在 -30 冰箱备用 A.2.2 标本总 RNA 提取用 RNA 提取试剂盒提取 RNA, 具体操作按说明书进行 经紫外分光光度计测定浓度, 通过 OD260/OD280 比值判定质量 A.2.3 PCR 反应 cdna 合成反应 : 按照 FermentasRevertAid TM First Strand cdna Synthesis Kit 操作步骤, 依据反转录体系 : 病毒 RNA 8μL Random Hexamer Primer 1μL nuclease-free Water 3 μl 5 Reaction Buffer 4μL RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL) 1μL 10mM dntp Mix 2μL RevertAid M-MuLV RT(200U/μL) 1μL, 反应条件为 :25 孵育 5min,42 60min, 70 5min 获得 cdna 第一次 PCR 反应体系 : 反转录 cdna 模板 3μL DreamTaq Green PCR Master Mix 12.5 μl nuclease-free Water 7.5μL, 以外围引物 TRV-F1(5μM) TRV-R1(5μM) 各 1μL 进行巢式第一次 PCR 扩增 扩增条件 :95 变性 5min;95 30sec,50 30sec,72 2min, 35 个循环 ;72 延伸 10min 第二 PCR 反应 : 取第一次 PCR 产物 3μL, 以内围引物 TRV-F2(5μM) TRV-R2(5μM) 各 1μL 进行第二次 PCR 扩增, 反应体系及反应条件同第一次 PCR 扩增 8

9 A.2.4 电泳检测取 5μL PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 用 DNA marker 确定 PCR 产物大小 用凝胶成像系统测定 PCR 产物, 阳性片段为 513bp A.3 结果判定扩增到特异性条带判为阳性 对阳性检测结果, 选用同一种或另一种方法重试, 如仍为阳性则判为阳性 9

10 附录 B 实验树鼩腺病毒 PCR 检测方法 B.1 材料 B.1.1 主要试剂 DNA 提取试剂盒和 PCR 试剂盒 ; 树鼩腺病毒 PCR 检测引物 : 上游引物 : GCGGAGCGGGTTGTAGGGT; 下游引物 :TCGTGCGGCTGGCGTTTT; 扩增目的片段 495bp B.1.2 主要仪器 PCR 仪 高速离心机 恒温水浴箱 电泳仪 紫外分光光度计 凝胶成像系统 B.2 方法采用普通 PCR 检测方法 B.2.1 样品取材采取树鼩新鲜粪便保存在 -30 冰箱备用 B.2.2 标本总 RNA 提取用 DNA 提取试剂盒提取粪便 DNA, 具体操作按说明书进行 经紫外分光光度计测定浓度, 通过 OD260/OD280 比值判定质量 B.2.3 PCR 反应 PCR 反应体系为 25μL, 包括 :10xPCR buffer2.5μl,dntp 2μL,ddH2O17.35μL, 引物各 1μL,DNA1μL,HS Taq 酶 0.15μL PCR 反应条件为 :94 预变性 5min;94 1min; 退火温度 1min,72 1min,35 个循环 ;72 10min B.2.4 电泳检测取 5μL PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 用 DNA marker 确定 PCR 产物大小 用凝胶成像系统测定 PCR 产物, 阳性片段为 495bp B.3 结果判定扩增到特异性条带判为阳性 对阳性检测结果, 选用同一种或另一种方法重试, 如仍为阳性则判为阳性 10

11 附录 C 实验树鼩变形杆菌检测方法 C.1 材料 C.1.1 主要试剂 S.S 琼脂 ; 血琼脂培养板 ; 麦凯恩琼脂平板 ; 氧化酶试纸 C.1.2 主要仪器普通恒温培养箱 ; C.2 方法 C.2.1 动物的取材用无菌棉签采取树鼩肛拭子, 或新鲜粪便 C.2.2 检测流程氧化酶试验阴性 痰 血液 粪便等 血琼脂平板呈蔓延生长 麦凯恩琼脂平板呈无色菌落 仪器的鉴定或手工生化鉴定并做药敏实验 变形杆菌属 图 1 检测流程图 C.2.3 形态与染色革兰阴性菌落 C.2.4 培养特性在血琼脂平板上 35 C 培养 18-24h, 可蔓延成波纹状薄膜, 布满整个平板表面 ( 迁徙现象 ); 在 SS 平板上为无色透明中心黑色或灰色 中等大小菌落 ; 在麦凯恩琼脂平板上形成圆形 扁平 无色半透明的菌落 C.2.5 生化反应氧化酶试验阴性, 发酵葡萄糖和蔗糖, 不发酵乳糖 肌醇和甘露醇,KCN 生长 动力 H2S 脲酶和苯丙氨酸脱氨酶试验均为阳性,TSI 为 K/A 11

12 C.2.6 鉴别要点 C 本菌属特征 血琼脂平板上菌落呈迁徙生长,SS 平板上为无色透明中心黑色或灰色 中等大小菌落 ; 脲酶 H2S 苯丙氨酸脱氨酶试验均为阳性 C 变形杆菌种间的鉴别见表 1 表 1 变形杆菌种间的鉴别 菌名 VP H2S 吲哚 脲酶 鸟氨酸 麦芽糖 苯丙氨酸 奇异变形杆菌 普通变形杆菌 潘氏变形杆菌 产黏变形杆菌 C.2.7 操作步骤 C 氧化酶试验 将滤纸片浸泡于 1% 盐酸四甲基对苯二胺试剂中制成试剂纸片, 取菌涂于试剂纸上, 细 菌在与试剂接触 10 秒内呈深紫色, 则为阳性 C 鉴定 从麦凯恩琼脂平板上挑取可疑菌落, 用微生物鉴定仪 ( 参见 仪器操作作业指导书 ) 或传统生化反应进行细菌鉴定 12

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