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胜衲文
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1 2526 论著广西壮族类风湿关节炎患者 HLA-DR 基因表达及其与临床指标的相关性研究揭旭日, 王小超, 陆翔, 黄丹, 吕丽娜, 李红文摘要目的了解广西壮族类风湿关节炎 (RA) 患者 HLA-DR 基因的表达情况, 探讨 RA 患者 HLA-DR 基因的表达与抗环瓜氨酸肽 (CCP) 抗体类风湿因子 (RF) C 反应蛋白 (CRP) 的相关性方法选取 2008 年 1 月 2013 年 2 月右江民族医学院附属医院风湿科收治的广西壮族 RA 患者 49 例为 RA 组, 另选取同时期本院体检健康的广西壮族成年人 54 例为对照组, 采用序列特异性引物 - 聚合酶链式反应 (SSP-PCR) 法检测 HLA-DR 基因表达, 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测抗 CCP 抗体, 免疫比浊法检测 RF CRP 水平结果 RA 组抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平高于对照组 (P<0 05) 两组均可检测出 DRB1 03 DRB1 04 DRB1 08~DRB1 17 DRB3 01 DRB4 01 DRB5 01 亚型 ;RA 组 DRB1 10 DRB4 01 阳性表达率均高于对照组 (P<0 05); 两组其余 13 个亚型阳性表达率比较, 差异均无统计学意义 (P>0 05) DRB1 10 阳性 RA 患者与 DRB1 10 阴性 RA 患者 DRB3 01 阳性 RA 患者与 DRB3 01 阴性 RA 患者 DRB4 01 阳性 RA 患者与 DRB4 01 阴性 RA 患者 DRB5 01 阳性 RA 患者与 DRB5 01 阴性 RA 患者抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较, 差异均无统计学意义 (P>0 05) 结论广西壮族 RA 患者 HLA-DR 基因 DRB1 10 DRB4 01 亚型可能为易患基因, 但 DRB1 10 DRB3 01 DRB4 01 DRB5 01 的阳性表达均与抗 CCP 抗体 RF CRP 无相关性关键词关节炎, 类风湿 ;HLA 抗原 ; 类风湿因子 ;C 反应蛋白质中图分类号 R 文献标识码 A doi: /j isn 揭旭日, 王小超, 陆翔, 等广西壮族类风湿关节炎患者 HLA-DR 基因表达及其与临床指标的相关性研究 [J]. 中国全科医学,2015,18(21): [www chinagp net] JieXR,WangXC,LuX,etal HLA-DRgeneexpresionofZhuangethnicpatientswithrheumatoidarthritisandits corelationwithclinicalindicators[j].chinesegeneralpractice,2015,18(21): HLA-DRGeneExpresionofZhuangEthnicPatientsWithRheumatoidArthritisandItsCorrelationWithClinical Indicators JIE Xu-ri, WANG Xiao-chao, LU Xiang, etal Youjiang MedicalUniversityforNationalities, Baise ,China Abstract Objective ToexploretheHLA-DRgeneexpresionofZhuangethnicpatientswithrheumatoidarthritis (RA)andinvestigateitscorelationwithanti-cycliccitrulinatedpeptide(CCP)antibody,rheumatoidfactor(RF)andC- reactiveprotein(crp) Methods 49ZhuangethnicpatientswithRAwhoreceivedtreatmentintheDepartmentofRheumatism oftheafiliatedhospitalofyoujiangmedicaluniversityfornationalitiesfrom January2008toFebruary2013astheRA group Andanother54Zhuangethnichealthyadultswhoreceivedphysicalexaminationinthesamehospitalduringthesameperiod wereenroledasthecontrolgroup PCR-SSPmethodwasusedtodetectHLA-DRgeneexpresion,ELISAwasemployedto detectanti-ccpantibody,andimmunoturbidimetrywasusedtodetectthelevelsofrfandcrp Results TheRAgroupwas higherinpositiverateofanti-ccpantibodyandthelevelsofrfandcrfthanthecontrolgroup(p<0 05).NotedDRB1 03,DRB1 04,DRB ,DRB3 01,DRB4 01andDRB5 01inbothgroups,andRAgroupwashigher(P< 0 05)thancontrolgroupinthepositiveexpresionratesofDRB1 10andDRB4 01;thetwogroupswerenotsignificantly diferent(p>0 05)inthepositiveexpresionratesoftherest13genesubtypes Nosignificantdiferences(P>0 05)were notedinthepositiverateofanti-ccpantibodyandthelevelsofrfandcrfbetweendrb1 10positivegroupandDRB1 10 negativegroup,betweendrb3 01positivegroupandDRB3 01negativegroup,betweenDRB4 01positivegroupandDRB4 基金项目 : 广西教育厅课题 (200710LX134,200701LX111) 作者单位 : 广西百色市, 右江民族医学院通信作者 : 陆翔, 广西百色市, 右江民族医学院 ; @126 com

2 negativegroupandbetweenDRB5 01positivegroupandDRB5 01negativegroup Conclusion DRB1 10andDRB4 01maybethesusceptiblegenesinZhuangethnicpatientswithRA,whilethepositiveexpresionsofDRB1 10,DRB3 01, DRB4 01andDRB5 01havenocorelationwithanti-CCPantibody,RFandCRP Keywords Arthritis,rheumatoid;HLAantigens;Rheumatoidfactor;C-reactiveprotein 人类白细胞抗原 (HLA) 是一个高度多态性的复合体,HLA-DR 为经典的 Ⅱ 类基因, 由于其基因高度多态性, 多种疾病与 HLA-DR 有着密切关联类风湿关节炎 (RA) 是一种慢性自身免疫性疾病, 其发病与免疫紊乱遗传及环境因素有关研究表明,HLA-DR 基因亚型与 RA 在不同种族和地域存在程度不一的相关性 [1] 本研究对广西壮族 RA 患者的 HLA-DR 基因进行检测, 了解其基因亚型分布情况, 并探讨 HLA-DR 基因与临床指标的相关性 1 资料与方法 1 1 临床资料选取 2008 年 1 月 2013 年 2 月右江民族医学院附属医院风湿科收治的广西壮族 ( 三代均为壮族家系并居住在广西, 与其他民族无通婚史 ) RA 患者 49 例为 RA 组, 其中男 18 例, 女 31 例 ; 年龄 15~72 岁, 平均年龄 (47 0±5 6) 岁 ; 病程 4~216 个月, 平均病程 45 9 个月无慢性心肺疾病无肝肾功能损害, 无其他自身免疫性疾病及肿瘤病史 9 例患者有关节疼痛家族史, 既往无特殊病史 RA 诊断主要依据 1987 年美国风湿病学会 (ACR) 标准 [2] 另选取同时期本院体检健康广西壮族 ( 三代均为壮族家系并居住在广西, 与其他民族无通婚史, 与 RA 组患者无亲戚关系 ) 成年人 54 例为对照组, 其中男 28 例, 女 26 例 ; 年龄 18~66 岁, 平均年龄 (42 0±4 5) 岁两组性别及年龄具有均衡性受试者均知情同意 1 2 仪器与试剂 ABI9700 聚合酶链式反应 (PCR) 扩增仪由美国 PE 公司提供, 电泳槽由美国 Texas BioGene 公司提供, 凝胶成像系统由北京市亚力恩机电技术研究所提供,IMMAGE 全自动蛋白分析仪由美国 BECKMAN-Coulter 公司提供, 电泳仪由美国 BIORAD 公司提供, 宝特 ELX-800 酶标仪由立陶宛 Fermentas 公司提供,Morgan TM HLA-DR4 序列特异性引物 (SSP) 分型试剂盒由美国 TexasBioGene 公司提供,EZHigh TM DNA 提取试剂盒由美国 TexasBioGene 公司提供, HLA-DR 位点试剂盒由德国 PROTRANS 公司提供, 抗环瓜氨酸肽 (CCP) 抗体试剂盒由 IMTEC 公司提供, 类风湿因子 (RF) 试剂盒由北京利德曼生化股份有限公司提供,C 反应蛋白 (CRP) 试剂盒由上海科华生物生化股份有限公司提供,IMMAGE 全自动蛋白分析仪由美国 BECKMAN-Coulter 公司提供 1 3 HLA-DR 基因检测清晨空腹采集外周血 2ml, 置欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍本研究创新点 : 类风湿关节炎 (RA) 是一种晚期致残的常见慢性自身免疫性疾病,HLA-DR 基因与 RA 的遗传易患性有关, 但不同地域不同民族易患性不同中国汉族人群 HLA-DR 基因 DRB 与 RA 关联性最强亚洲多个国家 RA 患者在 HLA-DR 基因 B DRB DRB 和 DRB 与健康者比较有较高的易患性 HLA-DR 不仅与 RA 易患性有关, 在预后判断和病情评估方面亦有重要价值最近, 国内也有一些不同民族 RA 患者遗传易患性的研究, 但作为中国最大的少数民族壮族未见有相关报道本研究采用序列特异性引物 - 聚合酶链式反应 (SSP-PCR) 法对广西壮族 RA 患者 HLA-DR 基因进行研究, 结果发现, RA 患者 HLA -DR 基因 DRB1 10 DRB4 01 阳性表达率高于对照组 HLA-DR 基因亚型阳性表达与抗环瓜氨酸肽 (CCP) 抗体类风湿因子 (RF) C 反应蛋白 (CRP) 未见相关性提示广西壮族 RA 患者 HLA-DR 基因 DRB1 10 DRB4 01 亚型可能为遗传易患基因, 但 HLA-DR 与临床指标未见相关性研究结果从基因水平上探索广西壮族 RA 患者 HLA-DR 基因遗传易患性, 丰富了 RA 人群遗传易患性的资料, 为壮族人群 RA 的早期预防和个体化治疗提供了临床研究基础于乙二胺四乙酸 (EDTA) 抗凝管中提取 DNA, 采用酚欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍 - 氯仿抽提法, 严格按照全血 DNA 快速提取试剂盒说明书操作 PCR 扩增 :HLA-DR 基因特异性扩增采用 SSP-PCR 法进行, 扩增的序列特异性引物设计与合成根据 1995 年公布的 HLA-Ⅱ 类等位基因核苷酸序列设计 [3], 共设计 DRB1 01~DRB1 17 DRB3 01 DRB4 01 DRB5 01, 由北京圣泰华生物技术有限公司提供严格按照试剂盒要求进行 PCR 反应体系混合物的配置, 并建立扩增反应条件 PCR 程序 : 将以上反应体系于 96 预热 1min 后进行以下循环 :96 变性 25s,70 退火 50s,72 延伸 45s, 共 5 个循环 ; 96 变性 25s,65 退火 50s,72 延伸 45s, 共 21 个循环 ;96 变性 25s,55 退火 50s,72 延伸 120s, 共 4 个循环 ; 最后终止于 4 扩增产物的检测 : 将 PCR 扩增产物转至 2% 琼脂糖凝胶中水平电泳,

3 2528 紫外灯下观察, 根据电泳出现的条带对照 Marker 确定等位基因 1 4 抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平检测清晨空腹采集外周血 6ml, 其中 3ml 采用 4000r/min 离心 10 min( 离心半径 30cm), 保存于 -80 冰箱待检测抗 CCP 抗体阳性率 : 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法, 酶标仪检测 450nm 处吸光度 (OD 值 ), 以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线, 抗 CCP 抗体 > 15 为阳性, <15 为阴性另 3ml 外周血检测 RF CRP 水平 : 加入相应试剂盒后, 采用免疫比浊法通过 IMMAGE 全自动蛋白分析仪自动检测 1 5 统计学方法采用 SPSS11 5 统计学软件进行数据处理, 计数资料比较采用四格表的 χ 2 检验 ; 计量资料以 (x±s) 表示, 两组间比较采用 t 检验以 P<0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 对照组与 RA 组 HLA-DR 基因检测情况两组均可检测出 DRB1 03 DRB1 04 DRB1 08 ~ DRB1 17 DRB3 01 DRB4 01 DRB5 01 亚型, 两组各 15 个亚型均未检测到 DRB1 01~DRB1 02 DRB1 05~DRB1 07 亚型其中对照组与 RA 组 DRB1 10 DRB4 01 阳性表达率比较, 差异均有统计学意义 (P<0 05); 其余 13 个亚型阳性表达率比较, 差异均无统计学意义 (P>0 05, 见表 1) 2 2 对照组与 RA 组抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较对照组与 RA 组抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0 05, 见表 2) 2 3HLA-DR 基因亚型阳性 RA 患者与 HLA-DR 基因亚型阴性 RA 患者抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较 DRB1 10 阳性 RA 患者与 DRB1 10 阴性 RA 患者 DRB3 01 阳性 RA 患者与 DRB3 01 阴性 RA 患者 DRB4 01 阳性 RA 患者与 DRB4 01 阴性 RA 患者 DRB5 01 阳性 RA 患者与 DRB5 01 阴性 RA 患者抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较, 差异均无统计学意义 (P>0 05, 见表 3) 3 讨论 RA 以慢性多发性关节滑膜炎为主要特点, 病情可反复迁延不愈, 成为晚期致残的一种自身免疫病遗传易患基因在 RA 发病中的作用已得到共识研究表明, 我国汉族 RA 易患性与 HLA-DR4 基因相关, 尤其 DRB DRB 亚型, 国内大部分报道与北方汉族相似 [4] 壮族作为中国最大的少数民族, 其 RA 患者的 HLA-DR 基因表达未见相关报道为了解广西壮族 RA 患者 HLA-DR 基因表达情况及其与临床指标的相关性, 本研究采用 SSP-PCR 法检测广西壮族 RA 患者 HLA-DR 基因表达情况表 1 对照组与 RA 组 HLA-DR 基因亚型阳性表达率比较 n(%) Table1 ComparisonofthepositiveexpresionrateofHLA-DRgenesubtypesbetweencontrolgroupandRAgroup 例数 DRB1 03 DRB1 04 DRB1 08 DRB1 09 DRB1 10 对照组 54 7(13 0) 47(87 0) 6(11 1) 48(88 9) 1(1 9) 53(98 1) 2(3 7) 52(96 3) 1(1 9) 53(98 1) RA 组 49 6(12 2) 43(87 8) 11(22 4) 38(77 6) 3(6 1) 46(93 9) 6(12 2) 43(87 8) 7(14 3) 42(85 7) χ 2 值 a 1 56 a 3 94 a P 值 DRB1 11 DRB1 12 DRB1 13 DRB1 14 DRB1 15 对照组 3(5 6) 51(94 4) 8(14 8) 46(85 2) 6(11 1) 48(88 9) 12(22 2) 42(77 8) 23(42 6) 31(57 4) RA 组 1(2 0) 48(98 0) 6(12 2) 43(87 8) 4(8 2) 45(91 8) 12(24 5) 37(75 5) 15(30 6) 34(69 4) χ 2 值 0 17 a a P 值 DRB1 16 DRB1 17 DRB3 01 DRB4 01 DRB5 01 对照组 22(40 7) 32(59 3) 2(3 7) 52(96 3) 27(50 0) 27(50 0) 10(18 5) 44(81 5) 44(81 5) 10(18 5) RA 组 22(44 9) 27(55 1) 2(4 1) 47(95 9) 22(44 9) 27(55 1) 19(38 8) 30(61 2) 34(69 4) 15(30 6) χ 2 值 a P 值注 : a 为校正 χ 2 值 ;RA= 类风湿关节炎

2529 表 2 对照组与 RA 组抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较 Table2 Comparisonofthepositiverateofanti-CCPantibodyandthe levelsofrfandcrpbetweencontrolgroupandragroup 抗 CCP 抗体 n(%) 例数 RF(U/ml) CRP(mg/L) 对照组 54 2(3 7)

4 2529 表 2 对照组与 RA 组抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较 Table2 Comparisonofthepositiverateofanti-CCPantibodyandthe levelsofrfandcrpbetweencontrolgroupandragroup 抗 CCP 抗体 n(%) 例数 RF(U/ml) CRP(mg/L) 对照组 54 2(3 7) 52(96 3) 4 7± ± 1 4 RA 组 49 33(67 3) 16(32 7)454 7± ±55 7 χ 2 (t) 值 a 4 48 a P 值 <0 001 <0 001 <0 001 a 为 t 值注 :CCP= 环瓜氨酸肽,RF= 类风湿因子,CRP=C 反应蛋白 ; 表 3 HLA-DR 基因亚型阳性 RA 患者与 HAL-DR 基因亚型阴性 RA 患者抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平比较 Table3 Comparisonofthepositiverateofanti-CCPantibodyandthe levels ofrf and CRP between RA patients with positive HLA-DR gene subtypes and RA patients with negative HLA-DRgenesubtypes 基因亚型例数抗 CCP 抗体 n(%) RF(U/ml) CRP(mg/L) DRB1 10 阳性 7 7(100 0) ± ±13 7 DRB1 10 阴性 42 26(61 9) 16(38 1) 433 7± ±60 6 χ 2 (t) 值 a 1 58 a P 值 DRB3 01 阳性 22 15(68 2) 7(31 8) 542 4± ±60 8 DRB3 01 阴性 27 18(66 7) 9(33 3) 397 8± ±52 4 χ 2 (t) 值 a 0 52 a P 值 DRB4 01 阳性 19 12(63 2) 7(36 8) 421 8± ±55 5 DRB4 01 阴性 30 21(70 0) 9(30 0) 482 8± ±56 7 χ 2 (t) 值 a 0 20 a P 值 DRB5 01 阳性 34 22(64 7) 12(35 3) 403 9± ±55 8 DRB5 01 阴性 15 4(26 7) 11(73 3) 569 8± ±56 5 χ 2 (t) 值 a 0 65 a P 值注 : a 为 t 值我国人群 RA 的易患基因已有较多报道, 谭立明 [5] 等研究发现,HLA-DR4 HLA-DR53 基因与自身抗体间存在高度一致, 认为 HLA-DR4 HLA-DR53 基因 [6] 与 RA 关联性较强薛愉等进行 RA 基因分型 Meta 分析发现, HLA-DR 4 和 HLA - DQB HAL-DQB 相连锁是中国汉族人群 RA 的危险 [7] 基因型罗采南等研究新疆哈萨克族汉族 RA 患者 HLA-DR4 等位基因表达, 结果显示,HLA-DR4 在哈萨克族 RA 患者基因频率为 54 1%, 为主要的易患基 [8] 因李英进一步的研究发现,HLA-DR4 基因阳性的 RA 患者骨及关节骨质破坏骨质疏松更明显, 关节腔血管翳更丰富本研究结果显示,49 例广西壮族 RA 患者有 15 个 HLA-DR 基因亚型表达, 其中以 DRB5 01 DRB3 01 DRB1 16 DRB1 15 阳性表达率较高, 以 DRB1 11 DRB1 17 阳性表达率较低, 但与对照组比较无差异, 不同于我国人群 RA 患者 HLA-DR 基因分型特点 [6,9], 提示不同地域和种族 RA 患者遗传特异性有所不同本研究中 RA 组 DRB1 10 DRB4 01 阳性表达率高于对照组, 表明 DRB1 10 及 DRB4 01 可能为广西壮族 RA 患者的易患基因但本研究未发现广西壮族 RA 发病的保护基因, 可能为壮族人群在 HLA-DR 基因亚型中无保护基因, 亦或为本研究样本量较少基因检测的分辨率相对较低或和地域分布有关 RA 患者早期体内就可以产生自身抗体, 如抗 CCP 抗体抗核抗体 (ANA) 抗角蛋白抗体 (AKA) anti-sa 和动物蛋白因子 (APF) [10-11], 抗 CCP 抗体可作为早期 RA 或 RF 阴性不典型 RA 的诊断指标之一 [12], 近年研究还认为, 其与病情进展及预后有关 [13-14] 已有研究表明,HLA-DR 基因 DRB 亚型与抗 CCP 抗体具有关联性, 认为 DRB 阳性 RA 患者抗 CCP 抗体阳性率高于 DRB 阴性患者 [9] 但也有学者认为,HLA-DR 易患基因如 DRB DRB DRB1 09 与抗 CCP 抗体的产生无相关性 [15] 本研究结果显示,HLA-DR 基因亚型分布与临床指标抗 CCP 抗体阳性率 RF CRP 水平未发现相关性, 表明 DRB1 10 DRB4 01 易患基因与病情活动及病情轻 [15] 重可能不存在关联性, 与蒋真等报道相似近年来, 由于 RA 基因易患性的研究越来越深入, 部分地区的部分基因亚型阳性 RA 与骨关节骨质破坏病情的严重程度有关 [8], 目前靶向治疗是 RA 治疗研究的热点和有望达到更好的治疗疗效的一类治疗方法 [16-17], 由于 RA 患者不同地域和种族遗传特异性不同, 研究哪些基因为广西壮族 RA 患者的易患基因, 哪些为保护基因, 哪些基因还与疾病的严重程度和关节外表现呈明显的相关性, 值得增大样本量进一步研究探讨针对易患基因, 是否通过研究相应的靶向治疗药物, 直接封闭这些基因以达到治疗的目的? 而针对保护基因, 是否通过促炎因子免疫细胞和信号转导通路等分子靶向治疗药物的炎症抑制作用, 对这些保护基因加以保护呢? 以上均值得进一步研究探讨参考文献 [1]TanLM,QueQH,PengWH,etal AsociationstudyofHLA-DR genewiththesusceptibilitytorheumatoidarthritisin JiangxiHan population[j]. ImmunologicalJournal,2010,26 (6):555-

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