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甭韶
5 years ago
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1 化痰通络方对刺激的滑膜成纤维细胞增殖及 # 和的影响徐振兴陈进春邱明山滕菁徐明摘要目的探讨化痰通络方对刺激的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞 ) 2 ) 3 3 4! 5 6 6! 3 ' 7 增殖及肿瘤坏死因子 # 和酸性成纤维细胞生长因子 ! ) 5. 分泌的影响方法体外培养 ' 7 细胞株加入终浓度为 & +1 的 %%$ ) 以 ' 法检测 ' 7 增殖率然后选择 +1 的为诱导剂量为组在此基础上加入终浓度 1 为 &999 的高中低浓度化痰通络方水煎液为高中低浓度化痰通络方组培养 %%$ ) 并设空白对照组比较 ' 7 的增长率 ' 法检测各组 # 和含量 : 检测 # 和 # 表达结果 %%$ ) 时与 +1 比较 & +1 ' 7 增殖率升高 : ; 与 & +1 比较 +1 ' 7 增值率升高 : ; 且 +1 ' 7 增值率高于 +1 : ; %$ ) 时各浓度的 ' 7 增值率高于 % ): ; 与高浓度化痰通络方组比较中低浓度化痰通络方组 ' 7 增殖率降低且中浓度化痰通络方组对刺激的 ' 7 增殖率明显降低 : ; 与空白对照组比较组 %%$ ) 时 # # 表达及含量均升高 : ;& 与组比较除 % ) 低浓度化痰通络方组 # # 表达外 %%$ ) 高中低浓度化痰通络方 # # 表达及含量均降低 : ;& 与高浓度化痰通络方组比较 %%$ ) 时中低浓度化痰通络方 # # 表达升高 % ) 低浓度化痰通络方 # 含量以及 %%$ ) 中低浓度化痰通络方 # 含量升高 : ;& 结论化痰通络方治疗的机理可能涉及抑制 ' 7 的增殖降低 # 和 # 的表达及其蛋白的分泌关键词类风湿关节炎滑膜细胞化痰通络方肿瘤坏死因子酸性成纤维细胞生长因子 ! :! 5 5 ) 2 ) 3 ' 4! 6 6! ) : 2. 5 # 2 ) * + #.) + 3) # / 5!.! 3 + 3! 5 2! ) 3 2. < ! ) ' 06< ) !. )! ) 2 ) 3 3 4! 5 6 6! 3 ' # ! ) 5. 4 " ) 23 ' 7.!!! 8 3.! ! 2 6 " )! 5 5 ' ' ) 5! & +1 5 % 2 %$ ) 3. 4!" ) " +) 22!! ) 5!.. 5 & ! 5 % 2 %$ )" 6! =.! + 8 3!3 3 " )! " 3 5 # ) ' " # * # : " 3! 3 )! ' 7 % ) 2 %$ ) 8! 8 +1 ) & +1 : ; " )! 5 5 ' ) +) 2 +1 ) & +1 : ;" )! 5 5 ' ) +) +1 ) 基金项目国家自然科学基金课题资助项目 # " $%&% 福建省卫生厅中医药课题资助项目 # " ' 作者单位福建中医药大学附属厦门市中医院检验科厦门通讯作者陈进春!& && &!() * +,- ". /0 1

2 中国中西医结合杂志年月第卷第期!" # +1 : ;" )! 5 5 ' ) +) %$ ) ) % ) : ; " 2 8 ) ) ) +) )! 5 5 ' 7 8 3! ! 2! : ; " ! 5 5 ' ! 2. 2 ) 22! : ; " 2 8 ) ) 6! =.! + # * # 2 2 ). 3 8! 4 2 ) + % 2 %$ ) : ; &" 2 8 ) ) + # * # 2 2 ). 3 *. # # * 33 )! % ) 8!! 64 3!! % ) 2 %$ ) : ;&" 2 8 ) ) ) +) # * # ! 2! % ) 2 %$ ) #. )! % ). 3 5 # 2 22! 2! % ) 2 %$ )!!. 3 2 : ;&".! 3 ).) ) 6! 2 ) 6 + ' 7! # * # 2 3 8!! 3 ) 3. " >? 0 /' ) 2 ) ! ! ) 5. 类风湿性关节炎 ) 2 ) 3 是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性自身免疫性疾病主要表现为反复发作的关节疼痛肿胀功能下降等已有研究证据表明患者滑膜成纤维细胞 ' 7 是遭侵犯的关节翳中的主要细胞在相关的关节破坏和炎症反应的引发中起着重要作用在某种意义上 ' 7 的肿瘤样异常增生是区别于其它关节炎的重要特征异常增生的 ' 7 过度分泌细胞因子参与的一系列病例过程因此 ' 7 的增生已成为领域研究的热点之一我院风湿免疫科的中药组方化痰通络方经过动物实验和临床疗效观察发现可明显减轻患 % 者临床症状降低其 & 积分 & 本实验笔者从化痰通络方对 ' 7 的增殖及其分泌 # 和的影响来探讨其治疗的可能机制材料和方法细胞人滑膜成纤维细胞株批号 %$ & &.!!314! 购自美国.!!!. 3 公司药物化痰通络方组成胆南星 + 桃仁 + 白芥子 + 僵蚕 + 白芍 & + 生药购自厦门市中医院中药房方剂以自动电煎药机水煎次合并药液约生物安全柜内以生物膜过滤除菌滤过除菌后分装小袋 % 储存周试剂及仪器试剂 ' 7 专用培养基美国.!!!. 3 公司批号 %& ' ' 试剂盒中国南京凯基生物公司批号 > & (! 美国 4 + 批号 &&./# 第一链合成试剂盒美国 ) 3) >! : 3 * '?7 日本 0?070 批号 $ # 试剂盒中国南京凯基生物公司批号 > 试剂盒中国武汉博士德生物工程研究所批号 > 北京三元基因工程有限公司仪器紫外光度仪日本岛津制作所 %& 普通梯度 : 仪美国 7 公司 8!! )!..! 荧光定量 : 循环仪美国 7 公司 '! 3! : 33 凝胶成像仪美国 70 / 公司! /. % 细胞培养液氮中取出冻存管立即投入温水中迅速晃动直至冻存液完全溶解将细胞冻存悬液转移到离心管内加入约 & 培养液轻轻吹打混匀 $ 1 离心 & 弃上清夜后加入完全培养液吹打混匀将细胞悬液转移到培养瓶内补足培养液进行培养培养瓶中的细胞覆盖率达到 9 时按常规方法胰酶消化后进行细胞传代代的细胞进行实验 & 观察指标及方法 & ' 7 增殖检测采用 ' 法检测细胞增殖细胞消化计数配制成浓度为 & % 个 1 的细胞悬液孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液于培养箱中培养 % ) 弃去培养基 :7' 清洗次用完全培养基稀释药物至所需浓度每孔加入相应的含药培养基将孔细胞培养板置于 &9 0 培养箱中培养 %%$ ) 孔板进行 ' 染色 A %& 测定 0/ 值增长率 A 试验 0/ 值 1 对照组 0/ 值 9 抑制

3 率 A 试验 0/ 值 1 对照组 0/ 值 9 & 对 ' 7 增殖的影响设对照组和组每组个复孔对照组不加干预的 ' 7 组在细胞过夜贴壁后分别加入终浓度为 & +1 的继续培养 %%$ ) 同时观察细胞形态变化比较各组 ' 7 的增长率 & 化痰通络方对 ' 7 增殖的影响分为化痰通络方高中低浓度组细胞过夜贴壁后分别加入终浓度为 &9 9 9 的高中低浓度化痰通络方水煎液继续培养 % )%$ ) 比较各组 ' 7 的增长率在高浓度的化痰通络方作用 %$ ) 后细胞形态仍正常选择高中浓度组观察撤除药物后细胞的生长情况比较撤药后抑制率 & 化痰通络方对刺激 ' 7 增殖的影响实验分 & 组空白对照组不加任何干预的 ' 7 组细胞过夜贴壁后加入终浓度为 +1 的继续培养 % )%$ ) 高中低浓度化痰通络方组细胞过夜贴壁后加入终浓度为 +1 的继续培养 % ) 后分别加入终浓度为 &9 9 9 的高中低浓度化痰通络方水煎液继续培养 %%$ ) 比较各组 ' 7 的抑制率 & # # 及含量检测分组同 & & ' 7 内 # # 检测培养的 ' 7 细胞中提取总 #! : 检测 # # 以 :/ 为内对照未加任何药物的 ' 7 为空白对照计算实验各组值! : 所用引物序列如下南京金斯瑞科技有限公司合成 :/ & & & 6 # & & $ 6 & & 6 反应条件为!! : 3 * '?7 模板./ # 稀释倍引物各 9 / : 水总体积为 & & & & 3 3 % 3 共 % 个循环 & # 含量的检测按试剂盒说明书 ' 法检测 ' 7 细胞上清中 # 含量严格按照说明书说明进行统计学方法采用 ':'' 软件进行分析所有实验均为复孔数据以 * 3 表示多组间均数比较用方差分析多组间均数两两比较用 '#> 检验两独立样本均数比较用检验 : ; & 为差异有统计学意义结果对 ' 7 增殖的影响表 % %$ ) 时与 +1 比较 & +1 ' 7 增值率升高 : ; 与 & +1 比较 +1 ' 7 增值率升高 : ; 且 +1 ' 7 增值率高于 +1 : ; %$ ) 时各浓度 ' 7 增值率高于 % ): ; 表对 ' 7 增殖的影响呈剂量和时间依赖性 * 3 +1 ' 7 增值率 9 % % & % & & & && 注与 +1 比较 : ; 与 & +1 比较 : ; 与 +1 比较 : ; 与同浓度 % ) 比较 : ; 化痰通络方对 ' 7 增殖的影响表与高浓度化痰通络方组比较中低浓度化痰通络方组 ' 7 增殖率降低差异有统计学意义 : ; 且低浓度化痰通络方组 ' 7 增殖率低于中浓度化痰通络方组 : ; " 各浓度化痰通络方组 %$ ) ' 7 抑制率均高于同组 % ): ; 表化痰通络方对 ' 7 增殖的影响 * 3 化痰通络方浓度 ' 7 抑制率 9 高 & % $% 中 %$ B & & B 低 B & & B 注与高浓度化痰通络方组比较 B : ; 与中浓度化痰通络方组比较 : ; 与同浓度 % ) 比较 : ; 表化痰通络方对 C 刺激的 ' 7 增殖的影响 * 3 ' 7 抑制率 9 &% $ % 高浓度化痰通络方 % B & $ B 中浓度化痰通络方 %$ & B B 低浓度化痰通络方 $ B % B 注与比较 B : ; 与高浓度化痰通络方组比较 : ; 与中浓度化痰通络方组比较 : ; 与本组 % ) 比较 : ;

4 中国中西医结合杂志年月第卷第期!" # 化痰通络方对刺激的 ' 7 增殖的影响表与高浓度化痰通络方组比较与组比较化痰通络方各浓度组 ' 7 抑制率明显增加 : 与高浓度化痰通络方组比较中低浓度化痰通络方组 ' 7 抑制率降低 : 且低浓度化痰通络方组 ' 7 抑制率低于中浓度化痰通络方组 : 与本组 % ) 比较化痰通络方各浓度组 ' 7 抑制率明显增加 : 组 ' 7 抑制率降低 : % 各组 ' 7 分泌 # # 表达及含量比较表 %& 与空白对照组比较组 %%$ ) 时 # # 表达及含量均升高差异有统计学意义 : ; & 与组比较除 % ) 低浓度化痰通络方组 # # 表达外 %%$ ) 高中低浓度化痰通络方 # # 表达及含量均降低差异有统计学意义 : ; & 与高浓度化痰通络方组比较 %%$ ) 时中低浓度化痰通络方 # # 表达升高 % ) 低浓度化痰通络方 # 含量以及 %%$ ) 中低浓度化痰通络方 # 含量升高差异有统计学意义 : ;& 讨论是一类慢性自身免疫性疾病其具体的发病机制至今尚未完全清楚近年来的研究证据表明 ' 7 在相关的关节破坏和炎症反应的引发中起着重要作用的主要病理特点是滑膜组织的增生其主要原因是滑膜组织内 ' 7 细胞过度增殖造成细胞数量的大量增加体外实验表明 ' 7 的增殖速率要高于非和骨关节炎病人的 ' 7 在部分患者中 ' 7 的肿瘤样增殖出现在炎症细胞聚集之前表明 ' 7 在炎症反应初期发挥着重要功能本研究显示化痰通络方能有效抑制刺激的 ' 7 的增殖细胞因子在病理进程中的作用已较为明确其中 # 的异常表达是的典型特征之一它们在的细胞因子网络中起中心作用与发病机制直接相关能促进滑膜细胞和淋巴细胞的增殖和分化促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素 : 和胶原酶造成关节损伤同时能活化 ' 7 活化的 ' 7 又可以产生 # 和等细胞因子和相关酶类促进炎症免疫进程 # 在活动性中能提高血小板的活性和聚积促进成纤维细胞释放细胞黏附分子在的发病中起着重要作用成纤维细胞生长因子家族是生理功能较广泛的生长因子它们在促进细胞生长组织形成与修复胚胎发育血管形成等方面具有非常重要的作用研究结果表明可提高小鼠皮肤成纤维细胞整合素的表达 " 促进大鼠皮肤成纤维细胞增殖已有研究报道体外培养的 ' 也能够合成并释放大量的并且与相互作用促进 ' 增殖 $ 表 % 各组 # 及 # 相对定量比较 * 3 # # # 空白对照 && 高浓度化痰通络方 % %$ $ % 中浓度化痰通络方 & % 低浓度化痰通络方 & % & 注与对照组比较 : ; & 与组比较 : ; & 与高浓度化痰通络方组比较 : ; & 表 & 各组 # 及含量比较 * 3 # 空白对照 & & %& $ % % $ % 高浓度化痰通络方 % & && &% % 中浓度化痰通络方 % & % 低浓度化痰通络方 $ % 注与对照组比较 : ; & 与组比较 : ; & 与高浓度化痰通络方组比较 : ; &

5 属于中医痹证痹顽痹历节风范畴其基本病机是气血不足肝肾亏损风寒热湿邪痹阻脉络流注关节而闽南地区气候潮湿居民喜食甘凉厚味致机体气机郁滞或阳气衰微不能正常运化水湿津液滞而为痰阻碍气血运行而成顽痹笔者结合历代医家对痰瘀致痹的认识将疏畅气机化痰活血通络作为治疗的思路总结出了化痰通络方并在临床及动物实验上加以实践均取得了一 % 定效果 & 该方由胆南星桃仁白芥子僵蚕白芍五味药组成胆南星为南星经过牛胆汁制专主经络风痰与桃仁共为君药有化痰祛风消肿散结活血化瘀通络止痛之功白芥子温通经脉消肿散结与僵蚕同用可加强胆南星的作用共为臣药白芍具有抗炎镇痛和免疫调节的作用可有效地抑制滑膜细胞分泌等炎症介质对具有确切的疗效本实验以刺激 ' 7 后加入不同浓度化痰通络方水煎液观察化痰通络方对 ' 7 增殖及对其分泌 # 和的影响结果显示化痰通络方能剂量依赖地抑制 ' 7 的增殖而且在体外细胞培养中加入该方出现生长抑制后撤除该方能使细胞增殖速度恢复这提示一定剂量内的化痰通络方对 ' 7 的作用是可逆的也提示该抑制作用是非细胞毒作用显微镜下的细胞形态正常也支持这一观点鉴于是 ' 7 的强刺激因子我们观察了化痰通络方对刺激后的 ' 7 的影响结果显示化痰通络方也剂量依赖地抑制了 ' 7 增殖并在转录和含量上降低了 # 和的分泌这进一步阐明了化痰通络方治疗的作用机制为该方剂的临床应用奠定了一定的基础参考文献 7 = 7 3 '" 6 6! 3! = = 55..!!3 ) 2 ) 3 "! 4 &&" 7 # 3 '" /! ! 3! = " # 4 )! % " 6 / 3! 0!" ' 4! 5 6 6! 3 3 =! 3 2 ) 3 " )! + %& &" % 张怡燕陈进春邱明山等 " 化痰通络方治疗痰瘀痹阻型类风湿关节炎的临床观察 " 中医药通报 % &" & 邱明山陈进春张怡燕等 " 化痰通络方对大鼠胶原诱导性关节炎作用的实验研究 " 北京中医药大学学报 & " )!". 6 ) 2 3 ) 6 3 2< 4 ) ! + * # 2. " 5! 3 $ $ $&" 靳波徐盈斌刘旭盛等 " 6 和对小鼠皮肤成纤维细胞生长及蛋白酶活化受体的影响 " 中国生化药物杂志 $ $" $ ) 3 ) 7 2!" ! ) !.!!3 " ) 3 ) 3 % & & " )? )?!" : 5! ) 6 3! ! 3! = ) +) ! 2. = 3 " :! 2 $ & " 吴华勋陈镜宇汪庆童等 " 白芍总苷对胶原性关节炎大鼠滑膜抑制蛋白的影响与其抑制滑膜细胞增殖的关系 " 中国药理学通报 $ % " 收稿 & 修回 &

中国中西医结合杂志 年 月第 卷第 期!" # +1 : ;" )! 5 5 ' ) +) %$ ) ) % ) : ; " 2 8 ) ) ) +) )! 5 5 ' 7 8 3! ! 2! : ; " ! 5 5 '

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