第六章微生物培养技术及酵动力学

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杉莉费
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2 第一节微生物的分批培养分批培养, 是指在灭菌后的培养基中, 接种某种活的生产菌, 而不再向培养基中加入或移去任何物质 ( 如果是需氧微生物, 则需不但供入氧气 ) 的培养方式稳定期细胞数的对数值 X m 延迟期指数期衰亡期 a b c d 培养时间

4 一微生物生长的不同时期 1 延迟期在设计发酵过程时, 要尽可能缩短生产的周期, 其中包括缩短每批培养时所耗用的延迟时间, 一般应遵循下列规则 : 1 接种菌应尽可能活力强, 用处于指数生长期的青年菌种进行接种 2 用于种子培养的介质和条件, 应尽可能接近生产上使用的发酵液的组成和培养条件 3 建议采用大体积量的菌种, 以避免生长素和激活剂等因素扩散而引起过大的损失

5 2 指数生长期和莫若特方程此时, 微生物的增长速率正比于原有的微生物数, 固有 : dx = µ X dt 经积分后得到 : X ln = µ t X lnx=lnx 0 +μt X= X 0 e μt 或 0 t = µ log X X 0

6 当细胞群体增加一倍时, 所需要的时间 t d 为 : 细胞种类细菌酵母菌霉菌动物细胞植物细胞 ln 2 t d = = µ 不同细胞的 t d µ 值 T d (h) 0.25~1 1.15~2 2~6.9 15~100 24~75

8 发酵动力学研究的主要是菌体生长率和产物合成与各种主要发酵控制变量之间关系的微生物生长动力学和产物合成动力学先在此仅讨论营养物对 μ 的影响, 描绘营养物浓度对微生物生长影响的关系式, 可由莫诺特 (Monod) 公式表示, 营养物浓度 S 对微生物比生长速率 μ 的影响, 并由下式表示 : µ = µ m s K s + s

9 比生长速率 μ 与营养组分浓度之间的关系

10 莫若特式是呈双曲线型式中 :S: 是某限制性营养物的浓度 ; ;μ m 为最大比生长速率 ; K 为常数, 是在 μ=1/2μ m 时的营养物浓度值, K 值一般很小, 故在大多数发酵初期, 均能满足 S>>K S 条件, 于是 μ μ m 为常数, 可获得真正的指数生长, 不同的微生物的 K S 是不同的, 如以葡萄糖为限制性营养物时, 产气肠杆菌的 K S 为 1.0; ; 大肠杆菌为 2.0~ ; ; 酿酒酵母为 25.0 理论上 S 时,,μ μ m, 但实际上是不可能达到的

11 3 稳定期和最大的微生物群体

12 4 衰亡期生物群体死亡, 也遵循指数规律衰减, 即 : X=X e -at m X m 最大细胞浓度 ; α 微生物的比死亡速率 ; t- 进入衰亡期的时间

13 二分批培养中基质的消耗 1 得率系数细胞内的生化反应极其复杂, 总况可用下式表示 : 碳源 + 氮源 + 氧细胞 + 产物 +CO+ 2 +H 2 O 或 : S+ S+ N+ N+ O 2 X+ X+ P+ CO 2 + H 2 O 细胞对于消耗的基质的得率系数可用下式表示 : Y X / S 对于氧的得率系数为 : = Y X S X / O = X O 2

14 微生物一些微生物的 Y X/S 和 Y X/O 基质 g/mol) Y X/S (g/mol Y X/O (g/mol) 产朊假丝酵母葡萄糖乙醇产气克雷伯氏菌啤酒酵母醋酸葡萄糖 70.2 琥珀酸 27.1 葡萄糖甲基单胞菌甲醇粪链球菌葡萄糖 57.6 葡萄糖 21.6 假单胞菌甲醇

15 2 基质消耗速率在分批培养时, 培养液中基质的减少是由于细胞和产物的生成, 根据物料衡算 : ds µ X = 式 1 dt Y X Y X/S - 细胞消耗的基质得率系数如果限制性基质是碳源, 消耗掉的碳源中一部分形成细胞物质, 一部分形成产物, 一部分产生能量供细胞维持生命活动, 即 : ds dt = µ X Y G + mx / S 1 + Y P dp dt Y G - 细胞的生长得率系数,g/mol, m- 细胞的维持系数,mol/g., Y P - 产物得率系数式 2

16 如果用比速率来表示基质消耗或产物生成, 即 : ds 1 ds = Xq s q s = dt X dt 式 3 d P = Xq = p dt X dt 式 4 其中,q, S 和 q p 分别为基质比消耗速率和产物比生成速率, 则上面两个式 1 和式 2 分别可以写作 : q s µ = 式 5 Y q s = µ + m + Y G q p 1 X / S q Y p P dp 式 6

17 若产物生成可以忽略 1, 合并式式 1 和式 2 得到 : m = 1 + 式 7 YX / S YG µ 可用图解法求出 Y G 和 m, 利用连续培养法, 很容易求出 Y X/S 与 μ 的关系, 进而求出 Y G 和 m

18 三产物的生产 1 生长关联型 : 产物的生产速率为 : 如乙醇发酵 dp dx = YP / X dt dt Y P/X - 产物对于细胞的得率系数 2 部分生长关联型 : 如乳酸发酵和柠檬酸发酵 dp dx = α + βx dt dt 如用比速率表示, 则上式可写作 : q P = αµ + β

19 3 非生长关联型 : 如抗生素类的次级代谢产物的发酵 dp dt = q P X kp k- 不稳定产物的失活常数

20 动力学方程研究的意义以上由细胞生长, 基质消耗和产物生成的微分方程构成的微分方程组微分方程组, 反映了分批培养中细胞基质和产物浓度细胞基质和产物浓度的变化, 如果通过实验摸清细胞生长基质消耗和产物生成的规律, 建立适当的微分方程组, 并确定其中的参数值, 就可以对分批培养过程进行模拟, 进而有可能对分批培养进行优化, 使产物的生成效率大大提高

21 第二节微生物的连续培养

22 一连续培养的定义及优缺点 1 定义连续培养就是在发酵过程中, 连续或定时地以一定速度向发酵罐内流加新的培养基, 同时以相同的速度等量排出已培养结束的发酵液, 从而使培养物在发酵罐内近似恒定状态下连续不断地发酵

24 2 优缺点 (1)) 优点 1 高效 : 简化了装料灭菌出料清洗发酵罐等许多单元操作, 从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率 ; 2 自控 : 便于利用各种仪表进行自动控制 ; 3 稳定 : 产品质量较稳定 ; 4 节约 : 节约了大量动力人力水和蒸汽, 且使水汽电的负荷均匀合理

25 (2)) 缺点 1 菌种易于退化 2 易遭杂菌污染 3 新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合, 影响培养和营养物质的利用

26 二连续培养的工艺种类 1.. 均匀混合的生物反应器在这种反应器中, 培养基经搅拌而混合均匀, 反应器中的各部分培养基间不存在浓度梯度这种连续培养装置又可进一步分为恒化器和恒浊器两种

27 (1) 恒化器是一种设法使培养液流速保持不变, 并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置这是一种通过控制某一种营养物的浓度, 使其始终成为生长限制因子的条件下达到的, 因而可称为外控制式的连续培养装置在恒化器中, 一方面菌体密度会随时间的增长而增高, 另一方面, 限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低, 两者互相作用的结果, 出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡

29 (2) 恒浊器是根据培养器内微生物的生长密度生长密度, 并借光电控制系统借光电控制系统来控制培养液流速, 以取得菌体密度高生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器在这一系统中, 当培养基的流速低于微生物生长速度时, 菌体密度增高, 这时通过光电控制系统的调节, 可促使培养液流速加快, 反之亦然, 并以此来达到恒密度的目的因此, 这类培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的

30 通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定使细菌生长连续进行的一种培养方式用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业

31 2,, 活塞流反应器这是一种不均一的管状反应器, 培养基由反应器的一端流入, 而从另一端流出在这种反应器中, 没有返混现象, 因而, 反应器内的培养基呈极化状态, 在其不同的部位, 营养物的成分细胞数目传质效果氧供应和生产量都不相同对于这类反应器, 在其入口处, 加入物料的同时也必须加入微生物细胞通常是在反应器的出口处装一支路, 使细胞返回, 也可以来自另一连续培养装置 ( 种子供应系统 )

32 恒化器 (A) 恒浊器 (B) 和活塞流反应器 (c) 中的连续发酵

33 三微生物的物料衡算对微生物细胞的衡算, 可按下式进行 : ( 细胞进入 )-( 细胞流出 )+( 细胞生长 )-( 细胞死亡 ) =( 细胞积累速率 ) F- 培养液的流量 (m( 3 / 分或 L/ 分 );V- 发酵罐有效体积 (m( 3 );X 0 - 进料中的微生物细胞浓度 ( 个或克 / 升 );X- 出料中微生物细胞浓度 ( 个或克 / 升 );μ - 微生物比生长速率 ;a-; 微生物比死亡速率

34 F 如果 X 0 =0, 且令 D = 上式可简化为 : V dx X( µ - D) = dt 式中 D 称为稀释率 D 是连续培养系统中一个重要参数, 它的倒数, 1 V D = F 即物料在容器内平均停留时间 τ 如果发酵过程进入稳定操作, 培养液中的细胞基质和产物浓度恒定, dx = 0 dt 于是就有 X(μ-D)=0 D)=0, 因为 X 0, 故有 μ=d

35 连续培养的自平衡能力就是指微生物连续培养过程中, 即使系统的稳定操作遭到破坏, 但据它自身的特点, 最终仍能建立稳定例如,D<, D<μ, 则 : dx > 0 dt 稳定操作破坏, 但这时微生物的浓度将随时间而增加, 其结果是导致营养物被微生物大量消耗而含量降低, 由 Monod 方程可知,S, 降低, 微生物的 μ 也随着下降, 直至 μ=d 为止, 在新的条件下, 建立新的稳定 ; 反之也然

36 四限制性营养物的物料衡算营养物的物料衡算 ( 进入 )-( 流出 )-( 消耗于菌体合成 ) =( 营养物积累速率 ) F V 即 : S 0 F µ X - S- V Y = dx dt 或 µ X D(S 0 S ) = Y 式中 :S 0 - 进料中的营养物浓度 ( 克 / 升 );S- 出料中营养物浓度 ( 克 / 升 ) 了 ;Y-; 营养物的收率系数, 即前面所说的 Y X/S, 表明营养物转化为细胞的程度 ( 克细胞或个细胞 / 克营养物 ) dx dt

37 同样, 如为稳定操作, dx dt = 0 则 D(S S)Y=μ =μx, 0- 因稳定操作时,μ=, D, 所以又得 :X=Y(S: 0 -S)

38 五 X S 和 D 之间的关系 S 由 Monod 式 : µ µ = max K s + 在稳定操作时,μ=, μ=d 故可写成 : 此得到稳定操作时,S, 随 D 的变化为 : S = S DK µ max S D D = µ max K s + 又因 X=Y(S 0 -S) S), 可得到微生物浓度 X 与 D 的关系为 : DK X = Y(S0 s ) µ D max S S

39 在连续培养中, 变量很多, 但其中 D 是最基本的, 这不仅因为 D 可通过加料量 F 而任意调节, 更重要的一旦 D 变化, 就会引起 X S μ 等一系列的变化, 直至达到新的稳定状态

40 六冲溃现象 D 0,S 趋向于 0,, 而生物体的浓度则达到最大值 D 值增大, 出现 S 增大,X, 下降的现象, 待稀释率增大至 D μ m 时,S, 迅速增大, 微生物浓度 X 迅速下降, 在某一点处, 生物体的浓度 X 为 0 这种在稳定操作下丧失所有微生物体的现象, 称之为冲溃现象 (Washout( Washout) 其时 X=0, D=D w, 即得到 : S D K Dw = µ w s max 0 0 = 0 故 : µ max Dw K + S0 D w 生产中稀释率的使用极限, 称为极限稀释率或临界稀释率, 一般应操作稀释率要小于 D w S

41 七细胞的最大产量如果连续培养的目的是生产生物体细胞自身, 如生产单细胞蛋白面包酵母, 那么, 该时希望能得到最高的细胞产量在连续培养系统中, 单位体积发酵罐内的细胞产量 P 为 :

42 可见, 生物体细胞的产量 P 也是稀释率 D 的函数, P 随 D 的变化有一最大值, 如取其一阶导数等于零, dp dd =0, 便可得到生物体细胞产量为最大时的稀释率 D M 为 : 生产时我们应选用的操作稀释率 D p, 应是 D p <D w, 并 D p D M, 以获得高产稳产

43 第三节补料分批操作

44 高底物浓度的优缺点提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期, 从而提高发酵的设备利用率容积产量和产物的积累浓度 ; 但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响, 如底物抑制粘度升高引起的传质效率降低如底物抑制粘度升高引起的传质效率降低等尤为严重的是, 微生物的许多次级代谢产物次级代谢产物的产生, 都受高浓度的葡萄糖碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制

45 一补料分批培养 (FBC( FBC) 的定义和优点 1 定义 : 补料分批培养 (fed( fed-batch culture), 又称半连续培养或半连续发酵, 是指在分批培养过程中, 间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法

46 2 FBC 优点 : (1) 可以控制抑制性底物的浓度, 解除或减弱分解产物阻遏作用 (2) 对于耗氧过程, 可以避免在培养过程中耗氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况 (3) 微生物细胞可以被控制在一系列连续的过渡态阶段, 可用来控制细胞的质量 (4) 可以是发酵过程优化

47 二 FBC 的补料方式

48 1 周期补料 : 又称间断补料, 就是每隔一定时间补入一次料 2 恒速补料 : 以固定的速度连续的流加 3 对数和指数补料 : 也就是补料速率分别随时间呈对数关系或指数关系递增 4 反馈控制系统补料 : (1)) 直接方法 (2)) 间接方法 5 无反馈控制补料 :

49 三操作过程特征 F(t) X 0 S 0 F(t) F(t)

50 FBC 操作中, 系统内的培养液体积 V 微生物浓度 X 和营养物浓度 S 等均随时间变化, 稀释率 D 也将按下式减小 : D = V 0 F + Ft 式中 :V: o - 原有培养液的体积 F- 营养物补入速率 t- 补料时间可见, 补料分批发酵是一个不稳定的过程

51 二补料分批物料衡算分批补料操作是一种不稳定的过程, 它的 V X S 等均随时间变化, 如果建立物料衡算式, 物料衡算式 d( VX ) 对微生物是 : = FX 0 + rx V 式 1 dt 对营养物 : d( VS) dt = FS 式中 :r: X =μx;r S =r X /Y o 对总物料 : + r 0 s dv dt V = F 式 2 式 3

52 在 X o =0 的情况下, 式 1 可写成 : d( VX dt ) dv dx = x + V dt dt = µ XV 式 4 合并式 3 和式 4,, 可得 : dx dt F µ maxs = X + V K S s + X 式 5 同样, 对营养物的衡算式 2,, 可简化为 : ds dt = F S) V µ K max ( So s S x + S Y 式 6

53 上述式 3 式 5 和式 6 均是分批补料操作时的数学模型, 如果操作条件及各种动力学参数给定, 经解上述微分方程后, 便可获得罐内 X S V D 等随时间的变化规律

54 本章习题 1 1. 在 25m 3 培养液中, 按 10% % 接种量接种, 已知原接种液中含菌个 /ml, 如果培养后发酵液中的菌体含量需达个 /ml, 求所需的培养时间, 假定在整个培养期间, 均满足 S>>K S 的条件, 已知 μ m =0.7(1/h) ) 2. 设 μ max =1.0(1/ 1/ 时 ),Y= ,K S =0.2 ( 克 / 升 ),S 0 =10( 克 / 升 ), 若操作稀释率 D=0.5(1/ 时 ), 试根据上述本章内容求取 μ S X 以及 D w D m 和最大细胞产量 P M

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第六章 微生物培养技术及酵动力学

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