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圣埋昌
5 years ago
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1 microrna lncrna 和外泌体杨兴林和元生物

2 主要内容第一部分 : ncrna 介绍第二部分 : LncRNA 及 mirna 第三部分 : 病毒载体在 ncrna 研究中的应用特殊性第四部分 : 外泌体

3 第一部分 : ncrna 介绍

4 ncrna 介绍分子生物学中心法则

ncrna 介绍定义 : ncrna noncoding RNA, 非编码 RNA: 不编码蛋白质的 RNA 分类 ( 长度 ): 18-25 nt: 包括 microrna,sirna,pirna 等 20 nt 到 200 nt: 包括 rrna,trna,snrna,snorna,slrna,

5 ncrna 介绍定义 : ncrna noncoding RNA, 非编码 RNA: 不编码蛋白质的 RNA 分类 ( 长度 ): nt: 包括 microrna,sirna,pirna 等 20 nt 到 200 nt: 包括 rrna,trna,snrna,snorna,slrna, SRPRNA 等大于 200 nt: 包括长的 mrna-1ike 的非编码 RNA, 长的不带 polya 尾巴的非编码 RNA 等来源 : II 型启动子 : III 型启动子 : 转录加工产物 : rrna, trna, 部分 microrna microrna, LncRNA microrna, LncRNA

6 常见 ncrna

7 常见 ncrna

8 ncrna 重要性生物学中的 Dark matter -- 普通物质只占宇宙质量 5% 编码蛋白的基因目前不超过 5% 的人类基因组人类蛋白质编码基因数目很可能不超过 20,000 个, 远低于最初估计的 100,000 个 ncrna 有希望最终解释机体复杂度

9 第二部分 : LncRNA 及 mirna

10 mirna 及 LncRNA housekeeping noncoding RNAs :trna rrna snrna regulatory noncoding RNAs: short regulatory noncodingrnas: micrornas, small interfering RNAs(siRNA) and Piwi-interacting RNAs (pirna) LncRNAs

11 mirna mirna 概述 mirna 是一类在真核细胞中广泛存在的小分子单链 RNA, 一般长度碱基. mirna 分子与 Argonaute 蛋白结合成为 RISC 复合体 (RNA-induced silencing complex), 该复合体是 mirna 发挥生物学功能的单位. RISC 复合体根据 mirna 序列不同选择性结合到不同的 mrna 的 3 UTR 区上, 调控目标 mrna 的表达水平 (mrna 水平或者蛋白水平 ). mirna 特点 mirnas 在真核生物中广泛存在, 在植物动物和真菌都有发现. 通常的长度为 21~23 nt, 但在 3 端可以有 1~2 个碱基的长度变化. 成熟的 mirna 5 端有一磷酸基团, 3 端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能 RNA 的降解片段区别开来. 多数 mirna 还具有高度保守性时序性和组织特异性

mirna 重要性 http://www.mirbase.org 作用广泛且复杂.

12 mirna 重要性作用广泛且复杂. 根据 mirbase 数据库在人类基因组中已经发现有超过 2000 种不同的 mirnas, 预计调控至少 30% 以上的基因表达一种 mirna 调控多个靶 mrna 一种 mrna 受到多种 mirna 的调控

13 mirna 重要性 mirnas 参与正常的生理功能 : 在细胞生长和凋亡, 血细胞分化, 同源异形盒基因调节, 神经元的极性, 胰岛素分泌, 大脑形态形成, 心脏发生, 胚胎后期发育等过程中发挥重要作用 mirna 异常表达与多种疾病相关 : 大约 50% 得到注解的 mirnas 在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点 (fragile site) 这说明 mirnas 在肿瘤发生过程中起至关重要的作用.

mirna 的发生 Pol II / 70-100 nt 可长达 1000nt 大约 60% 的 mirnas

14 mirna 的发生 Pol II / nt 可长达 1000nt 大约 60% 的 mirnas 为独立表达,15% 左右的 mirnas 成簇表达, 还有 25% 的 mirnas 位于内含子独立表达的 mirnas

15 mirna 的发生来源于内含子的 mirnas

16 mirnas 与靶目标结合方式

17 mirnas 的 Seed 类型

18 mirnas 的 Seed 类型 Seed 8mer

19 mirna 的作用机制

20 mirnas 的命名规则 1. 确定命名规则之前发现的 mirna, 则保留原来名字, 如 hsa-let-7 2. mirna 成熟体简写成 mir, 再根据其物种名称, 及被发现的先后顺序加上阿拉伯数字, 如 hsamir-21, mmu-mir-21, rno-mir-21; 3. 高度同源的 mirna 在数字后机上英文小写字母 (a,b,c, ), 如 hsa-mir-34a,hsa-mir-34b,hsamir-34c 等 ; 4. 由不同染色体上的 DNA 序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的 mirna, 则在后面机上阿拉伯数字以示区分, 如 hsa-mir-199a-1 和 hsa-mir-199a-2; 5. 通常一个 mirna 前体长度大约为 70~80nt, 很可能两个臂分别产生 mirna 以前的做法是 : 表达水平较高的 mirna 后面不加任何符号, 而表达水平较低的 mirna 后面加上 * 号, 如 rno-mir-9* 有时带 * 的 mirna 就根本不出现而如果没有明显的表达差异, 则以 -5p 和 -3p 分别命名如 hsa-mir-26b-5p 和 hsa-mir-26b- 3p, 分别表明从 hsa-mir-26b 前体的 5 端臂和 3 端臂加工而来的注意 :mirbase 18.0 对 mirna 成熟体的名称进行了大量的修改, 很多带 * 的 mirna 都变成了 -5p 或 -3p 当然, 新名称下面对应有其原来的名称 hsa-mir-21-5p hsa-mir-21-3p hsa-mir-21 hsa-mir-21*

21 LncRNA 长链非编码 RNA(LncRNA) 任何内源细胞内长链 (>200nt) 不编码蛋白的类 mrna 的 RNA 一般正向缺乏大于 100 个氨基酸的 ORF 有实验证据其功能不属于目前已知 RNA 分类 ( 例如 ribosomal, transfer, and small nuclear/nucleolar RNAs) long RNA, large RNA, macro RNA, intergenic RNA, NonCoding Transcripts 等多种命名 2009, Cell 136(4),C.P. Ponting, P.L. Oliver, W

22 Nature Antisense Intronic antisense bidirectional Exon-sense Overlapping intergenic Intron-sense LincRNA(large intergenic) LncRNA with Enhance-like LncRNA 来源

23 LncRNA 功能

24 LncRNA 功能研究进展 Chromatin modification long ncrnas can mediate epigenetic changes by recruiting chromatin remodelling complexes to specific genomic loci. 2007,Cell,Rinn, J. L. et al

25 LncRNA 功能研究进展 Transcriptional regulation The pervasive transcription of enhancers and promoters anticipates a core role for long ncrna in regulating the process of transcription. lncrna-evf2 二氢叶酸还原酶

26 LncRNA 功能研究进展 Post-transcriptional regulation The ability of ncrnas to recognize complementary sequences also allows highly specific interactions that are amenable to regulating various steps in the post- transcriptional processing of mrnas, including their splicing, editing, transport, translation and degradation.

27 与疾病相关的 LncRNA HOTAIR: regulates metastatic progression(2010,nature,gupta RA) antisense ncrna transcribed from the p15 tumour suppressor (2008,Nature,Yu, W. et al) BACE1AS: increased expression in Alzheimer's disease(2008,nat. Med, Laurent G)

28 LncRNA 常见数据库资源

29 第三部分 : 病毒载体在 ncrna 研究中的应用特殊性 Gain-of-funciton Loss-of-function

30 mirna 及 LncRNA 基础研究手段 Gain-of-function: (OverExpression): 过表达载体 Loss-of-function: 基因沉默 (KnockDown):RNAi 基因敲除 (KnockOut) 基因功能研究的基础手段 : 上调和下调目的基因的表达

31 Gain-of-function 理想的基因载体的要求 : 适用范围广 ( 原代细胞, 造血干细胞, 神经干细胞, 处于分化终末的神经元, 肝实质细胞 ) 感染效率高对细胞损伤小能稳定表达, 也能瞬时表达可以进行动物水平的导入使用方便非病毒载体 : 转染试剂病毒载体 : 慢病毒逆转录病毒腺病毒腺相关病毒

32 ncrna 过表达的特点 RNA 为最终产物相对于编码蛋白基因的过表达, 对 RNA 序列的精确性有特殊要求对编码蛋白基因的过表达有影响, 但不是决定性的对 ncrna 异常重要

33 合适病毒载体的选择类型载体容量整合适宜表达水平慢病毒 RNA 病毒 4kb 整合动物, 细胞逆转录病毒 RNA 病毒 4kb 整合动物, 细胞腺病毒 DNA 病毒 5kb 不整合动物, 细胞腺相关病毒单链 DNA 病毒 2.2kb 定点整合动物

34 RNA 病毒的特殊性包膜蛋白质粒包装质粒载体质粒

35 合适病毒载体的选择 mirna 过表达 : mirna 的成熟体最终经过转录后 Drosa,Dicer 酶加工各种病毒载体都适合, 根据实际需要去选择病毒类型

36 mirna 表达载体选择的特殊性

37 mirna 表达载体选择的特殊性 5 Cap AAA + 缺失 WRE 和 Poly(A) 可能会引起 mrna 的不稳定 + mirna 成熟体

38 mirna 表达载体选择的特殊性

39 mirna 表达载体选择的特殊性独立表达 splicing

40 LncRNA 过表达载体的选择 ITR Ad element ITR mcmv Promoter Amp padeno-mcmv-lncrna 4770 bp LncRNA SV40 polya ori loxp mrna

41 LncRNA 过表达载体的选择 AmpR promoter Ampicillin HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE pbr322 origin plenti-cmv-lncrna 7729 bp cppt trunchiv-1 3 LTR CMV promoter WPRE LncRNA mrna

42 LncRNA 过表达载体的选择建议使用 DNA 病毒如果使用慢病毒, 可能需要解释多余的序列是否对功能产生影响

43 Loss-of-function RNAi RNA 水平 ( 不适合 mirna 的应用 ) 可应用于 LncRNA, 但是和普通编码蛋白的 mrna 有差别 Antisense, 适用于 mirna 三种具体的 mirna 封闭方案 : inhibitor, tudrna, sponge 基因敲除 (DNA 水平 ) TALEN, CRISPR/Cas9

44 RNAi 在 LncRNA 的应用 LncRNA 大部分都是定位与细胞核内,RNAi 机制在细胞质效用远远高于细胞核 LncRNA 是具有高度二级结构的 RNA,RNA 的二级结构空间位阻于 sirna 与 LncRNA 的结合 LncRNA 与 DNA 和蛋白相互结合形成复合体, 同样阻止了 RISC 复合体与 LncRNA 的结合效率 LncRNA 在很多细胞类型或者模型中表达丰度很低, 可能会影响干扰效果的判定

45 mirna 的封闭化学合成 mirna inhibitor mirna antagomir (Decoy) 封闭载体

46 mirna 的封闭 2 mirna-binding sites (MBS) TuD RNAs(Tough Decoy RNAs)

47 mirna 的封闭

48 mirna 的封闭 mirna 海绵吸附

60 Targetscan 数据库 mirna 验证实例

62 WT+NC WT+mir-150 MT+Nc MT+mir-150

63 第四部分 : 外泌体

64 外泌体外泌体 (exosome) 是细胞主动向胞外分泌的大小均一的囊泡样小体, 直径为 40~100 nm, 密度 1.10~1.18 g/ml

65 外泌体组成外泌体含有多种分子复合物, 包括蛋白质, 脂质,microRNA 和 mrna, 最常见的外泌体蛋白组成包括膜转运和融合相关蛋白 (Rab GTPases,Annexins,Flotillin 等 ) 多囊泡胞内体产生相关蛋白 (Alix,TSG101 等 ) 分子伴侣 (HSP70,HSP90) 整合素和四跨膜蛋白超家族 (CD63,CD9,CD81,CD82 等 ), 这些成分反映了其生物起源蛋白质, 如 CD9,CD63,CD81,TSG101, Alix 和 HSP70 常见于大多数外泌体中外泌体富含胆固醇, 鞘脂, 神经酰胺, 糖脂 GM3 和含长饱和脂肪酰基的甘油磷脂链

66 外泌体功能携带多种蛋白质 mrna mirna, 参与细胞通讯细胞迁移血管新生和肿瘤细胞生长等过程可能成为药物的天然载体, 应用于临床治疗

68 外泌体靶向细胞的方式 1. 直接与靶细胞的胞膜融合, 同时释放 mrna mirna 进入细胞质 2. 通过内吞作用被靶细胞摄取 3. 识别细胞表面的特异性受体

70 外泌体的获取离心法过滤离心密度梯度离心法免疫磁珠法色谱法

71 外泌体最新研究进展 1. 体内成像证实外泌体体内传递的广泛性 2. 外泌体可作为肿瘤标志 3. 外泌体与肿瘤的转移密切相关 4. 血浆外泌体参与心脏保护 5. 包含 circular RNA 的外泌体 6. 胚胎干细胞外泌体可治疗心梗 7. 外泌体与高血压相关 8. 外泌体参与肿瘤免疫逃逸

72 体内成像证实外泌体体内传递的广泛性 Cell:In Vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior.

73 外泌体可作为肿瘤标志 Nature:Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.

74 外泌体与肿瘤的转移密切相关 Nature: Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.

75 外泌体与肿瘤的转移密切相关 Nature: Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microrna primes brain metastasis outgrowth.

76 外泌体与肿瘤的转移密切相关 Nature Cell Biology: Breast-cancer-secreted mir-122 reprograms glucose metabolism in premetastatic niche to promote metastasis.

77 血浆外泌体参与心脏保护 Journal of the American College of Cardiology : Plasma exosomes protect the myocardium from ischemia-reperfusion injury.

78 包含 circular RNA 的外泌体 Cell Research: Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.

79 胚胎干细胞外泌体可治疗心梗 Circulation Research: Embryonic Stem Cell-Derived Exosomes Promote Endogenous Repair Mechanisms and Enhance Cardiac Function Following Myocardial Infarction.

80 外泌体参与肿瘤免疫逃逸 Journal of Clinical Investigation: Membrane-associated Hsp72 from tumorderived exosomes mediates STAT3-dependent immunosuppressive function of mouse and human myeloid-derived suppressor cells.

81 展望外泌体领域进展主要集中在肿瘤转移肿瘤免疫诊断心血管干细胞方面除此之外外泌体在除肿瘤外的免疫调节靶向给药组织损伤修复基于芯片的外泌体快速检测外泌体形成与分泌机制等方面都有研究发现 PubMed 中统计数据显示,2015 年度外泌体领域论文共 1017 项, 较 2014 年 767 项增长 32.6% 我们有理由相信外泌体领域会有更多重要研究进展

82 谢谢!

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