术有限公司 FISH AFLP 试剂盒说明 利用 2 组 DNA 样品从 64 对 AFLP 引物中 (PstⅠ/MseⅠ)( 表 2) 筛选出扩增图谱清晰的 8 对引物对进行选择性扩增反应, 分 表 2 AFLP 接头和引物序列 别是 P GAA/M CTG,P GAA/M CTT,P GAC/M

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1 迁地保护黄檗群体的遗传多样性评价 闫志峰, 张本刚, 张昭 ( 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所, 北京 ) [ 摘要 ] 目的 : 评价迁地保护黄檗群体的遗传多样性水平 方法 : 利用 8 对荧光引物, 对 10 个迁地保护黄檗群体共计 67 株个体进行 AFLP 分析 结果 : 共扩增 1574 条谱带, 其中多态带 1354 条 ; 黄檗物种水平的遗传多样性高于迁地保护群体水平, 多态位点百分率 PPL 分别是 86 02,41 55, 有效等位基因数 Ne 分别为 ,1 2376,Nei 基因多样性指数 H 分别是 ,0 1400,Shannon 信息指数 I 分别是 , 结论: 初步评价了黄檗迁地保护效果 [ 关键词 ] 珍稀濒危药用植物 ; 黄檗 ; 迁地保护 ;AFLP; 遗传多样性 ; [ 中图分类号 ]R282.5 [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] (2008) 黄檗 PhelodendronamurenseRupr. 为芸香科黄檗属植物, 系第三纪古热带植物区系的孑遗植物 [1], 为常用中药材关黄柏的基源植物 [2], 是我国珍贵的药用和用材树种 曾广泛分布于我国东北的吉林 黑龙江 辽宁等地, 由于长期过量的林木采伐和不合理药材采收, 资源量越来越少, 野生黄檗的生存状况十分严峻, 极易陷入濒危的状态, 在 中国植物红皮书 稀有濒危植物 第 1 册中 [3], 黄檗被列为渐危种, 国家 2 级保护植物 根据作者多年野外调研发现, 野生黄檗多散生分布, 且成年树下很少有实生苗出现, 分布区持续缩小, 因此开展黄檗保护研究已是势在必行 DNA 分子标记技术已广泛用于濒危植物遗传多样性研究 [4,5], 目前在评价迁地保护群体遗传多样性上也有利用 [6] 扩增的限制性片段长度多态性 (amplifiedfagmentlengthpolymorphisms,aflp) [7] 是一种高效的显性遗传标记, 结合了 RFLP 的专一性和 RAPD 技术的随机性 高效性, 是新一代的分子标记技术, 本实验采用荧光标记引物扩增产物在自动测序仪上扫描鉴定 [8], 分析和评价了迁地保护黄檗群体的遗传多样性和保护效果 1 材料与方法 1.1 材料 [ 收稿日期 ] [ 基金项目 ] 国家中医药管理局科学技术研究专项 (04-05ZP07); 北京市教委重点学科共建项目 (XK ) [ 通讯作者 ] 张昭,Tel:(010) ,E mail:zhangzhao1962@ tom.com 在以往迁地保护以及调查研究的基础上 [9,10], 选取来自 10 个地区的黄檗迁地保护群体个体进行实验 ( 表 1) 中国医学科学院北京药用植物园所保护的 7 个迁地保护群体 (THA,THB,JH,Q,W,F, BJ) 及中国科学院植物研究所植物园 ( 南 )(X) 和北京植物园 ( 北 )(Y) 所保护的 2 个迁地保护群体的样品采幼嫩叶片放入自封袋中,-20 迅速冷冻保存 ; 哈尔滨国家森林植物园 (H) 的样品采用 10 倍量的变色硅胶 ( 青岛海洋化工有限公司 )12h 内快速干燥 实验采用北京鼎国生物技术有限公司的 FISH AFLP 试剂盒 表 1 黄檗迁地保护群体的取样情况 种源地 群体编号 采集地 取样数 / 株 通化 THA 中国医学科学院药用植物园 10 通化 THB 中国医学科学院药用植物园 9 抚松 F 中国医学科学院药用植物园 10 蛟河 JH 中国医学科学院药用植物园 6 泉阳 Q 中国医学科学院药用植物园 3 湾沟 W 中国医学科学院药用植物园 5 不详 BJ 中国医学科学院药用植物园 9 不详 Y 北京植物园 6 不详 X 中国科学院北京植物所植物园 4 不详 H 哈尔滨国家森林植物园 总 DNA 制备 [11,12] 本实验称取材料 0 2g, 采用 CTAB 法提取 DNA,0 8% 琼脂糖电泳检测 DNA 纯度 完整性及产量,DNA 质量浓度大约为 50ng μl AFLP 实验 [7] AFLP 方法参照 VOS 等的方法, 其中酶切和连接采用一步法进行, 预扩增反应参考北京鼎国生物技 1121

2 术有限公司 FISH AFLP 试剂盒说明 利用 2 组 DNA 样品从 64 对 AFLP 引物中 (PstⅠ/MseⅠ)( 表 2) 筛选出扩增图谱清晰的 8 对引物对进行选择性扩增反应, 分 表 2 AFLP 接头和引物序列 别是 P GAA/M CTG,P GAA/M CTT,P GAC/M CTT, P GAC/M CAC,P GTT/M CAA,P GTT/M CAC,P GTT/M CTG,P GTT/M CTT DNA 接头和引物核苷酸序列备注 PstⅠ 接头 1 5 CTCGTAGACTGCGTACATGCA 3 连接接头 PstⅠ 接头 2 5 TGTACGCAGTCTAC 3 连接接头 MseⅠ 接头 1 5 GACGATGAGTCCTGAG 3 连接接头 MseⅠ 接头 2 5 TACTCAGGACTCAT 3 连接接头 PstⅠ 引物 PstI 预扩引物 5 GACTGCGTACATGCAG 3 预扩增 P GAA Primerp GACTGCGTACATGCAGAA 选择性扩增 P GAC Primerp GACTGCGTACATGCAGAC P GAG Primerp GACTGCGTACATGCAGAG P GAT Primerp GACTGCGTACATGCAGAT P GTA Primerp GACTGCGTACATGCAGTA P GTC Primerp GACTGCGTACATGCAGTC P GTT Primerp GACTGCGTACATGCAGTT P GTG Primerp GACTGCGTACATGCAGTG MseⅠ( 蓝色荧光 ) MseⅠ 预扩引物 5 GATGAGTCCTGAGTAAC 3 预扩增 M CAA FAM 标记 MseⅠ 1 5 GATGAGTCCTGAGTAACAA 选择性扩增 M CAC FAM 标记 MseⅠ 2 5 GATGAGTCCTGAGTAACAC M CAG FAM 标记 MseⅠ 3 5 GATGAGTCCTGAGTAACAG M CAT FAM 标记 MseⅠ 4 5 GATGAGTCCTGAGTAACAT M CTA FAM 标记 MseⅠ 5 5 GATGAGTCCTGAGTAACTA M CTC FAM 标记 MseⅠ 6 5 GATGAGTCCTGAGTAACTC M CTG FAM 标记 MseⅠ 7 5 GATGAGTCCTGAGTAACTG M CTT FAM 标记 MseⅠ 8 5 GATGAGTCCTGAGTAACTT 酶切和连接在 0 5mL 离心管中加入 ( 反应体系总体积为 20μL)4μLDNA,2 5μL10 bufer,2 5μLATP(10mmol L -1 ),1μL 接头,2 μlpsti/mseⅠ 内切酶对,1μLT4DNA 连接酶,7 μlaflp Water 混匀离心数秒,37 保温 5h,8 保温 4h,4 过夜 预扩增和选择性扩增预扩增参考 AFLP 试剂盒说明 选择性扩增体系 ( 反应体系总体积为 25μL)2μL 预扩模板,2 5μL10 PCRBufer,0 5 μldntps(10mmol L -1 ),1μLPstIprimer(50ng μl -1 ),1μLMseⅠ primer(50ng μl -1 ),0 5 μltaq(5u μl -1 ), 补足 17 5μLddH 2 O 按下列参数在 GeneAmpPCRSystem9600(PerkinElmer, USA) 进行 PCR 循环, 第 1 个循环扩增参数 :94 30s,65 30s,72 80s; 以后每轮循环温度递减 0 7, 扩增 12 轮 ; 最后按下列参数扩增 23 轮 :94 30s,55 30s,72 80s 扩增产物的凝胶电泳分析取 1μLPCR 产物 +1μL 内标 (GENEMARK500, 红色 ), 在 4% 的变性聚烯酰胺凝胶条件下, 利用 377DNA 自动测序仪电泳 2 4h, 得到清晰的 AFLP 指纹图谱, 在 Gene Scan 软件下自动采集电泳凝胶图 ( 图 1) 数据分析利用 GeneScan R 3 1 软件将 67 个个体,8 对引物产生的电泳凝胶图转化为 0,1 数据矩阵, 采用 NTSYSpc version2 11f 软件包进行结果分析, 根据内标确定片段大小, 计算样品间的 Nei 和 Li 相似性系数 DICE [DICE=2a/(2a+b+c)] [13], 并进行聚类分析 [14] 利用 POPEGENEversion1 32 软件计算如下遗传多样性参数 :1 多态位点百分率 PPL,2 等位基因平均数 Na,3 有效等位基因数 Ne,4Nei 基因多样性指数 H,Shonnon 信息指数 I,Nei 的遗传距离 D [15] 和遗传一致度 I, 并采用 MEGA3 0 软件对遗传距离 D 进行非加权算术平均聚类分析 (UPGMA) 2 结果 2.1 个体遗传相似性系数及其聚类分析利用 NTSYSpcversion2 11 分析软件对 0,1 数据计算出 DICE 相似系数, 进行 UPGMA 聚类分析 其中,W 4 与 THA 8 相似系数最小, 为 , 遗传距离最大 W 2 与 W 5 相似系数最大为 从聚类图上可以看出, 来自同一地区进行迁地保护的个体聚为一类, 如来自抚松 (F) 湾沟 (W) 蛟河 (JH) 泉阳 (Q) 通化 (THA,THB) 哈尔滨森林植物园 (H) 地区的已知群体聚在一起, 遗传距离较近

3 图 1 引物对 P GAC/M CTT 对的扩增结果 群体编号同表 1, 下标为个体编号 2.2 物种和群体水平的遗传多样性扩增片段长度为 50~500bp,67 个黄檗个体经过 8 对荧光引物扩增共得到 1574 条清晰的谱带, 其中多态带 1354 条, 多态位点百分率为 每对引物扩增出 144~193 条多态带, 平均 条, 黄檗的迁地保护群体共有带占总带数的 14 19% 黄檗物种水平 Shannon 信息指数 I=0 3973,Nei 基因多样性指数 H=0 2312, 有效等位基因数 Ne= ( 表 3), 物种水平具有较高的遗传多样性 PPL 是应用很广泛的多样性指标, 在参试群体中, 北京植物园的最高为 52 81%, 泉阳群体的最低为 26 25, 平均多态位点百分率为 Shannon 信息指数 (I) 分析结果显示, 北京植物园的群体最高为 , 泉阳群体最低为 , 平均 Shan non 信息指数 I=0 2113, 有效等位基因数 Ne= 群体遗传分化 Nei 基因多样性指数 (H) 是衡量群体遗传分化最常用的指标之一, 为总的遗传变异中群体间变异 表 3 AFLP 选择性扩增引物产生的条带多态性 ( 群体编号同表 1) 群体编号样本数 PPL/% 观察等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne Nei 基因多样性 H Shannon 信息指数 I F BJ X THB W JH Y Q H THA 群体水平 物种水平 所占的比例 10 个迁地保护群体的 Nei 基因多样性指数为 Y(0 1831)>BJ>THB>F >THA>W > H>JH>X>Q(0 0946) 2.4 群体间遗传一致度 遗传距离和 UPGMA 聚类分析 Nei 的遗传一致度 I 和遗传距离 D 反映了群体间的遗传分化程度 ( 表 4), 群体的遗传一致度在 ~0 9675, 遗传距离在 ~0 1959, 说明群体间的相似程度较高, 遗传距离较小, 其中, 中国医学科学院北京药用植物园来自通化地区的迁地保护群体与哈尔滨森林植物园迁地保护群体之间的遗传距离最小为 , 相似性最高 北京植物 所与中国医学科学院药用植物园来自泉阳群体的遗传距离最大为 , 遗传分化程度较大 根据 10 个群体的遗传距离进行 UPGMA 聚类分析结果显示 ( 图 2),10 个迁地保护群体明显分为两类, 其中北京地区除 Q 和 THA 与 H 聚为一类外, 其他的群体聚为一类 3 讨论 3.1 遗传多样性水平本实验利用 8 对荧光引物共扩增了 1574 条多态带, 多态位点百分率为 86 02, 平均每对引物检测到 个, 说明本实验选择的引物具有很高的多态性 [16], 黄檗物种水平具有较高的遗传多样性, 1123

4 表 4 黄檗迁地保护群体的遗传距离 群体 F BJ X THB W JH Y Q H THA F BJ X THB W JH Y Q H THA 注 : 三角形上为遗传一致度, 下为遗传距离 图 2 10 个迁地保护黄檗群体的 UPGMA 聚类分析图 但迁地保护黄檗比野生黄檗遗传多样性低 (PPL= 92 77,Shannon 信息指数 I=0 4275,Nei 基因多样性指数 H=0 2316, 有效等位基因数 Ne=1 9749) ( 另文报道 ), 这可能与迁地保护个体数量较少有关, 因此要达到有效保护, 还需要进一步增加保护样本数量, 丰富种质圃规模 研究结果表明迁地保护群体内遗传多样性偏低, 黄檗迁地保护群体水平遗传多样性低于濒危植 [5] 物元宝山冷杉的遗传多样性 (PPL=50 96,H= ,I=0 1735), 说明濒危植物黄檗迁地保护群体具有较低的遗传多样性 与迁地保护的金花 [6] 茶相比 (PPL=24 14,I=0 1528) 具有稍高的遗传多样性, 可见黄檗的迁地保护种质圃基本保存了该种的遗传多样性, 但为有效保护黄檗, 还需要进一步比较分析其野生群体的遗传结构, 增加迁地保护样本数量 3.2 遗传结构根据遗传距离的聚类分析结果, 来自各个地区的迁地保护群体分别聚为一类, 说明地理因素对黄檗影响很大 由此推测中国科学院北京植物所 (X) 的群体可能来自抚松地区, 北京植物园 (Y) 的群体 1124 可能来自蛟河或湾沟地区, 而中国医学科学院药用植物园 (BJ) 的成年大树可能部分来自抚松, 部分来自通化, 由于时间久远, 目前没有资料可以查阅, 因此以后迁地保护应该更加重视相关的信息记录 哈尔滨森林植物园 (H) 中国医学科学院药用植物园 THA 中国医学科学院药用植物园 Q 等聚为一类, 与其他类明显分开, 可能与迁地保护时的采样方式和数量有关 3.3 遗传多样性保护了解物种的遗传结构和遗传多样性, 对探讨物种濒危机制 指导迁地保护和引种栽培 自然保护区的规划及评估特定群体的保护价值等有着重要价值 根据本实验结果, 黄檗在物种水平具有较高遗传多样性, 但群体间遗传分化较大, 不同产地黄檗具有不同的遗传特征 因此在进行黄檗的迁地保护时, 应根据地理和植被特点, 在黄檗的自然分布范围内, 选择黄檗分布较集中, 生境具有一定差异, 并且相距较远的长白山 完达山 大兴安岭 小兴安岭 千山以及燕山山脉的云蒙山等不同生态环境的地区采集样本 同时, 充分考虑其遗传结构和道地性因子及品质特征 [17], 进行合理取样, 增大样本数量, 加强黄檗种质资源收集工作, 丰富现有种质圃规模, 对更好地保护黄檗的珍贵种质将会起到很好的效果 [18] 为了使植物园在迁地保护时发挥应有的作用, 应该注重记录和信息管理, 采集保育环境下植物物种 形态 发育 分类 利用 引种 栽培 生态等实物信息, 整合植物园空间固有信息, 以及原产地的生态环境信息, 建立濒危药用植物引种驯化与保护档案记录系统, 指导科研和保护工作的开展 [ 参考文献 ]

5 [1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志 [M]. 北京 : 科学出版社,1997,43(2):100. [2] 中国药典 [S]. 一部.2005:214. [3] 傅立国. 中国植物红皮书 稀有濒危植物 [M]. 第 1 册. 北 京 : 科学出版社,1991:572. [4] 闫志峰, 张本刚, 张 昭, 等.DNA 分子标记在珍稀濒危药用 植物保护中的应用 [J].,2005,30(24):1885. [5] 王 燕, 唐绍清, 李先琨. 濒危植物元宝山的遗传多样性研究 [J]. 生物多样性,2004,12(2):269. [6] 韦 霄, 韦记青, 蒋水元, 等. 迁地保护的金花茶遗传多样性 评价 [J]. 广西植物,2005,25(3):215. [7] VosP,HogerR,BleekerM,etal.AFLP:Anewtechniquefor DNAfingerprinting[J].NucleicAcidsRes,1995,23(21): [8] 杨 凯, 宋 婉, 张春庆, 等. 荧光标记 DNA 扩增片段长度多 态性方法的改进 [J]. 生物化学与生物物理进展,2001,28 (2):256. [9] 杨世林, 张 昭, 张本刚, 等. 珍稀濒危药用植物的保护现状 及保护对策 [J]. 中草药,2000,31(6):401. [10] 张 昭, 张本刚, 朱玉香. 北京地区野生药材的引种驯化及分 析 [J]. 中国植物园,2002,(7):122. [11] DoyleJJ,DoyleJL.ArapidDNAisolationprocedureforsmal quantitiesoffreshleaftisue[j].phytochembul,1987,(19): 11. [12] 邹喻苹, 葛颂, 王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记 [M]. 北京 : 科学出版社,2001:16. [13] NeiM,LiW H.Mathematicalmodelforstudyinggeneticvaria tionintermsofrestrictionendonucleases[j].procnatlacadsci USA,1979,76(10):5269. [14] YehFC,YangRC,boyleT,etal.Theuserfriendlyshareware forpopulationgeneticanalysis[d].edmonton:molecularbiolo gyandbiotechnologycenter,universityofalberta,1997. [15] KumarS,TamuraK,NeiM MEGA3:Integratedsoftwarefor molecularevolutionarygeneticsanalysisandsequencealignment [J].BriefBioinform,2004,5:150. [16] RuselJR,FulerJD,MacaulayM,etal.Directcomparison oflevelsofgeneticvariationamongbarleyaccesionsdetectedby RFLPs,AFLPs,SSRsandRAPDs[J].TheorApplGenet, 1997,95:714. [17] 贡济宇, 赵跃刚, 张皎月, 等. 不同产区关黄柏的质量分析 [J]. 中医药学报,2003,31(4):26. [18] 金燕, 卢宝荣. 遗传多样性的取样策略 [J]. 生物多样性, 2003,11(2):155. Geneticdiversityevaluationofex situconservationpopulationof PhelodendronamurensedetectedbyAFLPmarkers YANZhi feng,zhangben gang,zhangzhao (InstituteofMedicinalPlantDevelopment,PekingUnionMedicalColegeandChineseAcademyofMedicalSciences, Beijing100094,China) [Abstract] Objective:Toevaluatethegeneticdiversityfrom ex situconservationpopulationofphelodendronamurense. Method:Geneticdiversityin67individualsfromex situconservationpopulationofp.amurensewereasesedusingaflptechnique byeightfluorescentlabeledprimergroups.result:theeightprimercombinationsgeneratedatotalof1574bands,ofwhich1354 werepolymorphic.asforp.amurenseatspecieslevel,thepercentageofpolymorphicloci(ppl)was86 02,theefectivenumberof alelesperlocus(ne)was1 4275,theNei'sgenediversity(H)was0 2312,andtheShannon'sinformationindex(I)was Atthepopulationlevel,theestimatesPPL=41 55,H=0 1400,Ne=0 2376andI= Conclusion:Theefectofpresent ex situconservationwaspreliminarilyasesed. [Keywords] rareandendangeredmedicinalplant;phelodendronamurense;ex situconservation;aflp;geneticdiversity [ 责任编辑张宁宁 ]

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