1. 前言采用高性能尺寸排阻色谱法 (GFC 或 SEC) 进行多肽分离, 操作简便, 不仅可用作检测分子量的手段, 还可作为纯化多肽与蛋白质分解产物如多肽片断的方法之一 可与反相色谱法 (RPC) 及离子交换色谱法 (IEC) 联用 同时, 在临床上还通过把 GFC 进行比较, 来推测病程的进展

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1 No.073 TSKgel 色谱柱在尺寸排阻色谱法分离多肽中的应用 目录 页码 1. 前言 1 2. 应用实例 3 3. 总结 6

2 1. 前言采用高性能尺寸排阻色谱法 (GFC 或 SEC) 进行多肽分离, 操作简便, 不仅可用作检测分子量的手段, 还可作为纯化多肽与蛋白质分解产物如多肽片断的方法之一 可与反相色谱法 (RPC) 及离子交换色谱法 (IEC) 联用 同时, 在临床上还通过把 GFC 进行比较, 来推测病程的进展 表 1 所示为 TSKgel 色谱柱在采用 GFC 法进行多肽分离的相关文献及其概要 各著者均对洗脱液进行了细致的分离, 明确了 GFC 法中使用的洗脱液对分离性能与分馏后处理会产生影响 一般情况下, 采用 GFC 法分离多肽所使用的填充剂多为 TSKgel 的 SW 硅胶型填料而非 TSKgel 的 PW 树脂型填料 本报告中, 将针对这些填充剂 (TSKgel G2000SW XL 以及 TSKgel G2500PW XL ) 在多肽分离的应用上进行探讨 另外, 关于反相色谱法 (RPC) 在多肽分离方面具有的高分离性能, 在分离报告 No 中进行了详细的描述, 敬请参考

3 表 1 采用 GFC(SEC) 分离多肽的主要文献 文献编号 色谱柱 样品 分离条件及概要 1 TSKgel G2000SW 尿毒症患者体液中的多肽 50mM 磷酸缓冲液 (ph7.2)+0.3%sds 正常人与患者血清的 GFC 分离对比 2 TSKgel G2000SW 多肽标准品 (MW200~10,000) 0.15M 磷酸缓冲液 (ph7.4)+1mnacl+20% 甲基溶纤剂 +1%SDS 详细研究约 50 种多肽的洗脱效果 3 TSKgel G3000PW 多肽标准品 (MW300~) 0.1%TFA+45% 乙腈研究了 PW 色谱柱对 11 种多肽的洗脱条件 4 TSKgel G2000SW TSKgel G3000SW 多肽标准品 (MW255~) 6M 盐酸胍研究标准曲线的线性 5 TSKgel G2000SW 多肽标准品 (MW255~9,700) 0.1M 甲酸研究多肽的脱盐 6 TSKgel G2000SW 心房利钠肽 10mMTFA+0.2MNaCl+30% 乙腈 3K~5K 13K 活性多肽的分离 7 TSKgel G3000SW 肌钙蛋白 I-CNBr 断片 (MW1,437~4,050) 0.2M 甲酸钠 +6M 尿素 +0.1%TFA 采用可直接导入下一步 IEC 的洗脱条件进行分离 8 TSKgel G2000SW β- 微管蛋白消化物 (3~30 个氨基酸的多 10mM 醋酸铵 (ph6.8) 通过与 RPC 联用进行分离纯化 肽 ) 9 TSKgel G2000SW 多肽标准品及酪氨酸水解产物 0.05M 磷酸缓冲液 (ph2.5)+0.1%tfa+35% 甲醇研究多肽的洗脱条件 10 TSKgel G2000SW TSKgel G3000SW 多肽 蛋白质标准品 0.1%TFA+0.25MNaCl 研究了 37 种样品的分子量 氨基酸残基与洗脱位置的关系 11 TSKgel G2000SW 异常胶原纤维的消化物 10mM 磷酸缓冲液 +6M 盐酸胍 +1mMEDTA 多肽的纯化与分子量的测定 (MW1,535~2,473) 12 TSKgel G2000SW 胶原蛋白 α2(iv) 链消化物 0.1%TFA+ 醋酸铵 GFC+RPC 联用进行多肽纯化 13 TSKgel G2000SW 多肽标准品及肌球蛋白 CNBr 断片 0.1%TFA 或 50mMKH2PO4(pH6.5) +0.5MKCl+8M 尿素等研究多肽的洗脱情况 以及与填充剂的相互作用 14 TSKgel G2000SW β- 内啡肽 β- 促脂素 50mM 磷酸缓冲液 (ph5.8)+20% 乙腈对 RPC 无法分离的多肽采用 GFC 法分离 15 TSKgel G2000SW 6- 磷酸 -2- 激酶的胰蛋白酶消化物 20mM 磷酸缓冲液 (ph6.0)+6m 盐酸胍对含有标记氧化活性部位的多肽实施分离 16 TSKgel G2000SW α- 麦角蛋白消化物 6M 盐酸胍 (ph4.95) 测定 RPC 法纯化后多肽的分子量 (MW300~3,000) 17 TSKgel G2000SW 氨基酸 -trna 合成酶的多肽断片 醋酸 : 乙腈 : 水 =2:3:5 对含有活性部位的多肽进行分离 18 TSKgel G2000SW 人淋巴细胞嗜中性多肽 0.1%TFA 多肽 (10k) 的分离 酸性条件下分离 回收率佳 19 TSKgel G2000SW 乙酰胆碱受体活性部位的多肽断片 10% 醋酸 +8M 尿素亲和标记的多肽断片的纯化 分子量测定 20 TSKgel G2000SW 牛乳清蛋白质的水解物 0.1%TFA+35% 甲醇研究样品水解物对致敏作用的影响 21 TSKgel G2000SW 各类多肽 HPLC 法分离多肽的总论阐述了 GFC RPC IEC 分离模式的对比及其联用等内容 22 TSKgel G2000SW 血红蛋白消化物 10mM 醋酸铵 (ph6.0) 中试规模生产的试样中多肽消化物 (MW1000~22000) 的分离 23 TSKgel G2000SW 人中性粒细胞多肽 (MW3,715) 50mM 甘氨酸 (ph2)+0.1mnacl 通过与 RPC 联用进行纯化, 氨基酸序列分析 24 TSKgel G3000PW Cyt P450scc- 皮质铁氧还蛋白复合体的多肽断片 0.1%TFA+30% 乙腈复合物形成部位的多肽分离纯化, 使用 PW 型色谱柱进行分离

4 2. 实例应用 1) 标准多肽的分离表 2 所示为各多肽标准液的洗脱体积, 图 1 所示为标准曲线 洗脱液采用含有 45% 乙腈的 0.1%TFA 溶液 所有 TSKgel G2000SW XL 的样品洗脱速度均慢于 TSKgel G2500PW XL 同时, 在 TSKgel G2000SW XL 中, 肌球蛋白 (MW17, 800) 进入填充剂的小孔内部, 但在 TSKgel G2500PW XL 中, 肌球蛋白被小孔排阻, 从外水体积中被洗脱 根据其结果, 可认为 TSKgel G2500PW XL 在上述洗脱液条件下的多肽分子量排阻界限推测为 8000, 相比之下, 硅胶型填充剂 TSKgel G2000SW XL, 可适用于从低分子量到高分子量区域更广的范围 另一方面, 如样品分子量低于 3000,TSKgel G2500PW XL 显示的标准曲线与 TSKgel G2000SW XL 几乎趋于相同, 分离范围非常接近 但是, 对比各多肽的洗脱体积, 两者尚存有微妙的区别 ( 尤其是亮氨酸脑啡肽 ), 这是由于在分离过程中样品与填充剂之间的相互作用 ( 离子性 疏水性的相互作用等 ) 而造成的影响 表 2 采用 TSKgel G2500PW XL 与 TSKgel G2000SWxl 的多肽洗脱体积? 洗脱体积 (ml) 多肽标准品 MW 图 1 TSKgel G2500PW XL 与 TSKgel G2000SW XL 的标准曲线 洗脱液 :0.1%TFA+45% 乙腈流速 :1.0mL/min * 完全排阻 洗脱体积 (ml) 色谱柱 :TSKgel G2500PW XL TSKgel G2000SW XL (7.8mm ID X 30cm) 洗脱液 :0.1%TFA+45% 乙腈流速 : 1mL/min 温度 : 25 检测 : UV(215nm) 样品 : 1. 血红蛋白 (17,800) 2. 抑肽酶 (6,500) 3. 胰岛素 (5,807) 4. 大胃泌素 (3,849) 5. 胰高血糖素 (3,482) 6. 胃泌素 (1,619) 7. 物质 P(1,347) 8. 缓激肽 - 增强剂 B (1,182) 9. LH-RH(1,182) 10. 后叶催产素 (1,007) 11. DSIP(848) 12. 亮氨酸 - 脑啡肽 (555) 13. TRH(362) 14. 谷胱甘肽 (307) 15. 四聚甘氨酸 (246) 16. 甘氨酸 (75)

5 图 2 3 所示为 TSKgel G2500PW XL 与 TSKgel G2000SW XL 在分离多肽标准品时的对比图 通过色谱图可以明确的看出,TSKgel G2000SW XL 吸收峰形与分离带的宽度均更佳, 因此其分离性能更为优异 另一方面, 如果多肽的分子量小于 1000, 由于样品与填充剂之间的某些相互作用, 使用 TSKgel G2500PW XL 时的分离效果要高于 TSKgel G2000SW XL 例如图 2 中所示的后叶催产素 (MW1,007) 与亮氨酸 - 脑啡肽 (MW555) 以及图 3 所示的 TRH(MW362) 与甘氨酸 (MW75) 均显示了其分离效果高于 TSKgel G2000SW XL 如上所述, 在整体上,TSKgel G2000SW XL 具有更高的分离效果, 但对于分子量低于 1,000 的多肽样品,TSKgel G2500PW XL 的分离效果会更佳 另外, 由于 TSKgel SW 型硅胶填充剂不具有耐碱性, 如样品需要在碱性条件下进行分离 或使用 NaOH 溶液进行色谱柱清洗时, 请考虑使用 TSKgel PW 型色谱柱 洗脱时间 (min) 图 2 多肽混合物的分离 (1) 色谱柱 : 洗脱时间 (min) 图 3 多肽混合物的分离 (2) 色谱柱 : 洗脱条件 : 同图 1( 流速为 0.7mL/min) 样品 : 1. 抑肽酶 2. 大胃泌素 3. 后叶催产素 4. 胃泌素 5. 亮氨酸 - 脑啡肽 ( 各约 2.5ug/40uL) 洗脱条件 : 同图 1( 流速为 0.5mL/min) 样品 :1 肌球蛋白,2 胰高血糖素,3 LH-RH, 4 TRH,5 甘氨酸

6 2) 蛋白消化物的分离图 4 所示为分离基因重组 ProteinA 的 TRCK- 胰蛋白酶消化物的实例 样品中含有与蛋白质消化物分子量不同的各类多肽 如 2-1) 所示, 由于 TSKgel G2000SW XL 色谱柱的分离范围较宽, 其分离效果也更好 ( 该样品通过 RPC 分析的结果, 可观察到约有 60 种多肽峰在 RPC 下被检测到 可参考分离报告 No.69) 3 总结表 3 所示为采用尺寸排阻色谱法进行多肽分离时,TSKgel 色谱柱产品的不同性能 一般考虑采用 TSKgel G2000SW XL 较为适合, 但考虑到填充剂的耐碱性与多肽的分子量大小等因素, 也可根据情况而选择使用 TSKgel G2500PW XL 或 TSKgel G3000PW XL 表 3. TSKgel 色谱柱在分离多肽中的 ( 尺寸排阻色谱法 ) 性能对比 洗脱时间 (min) 图 4 蛋白质消化物的分离色谱柱 : 洗脱条件 : 同图 1( 流速为 0.2mL/min) 检测 : UV(215nm) A:0.64ABS/FS B:0.32ABS/FS 样品 : 重组蛋白 A-TRCK 胰蛋白酶消化物 (20ug/20ul) TSKgel * 预估值 多肽 蛋白质的分子量区间范围 特征 首选色谱柱分离范围大分离效果好 用于低分子量的多肽样品具有耐碱性 用于高分子量的多肽样品具有耐碱性

7 参考文献

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9 东曹 ( 上海 ) 生物科技有限公司地址 : 上海市徐汇区宜山路 1289 号 B 座 3F, 301 室电话 : 传真 : 电子邮件 :info@tosoh.com.cn 网址 :

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