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热磨堰向
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1 Differex TM 系统原英文技术手册号码 :TBD020 本说明书用于产品 DC6800 和 DC6801 所有的技术文献均可从公司网站得到请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本 I. 介绍 1 II. 产品组成 3 III. 从上皮细胞分离精子 A. 准备消化溶液 B. 差异抽提操作方法 IV. 问题及解决方法 V. 参考文献 6 6 VI. 相关产品 7 I 介绍 1985, Gill 等 (1) 开发了在大量上皮细胞存在的情况下富集精子细胞的方法在没有还原剂的情况下, 上皮细胞经控制裂解后, 通过离心从固体的基质分离完整的精子及含有来源于裂解的上皮细胞 DNA 的缓冲液然后再通过离心沉淀精子及细胞碎片, 除去含有上皮细胞 DNA 的溶液, 但是由于沉淀的松散特性, 依然会有含有上皮细胞 DNA 的溶液的残留为了得到没有上皮细胞 DNA 的精子, 需要多次洗涤及离心尽管费时费力, 这种处理方法在过去将近 20 年的时间里, 也没有重大的改变这种方法打破了除去上皮细胞 DNA 及洗涤过程中精子丢失之间的平衡由于除去上皮细胞 DNA 及精子丢失之间的竞争特性, 检验人员要花费大量的时间用以决定使用样品的量以及洗涤的次数, 因此检验人员的经验水平在决定本分离方法的成功与否方面发挥了重要作用 Differex 系统使用标准的蛋白酶 K 消化并结合相分离与差速离心的方法来分离精子及上皮细胞 DNA 经过标准的蛋白酶 K 消化后, 将样品及缓冲液加入到含有非水, 无毒, 可生物降解的分离溶液的离心管中这种溶液比水溶液的密度大, 并且与水相缓冲液不互溶, 但是比精子的密度小对未标于此处的问题, 请与您当地的办事处或分公司联系进一步的资料可登陆网页第 1 页共 7 页

2 在离心过程中, 精子沉淀于离心管的底部含有上皮细胞 DNA 的水相溶液位于非水相溶液的上方借助于缓冲液的黄色, 很容易将水相溶液除去通常情况下只会残留一薄层水相这种污染通过加入水对残留的 DNA 溶液进行稀释, 很容易除去水与底部的溶液不互溶, 可以轻易地除去而无须多余的离心步骤使用大密度的非水相溶液取代易被组织堵塞的膜, 并且该溶液的非水相特性有助于精子紧紧地沉淀于底部并将细胞碎片与精子沉淀分开当有效的除去含有上皮细胞 DNA 的溶液后, 用 DNA IQ 系统 (Cat.# DC6701) 分离精子 DNA 将含有 DTT 的 DNA IQ 裂解缓冲液加入沉淀中以溶解非水相溶液并裂解精子然后加入 DNA IQ 树脂, 按照 DNA IQ 纯化方法纯化精子 DNA 对于上皮细胞 DNA, 用类似的方法进行纯化, 即加入 2 倍体积的含有 DTT 的 DNA IQ 裂解缓冲液及 DNA IQ 树脂, 然后按照 DNA IQ 纯化方法进行纯化图 1 所示从一个保存 4 年的拭子上分离的 DNA 为模板的扩增结果从向样品中加入含有蛋白酶 K 的消化溶液开始, 包括一个 60 分钟的蛋白酶 K 消化步骤, 从上皮细胞中分离精子总耗时约为 90 分钟 DNA 纯化需要 30 分钟, 所以分离及纯化可以在 2 小时之内完成也可以使用基于苯酚 : 氯仿的方法从分离的上皮细胞及精子中纯化 DNA, 但需要较长的时间 The Differex 系统提供了一种简单高效的用于除去含有上皮细胞 DNA 溶液的方法可以减少操作者之间的误差另外, 因为只需离心一次, 减少了操作过程中精子的损失最后, 标准方法中熟悉的蛋白酶 K 消化依然用于检材的前处理图 1. 对从 4 年前的阴道拭子纯化的 DNA 的分析使用 Differex 系统从保存于室温 4 年的阴道拭子分离精子及上皮细胞使用 DNA IQ 系统从每一部分纯化 DNA 用 PowerPlex 16 系统扩增 DNA( 上皮细胞部分的 1/400 及精子部分的 1/80) 并使用 ABI PRISM 310 遗传分析仪进行分析图 A.FL 通道的结果图 B. JOE 通道的结果图 C. TMR 通道的结果第 2 页共 7 页

3 II. 产品组成产品包装目录号 Differex System 50 个样品 DC6801 非医学检验用途包含足够用于 50 个样品的试剂 : 25ml 消化缓冲液 5ml 分离溶液 2 x 13ml 无核酸酶纯水 1 技术手册产品包装目录号 Differex System 200 个样品 DC6800 非医学检验用途包含足够用于 200 个样品的试剂 : 100ml 消化缓冲液 20ml 分离溶液 * 150ml 无核酸酶纯水 1 技术手册储存条件 : 将所有组分储存于室温 * 分离试剂无毒并且是可生物降解的, 可以在通风良好的房间中, 通风橱外使用 III. 从上皮细胞分离精子当确定处理样品的大小时应遵循以下原则即, 在能获得足量的用于分析的精子 DNA 的前提下, 尽量减少检材量以减少精子部分混有的上皮细胞 DNA 量用户提供的用于差别抽提的材料蛋白酶 K (10-20mg/ml) (Cat.# V3021) 加样头微量离心管 (Promega Microtubes, 1.5ml, Cat.# V1231) DNA IQ Spin Baskets (Cat.# V1221) 微量离心机 56 C 或 37 C 的加热块或烤炉使用 DNA IQ 系统纯化 DNA 时, 用户提供的材料 DNA IQ 系统 (Cat.# DC6701 或 DC6700) 乙醇异丙醇 DTT (Cat.# V3151) 65 C 的加热块或烤炉第 3 页共 7 页

4 A. 准备消化溶液 1. 将蛋白酶 K 加入到消化缓冲液中, 使其终浓度为 270µg/ml 每一个样品需要 0.4ml 消化溶液一旦消化液中加注意 : 蛋白酶 K 的浓度可以依据经验, 根据上皮细胞的数量及检材量入蛋白酶 K, 请不进行调整要保存及重复使用 2. 混合并立即使用 B. 差异抽提操作方法 1. 将含有精子的固体检材置于离心管中 2. 向样品中加入 0.4ml 在章节 III.A 制备的黄色消化液注意 : 可以使用 3. 盖紧离心管盖并高速旋涡震荡 30 秒旋涡震荡时保持离心管垂直将 0.5ml 消化溶液离心管置于 56 C 1 小时或 37 C 2 小时但是, 离心后, 缓冲液的液滴会残注意 : 蛋白酶 K 的浓度及消化时间可以调整留于离心管的管壁这样会导致精 4. 将 100µl 分离溶液加入到一个新的离心管中并将 DNA IQ Spin 子部分存在残留 Basket 置于离心管的顶部的上皮细胞 DNA, 5. 蛋白酶 K 消化后 ( 步骤 3), 从消化溶液中取出固体检材并将其置于步通过第三次洗涤骤 4 准备的 spin basket 中缓缓将剩余的消化液吸入 spin basket 可以消除 ( 第三次 6. 将离心管的盖子盖在 spin basket 上并以最大速度 (14,000rpm) 室温离重复步骤 9 到心 10 分钟离心后, 离心管中将含有微小的, 微黄或白色的精子沉淀 ; 11 ) 澄清的下层分离溶液及黄色的含有上皮细胞 DNA 的上层消化溶液 7. 弃去 spin basket 用 Kimwipe 无尘纸或移液器去除离心管盖处所有不要将分离溶液黄色消化溶液及细胞碎片加入 8. 除去并保留尽可能多的黄色溶液以用于步骤 13 的上皮细胞 DNA 纯到将用于纯化上化有些下层分离溶液有可能与黄色消化溶液一同被吸取皮细胞 DNA 的部分小心不要扰动注意 : 没有必要将所有的液滴从管壁除去液滴可以在洗涤步骤中除去离心管底的微小沉淀 9. 将 500µl 水加于分离溶液的顶部, 洗涤管壁以除去所有黄色缓冲液液滴水与分离溶液即使有一些混合也不会影响结果, 但是要注意不要扰动沉淀 10. 等待 30 秒以上, 然后除去上层水相分离溶液的上层 1/3 及所有的邻近两种溶液界面的细胞碎片这一步洗涤将稀释并除去位于界面及管壁的含有上皮细胞 DNA 的缓冲液 11. 重复步骤 9 和 10, 再洗涤一次第 4 页共 7 页

5 注意 : 在第 9 步中, 第一次洗涤时水的颜色可以显示是否成功地除去了含有上皮细胞 DNA 的黄色缓冲液如果水的颜色澄清并且样品只含有少量的上皮细胞, 则没有必要进行第二次洗涤 12. 分离完成如要从精子部分抽提 DNA, 加入 200µl 或至少 2 倍体积的含有 DTT 的 DNA IQ 裂解缓冲液旋涡震荡分离溶液将完全溶于裂解缓冲液, 精子将裂解加入 7µl DNA IQ 树脂, 混合并按照 DNA IQ 系统 Small Sample Casework Technical Bulletin #TB296 中章节 IV.C, 步骤 4 的方法纯化 DNA 参见注意从步骤 8 收集的上皮细胞 DNA 的纯化向黄色溶液中加入 2 倍体积含有 DTT 的 DNA IQ 裂解缓冲液并混合加入 7µl DNA IQ 树脂, 混合并按照 DNA IQ 系统 Small Sample Casework Technical Bulletin #TB296 章节 IV.C, 步骤 4 的方法纯化 DNA 参见注意 3 注意 : 1. 对于大多数样品,100µl 从步骤 8 收集的黄色溶液即可得到足够用于基因分型的上皮细胞 DNA 如果需要可以从全部的上皮细胞部分纯化 DNA 但是, 因为 DNA IQ 树脂的结合能力的限制 ( ng), 所有过量的 DNA 将会丢失 2. 黄色染料不会影响扩增并且可以在纯化过程中除去 3. 另外, 也可以使用基于苯酚 : 氯仿的方法纯化 DNA 在加入含有去污剂及 DTT 的水溶液之前, 从精子沉淀中除去分离溶液当使用苯酚 : 氯仿方法时, DNA 必须使用 Microcon 离心膜进行浓缩和清洗第 5 页共 7 页

6 IV. 问题及解决方法问题可能原因评论细胞沉淀大而紧上皮细胞裂解不完蛋白酶 K 消化不完全使用一瓶新的 ( 精子部分混有上全蛋白酶 K, 并将样品在 56 C 消化 2 小时对未标于此处的皮细胞 ) 以上问题, 请与您当地大量松散的沉淀样品中含有大量的使用较少的检材量用蛋白酶 K 在的办事处或分公粘液 56 C 消化更长时间司联系进一步的在分离溶液中形成黄色缓冲液被大量紧密的精子沉淀上存在微黄的黄色缓资料可登陆网站黄色缓冲液的泡的细胞碎片所截留冲液泡是正常现象仔细除去黄色液体的泡而不要扰动精子沉淀延长蛋白酶 K 消化时间精子 DNA 存在于样品降解由于储存条件不当而引起样品中含有上皮部分或者精子大量裂解的精子, 这样会导致上皮细数量少胞部分含有一些精子 DNA 样品的过度消化使用蛋白酶 K 消化含有少量上皮细胞样品中含精子太少的样品时会导致一些精子细胞的裂解消化时, 使用较少的蛋白酶 K, 较低的温度或较短的孵育时间使用更多的样品性交 72 小时后采集的样品含有很少的精子考虑用 PowerPlex Y 系统扩增从全部样品纯化的 DNA V. 参考文献 1. Gill, P., Jeffreys, A.J. and Werrett, D.J. (1985) Forensic application of DNA fingerprints. Nature, 318, 第 6 页共 7 页

7 VI. 相关产品产品包装目录号 DNA IQ System 100 次反应 DC 次反应 DC6700 Tissue and Hair Extraction Kit ( 用于 DNA IQ ) 100 次反应 DC6740 限实验室使用其它组份产品包装目录号蛋白酶 K ( 干粉 ) 100mg V3021 DTT, 分子级 ( 干粉 ) 5g V3151 DNA IQ Spin Baskets** 1,000/bag V1221 微量离心管, 1.5ml 1,000/bag V1231 MagneSphere 磁性分离架 (2 孔 ) 1.5ml Z5332 MagneSphere 磁性分离架 (12 孔 ) 1.5ml Z5342 MagnaBot 96 磁性分离装置 1 each V8151 * 限实验室使用 ** 非医学检验用途第 7 页共 7 页

女性美容保健（四）.doc

女性美容保健（四）.doc ...1...4...6...8...9...10... 11...12...13...15...18...20...21...22...26...33...39...43 I II...47...52...53...59...60...63...65...68...69...71...73 1.5 ml...78...79...85...88...90...94...95...97...98...