TruSight Tumor 15 文库制备参考指南 ( )

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1 TruSight Tumor 15 参考指南仅供研究使用, 不可用于诊断程序 ILLUMINA 所有文档号 v05 CHS 2016 年 9 月使用自定义操作流程选择器自定义简要的端到端工作流程指南 support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

2 本文档及其内容归 Illumina, Inc. 及其附属公司 ( Illumina ) 所有, 并且仅供其客户用于与本文档内所描述的产品用途相关的合同用途, 不得用于其他任何目的在未获得 Illumina 的事先书面同意的情况下, 不得出于任何目的使用或分发本文档及其内容, 和 / 或以其他任何方式对其进行传播披露或复制 Illumina 不通过本文档根据其专利商标版权或普通法权利或任何第三方的类似权利授予任何许可本文档中的说明必须由具备资格且受过相关培训的人员严格且明确执行, 以确保本文档中描述的产品能够获得适当且安全的使用在使用此类产品之前, 相关人员必须通读并理解本文档中的所有内容未能完整阅读并明确遵守本文档中包含的所有说明可能会导致产品损坏对用户或其他人员造成人身伤害以及对其他财产造成损害对于由不当使用本文档中描述的产品 ( 包括其部件或软件 ) 引起的任何后果,ILLUMINA 概不承担任何责任 2016 Illumina, Inc. 保留所有权利 Illumina 南瓜橘色和流动底部设计是 Illumina, Inc. 及 / 或其附属公司在美国和 / 或其他国家 / 地区的商标所有其他名称徽标和其他商标均为其各自所有者的财产购买者须知 : 有限许可本产品的售价包括一份不可转让的有限许可, 在使用本产品时需遵守 BIO-RAD Laboratories, Inc. 在美国和其他国家 / 地区拥有的专利权不因购买者购买本产品而以明示或暗示方式向其授予这些专利项下的任何其他许可本产品在 Affibody AB, Sweden 的许可下出售 Phusion DNA Polymerase 由 Thermo Fisher Scientific 制造 Phusion 是 Thermo Fisher Scientific 或其子公司的商标或注册商标 ii 文档号 v05 CHS

3 修订历史记录文档日期更改描述文档号 v 年 6 月在试剂盒内含物品中添加了 TruSight Tumor 15 MiniSeq 试剂盒的商品目录号在相应步骤中添加了在离心和摇动之前盖上密封膜的步骤文档号 v 年 2 月更正了 Veriti 扩增仪的商品目录号文档号 v 年 1 月在 TST15 PCR1 和 TST15 PCR2 扩增仪程序中添加了反应液剂量添加了在解冻后混合 TAM(TruSight 肿瘤扩增混合液 ) 的说明在纯化文库一节中解释了第 6 步中的措辞, 注明等到微珠粘附到磁块为止在耗材列表中添加了多通道移液器删除了仪器特定说明该说明现已纳入您的测序仪器的变性和稀释文库指南及系统指南文档号 v 年 11 月解释了 TST15 PCR1 升降温率的要求更正了 TST15 PCR2 循环说明更正了琼脂糖凝胶示例中的孔标签文档号 v 年 10 月产品名更新为 TruSight Tumor 15 文档号 v 年 9 月最初版本 TruSight Tumor 15 参考指南 iii

4 iv 文档号 v05 CHS

5 目录修订历史记录目录 iii v 第 1 章概述 1 简介 2 DNA 输入建议 3 更多资源 4 第 2 章操作流程 5 操作流程简介 6 提示和技巧 7 文库制备工作流程 8 扩增和标记靶点 9 为靶点建立标签 11 纯化文库 13 检查文库 15 混合文库 17 附录 A 支持信息 19 简介 20 缩写 21 试剂盒内含物品 22 耗材和设备 23 标签序列 26 技术协助 27 TruSight Tumor 15 参考指南 v

6 vi 文档号 v05 CHS

7 第 1 章概述概述第 1 章简介 2 DNA 输入建议 3 更多资源 4 TruSight Tumor 15 参考指南 1

8 概述简介 Illumina TruSight Tumor 15 操作流程介绍了一种基于多重 PCR 的方法, 可制备用于对从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 的组织样品中提取的 DNA 进行测序的文库 TruSight Tumor 15 试剂盒中的试剂可基于 24 个 DNA 样品制备多达 48 个双末端标签文库试剂盒经过优化处理, 可实现对 15 种基因的扩增子覆盖, 能高度灵敏地分析从 FFPE 实体瘤样品中提取的低频体细胞变异这些基因和基因区域包含与癌症相关的单核苷酸变异 (SNV) 以及插入和缺失 (indel) TruSight Tumor 15 操作流程具有下列特点 : } 制备样品简单快捷 } 在 7 小时左右的时间 ( 包括 2.5 小时的手动操作时间 ) 内, 基于 24 个样品制备多达 48 个文库 ( 每个样品用引物混合液 A 和引物混合液 B 制备 ) } 低 DNA 输入 } 可在输入量低至 20 纳克 ( 每个样品的混合液 A 和 B 各 10 纳克 ) 最低 2 纳克 / 微升的输入 DNA 浓度的条件下实现更高的数据质量, 并发挥出强大性能 } 过滤变异报告可列出相关变异该实验分析方法的工作原理是什么? 该实验分析方法包含 2 个不同的已标记寡核苷酸引物库这些库用在多重 PCR 中, 用于针对选定的一系列靶点扩增并靶向源自 FFPE 样品中所提取 DNA 的感兴趣区域通过使用试剂盒中提供的标签接头, 文库可以加上标签并进一步扩增, 然后在准备双末端测序运行时在单个试管中融合测序完成后, 分析报告会提供特定的一系列与癌症相关的单核苷酸变异 (SNV) 以及小插入和缺失 2 文档号 v05 CHS

9 DNA 输入建议 TruSight Tumor 15 试剂盒已针对特定 DNA 输入量进行优化请在开始该操作流程之前对输入 DNA 进行定量 } 使用浓度至少为 2 纳克 / 微升, 总量为 20 纳克 ( 对于每个样品,10 纳克用于混合液 A, 10 纳克用于混合液 B) 的人类基因组 DNA (gdna) 输入量 } 使用采用 dsdna 结合染色剂的荧光定量方法, 如 AccuClear( 推荐 ) Qubit 或 PicoGreen } 用不含 RNase/DNase 的水稀释原料 DNA 输入建议参考样品 [ 可选 ] } 在运行 HorizonDx HD701/HD200( 需要提取 DNA) 或 AcroMetrix Oncology Hotspot Control 等文库制备流程时, 请使用已定性的参考材料 } 使用 5 微升不含 RNase/DNase 的水作为 PCR 扩增的非模板对照品请勿测序非模板对照品 FFPE DNA 提取注意运行参考样品或非模板对照品有助于降低用每个文库制备试剂盒所能处理的未知样品的总数请遵照以下建议从 FFPE 组织提取 DNA: } 至少使用 140 平方毫米肿瘤含量不低于 30% 的非黑色素瘤组织 } 使用以下一种试剂盒从 FFPE 组织提取 DNA: } AllPrep DNA/RNA FFPE Kit (QIAGEN)( 推荐 ) } QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) } ReliaPrep FFPE gdna Miniprep System (Promega) TruSight Tumor 15 参考指南 3

10 概述更多资源访问 Illumina 网站上的 TruSight Tumor 15 试剂盒支持页, 查看相应文档软件下载培训资源和 Illumina 兼容产品的相关信息以下文档可从 Illumina 网站下载资源自定义操作流程选择器 TruSight Tumor 15 操作流程指南 ( 文档号 ) TruSight Tumor 15 检查表 ( 文档号 ) TruSight Tumor 15 耗材和设备清单 ( 文档号 ) 描述 support.illumina.com/custom-protocolselector.html 用来生成定制的端到端文档的向导, 针对测序运行所用的文库制备方法运行参数和分析方法而调整为有经验的用户提供说明为有经验的用户提供步骤检查表提供用户自备耗材和设备的交互式检查表 4 文档号 v05 CHS

11 第 2 章操作流程操作流程第 2 章操作流程简介 6 提示和技巧 7 文库制备工作流程 8 扩增和标记靶点 9 为靶点建立标签 11 纯化文库 13 检查文库 15 混合文库 17 TruSight Tumor 15 参考指南 5

12 操作流程操作流程简介本节介绍 TruSight Tumor 15 操作流程 } 请使用指定的参数遵照操作流程按序操作 } 请先确认试剂盒内含物, 并确保您已备齐所需的耗材和设备, 然后再继续操作 } 在制备样品之前先记录样品相关信息, 以便稍后分析数据时使用 6 文档号 v05 CHS

13 提示和技巧除非在操作流程中指定了安全停止点, 否则请立即执行下一步骤避免交叉污染 } 添加或转移每个样品之后, 均请更换吸头 } 为每行和每列添加接头或引物之后, 均请更换吸头 } 从工作区中取走未使用的标签接头试管提示和技巧将板密封 } 在执行操作流程中的下列步骤之前, 请始终密封 96 孔板 : } 摇动步骤 } 振荡步骤 } 离心步骤 } 扩增步骤 } 使用粘性密封膜盖住板, 并使用橡胶辊进行密封 } Microseal B 粘性密封膜可在 -40 至 110 下发挥作用, 适用于带裙边或半裙边的 PCR 板如需摇动离心和长期存储, 请使用 Microseal B } Microseal A 粘性封膜适用于扩增, 并且当所使用的孔少于 96 个时, 易于切割板转移 } 在不同的板间转移剂量时, 请将一个板各孔中的指定剂量转移到另一个板的相应孔中离心 } 可在此程序的的任何步骤中进行离心, 使位于孔底部的液体或微珠汇合, 以免样品流失 } 要使微珠聚成颗粒, 请在 280 g 下离心 1 分钟处理微珠 } 缓缓对微珠悬液移液 } 混合时要充分彻底 } 如果微珠已吸入移液器吸头, 请重新将其分配到磁力架上的板上, 然后等到液体变得清澈为止 ( 约 2 分钟 ) } 清洗微珠时 : } 对板使用适合的磁块 } 分配液体, 以便润湿各孔侧边上的微珠 } 将板置于磁块上, 直到说明指示将其取下 } 当板在磁力架上时切勿摇动板请勿摇荡微珠颗粒 TruSight Tumor 15 参考指南 7

14 操作流程文库制备工作流程图 1 TruSight Tumor 15 工作流程 8 文档号 v05 CHS

15 扩增和标记靶点此流程使用混合液 A( 使用引物混合液 A) 和混合液 B( 使用引物混合液 B) 这两种引物混合液扩增靶区域, 为每个样品制备 2 个不同的文库耗材 } TTM(TruSight 肿瘤靶向混合液 ) } TPA(TruSight 肿瘤引物混合液 A) } TPB(TruSight 肿瘤引物混合液 B) } TTE(TruSight 肿瘤靶向酶 ) } 样品 DNA } 无 RNase/DNase 水 } 1.7 毫升微量离心管 (2 个 ) } 96 孔 PCR 板 } Microseal A 封膜 } Microseal B 粘性密封膜注意如要在将板放到扩增仪上之前密封板, 请使用 Microseal A 对于要求使用密封板的其他步骤, 请使用 Microseal B 扩增和标记靶点准备 1 准备下列耗材 : 物品存储说明 TTM -25 到 -15 在室温下解冻振荡每个试管以混匀溶液然后, 进行短暂的离心 TPA -25 到 -15 在室温下解冻振荡每个试管以混匀溶液然后, 进行短暂的离心 TPB -25 到 -15 在室温下解冻振荡每个试管以混匀溶液然后, 进行短暂的离心 TTE -25 到 -15 进行短暂的离心, 然后放在冰上或酶冷藏箱中样品 DNA -25 到 -15 在室温下解冻 2 分别将两个 1.7 毫升微量离心管标为预先混合液 A 和预先混合液 B 3 在带热盖的扩增仪上将以下程序另存为 TST15 PCR1 } 选择预热盖选项, 并将其设置为 102 } 将反应液剂量设为 15 微升 } 98 下 3 分钟 } 16 次以下循环 : } 96 下 45 秒钟 } 70 下 1 分钟 } 54 下 3 分钟 * } 72 下 15 秒钟 * } 72 下 5 分钟 } 保持在 10 *TST15 PCR1 程序需要使用特定的升降温率设置请参见扩增仪 ( 第 25 页 ) TruSight Tumor 15 参考指南 9

16 操作流程程序 1 使用 AccuClear( 推荐 ) Qubit 或 PicoGreen 等荧光法对样品 DNA 进行定量 2 用不含 RNase/DNase 的水将各样品 DNA 稀释为 2 纳克 / 微升, 最终剂量为 12.5 微升 3 分别在不同的微量离心管中装入以下试剂, 为 TPA 和 TPB 制备 PCR 预先混合液 PCR 成分每孔每 8 个样品每 16 个样品每 24 个样品 TTM µl 47 µl 94 µl 141 µl TPA 或 TPB 6.25 µl 50 µl 100 µl 150 µl TTE µl 3 µl 6 µl 9 µl 至少要制备 4 个样品 4 移液以混匀溶液 5 将 10 微升各 PCR 预先混合液加到每个孔中 } 预先混合液 A A 和 C 行 } 预先混合液 B B 和 D 行 6 将 5 微升 2 纳克 / 微升 DNA 加到相应的孔中 } 样品 1 12 A 和 B 行 } 样品 C 和 D 行 7 移液以混匀溶液 8 盖上密封膜, 在 1000 g 下离心 1 分钟 9 立即置于扩增仪上并运行 TST15 PCR1 程序安全停止点如要停止操作, 请将板密封并存储在 2 至 8 下, 最长可存放 3 天或者, 请整夜将板留在扩增仪上 10 文档号 v05 CHS

17 为靶点建立标签此流程会为扩增后 DNA 加上标记, 添加标签 1 (i7) 接头和标签 2 (i5) 接头及形成簇所需的序列, 同时每个文库都会分配到唯一的标签 1 和标签 2 接头组合耗材 } 标签 1 (i7) 接头和橙色管帽 } 标签 2 (i5) 接头和白色管帽 } TAM(TruSight 肿瘤扩增混合液 ) } 1.7 毫升微量离心管 ( 每个标签接头试管 1 个 ) } Microseal A 封膜 } Microseal B 粘性密封膜注意如要在将板放到扩增仪上之前密封板, 请使用 Microseal A 对于要求使用密封板的其他步骤, 请使用 Microseal B 为靶点建立标签准备 1 准备下列耗材 : 物品存储说明标签接头 (i7 和 i5) -25 至 -15 仅取走正在使用的接头在室温下解冻 20 分钟振荡每个试管以混匀溶液使用 1.7 毫升微量离心管作为离心机中的支架 / 接头进行短暂的离心 TAM -25 至 -15 在室温下解冻 20 分钟振荡试管混匀溶液然后, 进行短暂的离心 2 在带热盖的扩增仪上将以下程序另存为 TST15 PCR2 } 选择预热盖选项, 并将其设置为 102 } 将反应液剂量设为 50 微升 } 98 下 30 秒钟 } 17 次以下循环 : } 98 下 20 秒钟 } 60 下 30 秒钟 } 72 下 45 秒钟 } 72 下 5 分钟 } 保持在 10 程序 1 在 TruSeq 标签板定位装置的顶行布置标签 1 (i7) 接头 2 在 TruSeq 标签板定位装置的 A B 行布置标签 2 (i5) 接头 3 将板置于 TruSeq 标签板定位装置上 TruSight Tumor 15 参考指南 11

18 操作流程图 2 标签板定位装置 A 1 12 列 : 标签 1 (i7) 接头 ( 橙色管帽 ) B A B 行 : 标签 2 (i5) 接头 ( 白色管帽 ) C 96 孔板 4 对于样品 1 12, 执行下列操作 : a 使用多通道移液器, 将 4 微升的各标签 2 (i5) 接头添加到 A 行和 B 行中如果您没有多余的样品, 则将每个 i5 接头试管上的管帽更换为新的白色管帽 b 使用多通道移液器, 将 4 微升的各标签 1 (i7) 接头 (R701 R709 R711 R712 R749) 添加到 A 行和 B 行的每一列中将每个 i7 接头试管上的管帽更换为新的橙色管帽 5 对于样品 13-24, 执行下列操作 : a 将标签 2 (i5) 接头移至 C-D 行 b 将顶行的标签 1 (i7) 接头更换为第二组 (R725 R736) c 使用多通道移液器, 将 4 微升的各标签 2 (i5) 接头添加到 A 行和 B 行中将每个 i5 接头试管上的管帽更换为新的白色管帽 d 使用多通道移液器, 将 4 微升的各标签 1 (i7) 接头 (R725 R736) 添加到 C 行和 D 行的每一列中将每个 i7 接头试管上的管帽更换为新的橙色管帽 6 将 27 微升 TAM 添加到每个孔中 7 移液以混匀溶液 8 盖上密封膜, 在 1000 g 下离心 1 分钟 9 立即置于扩增仪上并运行 TST15 PCR2 程序安全停止点如要停止操作, 请将板密封并存储在 -25 至 -15 下, 最长可存放 7 天 12 文档号 v05 CHS

19 纯化文库此步骤使用 SPB( 样品纯化微珠 ) 纯化来自其他反应成分的 PCR 产物耗材 } SPB( 样品纯化微珠 ) } RSB( 重悬缓冲液 ) } 新制备的浓度为 80% 的乙醇 (EtOH) } 96 孔 MIDI 板 } 96 孔 PCR 板 } Microseal B 粘性密封膜纯化文库关于试剂 } 每次使用前都要振荡 SPB } 需频繁振荡 SPB, 以确保微珠均匀散布 } 由于溶液的粘度较高, 请缓慢吸出并分配 SPB 准备 1 准备下列耗材 : 试剂存储说明 SPB 2 到 8 等待 30 分钟, 使其恢复到室温 RSB 2 到 8 等待 30 分钟, 使其恢复到室温 2 新鲜制备浓度为 80% 的乙醇 3 将新的 96 孔 PCR 板标为 PLP ( 纯化文库板 ) 程序 1 在 1000 g 下离心 1 分钟 2 将 40 微升 SPB 加到新 MIDI 板的每个孔中 3 从 PCR 板转移 45 微升上层清液到 MIDI 板相应的孔中 4 盖上密封膜, 以 1800 转 / 分的转速离心 5 分钟 5 在室温下孵育 5 分钟 6 置于磁力架上, 并等到微珠粘附到磁块上为止 ( 约 2 分钟 ) 7 取出并丢弃每个孔中的所有上层清液 8 按如下方式清洗两次 a b c 将 200 微升新制备的浓度为 80% 的乙醇加到每个孔中在磁力架上孵育 30 秒钟取出并丢弃每个孔中的所有上层清液 9 使用 20 微升移液器从每个孔中取出残余的 80% 乙醇 10 在磁力架上风干 5 分钟 11 将 32 微升 RSB 加到每个孔中 TruSight Tumor 15 参考指南 13

20 操作流程 12 盖上密封膜, 以 1800 转 / 分的转速离心 2 分钟如果微珠未重悬, 应移液以混匀或重复以 1800 转 / 分的速度摇动 2 分钟 13 在室温下孵育 2 分钟 14 置于磁力架上, 并等到液体变得清澈为止 ( 约 2 分钟 ) 15 从每个孔中转移 30 微升上层清液到 PLP 板相应的孔中 16 盖上密封膜, 在 1000 g 下离心 1 分钟安全停止点如要停止操作, 请将板密封并存储在 -25 至 -15 下, 最长可存放 2 个月 14 文档号 v05 CHS

21 检查文库执行下列程序可对文库定量, 并检查文库质量精确定量 DNA 文库有助于确保在流动槽上实现最佳的簇密度为了得到最佳的结果, 用于对样品测序的文库混合液 A 和 B 的产量不应低于 20 纳克 / 微升文库产量偏低会导致数据质量不佳, 变异报告不够准确检查文库耗材 } RSB( 重悬缓冲液 ) } 96 孔 PCR 板 } 1.7 毫升微量离心管准备 1 准备下列耗材 : 物品存储说明 RSB 2 到 8 等待 30 分钟, 使其恢复到室温 2 将新的 96 孔 PCR 板标为 NLP ( 标准化文库板 ) 程序 1 使用 AccuClear( 推荐 ) Qubit 或 PicoGreen 等荧光法对文库进行定量 2 按如下方法计算将文库浓度调为 5 纳克 / 微升所需的 RSB 量 a 使用公式 C1V1 = C2V2 来计算 V2 的值, 其中 C1 是文库定量的结果,V1 是 8 微升, C2 是 5 纳克 / 微升 b 计算用于将每个文库的浓度调为 5 纳克 / 微升所需的 RSB 量 (V2-8 微升 ) 3 将所需的 RSB 量加到 NLP 板相应的孔中如果文库 100 纳克 / 微升, 请将 RSB 转移到 1.7 毫升试管 4 将 PLP 板中的每个文库转移 8 微升到 NLP 板的相应孔或 1.7 毫升试管中 5 采用下列方法之一对每个标准化文库进行等分 : } 使用 50 碱基对 DNA 分子量标记物, 通过 2% 琼脂糖凝胶按 15 微升分装 } 使用 DNA 1000 芯片, 通过 Bioanalyzer 按 1 微升分装预计的 PCR 产物约为 350 碱基对, 表示文库扩增成功如果引物二聚体迹象明显, 即说明文库制备失败 TruSight Tumor 15 参考指南 15

22 操作流程图 3 琼脂糖凝胶示例 A 非模板对照品 B 样品文库 ( 约 350 碱基对 ) C 大小标准 D 靶向扩增子 E 引物二聚体图 4 Bioanalyzer 示例 A 标记 B 样品文库 ( 约 350 碱基对 ) C 标记安全停止点如要停止操作, 请将板密封并存储在 -25 至 -15 下, 最长可存放 14 天 16 文档号 v05 CHS

23 混合文库请遵照下列操作流程混合文库混合之后, 先对混合的文库进行稀释和变性, 然后再装入文库以用于测序运行有关详细信息, 请参见您的测序仪器的文库稀释和变性指南耗材 } RSB( 重悬缓冲液 ) } 1.7 毫升微量离心管 (2 个 ) 混合文库关于试剂 } PNL 试管在 -25 到 -15 下最多可以存储 7 天 } DNL 试管在 -25 到 -15 下最多可以存储 7 天准备 1 准备下列耗材物品存储说明 RSB 2 到 8 等待 30 分钟, 使其恢复到室温 2 将新的 1.7 毫升微量离心管标为 PNL ( 混合标准化文库 ) 3 将新的 1.7 毫升微量离心管标为 DNL ( 稀释的标准化文库 ) 4 如果 NLP 板是冷冻存储的, 则需先在室温下解冻, 然后再进行短暂的离心移液以混匀溶液 5 若要为测序运行做准备, 请按照您的测序仪器的说明开始解冻试剂程序 1 盖上密封膜, 在 1000 g 下将 NLP 板离心 1 分钟 2 将 NLP 板中的每个文库转移 4 微升到 PNL 试管中 3 振荡以混匀溶液, 然后进行短暂的离心 4 将 41 微升 RSB 加到 DNL 试管中 5 从 PNL 试管转移 9 微升液体到 DNL 试管中, 以便将混合文库稀释为 0.9 纳克 / 微升 (4 纳摩 ) 6 对混合文库进行变性及稀释, 达到所用测序仪器所需的装入浓度请查看您的仪器对应的文库稀释和变性指南 TruSight Tumor 15 参考指南 17

24 18 文档号 v05 CHS

25 附录 A 支持信息支持信息第 A 章简介 20 缩写 21 试剂盒内含物品 22 耗材和设备 23 标签序列 26 TruSight Tumor 15 参考指南 19

26 支持信息简介本指南中介绍的操作流程假定您已查看本附录内容, 确认了试剂盒中的物体, 并且已取得所有需要的耗材和设备 20 文档号 v05 CHS

27 缩写缩写缩写 DAL DNL HP3 HT1 NLP PLP PNL RSB SPB TAM TPA TPB TTE TTM 定义变性的扩增子文库稀释的标准化文库 2N NaOH 杂交缓冲液标准化文库板纯化文库板混合标准化文库重悬缓冲液样品纯化微珠 TruSight 肿瘤扩增混合液 TruSight 肿瘤引物混合液 A TruSight 肿瘤引物混合液 B TruSight 肿瘤靶向酶 TruSight 肿瘤靶向混合液 TruSight Tumor 15 参考指南 21

28 支持信息试剂盒内含物品请确保您已备齐本节指定的所有试剂后再继续执行文库制备程序试剂有以下配置耗材商品目录号 TruSight Tumor 15 MiSeq 试剂盒 (1 组文库制备 24 个样品 ;3 盒 MiSeq 试剂盒 v3) TruSight Tumor 15(1 组文库制备,24 个样品 ) TruSight Tumor 15 MiniSeq 试剂盒 (1 组文库制备 24 个样品 ;3 盒 MiSeq 试剂盒 ) OP OP 第 1 盒 (PCR 前 ) 存储于 -25 至 -15 温度下数量试剂描述 1 TTM TruSight 肿瘤靶向混合液 1 TTE TruSight 肿瘤靶向酶 1 TPA TruSight 肿瘤引物混合液 A 1 TPB TruSight 肿瘤引物混合液 B 第 2 盒 (PCR 后 ) 存储于 -25 至 -15 温度下数量试剂描述 2 TAM TruSight 肿瘤扩增混合液 1 HP3 2 N NaOH 2 A501 A502 i5 标签接头 24 R701-R709 R711 R712 R749 R725 R736 i7 标签接头第 3 盒 (PCR 后 ) 存储于 2 至 8 温度下数量试剂描述 1 SPB 样品纯化微珠 1 RSB 重悬缓冲液 22 文档号 v05 CHS

29 耗材和设备耗材开始执行操作流程之前, 请确保已准备好所需的用户自备耗材和设备操作流程已经过优化, 并使用所列项目对其进行验证如果使用其他耗材和设备来代替, 则不保证性能保持同样水准耗材和设备耗材供应商 1.7 毫升微量离心管一般实验室供应商 20 微升多通道移液器一般实验室供应商 200 微升多通道移液器一般实验室供应商 20 微升屏障移液器吸头一般实验室供应商 200 微升屏障移液器吸头一般实验室供应商 1000 微升屏障移液器吸头一般实验室供应商 96 孔透明平底黑色微孔板注意 : 在用 SpectraMax M5 荧光光谱仪定量样品时使用 Corning, 部件号孔存储板, 圆孔,0.8 毫升 (MIDI 板 ) Fisher Scientific, 部件号 AB-0859 圆锥形离心管 (15 毫升或 50 毫升 ) 分子生物学用无水纯乙醇 (500 毫升 ) 96 孔 PCR 板请使用与扩增仪兼容的 PCR 板 ( 请参见扩增仪 ( 第 25 页 )) Microseal A 封膜 Microseal B 粘性密封膜 PCR 级用水不含 RNase/DNase 的一次性多通道试剂槽无 RNase/DNase 水荧光基定量试剂, 例如 AccuClear( 推荐 ) Qubit 或 PicoGreen AccuClear 超高敏感度 dsdna 定量试剂盒以下其中一个 ( 用于验证文库 ): 2% 琼脂糖凝胶 DNA 1000 芯片一般实验室供应商 Sigma-Aldrich, 部件号 E7023 一般实验室供应商 Bio-Rad, 部件号 MSA-5001 Bio-Rad, 部件号 MSB-1001 一般实验室供应商 VWR, 部件号一般实验室供应商 Biotium, 商品目录号一般实验室供应商 Agilent, 部件号 [ 可选 ] 螺帽试管一般实验室供应商 TruSight Tumor 15 参考指南 23

30 支持信息测序试剂盒 [ 可选 ] 设备 PhiX 对照品 v3 商品目录号 FC MiSeq 试剂盒 v3,600 次循环 MS 设备设备以下磁力架之一 : Magnetic Stand-96 DynaMag-96 Side Skirted Magnet 微量离心机微孔板离心机微孔板荧光检测仪振荡器以下 96 孔扩增仪之一 ( 请参见扩增仪 ( 第 25 页 )): C1000 Touch 扩增仪 S1000 扩增仪 Veriti 扩增仪以下微孔板混合器之一 : BioShake iq 高速热混合器 BioShake XP 高速混合器 VWR 高级高速微孔板混合器 VWR Signature 高速微孔板混合器以下其中一个 ( 用于文库验证 ): 凝胶电泳设备 2100 Bioanalyzer 桌面系统供应商 / 描述 Thermo Fisher, 商品目录号 AM10027 Thermo Fisher, 商品目录号一般实验室供应商一般实验室供应商一般实验室供应商一般实验室供应商 Bio-Rad, 部件号 Bio-Rad, 部件号 Thermo Fisher, 商品目录号 Q Instruments, 型号 Q Instruments, 型号 VWR, 商品目录号 (230 伏 ) VWR, 商品目录号 (110 伏 /120 伏 ) 一般实验室供应商 Agilent, 部件号 G2940CA 和 TruSeq 标签板定位装置套件 [ 可选 ] 设备 [ 可选 ] TruSeq 标签板定位装置套件注意 : 建议用其设置标签接头此部件可重复使用供应商 Illumina, 商品目录号 FC 文档号 v05 CHS

31 扩增仪扩增仪 TST PCR1 TST PCR1 预计运行时间 54 和 72 循环步骤升降温率 * Bio-Rad C1000 扩增仪 3:08:02 下降 0.1 /s 上升 0.1 /s 耗材和设备 Bio-Rad S1000 扩增仪 3:51:52 下降 0.1 /s 上升 0.1 /s Applied Biosystems GeneAmp PCR 系统 9700 Applied Biosystems Veriti 扩增仪 Eppendorf Mastercycler ep Gradient Eppendorf Mastercycler ep Gradient-S 2:55:00 下降 7% 上升 7% 3:06:00 下降 4.5% 上升 4.0% 3:14:00 下降 6% 上升 4% 2:50:00 下降 2% 上升 2% * 其他所有 TST PCR1 步骤和所有 TST PCR2 步骤都需要使用默认或最大扩增仪升降温率 TruSight Tumor 15 参考指南 25

32 支持信息 26 文档号 v05 CHS 标签序列采用下列序列设置运行标签序列 A501 TGAACCTT A502 TGCTAAGT R701 ATCACG R702 CGATGT R703 TTAGGC R704 TGACCA R705 ACAGTG R706 GCCAAT R707 CAGATC R708 ACTTGA R709 GATCAG R749 GATGCT R711 GGCTAC R712 CTTGTA R725 ACTGAT R726 ATGAGC R727 ATTCCT R728 CAAAAG R729 CAACTA R730 CACCGG R731 CACGAT R732 CACTCA R733 CAGGCG R734 CATGGC R735 CATTTT R736 CCAACA

33 技术协助如需技术协助, 请与 Illumina 技术支持部门联系表 1 Illumina 常用联系信息网站技术协助电子邮件 techsupport@illumina.com 表 2 Illumina 客户支持部门电话号码地区联系号码地区联系号码北美瑞典澳大利亚瑞士爱尔兰台湾奥地利西班牙比利时香港丹麦新加坡德国新西兰法国意大利芬兰英国荷兰中国挪威其他国家 / 地区日本安全数据表 (safety data sheet, 简称 SDS) 可通过 Illumina 网站 (support.illumina.com/sds.html) 获取产品文档可通过 Illumina 网站下载 PDF 版本请转到 support.illumina.com, 选择一个产品, 然后选择 Documentation & Literature( 文档与文献 ) TruSight Tumor 15 参考指南 27

34 Illumina 5200 Illumina Way San Diego, California U.S.A ILMN (4566) 北美以外

TruSight Tumor 15 文库制备参考指南 ( )

TruSight Tumor 15 文库制备参考指南 ( ) TrSight Tmor 15 参考指南 2018 年3 月仅供研究使用不可用于诊断过程 ILLUMINA 所有 TrSight Tmor 15 参考指南本文档及其内容归 Illmina, Inc. 及其附属公司 ( Illmina ) 所有, 并且仅供其客户用于与本文档内所描述的产品用途相关的合同用途, 不得用于其他任何目的在未获得 Illmina 的事先书面同意的情况下, 不得出于任何目的使用或分发本文档及其内容,