TruSight Tumor 15 文库制备参考指南 ( )

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1 TrSight Tmor 15 参考指南 2018 年3 月仅供研究使用不可用于诊断过程 ILLUMINA 所有

2 TrSight Tmor 15 参考指南本文档及其内容归 Illmina, Inc. 及其附属公司 ( Illmina ) 所有, 并且仅供其客户用于与本文档内所描述的产品用途相关的合同用途, 不得用于其他任何目的在未获得 Illmina 的事先书面同意的情况下, 不得出于任何目的使用或分发本文档及其内容, 和 / 或以其他任何方式对其进行传播披露或复制 Illmina 不通过本文档向第三方授权其任何专利商标所有权或习惯法权利或类似权利本文档中的说明必须由具备资格且受过相关培训的人员严格且明确执行, 以确保本文档中描述的产品能够获得适当且安全的使用在使用此类产品之前, 相关人员必须通读并理解本文档中的所有内容未能完整阅读并明确遵守本文档中包含的所有说明可能会导致产品损坏对用户或其他人员造成人身伤害以及对其他财产造成损害, 并且将导致产品适用的保证失效对于由不当使用本文档中描述的产品 ( 包括其部件或软件 ) 引起的任何后果,ILLUMINA 概不承担任何责任 2018 Illmina, Inc. 保留所有权利所有商标均为 Illmina, Inc. 或其各自所有者的财产有关特定的商标信息, 请参见购买者须知 : 有限许可本产品的售价包括一份不可转让的有限许可, 在使用本产品时需遵守 BIO-RAD Laboratories, Inc. 在美国和其他国家 / 地区拥有的专利权购买本产品不会以明示或暗示方式向购买者授予这些专利项下的任何其他许可本产品在 Affibody AB, Sweden 的许可下出售 Phsion DNA Polymerase 由 Thermo Fisher Scientific 制造 Phsion 是 Thermo Fisher Scientific 或其子公司的商标或注册商标 ii

3 TrSight Tmor 15 参考指南修订历史记录文档日期更改描述文档号 v06 文档号 v05 文档号 v04 文档号 v03 文档号 v02 文档号 v01 文档号 v 年 3 月 2016 年 6 月 2016 年 2 月 2016 年 1 月 2015 年 11 月 2015 年 10 月 2015 年 9 月在提示和技巧中 : 更新了将板密封中的 Microseal A 更新了处理微珠中的微珠制备 ( 第 2 点和第 3 点 ) 更新了纯化文库中的关于试剂部分在试剂盒内含物品中添加了 TrSight Tmor 15 MiniSeq 试剂盒的商品目录号在相应步骤中添加了在离心和摇动之前盖上密封膜的步骤更正了 Veriti 扩增仪的商品目录号在 TST15 PCR1 和 TST15 PCR2 扩增仪程序中添加了反应液剂量添加了在解冻后混合 TAM(TrSight 肿瘤扩增混合液 ) 的说明在纯化文库一节中解释了第 6 步中的措辞, 注明等到微珠粘附到磁块为止在耗材列表中添加了多通道移液器删除了仪器特定说明该说明现已纳入您的测序仪器的变性和稀释文库指南及系统指南解释了 TST15 PCR1 升降温率的要求更正了 TST15 PCR2 循环说明更正了琼脂糖凝胶示例中的孔标签产品名更新为 TrSight Tmor 15 最初版本 iii

4 目录修订历史记录 iii 第 1 章概述 1 简介 1 DNA 输入建议 2 更多资源 2 第 2 章操作流程 3 操作流程简介 3 提示和技巧 3 文库制备工作流程 5 扩增和标记靶点 5 为靶点建立标签 8 纯化文库 10 检查文库 11 混合文库 13 附录 A 支持信息 15 简介 15 缩写 15 试剂盒内含物品 15 耗材和设备 16 标签序列 19 技术协助 20 iv

5 第 1 章概述简介 1 DNA 输入建议 2 更多资源 2 简介 Illmina TrSight Tmor 15 操作流程介绍了一种基于多重 PCR 的方法, 可制备用于对从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 的组织样品中提取的 DNA 进行测序的文库 TrSight Tmor 15 试剂盒中的试剂可基于 24 个 DNA 样品制备多达 48 个双末端标签文库试剂盒经过优化处理, 可实现对 15 种基因的扩增子覆盖, 能高度灵敏地分析从 FFPE 实体瘤样品中提取的低频体细胞变异这些基因和基因区域包含与癌症相关的单核苷酸变异 (SNV) 插入缺失 ( 插入缺失 ) 和扩增 TrSight Tmor 15 操作流程具有下列特点 : 制备样品简单快捷在 7 小时左右的时间 ( 包括 2.5 小时的手动操作时间 ) 内, 基于 24 个样品制备多达 48 个文库 ( 每个样品用引物混合液 A 和引物混合液 B 制备 ) 低 DNA 输入可在输入量低至 20 纳克 ( 每个样品的混合液 A 和 B 各 10 纳克 ) 最低 2 纳克 / 微升的输入 DNA 浓度的条件下实现更高的数据质量, 并发挥出强大性能过滤变异报告可列出相关变异该实验分析方法的工作原理是什么? 该实验分析方法包含两个不同的已标记寡核苷酸引物库这些库用在多重 PCR 中, 用于针对选定的一组靶点扩增并靶向源自 FFPE 样品中所提取 DNA 的目标区域通过使用试剂盒中提供的标签接头, 文库可以加上标签并进一步扩增, 然后在准备双末端测序运行时在单个试管中融合测序完成后, 分析报告会提供特定的一组与癌症相关的单核苷酸变异 (SNV) 小插入缺失和扩增 1

6 TrSight Tmor 15 参考指南 DNA 输入建议 TrSight Tmor 15 试剂盒已针对特定 DNA 输入量进行优化请在开始该操作流程之前对输入 DNA 进行定量使用浓度至少为 2 纳克 / 微升, 总量为 20 纳克 ( 对于每个样品,10 纳克用于混合液 A,10 纳克用于混合液 B) 的人类基因组 DNA (gdna) 输入量使用采用 dsdna 结合染色剂的荧光定量方法, 如 AccClear( 推荐 ) Qbit 或 PicoGreen 用不含 RNase/DNase 的水稀释原料使用 delta Cq 值 5 的 DNA 样品使用 delta Cq > 5 的样品可能会导致产物产量下降 (< 20 纳克 / 微升 ) 引物二聚体的量增加, 以及测序运行的 Q > 30 百分比下降 DNA 样品的 delta Cq 值可以使用 Illmina FFPE QC 试剂盒进行评估参考样品 [ 可选 ] 在运行 HorizonDx HD701/HD200( 需要提取 DNA) 或 AcroMetrix Oncology Hotspot Control 等文库制备流程时, 请使用已定性的参考材料使用 5 微升不含 RNase/DNase 的水作为 PCR 扩增的非模板对照品请勿测序非模板对照品注意 FFPE DNA 提取运行参考样品或非模板对照品有助于降低用每个文库制备试剂盒所能处理的未知样品的总数请遵照以下建议从 FFPE 组织提取 DNA: 至少使用 140 平方米肿瘤含量不低于 30% 的非黑色素瘤组织使用以下一种试剂盒从 FFPE 组织提取 DNA: AllPrep DNA/RNA FFPE Kit (QIAGEN)( 推荐 ) QIAamp DSP DNA FFPE Tisse Kit (QIAGEN) ReliaPrep FFPE gdna Miniprep System (Promega) 更多资源访问 Illmina 网站上的 TrSight Tmor 15 试剂盒支持页, 查看相应文档软件下载培训资源和 Illmina 兼容产品的相关信息以下文档可从 Illmina 网站下载资源自定义操作流程选择器 TrSight Tmor 15 操作流程指南 ( 文档号 ) TrSight Tmor 15 检查表 ( 文档号 ) TrSight Tmor 15 耗材和设备清单 ( 文档号 ) 描述 spport.illmina.com/cstom-protocol-selector.html 用来生成定制的端到端文档的向导, 针对测序运行所用的文库制备方法运行参数和分析方法而调整为有经验的用户提供说明为有经验的用户提供步骤检查表提供用户自备耗材和设备的交互式检查表 2

7 第 2 章操作流程操作流程简介 3 提示和技巧 3 文库制备工作流程 5 扩增和标记靶点 5 为靶点建立标签 8 纯化文库 10 检查文库 11 混合文库 13 操作流程简介请使用指定的参数, 遵照 TrSight Chimerism 操作流程按序操作请先确认试剂盒内含物, 并确保您已备齐所需的耗材和设备, 然后再继续操作请参见试剂盒内含物品 ( 第 15 页 ) 和耗材和设备 ( 第 16 页 ) 在制备样品之前先记录样品相关信息, 以便稍后分析数据时使用提示和技巧除非在操作流程中指定了安全停止点, 否则请立即执行下一步骤避免交叉污染添加或转移每个样品之后, 都要更换吸头为每行和每列添加接头或引物之后, 都要更换吸头从工作区中取走未使用的标签接头试管从扩增前区域移动到扩增后区域时, 请采用单向工作流程为防止带出扩增产物或探针, 在扩增后区域内开始操作后, 请勿再返回扩增前区域在每个孔中添加标签引物之后, 都要更换吸头如果手套接触到混合液 A 或混合液 B 引物标签引物或样品, 请更换手套操作前后必须彻底清洁工作台表面将板密封在执行操作流程中的下列步骤之前, 请始终密封 96 孔板 : 摇动步骤振荡步骤离心步骤扩增步骤使用粘性密封膜盖住板, 并使用橡胶辊进行密封 Microseal B 粘性密封膜可在 -40 C 至 110 C 下发挥作用, 适用于带裙边或半裙边的 PCR 板如需振动离心和长期存储, 请使用 Microseal B Microseal A 粘性封膜用于扩增步骤, 可防止蒸发板转移在不同的板间转移剂量时, 请将一个板各孔中的指定剂量转移到另一个板的相应孔中 3

8 TrSight Tmor 15 参考指南离心可在此程序的的任何步骤中进行离心, 使位于孔底部的液体或微珠汇合, 以免样品流失处理微珠不要冷冻微珠缓缓对微珠悬液移液使用前将微珠恢复到室温在使用的前一刻充分振荡微珠, 使之完全散开液体的颜色应均匀在整个操作流程中根据需要振荡, 使液体保持均匀如果微珠已吸入移液器吸头, 请重新将其分配到磁力架上的板中, 然后等到液体变得清澈为止 ( 约 2 分钟 ) 清洗微珠时 : 对板使用指定的磁力架分配液体, 以便润湿各孔侧边上的微珠将板置于磁力架上, 直到说明指示将其取下当板在磁力架上时切勿摇动板请勿摇荡微珠沉淀 4

9 TrSight Tmor 15 参考指南文库制备工作流程图 1 TrSight Tmor 15 工作流程扩增和标记靶点此流程使用混合液 A( 使用引物混合液 A) 和混合液 B( 使用引物混合液 B) 这两种引物混合液扩增靶区域, 为每个样品制备 2 个不同的文库耗材 TTM(TrSight 肿瘤靶向混合液 ) TPA(TrSight 肿瘤引物混合液 A) TPB(TrSight 肿瘤引物混合液 B) TTE(TrSight 肿瘤靶向酶 ) 样品 DNA 无 RNase/DNase 水 5

10 TrSight Tmor 15 参考指南 1.7 毫升微量离心管 (2 个 ) 准备 96 孔 PCR 板 Microseal A 封膜 Microseal B 粘性密封膜注意如要在将板放到扩增仪上之前密封板, 请使用 Microseal A 对于要求使用密封板的其他步骤, 请使用 Microseal B 1 准备下列耗材 : 物品存储说明 TTM -25 C 到 -15 C 在室温下解冻振荡每个试管以混匀溶液然后, 进行短暂的离心 TPA -25 C 到 -15 C 在室温下解冻振荡每个试管以混匀溶液然后, 进行短暂的离心 TPB -25 C 到 -15 C 在室温下解冻振荡每个试管以混匀溶液然后, 进行短暂的离心 TTE -25 C 到 -15 C 进行短暂的离心, 然后放在冰上或酶冷藏箱中样品 DNA -25 C 到 -15 C 在室温下解冻 2 将两个 1.7 毫升微量离心管分别标为预先混合液 A 和预先混合液 B 3 在带热盖的扩增仪上将以下程序另存为 TST15 PCR1 选择预热盖选项, 并将其设置为 102 C 将反应液剂量设为 15 微升 98 C 下 3 分钟 16 次以下循环 : 96 C 下 45 秒钟 70 C 下 1 分钟 54 C 下 3 分钟, 采用以下升降温率 ( 视扩增仪而定 ): 扩增仪升降温率 Bio-Rad C1000 扩增仪下降 0.1 C/s 上升 0.1 C/s Bio-Rad S1000 扩增仪下降 0.1 C/s Applied Biosystems GeneAmp PCR 系统 9700 下降 7% 上升上升 7% 0.1 C/s Applied Biosystems Veriti 扩增仪下降 4.5% 上升 4.0% Eppendorf Mastercycler ep Gradient 下降 6% 上升 4% Eppendorf Mastercycler ep Gradient-S 下降 2% 上升 2% 6

11 TrSight Tmor 15 参考指南程序 72 C 下 15 秒钟, 采用以下升降温率 ( 视扩增仪而定 ): 扩增仪 72 C 下 5 分钟保持在 10 C 注意升降温率 Bio-Rad C1000 扩增仪下降 0.1 C/s 上升 0.1 C/s Bio-Rad S1000 扩增仪下降 0.1 C/s Applied Biosystems GeneAmp PCR 系统 9700 下降 7% 上升上升 7% 0.1 C/s Applied Biosystems Veriti 扩增仪下降 4.5% 上升 4.0% Eppendorf Mastercycler ep Gradient 下降 6% 上升 4% Eppendorf Mastercycler ep Gradient-S 下降 2% 上升 2% 升降温率对 TrSight Tmor 15 的性能而言至关重要如果无法设置升降温率, 将导致产物产量下降和引物二聚体的量增加 1 使用 AccClear( 推荐 ) Qbit 或 PicoGreen 等特定于双链 DNA 的荧光法对样品 DNA 进行定量 2 用不含 RNase/DNase 的水将各样品 DNA 稀释为 2 纳克 / 微升, 最终剂量为 12.5 微升 3 分别在不同的微量离心管中装入以下试剂, 为 TPA 和 TPB 制备 PCR 预先混合液 PCR 成分每孔每 8 个样品每 16 个样品每 24 个样品 TTM µl 47 µl 94 µl 141 µl TPA 或 TPB 6.25 µl 50 µl 100 µl 150 µl TTE µl 3 µl 6 µl 9 µl 至少要制备 4 个样品 4 用移液器上下吸打以混匀溶液 5 将 10 微升各 PCR 预先混合液加到每个孔中预先混合液 A A 和 C 行预先混合液 B B 和 D 行 6 将 5 微升 2 纳克 / 微升 DNA 加到相应的孔中样品 1 12 A 和 B 行样品 C 和 D 行 7 用移液器上下吸打以混匀溶液 8 盖上密封膜, 在 1000 g 下离心 1 分钟 9 立即置于扩增仪上并运行 TST15 PCR1 程序 7

12 TrSight Tmor 15 参考指南安全停止点若要停止操作, 请将板密封并在 3 C 至 8 C 下存储, 最长可存放 2 天或者, 请将板整夜留在扩增仪上为靶点建立标签此流程会为扩增后 DNA 加上标记, 添加标签 1 (i7) 接头和标签 2 (i5) 接头及形成簇所需的序列, 同时每个文库都会分配到唯一的标签 1 和标签 2 接头组合耗材标签 1 (i7) 接头和橙色管帽标签 2 (i5) 接头和白色管帽 TAM(TrSight 肿瘤扩增混合液 ) 1.7 毫升微量离心管 ( 每个标签接头试管 1 个 ) 准备 Microseal A 封膜 Microseal B 粘性密封膜注意如要在将板放到扩增仪上之前密封板, 请使用 Microseal A 对于要求使用密封板的其他步骤, 请使用 Microseal B 1 准备下列耗材 : 物品存储说明标签接头 (i7 和 i5) TAM -25 C 到 -15 C -25 C 到 -15 C 仅取走正在使用的接头在室温下解冻 20 分钟振荡每个试管以混匀溶液使用 1.7 毫升微量离心管作为离心机中的支架 / 接头进行短暂的离心在室温下解冻 20 分钟振荡试管混匀溶液然后, 进行短暂的离心 2 在带热盖的扩增仪上将以下程序另存为 TST15 PCR2 选择预热盖选项, 并将其设置为 102 C 将反应液剂量设为 50 微升 98 C 下 30 秒钟 17 次以下循环 : 98 C 下 20 秒钟 60 C 下 30 秒钟 72 C 下 45 秒钟 72 C 下 5 分钟保持在 10 C 程序 1 在 TrSeq 标签板定位装置的顶行布置标签 1 (i7) 接头 2 在 TrSeq 标签板定位装置的 A B 行布置标签 2 (i5) 接头, 以使混合液 A 和混合液 B 获取唯一的 i5/i7 标签组合例如,A 行的 A501 用于混合液 A,B 行的 A502 用于混合液 B 3 记录为进行样品测序, 对每个样品所使用的标签接头 8

a 将标签 2 (i5) 接头 (i501 和 i502) 分别移到 C 行和 D 行 (i501 移到 C 行,i502 移到 D 行 ) b 将顶行的标签 1 (i7) 接头更换为第二组 (R725 R736) c 使用多通道移液器, 将各标签 2 (i5) 接头分别加 4 微升到 C 行和 D 行中将每个 i5 接头试管上的管帽更换为新的白色管帽 d

13 TrSight Tmor 15 参考指南 4 将板置于 TrSeq 标签板定位装置上图 2 标签板定位装置 A 1 12 列 : 标签 1 (i7) 接头 ( 橙色管帽 ) B A B 行 : 标签 2 (i5) 接头 ( 白色管帽 ) C 96 孔板 5 对于样品 1 12, 执行下列操作 : a b 使用多通道移液器, 将各标签 2 (i5) 接头 (i501 和 i502) 分别加 4 微升到 A 行和 B 行中如果您没有多余的样品, 则将每个 i5 接头试管上的管帽更换为新的白色管帽使用多通道移液器, 将各标签 1 (i7) 接头 (R701 R709 R749 R711 R712) 分别加 4 微升到 A 行和 B 行的每一列中将每个 i7 接头试管上的管帽更换为新的橙色管帽 6 对于样品 13-24, 执行下列操作 : a 将标签 2 (i5) 接头 (i501 和 i502) 分别移到 C 行和 D 行 (i501 移到 C 行,i502 移到 D 行 ) b 将顶行的标签 1 (i7) 接头更换为第二组 (R725 R736) c 使用多通道移液器, 将各标签 2 (i5) 接头分别加 4 微升到 C 行和 D 行中将每个 i5 接头试管上的管帽更换为新的白色管帽 d 使用多通道移液器, 将各标签 1 (i7) 接头 (R725 R736) 分别加 4 微升到 C 行和 D 行的每一列中将每个 i7 接头试管上的管帽更换为新的橙色管帽注意记录为准备样品表而使用的标签布置 7 将 27 微升 TAM 加到每个孔中 8 用移液器上下吸打以混匀溶液 9 盖上密封膜, 在 1000 g 下离心 1 分钟 10 立即置于扩增仪上并运行 TST15 PCR2 程序 9

14 TrSight Tmor 15 参考指南安全停止点若要停止操作, 请将板密封并在 -25 C 至 -15 C 下存储, 最长可存放 7 天纯化文库此步骤使用 SPB( 样品纯化微珠 ) 纯化来自其他反应成分的 PCR 产物耗材 SPB( 样品纯化微珠 ) RSB( 重悬缓冲液 ) 新制备的浓度为 80% 的乙醇 (EtOH) 96 孔 MIDI 板 96 孔 PCR 板 Microseal B 粘性密封膜关于试剂使用前将 SPB 恢复到室温在使用的前一刻充分振荡 SPB, 使之完全散开液体的颜色应均匀由于溶液的粘度较高, 请缓慢吸出并分配 SPB 准备 1 准备下列耗材 : 试剂存储说明 SPB 2 C 到 8 C 搁置 30 分钟, 使其恢复到室温 RSB 2 C 到 8 C 搁置 30 分钟, 使其恢复到室温 2 新鲜制备浓度为 80% 的乙醇 3 将一块新的 96 孔 PCR 板标为 PLP ( 纯化文库板 ) 程序 1 在 1000 g 下离心 1 分钟 2 将 40 微升 SPB 加到新 MIDI 板的每个孔中 3 从 PCR 板转移 45 微升上层清液到 MIDI 板相应的孔中 4 盖上密封膜, 以 1800 转 / 分的速度振动 5 分钟 5 在室温下孵育 5 分钟 6 置于磁力架上, 并等到微珠粘附到磁块上为止 ( 约 2 分钟 ) 7 取出并丢弃每个孔中的所有上层清液 10

15 TrSight Tmor 15 参考指南 8 按如下方式清洗两次 a b c 将 200 微升新制备的浓度为 80% 的乙醇加到每个孔中在磁力架上孵育 30 秒钟取出并丢弃每个孔中的所有上层清液 9 使用 20 微升移液器从每个孔中取出残余的 80% 乙醇 10 在磁力架上风干 5 分钟 11 将 32 微升 RSB 加到每个孔中 12 盖上密封膜, 以 1800 转 / 分的速度振动 2 分钟如果微珠未重悬, 应用移液器上下吸打以混匀溶液或重复以 1800 转 / 分的速度振动 2 分钟 13 在室温下孵育 2 分钟 14 置于磁力架上, 并等到液体变得清澈为止 ( 约 2 分钟 ) 15 从每个孔中转移 30 微升上层清液到 PLP 板相应的孔中 16 盖上密封膜, 在 1000 g 下离心 1 分钟安全停止点若要停止操作, 请将 PCR 板密封并在 -25 C 至 -15 C 下存储, 最长可存放 2 个月检查文库执行下列程序可对文库定量, 并检查文库质量精确定量 DNA 文库有助于确保在流动槽上实现最佳的簇密度为了得到最佳的结果, 用于对样品测序的文库混合液 A 和 B 的产量不应低于 20 纳克 / 微升文库产量偏低会导致数据质量不佳, 变异报告不够准确耗材 RSB( 重悬缓冲液 ) 准备 96 孔 PCR 板 1.7 毫升微量离心管 1 准备下列耗材 : 物品存储说明 RSB 2 C 到 8 C 搁置 30 分钟, 使其恢复到室温 2 将一块新的 96 孔 PCR 板标为 NLP ( 标准化文库板 ) 11

TrSight Tmor 15 参考指南程序 1 使用 AccClear( 推荐 ) PicoGreen 或 Qbit 等荧光法对文库进行定量 2 按如下方法计算将文库浓度调为 5 纳克 / 微升所需的 RSB 量 a 使用公式 C1V1 = C2V2 来计算 V2 的值, 其中 C1 是文库定量的结果,V1 是 8 微升,C2 是 5 纳克 / 微升 b 计算用于将每个文库的浓度调为 5

16 TrSight Tmor 15 参考指南程序 1 使用 AccClear( 推荐 ) PicoGreen 或 Qbit 等荧光法对文库进行定量 2 按如下方法计算将文库浓度调为 5 纳克 / 微升所需的 RSB 量 a 使用公式 C1V1 = C2V2 来计算 V2 的值, 其中 C1 是文库定量的结果,V1 是 8 微升,C2 是 5 纳克 / 微升 b 计算用于将每个文库的浓度调为 5 纳克 / 微升所需的 RSB 量 (V2-8 微升 ) 3 将所需的 RSB 量加到 NLP 板相应的孔中如果文库 100 纳克 / 微升, 请将 RSB 转移到 1.7 毫升试管 4 将 PLP 板中的的每个文库转移 8 微升到 NLP 板的相应孔或 1.7 毫升试管中 5 采用下列方法之一对每个标准化文库进行等分 : 使用 50 碱基对 DNA 分子量标记物, 通过 2% 琼脂糖凝胶按 15 微升分装使用 DNA 1000 芯片, 通过 Bioanalyzer 按 1 微升分装预计的 PCR 产物约为 350 碱基对, 表示文库扩增成功如果引物二聚体迹象明显 ( 约 160 碱基对 ), 即说明文库制备失败图 3 琼脂糖凝胶示例 A 非模板对照品 B 样品文库 ( 约 350 碱基对 ) C 大小标准 D 靶向扩增子 E 引物二聚体 ( 约 160 碱基对 ) 12

17 TrSight Tmor 15 参考指南图 4 Bioanalyzer 示例 A 标记 B 样品文库 ( 约 350 碱基对 ) C 标记安全停止点若要停止操作, 请将板密封并在 -25 C 至 -15 C 下存储, 最长可存放 14 天混合文库请遵照下列操作流程混合文库耗材 RSB( 重悬缓冲液 ) 1.7 毫升微量离心管 (2 个 ) 关于试剂 PNL 试管在 -25 C 到 -15 C 下最多可以存储 7 天 DNL 试管在 -25 C 到 -15 C 下最多可以存储 7 天准备 1 准备下列耗材物品存储说明 RSB 2 C 到 8 C 搁置 30 分钟, 使其恢复到室温 2 将一个新的 1.7 毫升微量离心管标为 PNL ( 混合标准化文库 ) 3 将一个新的 1.7 毫升微量离心管标为 DNL ( 稀释的标准化文库 ) 4 如果 NLP 板是冷冻存储的, 则需先在室温下解冻, 然后再进行短暂的离心用移液器上下吸打以混匀溶液 5 若要为测序运行做准备, 请按照测序仪器的说明开始解冻试剂 13

18 TrSight Tmor 15 参考指南程序 1 盖上密封膜, 在 1000 g 下将 NLP 板离心 1 分钟 2 将 NLP 板中的每个文库转移 4 微升到 PNL 试管中 3 振荡以混匀溶液, 然后进行短暂的离心 4 将 41 微升 RSB 加到 DNL 试管中 5 从 PNL 试管转移 9 微升液体到 DNL 试管中 6 振荡以混匀溶液, 然后进行短暂的离心, 从而获取 4 纳摩尔 / 升混合文库 14

19 附录 A 支持信息支持信息简介 15 缩写 15 试剂盒内含物品 15 耗材和设备 16 标签序列 19 简介本指南中介绍的操作流程假定您已查看本节内容, 确认了工作流程内容, 并且已取得所有需要的耗材和设备缩写缩写 DAL DNL HP3 HT1 NLP PLP PNL RSB SPB TAM TPA TPB TTE TTM 定义变性的扩增子文库稀释的标准化文库 2 摩尔 / 升 NaOH 杂交缓冲液标准化文库板纯化文库板已混合的标准化文库重悬缓冲液样品纯化微珠 TrSight 肿瘤扩增混合液 TrSight 肿瘤引物混合液 A TrSight 肿瘤引物混合液 B TrSight 肿瘤靶向酶 TrSight 肿瘤靶向混合液试剂盒内含物品请确保您已备齐本节指定的所有试剂后再继续执行文库制备程序第 1 盒 (PCR 后 ) 存储于 -25 C 至 -15 C 温度下数量试剂描述 1 TTM TrSight 肿瘤靶向混合液 1 TTE TrSight 肿瘤靶向酶 1 TPA TrSight 肿瘤引物混合液 A 1 TPB TrSight 肿瘤引物混合液 B 15

20 TrSight Tmor 15 参考指南第 2 盒 (PCR 后 ) 存储于 -25 C 至 -15 C 温度下数量试剂描述 2 TAM TrSight 肿瘤扩增混合液 1 HP3 2 摩尔 / 升 NaOH 2 A501 A502 i5 标签接头 24 R701-R709 R711 R712 R749 R725 R736 i7 标签接头第 3 盒 (PCR 后 ) 存储于 2 至 8 温度下数量试剂描述 1 SPB 样品纯化微珠 1 RSB 重悬缓冲液耗材和设备执行实验分析方法需要使用以下耗材和设备, 但 TrSight Chimerism 试剂盒中不包含这些耗材和设备操作流程已经过优化, 并使用所列项目对其进行验证如果使用其他耗材和设备来代替, 则不保证性能保持同样水准耗材耗材供应商 1.7 毫升微量离心管一般实验室供应商 20 微升多通道移液器一般实验室供应商 200 微升多通道移液器一般实验室供应商 20 微升带滤芯移液器吸头一般实验室供应商 200 微升带滤芯移液器吸头一般实验室供应商 1000 微升带滤芯移液器吸头一般实验室供应商 96 孔透明平底黑色微孔板注意 : 在用 SpectraMax M5 荧光光谱仪定量样品时使用 Corning, 部件号孔存储板, 圆孔,0.8 毫升 (MIDI 板 ) Fisher Scientific, 部件号 AB-0859 圆锥形离心管 (15 毫升或 50 毫升 ) 分子生物学用无水纯乙醇 (500 毫升 ) 96 孔 PCR 板注意 : 请使用与扩增仪兼容的 PCR 板 ( 请参见扩增仪 ( 第 18 页 )) Microseal A 封膜 Microseal B 粘性密封膜 PCR 级用水一般实验室供应商 SigmaAldrich, 部件号 E7023 一般实验室供应商 Bio-Rad, 部件号 MSA-5001 Bio-Rad, 部件号 MSB-1001 一般实验室供应商 16

21 TrSight Tmor 15 参考指南耗材不含 RNase/DNase 的一次性多通道试剂槽无 RNase/DNase 水供应商 VWR, 部件号一般实验室供应商荧光基定量试剂, 例如 AccClear( 推荐 ) Qbit 或 PicoGreen AccClear 超高敏感度 dsdna 定量试剂盒 Biotim, 商品目录号以下其中一个 ( 用于验证文库 ): 2% 琼脂糖凝胶 DNA 1000 芯片一般实验室供应商 Agilent, 部件号 [ 可选 ] 螺帽试管一般实验室供应商测序试剂盒 [ 可选 ] 设备 PhiX 对照品 v3 MiSeq 试剂盒 v3,600 次循环商品目录号 FC MS 设备设备以下磁力架之一 : Magnetic Stand-96 DynaMag-96 Side Skirted Magnet 微量离心机微孔板离心机微孔板荧光检测仪振荡器以下 96 孔扩增仪之一 : C1000 Toch 扩增仪 S1000 扩增仪 Veriti 扩增仪以下微孔板混合器之一 : BioShake iq 高速热混合器 BioShake XP 高速混合器 VWR 高级高速微孔板混合器 VWR Signatre 高速微孔板混合器以下其中一个 ( 用于文库验证 ): 凝胶电泳设备 2100 Bioanalyzer 桌面系统供应商 / 描述 Thermo Fisher, 商品目录号 AM10027 Thermo Fisher, 商品目录号一般实验室供应商一般实验室供应商一般实验室供应商一般实验室供应商 Bio-Rad, 部件号 Bio-Rad, 部件号 Thermo Fisher, 商品目录号 Q Instrments, 型号 Q Instrments, 型号 VWR, 商品目录号 (230 伏 ) VWR, 商品目录号 (110 伏 /120 伏 ) 一般实验室供应商 Agilent, 部件号 G2940CA 和 TrSeq 标签板定位装置套件 [ 可选 ] 设备 [ 可选 ] TrSeq 标签板定位装置套件注意 : 建议用其设置标签接头此部件可重复使用供应商 Illmina, 商品目录号 FC

22 TrSight Tmor 15 参考指南扩增仪扩增仪 TST PCR1 预计运行时间 TST PCR1 54 C 和 72 C 循环步骤升降温率 * Bio-Rad C1000 扩增仪 3:08:02 下降 0.1 C/s 上升 0.1 C/s Bio-Rad S1000 扩增仪 3:51:52 下降 0.1 C/s Applied Biosystems GeneAmp PCR 系统 :55:00 下降 7% 上升上升 7% Applied Biosystems Veriti 扩增仪 3:06:00 下降 4.5% 0.1 C/s 上升 4.0% Eppendorf Mastercycler ep Gradient 3:14:00 下降 6% 上升 4% Eppendorf Mastercycler ep Gradient-S 2:50:00 下降 2% 上升 2% * 其他所有 TST PCR1 步骤和所有 TST PCR2 步骤都需要使用默认或最大扩增仪升降温率 18

23 TrSight Tmor 15 参考指南标签序列采用下列序列设置运行标签 A501 A502 R701 R702 R703 R704 R705 R706 R707 R708 R709 R749 R711 R712 R725 R726 R727 R728 R729 R730 R731 R732 R733 R734 R735 R736 序列 TGAACCTT TGCTAAGT ATCACG CGATGT TTAGGC TGACCA ACAGTG GCCAAT CAGATC ACTTGA GATCAG GATGCT GGCTAC CTTGTA ACTGAT ATGAGC ATTCCT CAAAAG CAACTA CACCGG CACGAT CACTCA CAGGCG CATGGC CATTTT CCAACA 19

24 技术协助如需技术协助, 请与 Illmina 技术支持部门联系网站 : 电子邮件 : techspport@illmina.com Illmina 客户支持部门电话号码地区免费电话区域电话北美澳大利亚爱尔兰奥地利比利时丹麦德国法国芬兰荷兰挪威日本瑞典瑞士西班牙新加坡新西兰意大利英国中国中国台湾中国香港其他国家 / 地区安全数据表 (safety data sheet, 简称 SDS) 可通过 Illmina 网站 (spport.illmina.com/sds.html) 获取产品文档可通过 Illmina 网站下载 PDF 版本请转到 spport.illmina.com, 选择一个产品, 然后选择 Docmentation & Literatre( 文档与文献 ) 20

TruSight Tumor 15 文库制备参考指南 ( )

TruSight Tumor 15 文库制备参考指南 ( ) TruSight Tumor 15 参考指南仅供研究使用, 不可用于诊断程序 ILLUMINA 所有文档号 1000000001245 v05 CHS 2016 年 9 月使用自定义操作流程选择器自定义简要的端到端工作流程指南 support.illumina.com/custom-protocol-selector.html 本文档及其内容归 Illumina, Inc. 及其附属公司 (