764 战润庆, 等膳食维生素 D 摄入与非小细胞肺癌发病风险的病例对照研究 HospitalofTraditionalChineseMedicine),and00sex andage matched(± 3years)controlsfromthephysicalexami nationcente

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1 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 流行病学研究 / 论著 膳食维生素犇摄入与非小细胞肺癌发病风险的病例对照研究 战润庆 1 李时捷 1 沈晓丽 梁军 3 张文峰 1 高锋善 4 1. 青岛大学附属海慈医院胸外科, 山东青岛 青岛大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室, 山东青岛 青岛大学附属医院肿瘤科, 山东青岛 平度市中医医院胸外科, 山东平度 摘要 目的已有研究显示, 维生素 D(VitminD,VitD) 与多种肿瘤发病相关, 而膳食摄入是人体获得 VitD 的重要途径, 本研究采用病例对照研究及膳食调查法探讨膳食 VitD 摄入对非小细胞肺癌 (non smalcellungcancer,nsclc) 发病风险的影响 方法采用 1 1 配对病例对照研究方法, 选择 青岛大学附属医院 (58 例 ) 和青岛大学附属海慈医院 (116 例 ) 及平度市中医医院 (6 例 ) 确诊的 00 例 NSCLC 患者, 选取同时期 3 家医院健康体检中心性别 年龄 (±3 岁 ) 匹配的 00 名健康查体者为对照, 通过包含 79 条项目的食物频率问卷 (foodfrequencyquestion naire,ffq) 调查研究对象既往 1 年膳食 VitD 摄入情况 条件 Logistic 回归分析 VitD 摄入量对 NSCLC 发病风险的影 响, χ 趋势检验分析两者之间的剂量 反应关系 结果病例组和对照组膳食 VitD 日平均摄入量分别为 (5.41± 1.19) μ g 和 (7.53±1.58) μ g, 差异有统计学意义, 犣 =3.87, 犘 <0.001 单因素条件 logistic 回归分析显示, 与 VitD 摄入量最低四分位组 (VitD 摄入量 <4μg/d) 相比, 第 分位组 (VitD 摄入量 4~7μg/d) 的 OR(95%CI) 值为 0.67 (0.37~1.18) 第 3 分位组 (VitD 摄入量 7~10μg/d)OR(95%CI) 值为 0.56(0.3~0.97) 第 4 分位组 (VitD 摄入量 >10μg/d)OR(95%CI) 值为 0.48(0.7~0.85), 随着膳食 VitD 日平均摄入量的增加,NSCLC 发病的 OR 值逐渐下降, 两者之间存在剂量 反应关系, χ =45.8, 犘 <0.001 在校正体质指数 教育程度 家庭收入 肿瘤家族史 户外活动 吸烟 被动吸烟 接受饮食健康指导 维生素 A 维生素 C 维生素 E 及硒的日平均摄入量后, 上述负性关联仍然存在, 与 Vit D 摄入量最低四分位组相比, 第 分位组调整 OR(95%CI) 值为 0.71(0.43~0.94) 第 3 分位组调整 OR(95%CI) 值为 0.54(0.34~0.71) 第 4 分位组调整 OR(95%CI) 值为 0.39(0.4~0.64) 结论病风险 关键词 非小细胞肺癌 ; 维生素 D; 病例对照研究 ; 食物频率法 膳食 VitD 摄入不足增加 NSCLC 发 中华肿瘤防治杂志,016,3(1): 犇犻犲狋犪狉狔犻狀狋犪犽犲狅犳狏犻狋犪犿犻狀犇犪狀犱狉犻狊犽狅犳狀狅狀 狊犿犪犾犮犲犾犾狌狀犵犮犪狀犮犲狉 : 犃犮犪狊犲犮狅狀狋狉狅犾狊狋狌犱狔 犣犎犃犖犚狌狀 1 狇犻狀犵, 犔犐犛犺犻 1 犼犻犲, 犛犎犈犖犡犻犪狅 犾犻, 犔犐犃犖犌犑狌狀 3, 犣犎犃犖犌犠犲狀 1 4 犳犲狀犵, 犌犃犗犉犲狀犵 狊犺犪狀 1. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犜犺狅狉犪犮犻犮犛狌狉犵犲狉狔, 犙犻狀犵犱犪狅犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎犻狊犲狉犎狅狊狆犻狋犪犾, 犙犻狀犵犱犪狅 66034, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犈狆犻犱犲犿犻狅犾狅犵狔犪狀犱犎犲犪犾狋犺犛狋犪狋犻狊狋犻犮狊, 犆狅犾犲犵犲狅犳犘狌犫犾犻犮犎犲犪犾狋犺, 犙犻狀犵犱犪狅犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犙犻狀犵犱犪狅 6603, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 3. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狀犮狅犾狅犵狔, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犙犻狀犵犱犪狅犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犙犻狀犵犱犪狅 66071, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 4. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犜犺狅狉犪犮犻犮犛狌狉犵犲狉狔, 犘犻狀犵犱狌犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犜狉犪狋犻狅狀犪犾犆犺犻狀犲狊犲犕犲犱犻犮犻狀犲, 犘犻狀犵犱狌 66700, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 VitaminD(VitD)hasbeenreportedtobeassociatedwithseveraltumors,anddietaryin takeisthemainsourceofvitd.theobjectiveofthisstudywastoexploretheassociationbetweendietaryintakeofvit Dandriskofnon smalcellungcancer (NSCLC). 犕犈犜犎犗犇犛 From December15th,014to March8th,015,a 1 1matchedcasecontrolstudywasconducted.Respondentsincluded00 NSCLCcases (58casesfromtheAfiliated HospitalofQingdao University,116casesfrom Qingdao University Afiliated Hiser Hospital,6casesfrom Pingdu 第一作者简介 战润庆, 男, 山东龙口人, 硕士, 主治医师, 主要从事肺癌发病机制及综合治疗方面的研究工作 Tel: E mail:haicizrq@163.com 通讯作者简介 张文峰, 男, 辽宁鞍山人, 博士, 主任医师, 硕士生导师, 主要从事肺癌发病机制及综合治疗方面的研究工作 Tel: E mail:zwfzrq@sina.com

2 764 战润庆, 等膳食维生素 D 摄入与非小细胞肺癌发病风险的病例对照研究 HospitalofTraditionalChineseMedicine),and00sex andage matched(± 3years)controlsfromthephysicalexami nationcenterofthesamehospital.facetofaceinterviewswereperformedtogettheinformationoncovariates.theha bitualdietaryintakewasdeterminedbya79 itemfoodfrequencyquestionnaire.conditionallogisticregressionwasadap tedtoanalysistheassociationbetweendietaryintakeofvitdandtheriskofnsclc.trendofchi squaretestwasadap tedtoanalysisdose responserelationshipbetweenthem. 犚犈犛犝犔犜犛 ThedietaryintakeofvitaminDinNSCLCpatients was(5.41±1.19) μ g,whichwaslowercomparedwith(7.53±1.58) μ gincontrols(z=3.87, 犘 <0.001).Theunivariate logisticanalysisshowedthatthensclcoddsratios(95%ci)forthequartilewas0.67( ),forthequartile 3was0.56( ),forthequartile4was0.48( ),accordingtothelowestquartileofVitDdietaryin take.thereisadose responserelationshipbetweennsclcoddsratiosandvitddietaryintake.withtheincreasingof VitDdietaryintake,theoddsratiosofNSCLCdropped.Afteradjustmentforpotentialcovariatesindemography,socioe conomics,healthbehaviors,bodymassindexandsomenutrients,thenegtiveassociationswasstilsignificant.according tothelowestquartileofvitddietaryintake,theadjustedoddsratiosforthequartilewas0.71( ),forthe quartile3was0.54( ),forthequartile4was0.39( ). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 Deficiencyindietaryintake ofvitamindisassociatedwithhigherriskofnsclc. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] non smalcellungcancer;vitamind;case controlstudy;foodfrequencymethod 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,016,3(1): 中图分类号 R734. 文献标识码 A 文章编号 (016) 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤, 居恶性肿瘤相关死亡原因居首位, 其中非小细胞肺癌 (non smalcel lungcancer,nsclc) 约占肺癌总数的 80%~85% [1] 1 世纪中国卫生部第三次死因回顾抽样调查结果显示, 肺癌的发病率自 年以每年 1.63% 的 [] 速度增加 肺癌的发生是环境因素与遗传因素共同作用的结果 相对于遗传因素, 对饮食 生活方式等个体差异较大的环境因素进行干预是预防肺癌发生的主要措施 近年来, 维生素 D(VitminD,VitD) 及其代 [3] 谢产物在癌症中的作用逐渐受到关注,VitD 通过抗增殖 促凋亡 促分化及抗血管形成等机制, 在癌症 [4] 发生与进展过程发挥重要作用 饮食是人们获取 VitD 安全有效的途径之一, 实验表明提高小鼠饲料 [5 6] VitD 的含量可降低其结肠癌发生率 ; 流行病学研究证实, 血浆 VitD 水平与肺癌发生发展及预后有 [7] [8] 关, 补充 VitD 能降低肺癌等恶性肿瘤的死亡率 目前国内尚未见膳食 VitD 摄入对肺癌发病影响的研究 本研究采用 1 1 病例对照研究的方法, 应用食物频率问卷 (foodfrequencyquestionnaire,ffq) 法对青岛地区 3 家医院就诊的肺癌患者膳食 VitD 摄入情况进行调查, 为探讨国人膳食 VitD 摄入情况与肺癌发病之间的关系提供依据 1 对象与方法 1.1 研究对象选取 青岛大学附属医院 (58 例 ) 和青岛市海慈医疗集团 (116 例 ) 及平度市中医医院 (6 例 ) 确诊的 NSCLC 患者 00 例作为病例组, 男 153 例, 女 47 例 年龄 39~76 岁, 中位年龄 58 岁 所有病例均经病理确诊为原发性肺癌, 其中鳞癌 10 例 (51.0%), 腺癌 93 例 (46.5%), 腺鳞癌 4 例 (%), 类癌 1 例 (0.5%) 依据国际肺癌研究协会 009 年第 7 版分期标准 (IASLC009),Ⅰ 期 39 例 (19.5%),Ⅱ 期 57 例 (8.5%),Ⅲ 期 93 例 (46.5%), Ⅳ 期 11 例 (5.5%) 所有病例确诊至接受调查时间为 1 个月以内 排除标准 :1) 合并肝肾功能不全 糖尿病和甲状腺功能异常等营养代谢相关疾病者 ;) 服用 VitD 补充剂者 ;3) 曾接受激素治疗者 ;4) 本地居住时间短于 5 年者 按 1 1 配对原则, 选取同时期 3 所医院查体中心接诊的性别相同, 年龄 ±3 岁志愿者 00 名作为对照组, 排除标准同病例组 本研究经青岛大学医学伦理委员会批准, 伦理编号 :014087, 病例和对照组调查对象均签署知情同意书 1. 调查内容与方法由经过培训的 6 名预防医学专业本科实习生担任调查员, 采用面对面访谈方式对研究对象进行调查, 调查内容包括一般情况和膳食调查两大部分 一般情况包括 : 调查对象家庭基本情况 年龄 职业 ( 设公职人员 教师 科研及智力研发 专业技术人员 企业管理人员 办事人员 技术工人 力工 ( 含农民工 ) 农民 商业服务人员 军人和其他 1 个选项, 科研和智力研发归为纯脑力劳动, 公职人员 教师 专业技术人员 企业管理人员 办事人员归为脑力劳动为主, 力工及农民归为纯体力劳动, 技术工人 商业服务人员 军人归为体力为主 教育程度 经济收入 主要慢性疾病史 肿瘤家族史 吸烟 饮酒和户外活动情况等 膳食调查采用 FFQ 法收集调查对象过去 1 年的膳食摄入情况 [9] FFQ 问卷包括 9 大类 79 条, 信度效度已经检验

3 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 通过提问方式让调查对象回顾过去 1 年内每种食物每天 每周 每月或每年的摄入频率及平均每次的食用量, 配合使用彩色食物及餐具图谱以辅助调查对象判断食用量 客观指标如身高 体质量采用直接测量法测量 制定统一质量控制标准, 调查员接受统一培训, 每日调查结束后对调查表质量进行审核 1.3 统计学方法采用 EpiData3.1 双录入数据建立数据库,Food NutritionCalculator(V1.60) 软件计算膳食 VitD 的日平均摄入量,SPSS17.0 进行数据分析 采用狋检验或 χ 检验比较病例组和对照组一般情况的差异 采用条件 logistic 回归分析 VitD 日平均摄入量和 NSCLC 发病风险的关系 根据病例组和对照组膳食 VitD 日平均摄入量的混合四分位数界值, 将病例组和对照组调查对象分为 4 组 (Q1~Q4), 以 Q1 组为参照, 计算其他各组的比值比 (oddsratio,or) 及 95% gistic 回归分析校正年龄 性别 体质指数 文化程度 职业 家庭收入 肿瘤家族史 户外活动量 吸烟 被动吸烟 饮酒 接受饮食健康指导 维生素 A 维生素 C 维生素 E 及硒的日平均摄入量因素, 计算调整 OR 值 采用 χ 趋势检验分析 VitD 日平均摄入量与 NSCLC 发病风险之间的剂量 反应关系 结果.1 一般情况 表 1 示, 病例组和对照组中位年龄分别为 58 和 56 岁, 两组在年龄 职业 维生素 E 日平均摄入量和硒日平均摄入量方面差异无统计学意义 病例组和对照组在体质指数 教育程度 家庭收入 肿瘤家族史 吸烟 被动吸烟 户外活动 曾接受饮食健康指导 维生素 A 日均摄入量和维生素 C 日均摄入量方面差异有统计学意义 置信区间 (confidenceinterval,ci) 采用多因素 lo 表 1 病例组和对照组一般情况和部分危险因素比较 变量 病例 ( 狀 =00) 对照 ( 狀 =00) 犣值 / χ 值 犘值 年龄 ( 岁 ) 58(39~76) 56(38~73) 0.38 a 0.80 体质指数 (kg/m ) 0.7± ± a 0.00 教育程度 狀 (%) 初中及以下 83(41.5) 16(63.0) 高中或中专 38(19.0) 4(1.0) 18.5 <0.001 大专及以上 79(39.5) 50(5.0) 家庭收入 ( 元 / 月 / 人 ) 狀 (%) 500 5(1.3) 5(.5) 501~000 79(39.6) 54(7.0) 001~ (33.) 93(46.5) > (15.0) 48(4.0) 职业 狀 (%) 纯脑力劳动 45(.5) 54(7.0) 脑力劳动为主 53(6.5) 47(3.5) 6.77 <0.001 纯体力劳动 7(13.5) 6(13.0) 体力劳动为主 60(30.0) 6(31.0) 其他 15(7.5) 11(5.5) 肿瘤家族史 狀 (%) 4(1.0) 8(4.0) 吸烟 狀 (%) 118(59.0) 61(30.5) 3.85 <0.001 被动吸烟 狀 (%) 94(47.0) 4(1.0) <0.001 饮酒 狀 (%) 54(7.0) 47(3.5) 户外活动 ( 小时 / 周 ) 4.6± ± a 0.01 曾接受饮食健康指导 狀 (%) 4(1.0) 87(43.5) <0.001 维生素 A 日平均摄入量 ( μ g) 659.8± ± a 维生素 E 日平均摄入量 (mg) 13.53± ± a 0.54 维生素 C 日平均摄入量 (mg) 95.47± ± a 硒日平均摄入量 ( μ g) 49.88± ± a 0.45 注 : a 为犣值. 病例组与对照组膳食犞犻狋犇日平均摄入量差异病例组膳食 Vit D 日平均摄入量为 (5.41± 1.19) μ g, 低于对照组的 (7.53±1.58) μ g, 差异有统计学意义, 犣 =3.87, 犘 < 膳食犞犻狋犇日平均摄入量对犖犛犆犔犆发病的影响根据病例组和对照组膳食 VitD 日平均摄入量的混合四分位数界值, 将病例组和对照组研究对象分为 4 组 (Q1~Q4), 以 Q1 组为参照 单因素条件 logistic

4 766 战润庆, 等膳食维生素 D 摄入与非小细胞肺癌发病风险的病例对照研究 回归分析显示, 与 VitD 摄入量最低四分位组 (Q1 组 ) 相比, 第 分位组 (Q 组 ) 的 OR 值 (95%CI) 为 0.67 (0.37~1.18) 第 3 分位组 (Q3 组 )OR 值 (95%CI) 为 0.56(0.3~0.97) 第 4 分位组 (Q4 组 )OR 值 (95%CI) 为 0.48(0.7~0.85), 随着膳食 VitD 日平均摄入量的 增加,NSCLC 发病的 OR 值逐渐下降, χ 趋势检验显示 VitD 日平均摄入量与 NSCLC 发病的 OR 值呈现剂量反应关系 ( χ =45.8, 犘 <0.001), 提示膳食 VitD 是 NSCLC 的保护因素 调整体质指数 教育程度 家庭收入 肿瘤家族史 户外活动 吸烟 被动吸烟 接受饮食健康指导 维生素 A 维生素 C 维生素 E 及硒的日平均摄入量因素后, 与 Q1 组相比,Q 组 OR(95%CI) 值为 0.71(0.43~0.94) Q3 组 OR(95%CI) 值为 0.54 (0.34~0.71) Q4 组 OR(95%CI) 值为 0.39(0.4~ 0.64),VitD 摄入与肺癌的关联未发生明显改变, 结果见表 表 膳食 VitD 日平均摄入量与 NSCLC 发病风险相关性 分组 VitD 摄入量 ( μ g/d) 病例 / 对照 ( 狀 ) OR(95% CI) 调整 OR a (95%CI) 调整 OR b (95%CI) Q1 <4 60/ Q 4~7 49/ (0.37~1.18) 0.63(0.38,0.84) 0.71(0.43,0.94) Q3 >7~10 50/ (0.3~0.97) 0.48(0.1,0.63) 0.54(0.34,0.71) Q4 >10 41/ (0.7~0.85) 0.37(0.16,0.58) 0.39(0.4,0.64) 注 : 调整 OR a 值调整因素包括体质指数 教育程度 家庭收入 肿瘤家族史 户外活动 吸烟 被动吸烟和接受饮食健康指导 ; 调整 OR b 值调整因 素包括体质指数 教育程度 家庭收入 肿瘤家族史 户外活动 吸烟 被动吸烟 接受饮食健康指导 维生素 A 日平均摄入量 维生素 C 日平均摄入 量 维生素 E 日平均摄入量和硒日平均摄入量 3 讨论目前研究认为, 人类饮食习惯与肺癌的发生有关, 增加富含维生素 C 维生素 E 维生素 A 及硒等微量元 [10 11] 素的饮食摄入有利于降低肺癌的发病风险 但是关于膳食 VitD 摄入与肺癌发病的关系仍存有争论, [1] Kilkkinen 等通过一项队列研究发现,VitD 摄入和肺癌的发病风险无关, 然而此后进一步的分层研究表明在女性及年轻人群中高水平的 VitD 摄入与肺癌的发病风险负相关 本研究发现将 NSCLC 病例组和健康对照组根据膳食 VitD 摄入量高低分组后, 随着膳食 VitD 日平均摄入量的增加,NSCLC 发病的 OR 值逐渐下降, 提示膳食 VitD 摄入是肺癌的保护性因素 考虑到这一结果在代表 VitD 与肺癌发病之间真正关联的同时也存在受到与 VitD 膳食摄入有关的其他膳食因素及非膳食因素的混杂作用影响的可能, 本研究校正了体质指数 文化程度 职业 家庭收入 户外活动量 肿瘤家族史 吸烟 被动吸烟等非膳食因素及维生素 A 维生素 C 维生素 E 和硒的日平均摄入量等膳食因素后,VitD 摄入与 NSCLC 发病的负性关联未发生明显改变, 表明膳食 VitD 摄入量增加能够降低 [13] NSCLC 的发病风险 马良等报道低 VitD 饮食习 [14] 惯可增加食管鳞癌发病风险, 陆嵘等报道增加富含 VitD 的饮食摄入有助于降低结肠癌的发病率, 但是目前尚未发现关于膳食 VitD 与肺癌发病关系的研究报道 本研究结果显示, 病例组及对照组户外活动时间差异有统计学意义 虽然日光照射是人体合成 VitD 的主要来源, 但是中国北方地区地处较高纬度, 由于日 光照射不足而导致的 VitD 缺乏现象严重, 近年来的城市生活习惯的改变 气候变化和大气污染等因素进一步降低了有效日光照射量, 膳食摄入是较高纬度地 [15] 区或冬春季节人体获取 VitD 的主要来源 青岛地区处于北纬 36, 属于较高纬度地区, 日光照射对居民体内 VitD 含量影响很小, 膳食 VitD 摄入差异成为决定居民体内 VitD 水平的主要因素 虽然 VitD 与包括恶性肿瘤在内的多种慢性疾病相关, 但是补充 VitD 也会增加肾结石和骨折发生风险, 服用 VitD 制剂的安全 有效剂量尚处于争论阶段, 目前国际上不推 [16] 荐采用 VitD 药物干预措施预防癌症等慢性疾病 目前阶段, 通过更为安全的膳食摄入途径进行肺癌预防干预应该是较为理想的选择 本研究发现病例组接受正规健康饮食教育的比例明显低于对照组, 提示从预防肺癌发生的角度应加强健康饮食教育, 指导人们在增加阳光照射的同时, 适当增加富含 VitD 的食物如海洋鱼类 动物肝脏 奶制品和蘑菇等的摄入频率和数量 VitD 发挥抗癌效应的靶细胞是肿瘤细胞或即将转变为肿瘤细胞的正常细胞, 抗癌机制与其具有抑制细胞增殖 促进细胞凋亡和抑制血管新生的作用有 [4] [17] 关 近年来,Shin 等研究证实体内缺乏 VitD 与肺腺癌患者表皮生长因子受体 (EGFR) 突变密切相 [18] 关 Zhang 等的研究亦发现,VitD 用于治疗 EG FR 突变的肺癌细胞系效果优于 KRAS 突变的细胞系, 无论肺癌细胞系对厄洛替尼耐药与否,VitD 与厄洛替尼联合用药效果均优于单独应用厄洛替尼 冯应 [19] 勤等通过体外实验证实盐酸埃克替尼与 VitD 联合用药对人肺腺癌 A549 细胞具有协同抗增殖作用

5 櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 这些研究为探索 VitD 抗肺癌的机制及应用 VitD 作为辅助治疗手段参与肺癌防治提供了新的研究方向 本研究对象分别选自青岛地区省市县级三家医院, 病例组和对照组研究对象的选取和排除遵循相同标准, 降低了选择偏倚 所有研究对象均为本地区居住 5 年以上的常住人口, 病例组为确诊 1 个月以内的新发病例, 通过 FFQ 法调查其发病前 1 年的饮食习惯, 避免了因罹患肺癌可能导致研究对象饮食习惯发生改变而引起的假性关联 本研究亦存在不足之处, 如对照组研究对象选自健康体检人群, 相对于病例组该人群普遍具有较强的健康保健意识, 较好的生活方式 教育程度和经济收入, 且居住地相对于病例组更局限于就诊医院周边, 难以避免由以上因素造成选择偏倚, 如有条件需在今后研究中选择普通人群作为研究对象, 避免选择偏倚的产生 此外, 本研究采用回顾性问卷调查方法难以完全避免被调查对象出现回忆偏倚, 未能采集调查对象血液标本测定体内 VitD 水平 同时, 本研究为病例对照研究, 仅提供了病因线索, 要证明膳食 VitD 摄入不足增加肺癌发病风险, 需进一步进行队列研究 参考文献 [1] MaioneP,RossiA,SaccoPC,etal.Advancesinchemotherapy inadvancednon smal cellungcancer[j].expertopinpharma cother,010,11(18): [] 陈万青, 张思维, 邹小农. 中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究 [J]. 中国肺癌杂志,010,13(5): [3] H bausj,thiem U,HummelDM,etal.Roleofcalcium,vita mind,andtheextrarenalvitamindhydroxylasesincarcinogen esis[j].anti canceragentsmedchem,013,13(1):0 35. [4] FeldmaD,KrishnanAV,SwamiS,etal.TheroleofvitminD inreducingcancerriskandprogression[j].natrev Cancer, 014,14(5): [5] MeekerS,SeamonsA,PaikJ,etal.Increaseddietaryvitamin Dsuppresses MAPK signaling,colitis,andcoloncancer[j]. CancerRes,014,74(16): [6] HummelDM,Thiem U,H bausj,etal.preventionofpreneo plasticlesionsbydietaryvitamindinamousemodelofcolorec talcarcinogenesis[j].jsteroidbiochem MolBiol,013,136 (6): [7] LiR,LouY,ZhangW,etal.VitaminDinhibitionoflungade nocarcinomacelproliferationinvitro[j].tumorbiol,014,35 (11): [8] BjelakovicG,GluudLL,NikolovaD,etal.VitaminDsupple mentforpreventionofmortalityinadults[j].cochranedata basesysrev,014,10(1):cd [9] ZhangCX,HoSC.Validityandreproducibilityofafoodfre quencyquestionnaireamongchinesewomeninguangdongprov ince[j].asiapacjclinnutr,009,18(): [10] HosseiniM,NaghanPA,JafariAM,etal.Nutritionandlung cancer:acasecontrostudyiniran[j].bmccancer,014,14: [11] BüchnerFL,Bueno de Mesquita HB,Ros MM,etal.Variety infruitandvegetableconsumptionandriskoflungcancerinthe Europeanprospectiveinvestigationintocancerandnutrition[J]. CancerEpidemiolBiomarkersPrev,010,19(9): [1] KilkkinenA,KnektP,Heli vaara M,etal.VitaminDstatus andtheriskoflungcancer:acohortstudyinfinland[j].cancer EpidemiolBiomarkersPrev,008,17(11): [13] 马良, 徐延钧, 杨建洲, 等. 血浆维生素 D 水平与食管鳞癌发生的关系 [J]. 中华内科杂志,015,54(1): [14] 陆嵘, 房静远. 饮食因素与结肠癌 [J]. 肠内与肠外营养,006, 13(5): [15] 周波, 王晓红, 郭连莹, 等. 中国北方地区老年人冬季维生素 D 缺乏与骨量丢失 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,011,15 (6): [16] MeyerHE,HolvikK,LipsP.ShouldvitaminDsupplementsbe recommendedto preventchronicdiseases? [J].BMJ,015, 350:h31. [17] Shin DY,Kim S,ParkS,etal.Serum 5 hydroxyvitamin D levelscorrelatewithegfr mutationalstatusinpulmonaryade nocarcinoma[j].endocrrelatcancer,014,1(5): [18] Zhang Q,KanterewiczB,ShoemakerS,etal.Diferentialre spongseto1α,5 dihydroxyvitmind3(1α,5(oh)d3)innon smalcellungcancercelswithdistinctoncogenemutations[j]. JSteroilBiochem MolBiol,013,136: [19] 冯应勤, 朱金峰, 何兴端, 等. 盐酸埃克替尼联合 1α,5 二羟基维生素 D3 对人肺腺癌 A549 细胞增殖及 EGFR 表达的影响 [J]. 南京医科大学学报 ( 自然科学版 ),014,34(5): 收稿日期 : 修回日期 : ( 编辑 : 王秀华 ) 殮 櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 殮 中华肿瘤防治杂志 唯一投稿网站 殮 殮

6 768 李瑞晓, 等转录因子 EF3 对浸润性膀胱癌细胞因子的调控反应 实验研究 / 论著 转录因子犈 犉 3 对浸润性膀胱癌细胞因子的调控反应 李瑞晓 1 李雪莲 李智 焦勇 1 赵致广 1 王禾 1 张波 1 贾洪涛 3 KamalPohar 3 1. 第四军医大学唐都医院泌尿外科, 陕西西安 西安市中医医院外科, 陕西西安 美国俄亥俄州立大学詹姆斯癌症医院泌尿外科, 俄亥俄州 431 摘要 目的 EF3 在浸润性膀胱癌的发生 发展中起着重要作用, 但是其具体调控分子机制尚不明确, 本研究旨在探讨 EF3 对浸润性膀胱癌细胞调控的分子机制 方法采用 RNAi 技术使 EF3 在浸润性膀胱癌细胞系中低表达, 通过蛋白质印迹法 PCR 进行检测及后续实验, 通过 CHIP 实验等观察 EF3 在 HT1376 和 TCCSUP 细胞系中与信号转导及转录激活因子 3(STAT3) 和 Ets1 之间及其相关侵袭细胞因子的调节关系 结果 EF3 STAT3 和 Ets1 基因在高表达 EF3 细胞系 (HT1376 和 TCCSUP) 中成功被沉默,CHIP 测序显示,EF3 与 Ets1 和 STAT3 基因启动子结合增多只出现在过表达膀胱癌细胞系中 ; 免疫组化和蛋白质印迹法检测结果显示,EF3 过表达细胞癌中,Ets1 和 STAT3 基因过表达, 二者呈正相关, 狉 =0.41, 犘 =0.03;EF3 高表达同时相关细胞因子也增加 (IL 1 IL 8 TNF α 和 VEGFA 等 ),Ets1 和 STAT3 被沉默后, 上述细胞因子也相对降低,CHIP 实验显示, 与低表达 EF3 膀胱癌相比, 在高表达 EF3 膀胱癌中,Ets1 和 STAT3 启动子活性增强 结论 EF3 过表达在人膀胱癌细胞系中通过 Ets1 和 STAT3 调节免疫相关基因的表达,EF3 的过表达促进 Ets1 和 STAT3 的表达 关键词 膀胱癌 ;EF3; 转录激活因子 3;RNAi; 免疫组织化学 中华肿瘤防治杂志,016,3(1): 犜狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犳犪犮狋狅狉狊犈 犉 3 狉犲犵狌犾犪狋犲狊犮狔狋狅犽犻狀犲狉犲狊狆狅狀狊犲犻狀犻狀狏犪狊犻狏犲犫犾犪犱犱犲狉犮犪狀犮犲狉 犔犐犚狌犻 狓犻犪狅 1, 犔犐犡狌犲 犾犻犪狀, 犔犐犣犺犻, 1 犑犐犃犗犢狅狀犵, 犣犎犃犗犣犎犐 1 犵狌犪狀犵, 犠犃犖犌犎犲 1, 犣犎犃犖犌犅狅 1, 犑犐犃犎狅狀犵 狋犪狅 3 3, 犓犪犿犪犾犘狅犺犪狉 1. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犝狉狅犾狅犵狔, 犜犪狀犵犱狌犎狅狊狆犻狋犪犾, 犉狅狌狉狋犺犕犻犾犻狋犪狉狔犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犡犻 犪狀 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犛狌狉犵犲狉狔, 犡犻 犪狀犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犜狉犪犱犻狋犻狅狀犪犾犆犺犻狀犲狊犲犕犲犱犻犮犻狀犲, 犡犻 犪狀 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 3. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犝狉狅犾狅犵狔犛狌狉犵犲狉狔, 犆狅犿狆狉犲犺犲狀狊犻狏犲犆犪狀犮犲狉犆犲狀狋犲狉, 犗犺犻狅犛狋犪狋犲犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犗犎 431, 犝犛犃 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 EF3playsanimportantroleinbladdercancer,butthemechanismsoftheregulationis notclear.thisarticleistoinvestigatethemechanismsofef3ininvasivebladdercancer. 犕犈犜犎犗犇犛 EF3wasknock downininvasivebladdercancercelslinesbyrnai.bythewestern,pcrandchipexperimentstoobservetheregula tionbetweentheef3andstat3,ets1aswelasinvasionrelatedfactors. 犚犈犛犝犔犜犛 EF3,STAT3andEts1were knockdowninef3high expressingcellines(ht1376andtccsup),chipassaysconfirmedincreasedbindingofef3 totheets1andstat3promotersinef3 overexpressingcellinesrelatedtonormalef3 expressingcellines.immu nohistochemistryand Western:Ets1andSTAT3proeinswereincreasedinhighEF3bladdercancer, 狉 =0.41, 犘 = 0.03.Thecytokines(IL 1,IL 8,TNF α,vegfaetc.)expresswereincreasedinoverexpressionofef3cels,knock downofets1andstat3inthesecelsledtoamarkeddecreaseintheexpressionofmostcytokines. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 EF3overexpressioninhumanbladdercancercellinesmodulatestheexpressionofimmunerelatedgenesthroughEts1 andstat3. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] bladdercancer;ef3;signaltransducersandactivatosoftranscription 3;RNAi;immunohistochemistry 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,016,3(1): 基金项目 国家自然科学基金 (317391); 陕西省科学技术研究发展计划 (008k09 04) 第一作者简介 李瑞晓, 男, 陕西西安人, 硕士, 主治医师, 主要从事泌尿系肿瘤基础研究工作 Tel: E mail:liruixiao4@163.com 通讯作者简介 张波, 男, 陕西西安人, 博士, 副主任医师, 主要从事泌尿系肿瘤基础研究工作 Tel: E mail:zhangbo@fmmu.edu.cn

7 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 中图分类号 R 文献标识码 A 文章编号 (016) EF3(EFtanscriptionfactor3) 是转录因子家族的成员之一, 定位于染色体 6p,EF3 转录调节因子主要参与了细胞周期的调控, 并与多种抑癌和致癌基因存在着密切的关系 前期研究发现,EF3 在膀胱癌组织中高表达, 并且 EF3 高表达提示患者生存及预后较差 Ets1 在膀胱癌的侵袭及发展中发挥重要作用, 并且, 下调 Ets1 的表达可降低膀胱癌的浸润及侵 [1] 袭性 ; 研究发现, 沉默转录激活因子 3(STAT3) 的表 [] 达, 可抑制膀胱癌细胞的增殖及转移 EF3 与 Ets1 和 STAT3 是否存在联系及具体调节分子机制是什么? 因此, 本研究旨在探讨 EF3 基因对浸润性膀胱癌相关基因及细胞因子的调控机制进行研究, 为临床上预防及治疗浸润性膀胱癌提供新的思路 1 材料与方法 1.1 材料人膀胱癌细胞株 RT4 HT1376 TCCSUP J8 和 T4,UMUC3 和永生化正常尿路上皮细胞 (NHU htert) 均购自美国标准细胞库 (ATCC, 弗吉尼亚州 ) 细胞系 TCCSUP HT1376 J8 T4 和 UMUC3 均培养于 Eagle 培养基 (Gibco,Life Tech nologies 公司, 加利福尼亚州 ), 培养基中含有 10% 的胎牛血清 (Gibco,LifeTechnologies 公司, 加利福尼亚州 ) 100 U/mL 青霉素和 100 μg/ml 链霉素 在 37 5% CO 加湿孵育箱中培养 NHU htert 在角化细胞无血清培养基 (KSFM) 中培养 (Invitrogen 公司, 加利福尼亚州 ) 1. 标本来源收集 第四军医大学唐都医院术前未接受放化疗的膀胱癌患者 41 例, 男 31 例, 女 10 例 年龄 4~71, 平均年龄 63.4 岁, 中位年龄 58 岁 所有蜡块标本均经病理确诊 选取同期本院术后非蜡块膀胱癌组织 17 例 1.3 筛选细胞系通过蛋白质印迹法对上述细胞进行检测, 检测 EF3 在不同膀胱癌细胞系中的表达情况, 选择 EF3 高表达膀胱癌细胞系进行后续研究使用 1.4 犚犖犃犻人 EF3 shrna Ets1 shrna STAT3 shrna 和 RB1 shrna 慢病毒以及对照组 RHS4346 均购自中国试剂网 将上述病毒颗粒转染至 93T 细胞中, 进行慢病毒包装 然后将包装好的病毒分别感染膀胱癌细胞株 HT1376 TCCSUP T4 和 UMUC3, 得到稳定表达细胞株并对其进行检测 EF3 shrna 在 细胞株 TCCSUP 中没有被成功的敲除, 因此该细胞株单独采用瞬时转染的方法, 使其瞬时转染 48h 后进行蛋白质印迹法检测, 被证实 EF3 在该细胞中被有效的沉默 1.5 蛋白质印迹法和犘犆犚检测所得样品 蛋白质印迹法 : 收集目的细胞, 裂解液分别提取各组细胞株的总蛋白 加入 A/B 液 (BCA 法 ),560nm 波长下鉴定吸光度, 进行蛋白量的分析计算, 电泳方法使用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE); 用 5% 脱脂牛奶封闭过夜, 加入一抗 4 过夜,PBS 洗涤 3 次后加入, 选用荧光素标记的羊抗鼠 / 羊抗兔二抗, 室温孵育 1h, 然后使用计算机 荧光扫描仪系统对膜进行扫描, 保存结果留待分析 实验所用抗体 :anti tubulin(sig ma 公司 ), 稀释 ; 小鼠抗 RB(BD 公司 ), 稀释 ; 兔抗 GAPDH(SantaCruz 公司 ),1 500 稀释 ; 兔抗 EF3(SantaCruz 公司 ), 稀释 ; 兔抗 STAT3(SantaCruz 公司 ),1 50 稀释 ; 兔抗 Ets1 (SantaCruz 公司 ),1 000 稀释 PCR: 收取细胞样品, 加入 1mLTrizol 裂解细胞, 加入 00μL 氯仿, 混匀后 10000r/min 离心 10min, 吸取上层液并加入 500μL 异丙醇,100r/min 离心 10min 后弃上清, 加入 75% 乙醇 1 ml, 混匀后离心, 弃上清,10000r/min 离心 5 min, 管底白色沉着物为 RNA 将所得 RNA, 取 1~mg, 使用 cdna 反转录试剂盒 (AppliedBiosystems 公司 ) 进行反转录成 cd NA; 并通过实时荧光定量 PCR 系统 (AppliedBio system) 进行扩增分析 1.6 犆犎犐犘 犘犆犚和犆犎犐犘 犛犲狇对样品进行检测 CHIP PCR: 用于验证 Ets1 和 STAT3 启动子, 片段大小 00~300bp 引物序列见表 1 步骤: 超声裂解膀胱癌细胞, 对 DNA 片段进行切割,10000r/min 离心 15min 处理后提取上清液 ; 吸取 0μL 上清液作为 Input, 加入 1800μLChIPDilutionBufer, 混匀后加入 75μLsalmonSperm DNA/ProteinA Agarose 50% Slurry,4 孵育 30 min, 减少背景的非特异性结合,10000r/min 离心 10 min 后吸取上清液, 加入 5μg 的抗体 ( 特异性抗体或对照 IgG);10000r/min 离心 5min, 去上清, 留取沉淀, 洗涤沉淀 3 次, 加入 E lutionbufer50μl,10000r/min 离心 5min 后收取上清, 重复 次, 收集洗脱液 加入 5 mol/l NaCl 去交联, 提取 DNA, 做 PCR CHIP Seq: 同上述方法, 提取上清液分别作为 In put 和 pul down, 提取 DNA 后送往美国俄亥俄州立大学综合癌症中心做芯片序列数据分析

8 770 李瑞晓, 等转录因子 EF3 对浸润性膀胱癌细胞因子的调控反应 表 1 PCR 引物序列 项目 正义 (5-3 ) 反义 (5-3 ) Ets1CHIP PCR CCTAAAGAGGAGGGGAGAGC AGGGGAAGTTGGCACTTTG STAT3CHIP PCR CGGAGTCACCCATGTTCTTT CCTGATACAGCTCCCTCCTG GAPDH qpcr ACTGGCGTCTTCACCACCAT CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG STAT3 qpcr GAGAAGCCAATGGAGATTGC CTGCACTCTCTTCCGGACAT Ets1 qpcr GAGTCAACCCAGCCTATCCA GGAGCTCTTCCGAGCTGAT TGFB1 qpcr CAACAATTCCTGGCGATACC GCAGTGTGTTATCCCTGCTG CCL5 qpcr CTGCTGCTTTGCCTACATTG TGTACTCCCGAACCCATTTC CXCL11 qpcr AGAGGACGCTGTCTTTGCAT TAAGCCTTGCTTGCTTCGAT IL1A qpcr CGGGAAGGTTCTGAAGAAGA ACTTTGATTGAGGGCGTCAT IL8 qpcr AACCTTTCCACCCCAAATTTAT ACTTCTCCACAACCCTCTGC TNFA qpcr CCCGAGTGACAAGCCTGTAG GAGGTACAGGCCCTCTGATG VEGFA qpcr CCCACTGAGGAGTCCAACAT TGCATTCACATTTGTTGTGC TNFRSF11b qpcr GAGCTGCCCTCCTGGATT AGGAGACCAAAGACACTGCAA EF3b qpcr GTTTCGGAAATGCCCTTACA CACTTCTGCTGCCTTGTTCA 1.7 统计学方法采用 SPSS19.0 对数据进行统计学分析, 计量资料以狓 - ± 狊表示,RC 列表资料采用 χ 检验, 两组间相关性研究采用秩次相关分析, 统计学方法经正态分布 Shapiro wilk 检验符合正态分布, 组间均数比较采用配对狋检验分析 非正态分布则采用非参数检验 检验水准 α=0.05 (HT1376 和 TCCSUP) 中 ( 图 6) CHIP 实验提示, 这一调节关系特定出现在 EF3 过表达细胞系中, 在 HT1376 和 TCCSUP 膀胱癌细胞系中 EF3 基因被沉默后 Ets1 和 STAT3 的启动子活性减弱, 从而导致了 Ets1 和 STAT3 的表达减少 ( 图 7 表 3 和表 4) 这些结果表明,EF3 直接调节 Ets1 和 STAT3 两种转录因子 结果.1 目的蛋白表达关系 对临床收集的膀胱癌样品进行免疫组化染色, EF3 高表达膀胱癌和低表达 EF3 膀胱癌中均出现高表达 EtsI 蛋白 ( 图 1), 其中 EF3 高表达膀胱癌中, Ets1 阳性表达率为 80.0%(16/0),EF3 低表达膀胱癌中,Ets1 阳性表达率为 3.8% (5/1); 图 1~ 图 3 示,STAT3 的表达在高表达 EF3 细胞系中明显增高, 差异有统计学意义, χ =4.7, 犘 =0.03 EF3 与 STAT3 之间的表达关系通过秩次相关分析显示, 二者之间呈正相关, 狉 =0.41, 犘 =0.03. 靶细胞系筛选 蛋白质印迹法检测结果如图 4 显示, 在膀胱癌 UMUC3 T4 J8 和 RT4 细胞系中,EF3 蛋白低表达或不表达 ; 在膀胱癌 HT1376 和 TCCSUP 细胞系中,EF3 蛋白高表达, 蛋白灰度相对表达量分别为 1.638±0.04( 犣 =3.449, 犘 =0.001),1.961±0.05 ( 犣 =3.09, 犘 =0.003).3 目的基因敲除效果检测 蛋白表达检测结果显示, 在两种浸润性膀胱癌 HT1376 和 TCCSUP 细胞系中,EF3 STAT3 和 Ets1 基因被成功沉默, 结果如表 和图 5 所示, 表达差异均有统计学意义, 犘 < 犈 犉 3 与犛犜犃犜 3 和犈狋狊 1 表达调节关系 CHIP Seq 检测证实,EF3 结合 STAT3 和 Ets1 这两个基因的启动子只出现在 EF3 过表达细胞系 图 1 注 :A.EF3 高表达 ;B.EF3 低表达 免疫组化法检测膀胱癌组织 EF3 的表达 (HE 100).5 犈 犉 3 过表达诱导犈狋狊 1 和犛犜犃犜 3 介导的细胞因子的表达 选取 IL1 CXCL11 IL8 TNF α 和 VEGFA 等 8 个因子作为研究 ( 图 8), 这些细胞因子被认为参与了肿瘤的侵袭与发展 表 5 和图 9 显示,EF3 mrna 表达水平在膀胱癌细胞中降低, 上述细胞因子表达水平也降低, 差异有统计学意义, 犘 <0.05;Ets1 和

9 中华肿瘤防治杂志 ２０１６ 年 ６ 月第 ２３ 卷第 １２ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｊｕｎｅ２０１６ Ｖｏ ｌ ２３ Ｎｏ １２ ７７１ ＳＴＡＴ３ 在 ＨＴ１３７６ 和 ＴＣＣＳＵＰ 细 胞 中 被 沉 默 上 述 细胞因子中大部分的 表 达 水 平 降 低 差 异 有 统 计 学 意 Ｅ２Ｆ３ 膀胱癌相比 高表达 Ｅ２Ｆ３ 膀胱癌中表现为 Ｅｔ ｓ １ 和 ＳＴＡＴ３ 启动子活性增强 此外 上 述 膀 胱 癌 组 织 样 义 犘 ０ ０５ 见 图 ９ 和 表 ２ 因 此 推 测 Ｅ２Ｆ３ 过 表 达通过 Ｅｔ ｓ １ 和 ＳＴＡＴ３ 调节免疫相关基因 品进行 蛋 白 质 印 迹 法 结 果 表 明 与 低 表 达 Ｅ２Ｆ３ 膀 胱 癌组相比 Ｅｔ ｓ １ 和 ＳＴＡＴ３ 的蛋白表达水平升高 差 异 有统计 学 意 义 相 对 蛋 白 定 量 分 别 为 Ｅ２Ｆ３ 高 表 达 组 中Ｅ ｔ ｓ １蛋白定量 ０ ９１９±０ ０４ 是 Ｅ２Ｆ３ 低 表 达 组 ０ ０７３±０ ０１ 的 １２ ５９ 倍 狋 ２０ ２１ 犘 ０ ０００１ Ｅ２Ｆ３ 高表达组中 ＳＴＡＴ３ 蛋白定量 是 ０ ４９６±０ ０２ Ｅ２Ｆ３ 低 表达组 ０ １９２±０ ０１ 的 ２ ５８ 倍 狋 ６ ２７８ 犘 ０ ０１３ 图 ３ 免疫组化阳性评分分析 ＳＴＡＴ３ 在膀胱癌组织中 与 Ｅ２Ｆ３ 的表达相关性 图 ４ 蛋白质印迹法检测 Ｅ２Ｆ３ 基因在 ６ 种膀胱癌细胞株中 蛋白表达水平 表 ２ 目的基因在两组细胞系中敲除效率检测 相对蛋白灰度 狓 ±狊 项目 Ｃｏｎ ｔ ｒ ｏ ｌ组 实验组 犣值 犘值 Ｅ２Ｆ３ １ １０４±０ ００１ ０ ０２２±０ ００１ ３ ３２３ ０ ００１ａ ＳＴＡＴ３ ０ ８５３±０ ００１ ０ １２９±０ ００１ ３ ００７ ０ ００６ａ Ｅｔ ｓ １ ０ ６４７±０ ００１ ０ ００１±０ ００１ ３ ３２３ ０ ００１ａ Ｅ２Ｆ３ ０ ８７４±０ ００１ ０ ０２１±０ ００１ ３ ０８４ ０ ００３ａ ＳＴＡＴ３ ０ ９４１±０ ００１ ０ ３４４±０ ００２ ２ ９７５ ０ ００９ａ Ｅｔ ｓ １ ０ ５８３±０ ００１ ０ ０１４±０ ００１ ３ ３２３ ０ ００１ａ ＨＴ１３７６ 细胞 ＴＣＣＳＵＰ 细胞 注 Ａ Ｅｔ ｓ １ 在 Ｅ２Ｆ３ 高表达 Ｂ Ｅｔ ｓ １ 在 Ｅ２Ｆ３ 低表达 Ｃ ＳＴＡＴ３ 在 Ｅ２Ｆ３ 高表达 Ｄ ＳＴＡＴ３ 在 Ｅ２Ｆ３ 低表达 图 ２ 免疫组化法检测 Ｅ ｔ ｓ １ 和 ＳＴＡＴ３ 在膀胱癌 ａ 为非正态分布 注 行非参数检验 组织 Ｅ２Ｆ３ 中的表达 ＨＥ １００ ２ ６ 犈２犉３ 过表达对 犈 狋 狊 １ 和 犛犜犃犜３ 的表达 在膀 胱 癌 组 织 中 通 过 ＣＨＩＰ ＰＣＲ 分 析 Ｅｔ ｓ １和 ＳＴＡＴ３ 在 ８ 例 Ｅ２Ｆ３ 高表达膀胱癌 组织 和 ９ 例 Ｅ２Ｆ３ 低表达膀胱癌组织中表达关系 图 １０ 显示 与低表达 ３ 讨论 恶性肿瘤患者死亡的主要原因是由于肿瘤 细胞的 侵袭与转移引起的 这是一个复杂 多变 的过 程 且 受多 种因素及相关基因的调控 膀胱癌是我 国泌 尿系 肿瘤

10 77 李瑞晓, 等转录因子 EF3 对浸润性膀胱癌细胞因子的调控反应 中最常见的恶性肿瘤之一, 其中 50%~80% 的膀胱癌会发生侵袭和转移, 进展为肌层浸润性膀胱癌, 虽然根治性膀胱切除术是治疗肌浸润性膀胱癌的首选治疗方法, 但术后仍有大约 50% 的患者最终出现肿瘤远处转移, 5 年生存率为 35%~55% 对于 T 3~T 4 期或者有淋巴结转移的高危患者 5 年生存率仅为 5%~35% [3] EF3 是 EF 家族的成员之一, 定位于染色体 6p,EF3 转录调节因子主要参与了细胞周期的调控, 并与多种抑癌和致癌基因存在着密切的关系 Ets1 是转录调控因子家族 (Ets) 中最早发现且研究较多的成员, 也是最重要的成员之一 Ets1 调节各种生理和病理过程, 研究显示 Ets1 在促进血管形成 调节细胞黏附力 参与细胞外基质蛋白降解 调节细胞缺氧 [4 5] 耐受等方面起重要作用 ;Ets1 在浸润性膀胱癌中高表达, 通过上调 MMP 1 的表达使得细胞基底膜和细胞外基质发生降解, 便于癌细胞的穿透及游走, 从而 [6 7] 导致癌细胞的侵袭和转移 图 5 注 :KD. 沉默组, 犘 <0.05 蛋白质印迹法检测膀胱癌 HT1376 和 TCCSUP 细胞系中目的基因的沉默效果 图 6 Ets1 和 STAT3 启动子在膀胱癌细胞系中表达情况 图 7 CHIP 检测 EF3 与 STAT3 和 ETS1 表达调节关系 信号转导和 STAT3 在细胞的增殖 转化和凋亡中起着重要的作用 STAT3 是转录因子 STATs 家族的成员之一,STATs 通过与细胞表面的受体结合后被激活, 在酪氨酸激酶磷酸化作用下形成二聚体转移 [8] 至细胞核内调控靶基因 STAT3 作为一个重要的下游炎性介质调节因子, 如 IL 6 和 IL 17, 其在膀胱肿瘤中产生是由于慢性炎症 ( 如吸烟 慢性尿路感染 ) [9] STAT3 的激活在人类 CK14 + 的侵袭性膀胱癌细胞核中有明显的表达,STAT3 诱导的干细胞的快速扩增在原位癌 (CIS) 发展为浸润性膀胱癌的过程中起到关键 [9] 的作用

11 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 表 3 EF3 基因沉默后与 Ets1 和 STAT3 启动子活性表达 ( 狓 - ± 狊 ) 项目 Control 组实验组狋值犘值 HT1376 细胞 Ets ± ± <0.01 STAT ± ± <0.01 TCCSUP 细胞 Ets ± ± <0.01 STAT3 0.0± ± <0.01 表 4 EF3 基因沉默后与 Ets1 和 STAT3mRNA 之间的表达 ( 狓 - ± 狊 ) 项目 Control 组实验组狋值犘值 HT1376 细胞 Ets1 1± ± <0.01 STAT3 1± ± <0.01 TCCSUP 细胞 Ets1 1± ± STAT3 1± ± 表 5 EF3 过表达诱导 Ets1 和 STAT3 介导的细胞因子的表达 (mrna 表达, 狓 - ± 狊 ) 项目 Control 组实验组犣值犘值 HT1376 细胞 EF3 1.0± ± a STAT3 1.0± ± a Ets1 1.0± ± a TCCSUP 细胞 EF3 1.0± ± a STAT3 1.0± ± a Ets1 1.0± ± a 注 : a 为非正态分布资料, 行非参数检验 注 : 具有统计学变化的基因 (>1.5 倍数变化, 犘 <0.05) 图 8 Heatmap 显示在 HT1376 细胞中 EF3 被沉默后相关基因 mrna 表达情况 图 9 EF3 调节相关细胞因子的表达情况以及与 Ets1 和 STAT3 之间的相关性

12 774 李瑞晓, 等转录因子 EF3 对浸润性膀胱癌细胞因子的调控反应 图 10 CHIP 法检测浸润性膀胱癌组织 EF3 过表达与 Ets1 和 STAT3 的表达关系 另外,STAT3 还可激活多个信号通路来诱导膀胱癌的发生, 研究发现膀胱癌细胞可通过 Mtor STAT3/ microrna143 途径调节细胞代谢, 为细胞的快速增殖和抗凋亡提供了有利的条件, 阻断 STAT3 的激活可 [10 11] 以有效抑制肿瘤的能量供应从而抑制肿瘤生长 以 STAT3 为靶点或联合多位点的治疗可能在膀胱癌的治疗中达到更好的效果 因此, 通过抑制 Ets1 和 STAT3 的活性, 从而在转录水平和蛋白水平阻断 MMP 1 细胞炎性因子等途径, 从而抑制浸润性膀胱癌的形成与进一步发展, 为临床上治疗浸润性膀胱癌或预防其转移提供新的理论依据与思想 本研究结果发现,EF3 调节两个非常强大的转录因子 Ets1 和 STAT3, 这两个基因反过来调节膀胱癌的炎性基因谱 在癌症中, 炎性环境主要包括细胞因子和趋化因子, 这些因子可促进癌症细胞的增 [1] 殖 浸润 血管上皮的生成 然而, 这些细胞因子之间存在着微妙的平衡, 而这种平衡的打破导致了抑制肿瘤反应或者是促进恶性肿瘤的形成 在大多数癌症中, 细胞因子和趋化因子是驻留在免疫细胞内 然而, 越来越多的证据表明炎性应激在一些癌症中的起源是 [13] 由癌基因的激活引发的, 其中包括 N RAS MYC 和 RET [14] 治疗早期浸润性膀胱癌(T1) 是临床上的一个难点, 因为临床上很难预测肿瘤的复发或者肿瘤 [15] 进一步的恶化 EF3 基因过表达是肿瘤浸润形式的一个转变点, 同时上调 Ets1 和 STAT3 的表达也是肿瘤预后较差的一个指标, 目前为止, 还没有靶向药物被批准用于膀胱癌, 这些都说明对 EF3 基因分子机制的了解有助于临床上治疗膀胱癌及癌症预后的判断提供一个新的思路 参考文献 [1] SariA,CaliA,GorgelSN,etal.Immunohistochemicaldeter minationofets 1oncoproteinexpressioninurothelialcarcino masoftheurinary bladder[j].applimmunohistochem Mol Morphol,01,0(): [] ZhangB,LuZ,HouY,etal.TheefectsofSTAT3andSur vivinsilencingonthegrowthofhumanbladdercarcinomacels [J].TumourBiol,014,35(6): [3] KimJ,AkbaniR,CreightonCJ,etal.Invasivebladdercancer: genomicinsightsandtherapeuticpromise[j].clincancerres, 015,1(0): [4] FujimotoJ,AokiI,ToyokiH,etal.Clinicalimplicationsofex pressionofets 1relatedtoangiogenesisinmetastaticlesionsof ovariancancers[j].oncology,004,66(5): [5] KeehnCA,SmolerBR,Morgan MB.Expressionoftheets 1 protooncogeneinmelanocyticlesions[j].modpathol,003,16 (3): ( 下转第 793 页 )

13 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 实验研究 / 论著 犜犕犘狔犘 4 对肝癌细胞犎犲狆犌 生长抑制作用的研究 阎敬 1 贺安宁 郝凤进 1 关一夫 1 1. 中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室, 辽宁沈阳 中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所第一研究室, 辽宁沈阳 摘要 目的 TMPyP4 是 G 四链体的配体, 能够诱导形成 G 四链体结构并增强 G 四链体结构的稳定性, 加强 G 四链体作为负调控因子抑制犕犈犜基因的表达 ;G 四链体结构的形成可以选择性的抑制肿瘤细胞增殖 本研究旨在分析 TMPyP4 对肝癌细胞 HepG 生长抑制作用的研究, 为犕犈犜高表达的肿瘤靶向治疗提供新思路 方法采用 CCK 8 方法分析 HepG 细胞增殖变化, 通过 Hoechst3334 细胞核染色和 Annexin Ⅴ FITC/PI 双染流式细胞术分析 HepG 细胞凋亡水平, 以及利用流式细胞术分析 HepG 细胞周期分布的变化 结果 CCK 8 分析 HepG 细胞增殖显示, 与对照组比较,10μmol/LTMPyP4 对 HepG 细胞存活率无显著影响, 和 00μmol/LTMPyP4 组 HepG 细胞存活率分别为 (8.8±1.99)% (68.88±3.06)% (55.57±.76)% 和 (50.3±5.78)%, 犉 =10.54, 犘 <0.001, 说明高于 0μmol/L 的 TMPyP4 显著抑制细胞增殖 ; 流式细胞术分析细胞凋亡不明显, 只有高浓度 TMPyP4 诱导少量 HepG 细胞发生了凋亡, 并出现了坏死细胞 ;100 和 00μmol/LTMPyP4 的实验组细胞经 Hoechst3334 染色, 有少数 HepG 细胞表现出细胞核固缩 致密, 形态不规则, 染色不均一, 呈现凋亡表现 ; 不同浓度的 TMPyP4 处理 HepG 细胞使 G0/G1 期细胞增加了 0%,S 期细胞减少,G/M 期细胞也减少, 表示 HepG 细胞发生了 G0/G1 细胞周期阻滞 结论 G 四链体的配体 TMPyP4 显著抑制了肝癌细胞 HepG 的细胞增殖, 诱导少量 HepG 细胞凋亡, 并使 HepG 细胞发生了 G0/ G1 细胞周期阻滞 关键词 TMPyP4; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ; 细胞周期阻滞 ; 犕犈犜启动子 G 四链体 犐狀犺犻犫犻狋狅狉狔犲犳犲犮狋狅犳犜犕犘狔犘 4 狅狀犎犲狆犌 犮犲犾犵狉狅狑狋犺 犢犃犖 1 犑犻狀犵, 犎犈犃狀 狀犻狀犵, 犎犃犗犉犲狀犵 1 1 犼犻狀, 犌犝犃犖犢犻 犳狌 中华肿瘤防治杂志,016,3(1): 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔犪狀犱犕狅犾犲犮狌犾犪狉犅犻狅犾狅犵狔, 犆狅犾犲犵犲狅犳犅犪狊犻犮犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲, 犆犺犻狀犪犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犛犺犲狀狔犪狀犵 1101, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔 1, 犆犪狀犮犲狉犐狀狊狋犻狋狌狋犲, 犉犻狉狊狋犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犆犺犻狀犪犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犛犺犲狀狔犪狀犵 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 TMPyP4isaligandofG quadruplex,whichcanstabilizetheg quadruplexstructureinthe promoterof 犕犈犜 geneandenhanceitsinhibitoryefectonitsexpression.theg quadruplexstructuresofprotooncogenes caninhibittheproliferationofcancercel.thisstudyaimstoanalyzetheefectoftmpyp4onhepgcelgrowthbysta bilizingtheg quadruplexstructurein 犕犈犜 promoter,whichwilprovideanewwayfortargetingtumortherapy. 犕犈犜犎 犗犇犛 CCK 8assaywasperformedtoanalyzetheproliferationofHepGcel.Hoechst3334dyeingfornucleuswasused torevealthecelapoptosis.theflowcytometrywasutilizedtoshowthecelapoptosisandthecelcycledistribution. 犚犈 犛犝犔犜犛 CCK 8assayshowedthatthecelviabilitiesin0,50,100and00μmol/L TMPyP4groupswere (8.8± 1.99)%,(68.88±3.06)%,(55.57±.76)% and (50.3±5.78)%,indicatingthesignificantinhibitoryefectoncel proliferation ( 犉 =10.54, 犘 <0.001).But10μmol/LTMPyP4hadnoefectonthecelproliferationofHepG.Minor celapoptosisonlyhappenedwhenbeingtreatedbyhighconcentrationoftmpyp4,inwhichnucleusexhibitedchromatin pycnosis,unevendyeingbyhoechst3334andirregularshape.hepgcelsatg0/g1 phaseincreasedby0% andde creasedatgandsphase,whichindicatedthattmpyp4inducedthecelcyclearrestatg0/g1phase. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 TMPyP4canstabilizeG quadruplexstructureinthepromoterof 犕犈犜,significantlyinhibittheHepGcelproliferation, induceg0/g1 phasecelcyclearrestandmakeminorhepgcelapoptosis. 基金项目 国家自然科学基金 ( ); 辽宁省科技厅项目 ( ) 第一作者简介 阎敬, 女, 辽宁盘锦人, 博士, 讲师, 主要从事肿瘤发生发展机制及其靶向治疗的研究工作 E mail:yanjing@mail.cmu.edu.cn 通讯作者简介 关一夫, 男, 辽宁沈阳人, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事核酸结构及其功能的研究工作 E mail:yfguan@mail.cmu.edu.cn

14 776 阎敬, 等 TMPyP4 对肝癌细胞 HepG 生长抑制作用的研究 [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] TMPyP4;celproliferation;celapoptosis;celcyclearrest;G quadruplexin 犕犈犜 promoter 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,016,3(1): 中图分类号 R735.7 文献标识码 A 文章编号 (016) 癌基因的过表达参与了肿瘤的发生 发展 转移和侵袭 在肝癌 非小细胞肺癌 结直肠癌 胃癌 肾癌和神经胶质瘤等多种肿瘤中, 原癌基因犕犈犜的持续高 [1 5] 表达可以通过自磷酸化作用活化犕犈犜信号通路, 从而促进肿瘤的发生 增殖 分化 血管形成 侵袭和转 [6] 移过程 此外, 犕犈犜的激酶活性还可被其他 HGF 非依赖的受体激活, 并且犕犈犜与其他多个膜受体交联, 这种交联也能以信号放大的方式进一步促进肿瘤形成和转移 因此, 犕犈犜作为抗肿瘤治疗的候选靶 [7] 点, 可相对容易地实现对多通路的同时干扰, 尤其是对犕犈犜高表达的肿瘤细胞具有更显著的治疗效果 [8] 前期实验中, 已经明确了犕犈犜启动子转录起始位点近端区域 - 48 ~ - 6 bp 的 Pu3WT 序列 GCGGGCGGGCGGGGCGCTGGGCT 形成了分子内平行型 G 四链体结构, 并且该结构能够抑制犕犈犜基因表达 ;G 四链体配体 TMPyP4 [5,10,15,0 Tetra (n Methyl Pyridyl)Porphine] 是一种阳离子卟啉化合物, 能够增强该平行型 G 四链体结构的稳定性, 加强 G 四链体作为负调控因子抑制犕犈犜基因的表达 本实验以 TMPyP4 作为外源药物, 解析其对人肝癌细胞 HepG 生长的影响, 为犕犈犜高表达的肿瘤的靶向治疗提供新思路 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 CelCountingKit 8 (CCK 8) 购自日本同仁化学公司,Hoechst3334 购自上海碧云天生物技术研究所, 细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司, 细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司, 荧光相差显微镜 CKX 31 购自日本 Olympus 公司, 多功能酶标仪 infinitem00 购自瑞士 Tecan 集团公司 1. 犆犆犓 8 分析犎犲狆犌 细胞增殖收集对数期生长的 HepG 细胞, 调整细胞浓度至 ml -1, 按照每孔 100μL 接种至 96 孔板 ; 细胞贴壁后更换为含 0( 空白对照组 ) μmol/L 浓度梯度的 TMPyP4 的培养基, 每个 TMPyP4 浓度设置 5 个复孔 ;37 5% CO 常规培养 4h, 倒置显微镜下观察 ; 每孔加入 10μL CCK 8 溶液, 继续培养 4h; 测量各孔的吸光度 A 450 ; 计算细胞生存率 1.3 细胞核犎狅犲犮犺狊狋 3334 染色及流式细胞术检 测犎犲狆犌 细胞凋亡在 4 孔培养板中接种 HepG 细胞, 细胞贴壁后, 更换为含浓度梯度的 TMPyP4 的培养基, 在 37 5% CO 中继续培养 4h; 弃培养基,PBS 洗涤细胞 ~3 次, 加入 500μL Hoechst3334 染色液, 培养箱中继续培养 1.5h; 弃染色液, 用培养液洗涤 ~3 次即可进行荧光检测 在 6 孔培养板中接种 HepG 细胞, 细胞贴壁后, 更换为含浓度梯度的 TMPyP4 的培养基, 在 37 5% CO 中继续培养 4h; 收集细胞,1000r/min4 离心 10min( 离心半径 6cm), 弃上清 ;PBS 清洗细胞 ; 将细胞重悬于 00μLBindingBufer; 加入 10μLAn nexin Ⅴ FITC 轻轻混匀, 室温避光反应 15min; 加入 300μLBindingBufer 以及 5μLPI; 用流式细胞仪检测细胞凋亡 1.4 流式细胞术检测犎犲狆犌 细胞周期首先对 HepG 细胞同步化培养 : 接种 6 孔培养板, 用不含 FBS 的培养基饥饿细胞 4h; 含浓度梯度的 TMPyP4 的完全培养基继续培养细胞 4h; 收集细胞,1000r/min 离心 7min( 离心半径 6cm), 弃上清, ml 预冷的 PBS 洗 1 次,1000r/min 离心 7 min( 离心半径 6cm) 加入 400μL 预冷的 PBS, 小心吹打, 不要产生气泡, 充分重悬细胞, 再加入 100μL 预冷的无水乙醇, 快速抽吸混匀,4 固定过夜 ; 将固定的细胞 4,1000r/min 离心 10min( 离心半径 6cm), 小心弃掉乙醇 ;PBS 清洗彻底去除固定液 ; 加入 100μLRNaseA,37 水浴 30 min 降解 RNA; 细胞冷却后, 加入 400μLPI, 混匀后 4 避光染色 30min; 用流式细胞仪检测 HepG 细胞周期的变化 1.5 统计学分析应用 SPSS13.0 对数据进行统计学分析, 数据以狓 - ± 狊表示, 采用单因素方差分析 (one way ANOVA) 进行统计处理 检验水准 α= 0.05 结果.1 犆犆犓 8 分析犎犲狆犌 细胞增殖不同浓度 TMPyP4 处理 HepG 细胞 4h 后, 加入 CCK 8 继续培养 4h, 测量 A 450nm, 统计分析结果显示, 与对照组相比,10μmol/L 的 TMPyP4 组细胞存活率 (90.78±1.58)% 无显著影响, 和 00μmol/L 的 TMPyP4 组细胞存活率分别为 (8.8±1.99)% (68.88±3.06)% (55.57±.76)% 和 (50.3±

15 中华肿瘤防治杂志 ２０１６ 年 ６ 月第 ２３ 卷第 １２ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｊｕｎｅ２０１６ Ｖｏ ｌ ２３ Ｎｏ １２ ７７７ Ｌ ５ ７８ ＩＥ５０ １６５ １７８ μｍｏ ｌ ９５ Ｃ Ｉ １３５ ３３８ ２１１ ９８３ 线性趋势检验 犉 ４８５ ８０５ 犘 ０ ００１ 呈线 性鉴定的染料 ＰＩ有抗染性而不被着染 坏死细胞的 细 性变化趋势 其中高于２０μｍｏ Ｌ 的 ＴＭＰｙＰ４ 显著抑制 ｌ 点图上 左 下 象 限 显 示 活 细 胞 右 上 象 限 是 非 活 细 胞 了细胞的增殖 犉 １２０ ５４２ 犘 ０ ００１ 坏死细胞 而右下 象 限 为 凋 亡 细 胞 如 图 ２ 结 果 显 ２ ２ 犎犲狆犌２ 细胞凋亡检测 荧光相差显 微 镜 采 集 图 像 显 示 对 照 组 以 及 １０ 示 高 浓 度 ＴＭＰｙＰ４ 诱 导 少 量 ＨｅｐＧ２ 细 胞 发 生 了 凋 亡 并出现了坏死细胞 Ｌ 实 验 组 细 胞 核 椭 圆 形 饱 满 染 色 均 ２０ 和 ５０μｍｏ ｌ 一 核膜完整 在 １００ 和 ２００μｍｏ Ｌ ＴＭＰｙＰ４ 的 实 验 ｌ 组有少数 ＨｅｐＧ２ 细胞表 现 出 细 胞 核 固 缩 致 密 形 态 ２ ３ 犎犲狆犌２ 细胞周期分析 流式 细 胞 仪 分 析 ＨｅｐＧ２ 细 胞 周 期 分 布 结 果 显 示 经 过 不 同 浓 度 的 ＴＭＰｙＰ４ 处 理 的 实 验 组 Ｇ０ Ｇ１ 不规则 染 色 不 均 一 呈 现 凋 亡 表 现 图 １ 细 胞 用 期细胞增加了 ２０ 图 ３ Ｓ 期 细 胞 减 少 Ｇ２ Ｍ 期 细 Ａｎｎｅｘ ｉ ｎ ⅤＦＩＴＣ ＰＩ双染后 凋亡细胞对用于细胞活 胞也减少 图 ３ 说明发生了 Ｇ０ Ｇ１ 细胞周期阻滞 胞膜损伤 可以被 ＰＩ着染 在双变量流式细胞仪的散 注 箭头标识为凋亡的细胞 图 １ ＨｅｐＧ２ 细胞 Ｈｏｅｈ ｓ ｔ３３３４２ 染色 ３ 讨论 瘤的黏附 运动 侵袭和转移发挥了重要的作用 近年 来的研究证实 了 这 些 原 癌 基 因 的 启 动 子 富 含 Ｇ 的 区 Ｂ 型双螺旋结构 是 基 因 组 ＤＮＡ 的 主 要 二 级 结 构 形式 同时三链 体 结 构 发 夹 结 构 Ｇ四 链 体 和 ｉ 模 体 域能 够 形 成 Ｇ四 链 体 结 构 并 且 Ｇ四 链 体 结 构 在 基 等二 级 结 构 形 式 也 存 在 于 基 因 组 ＤＮＡ 的 特 异 序 列 中 其中 Ｇ四链体 Ｇ ｒｕｐ ｌ ｅｘ 是 １９６２ 年通 过体 ｑｕａｄ Ｇ四链体结构能够抑 制 原 癌 基 因 表 达 进 而 通 过 下 游 的多个信号通路抑制 肿 瘤 细 胞 增 殖 减 缓 了 肿 瘤 细 胞 外实验证实了端粒 ＤＮＡ 能 形 成 Ｇ四 链 体 结 构 并 发 侵袭和转移 阳离 子 卟 啉 化 合 物 ＴＭＰｙＰ４ 是 Ｇ四 链 现 Ｇ四链 体 结 构 的 形 成 与 肿 瘤 发 生 发 展 密 切 相 关 体的配 体 其 结 构 为 平 面 大 分 子 可 以 通 过 大 键 与 近年的生物信息学分 析 和 多 项 研 究 结 果 显 示 核 糖 体 Ｇ四分体 平面 Ｇ四链 体的 结构 单元 发 生相 互作 用 诱导形成 Ｇ四链体结 构 并 增 强 Ｇ四 链 体 结 构 的 稳 定 ＤＮＡ 单拷贝基因 启动子和编 码 区 重 组 位 点 重 复 序列 卫星和端粒 ＤＮＡ 序列 的富含 Ｇ 的区域都 可以 因 转 录 调 控 过 程 中 发 挥 了 重 要 作 用 启 动 子 形 成 的 性 从而加强 Ｇ四链体作为基因表达负调控因子的作 形成 Ｇ四链 体 结 构 人 类 原 癌 基 因 ＭＹＣ ＶＥＧＦ 用 ９１２ Ｇ四链体 结 构 的 形 成 可 以 选 择 性 的 抑 制 肿 瘤 ＨＩＦ １α ＲＥＴ ＫＲＡＳ ＢＣＬ ２ ＫＩＴ ＰＤＧＦ Ａ 和 等在肿瘤细胞的 生 长 增 殖 分 化 凋 亡 以 及肿 ＭＹＢ 细胞增殖 １３

16 ７７８ 阎敬 等 图 ２ 流式细胞术分析 ＨｅｐＧ２ 细胞凋亡 图 ３ 流式细胞术分析 ＨｅｐＧ２ 细胞周期 ＴＭＰｙＰ４ 对肝癌细胞 ＨｅｐＧ２ 生长抑制作用的研究

17 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 前期实验发现,TMPyP4 能够通过稳定犕犈犜基因启动子中 Pu3 WT 序列形成的 G 四链体结构而抑 [8] 制犕犈犜基因表达 犕犈犜激酶的羧基端有两个非常关键的酪氨酸 Y1349 和 Y1356, 一旦这两个酪氨酸位点发生磷酸化, 会形成一个多功能的停泊位点, 可以从细胞中招募一些信号分子和衔接子, 包括磷脂酰肌醇 3 激酶 (phosphoinsitide3 kinase,pi3k) 非受体酪氨酸激酶 SRC 衔接子 GRB 和 SHC 以及多衔接子蛋白 GABl 和通过 GABl 结合的 PLC γ 及蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP, 还可以结合转录因子 STAT3, 并激活它们介导的信号通路 因此, 当 TMPyP4 下调犕犈犜基因表达后, 肿瘤细胞内异常活化的犕犈犜信号通路被抑制, 从而使多条信号通路同时被干扰, 肿瘤细胞的生物学行为表现出了一系列的变化, 细胞会出现细胞形态改变 增殖减缓 成瘤性降低及侵袭能力下降等一系列的变化 已有研究报道, 在骨髓瘤细胞 U66 B 细胞淋巴瘤细胞和胃癌细胞 MKN45 等多种肿瘤细胞中犕犈犜基因表达下调诱导细胞凋亡, 并且通过不同的信号通路使 U66 前列腺癌细胞 PC 3 和小细胞肺癌细胞 [14 18] NCI H69 发生 G 0 /G 1 细胞周期阻滞 在本研究中,TMPyP4 抑制了肝癌细胞 HepG 的增殖, 促进 HepG 细胞发生 G 0 /G 1 细胞周期阻滞, 并且引起了少量细胞凋亡等细胞生物学特性的改变, 推测可能由于犕犈犜的下调通过 Met/p38 MAPK 信号通路或者是 RB 和 RB1 的调控使细胞阻滞在 G 0 /G 1 期, 从而抑制了细胞增殖, 更加确切的信号转导通路将在后续实验中进一步验证 综上所述, 通过利用外源小分子配体诱导原癌基因启动子区域形成稳定的 G 四链体结构, 实现基因表达调控的目的, 为研究肿瘤治疗的新靶点, 开发肿瘤防治的新药物提供可靠的实验数据和理论依据 参考文献 [1] TretiakovaM,SalamaAK,KarrisonT,etal.METandphos phorylated METaspotentialbiomarkersinlungcancer[J].J EnvironPatholToxicolOncol,011,30(4): [] ScagliotiGV,NoveloS,VonPawelJ.Theemergingroleof MET/HGFinhibitorsinoncology[J].CancerTreatRev,013, 39(7): [3] DrakeJM,LeeJK,WiteON.Clinicaltargetingofmutatedand wild typeproteintyrosinekinasesincancer[j].molcelbiol, 014,(34): [4] 徐宝国, 杨永栋, 于霞, 等. 胃癌组织 c Met 和 MMP 11 表达与肝转移相关性研究 [J]. 中华肿瘤防治杂志,014,1(9): [5] 刘文静, 马杰, 李克, 等. 大肠癌组织 c Met 和 VEGF 表达及其与微血管密度关系的初步研究 [J]. 中华肿瘤防治杂志,01, 19(15): [6] AvanA,MaftouhM,FunelN,etal.METasapotentialtarget forthetreatmentofuppergastrointestinalcancers:characteriza tionofnovelc Metinhibitorsfrom benchtobedside[j].curr MedChem,014,1(8): [7] ThielA,RistimakiA.Targetedtherapyingastriccancer[J]. APMIS,015,13(5): [8] YanJ,ZhaoX,LiuB,etal.AnintramolecularG quadruplex structureformedinthehumanmetpromoterregionanditsbio logicalrelevance[j].molcarcinog,016,55: [9] GrandCL,Han H,MunozRM,etal.Thecationicporphyrin TMPyP4down regulatesc MYCandhumantelomerasereverse transcriptaseexpressionandinhibitstumorgrowthinvivo[j]. MolCancerTher,00,1(8): [10] Liu H,LvC,DingB,etal.AntitumoractivityofG quadru plex interactiveagenttmpyp4withphotodynamictherapyino variancarcinomacels[j].oncollet,014,8(1): [11] SeenisamyJ,BashyamS,GokhaleV,etal.DesignandSynthe sisofan Expanded Porphyrin That HasSelectivityforthec MYC G Quadruplex Structure[J].Journalofthe American ChemicalSociety,005,17(9): [1] LeVH,NageshN,LewisEA.Bcl promotersequenceg quadru plexinteractionswiththreeplanarandnon planarcationicporphy rins:tmpyp4,tmpyp3,andtmpyp[j].plos One,013,8 (8):e746. [13] ChoiEW,NayakLV,BatesPJ.Cancer selectiveantiprolifera tiveactivityisageneralpropertyofsomeg richoligodeoxynu cleotides[j].nucleicacidsresearch,010,38(5): [14] QueW,ChenJ.Knockdownofc Metinhibitscelproliferation andinvasionandincreaseschemosensitivitytodoxorubicininhu manmultiplemyelomau66celsinvitro[j].molmedreport, 011,4(): [15] UddinS,HussainAR,AhmedM,etal.Inhibitionofc METis apotentialtherapeuticstrategyfortreatmentofdifuselargeb cellymphoma[j].labinvest,010,90(9): [16] MunshiN,JeayS,LiY,etal.ARQ197,anovelandselective inhibitorofthehumanc Metreceptortyrosinekinasewithanti tumoractivity[j].molcancerther,010,9(6): [17] MukhopadhyayI,SausvileEA,DoroshowJH,etal.Molecular mechanismofadaphostin mediatedg1arrestinprostatecancer (PC 3)cels:signalingevents mediatedbyhepatocytegrowth factorreceptor,c Met,andp38 MAPK pathways[j].jbiol Chem,006,81(49): [18] MaPC,Tretiakova MS,NalasuraV,etal.Downstreamsig nalingandspecificinhibitionofc MET/HGFpathwayinsmal cellungcancer:implicationsfortumourinvasion[j].brjcanc er,007,97(3): 收稿日期 : 修回日期 : ( 编辑 : 王秀华 )

18 780 朱鹏冲, 等非小细胞肺癌组织 STAT3 信号与靶基因 VEGF 及 VEGF C 关系的研究 临床基础研究 / 论著 非小细胞肺癌组织犛犜犃犜 3 信号与靶基因犞犈犌犉及犞犈犌犉 犆关系的研究 朱鹏冲 1 孙志钢 肖伟 张楠 王军 王洲 3 朱良明 1. 兰州大学第一临床医学院, 甘肃兰州 山东大学附属济南市中心医院 ( 胸外科 : 孙志钢, 肖伟, 朱良明 ; 肿瘤科 : 张楠 ; 中心实验室 : 王军 ), 山东济南 山东大学附属省立医院胸外科, 山东济南 5001 摘要 目的 目前, 信号转导和转录激活因子 3 (signaltransducersandactivatorsoftranscription 3,STAT3) 在非小 细胞肺癌 (non smalcellungcancer,nsclc) 组织中是否通过激活靶基因血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelial growthfactor,vegf) 血管内皮细胞生长因子 C(vascularendothelialgrowthfactor C,VEGF C) 促进肿瘤的侵袭转移研究报道较少 本研究通过免疫组化技术探讨 NSCLC 组织中 STAT3 p STAT3 与靶基因 VEGF VEGF C 的关系 方法 选取 山东大学附属省立医院胸外科施行肺癌手术的 7 例 NSCLC 患者的标本, 包括 7 例 NSCLC 组织及随机选取的 0 例癌旁正常肺组织 免疫组化技术检测 NSCLC 组织及癌旁正常肺组织 STAT3 p STAT3 VEGF 和 VEGF C 的表达情况 结果 VEGF 及 VEGF C 蛋白在 NSCLC 组织中的表达均显著高于癌旁正常肺组织, 犘值分别为 0.01 和 VEGF 的表达与肿瘤大小 (pt) 淋巴结转移 (pn) 及 ptnm 分期显著相关, 犘值均 <0.05;VEGF C 的表达与淋巴结转移 (pn) 显著相关, 犘 = 例有淋巴结转移的肺癌组织中,VEGF VEGF C 表达阳性例数分别为 37 例 (71.6%) 和 36 例 (69.%), 差异有统计学意义, 犘 <0.05;0 例无淋巴结转移的肺癌组织中, VEGF VEGF C 表达阳性例数分别为 8 例 (40.0%) 和 7 例 (35.0%), 差异有统计学意义, 犘 <0.01 Spearman 等级相关分析表明, 在 NSCLC 组织中 STAT3 表达与 p STAT3 表达呈显著正相关, 狉 =0.307, 犘 =0.009 STAT3( 狉 =0.309, 犘 = 0.008) p STAT3( 狉 =0.381, 犘 =0.001) 表达均与 VEGF 表达呈显著正相关 结论 STAT 信号通路可能通过调控 VEGF VEGF C 的表达促进 NSCLC 的发生发展 浸润转移 关键词 非小细胞肺癌 ; 信号转导和转录激活因子 3; 血管内皮生长因子 ; 淋巴转移 中华肿瘤防治杂志,016,3(1): 犚犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆犫犲狋狑犲犲狀犛犜犃犜 3 狊犻犵狀犪犾犻狀犵狆犪狋犺狑犪狔犪狀犱犻狋狊狋犪狉犵犲狋犵犲狀犲犞犈犌犉, 犞犈犌犉 犆犻狀狆犪狋犻犲狀狋狊狑犻狋犺狀狅狀 狊犿犪犾犮犲犾犾狌狀犵犮犪狀犮犲狉 犣犎犝犘犲狀犵 1 犮犺狅狀犵, 犛犝犖犣犺犻 犵犪狀犵, 犡犐犃犗犠犲犻, 犣犎犃犖犌犖犪狀, 犠犃犖犌犑狌狀, 犠犃犖犌犣犺狅狌 3, 犣犎犝犔犻犪狀犵 犿犻狀犵 1. 犉犻狉狊狋犆犾犻狀犻犮犪犾犆狅犾犲犵犲狅犳犔犪狀狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犔犪狀狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪. 犑犻狀犪狀犆犲狀狋狉犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱狋狅犛犺犪狀犱狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犑犻狀犪狀 50013, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 3. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犜犺狅狉犪犮犻犮犛狌狉犵犲狉狔, 犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犎狅狊狆犻狋犪犾犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱狋狅犛犺犪狀犱狅狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犑犻狀犪狀 5001, 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Currently,whetherSTAT3signalisactivatedin NSCLCbythetargetgeneVEGFand VEGF Ctopromotetumorinvasionandmetastasisisreportedrarely.Thisstudyaimedtoinvestigatetherelationshipbe tween STAT3 signaling pathwayanditstargetgene VEGF,VEGF Cin patients with non smalcellungcancer (NSCLC),andtostudythemechanism ofstat3signalingpathwayoccurredin NSCLC. 犕犈犜犎犗犇犛 Atotalof7 NSCLCpatientswereenroledinthisstudyfrom September011toDecember011.Alpatientsunderwentcomplete tumorresection (lobectomyorpneumonectomy)withregionallymphnodedissection.weobtained7nsclcspecimens and0normalparacanceroustissuesfromthesepatients.theimmunehistochemistrywasusedtodetecttheexpression levelsofstat3,p STAT3,VEGF,VEGF CinNSCLCspecimensandparacancerousnormaltissues. 犚犈犛犝犔犜犛 The 基金项目 济南市科技计划 ( ) 第一作者简介 朱鹏冲, 男, 山东济南人, 主要从事肺癌及食管癌基础机制及临床治疗方面的研究工作 E mail:zpc015@16.com 通讯作者简介 朱良明, 男, 山东济南人, 博士, 主任医师, 教授, 硕士生导师, 主要从事肺癌及食管癌基础机制及临床治疗方面的研究工作 E mail:zlm1655@16.com

19 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No expressionsofvegfandvegf CproteininNSCLCtissuesweresignificantlyhigherthanthatinnormalparacancerous tissues( 犘 =0.01, 犘 =0.011).VEGFproteinexpressionwassignificantlyassociatedwithpT,pNandpTNM( 犘 <0.05, 犘 =0.08, 犘 <0.05).VEGF CproteinexpressionwassignificantlyassociatedwithpN ( 犘 =0.015).VEGF,VEGF C expressionofpositivecases was37 (71.6%),36 (69.%)in5cases withpn oflungcancer;compared with8 (40.0%),6 (30.0%)in0caseswithnopNoflungcancer,thereweresignificantdiferences( 犘 <0.05, 犘 <0.01).In thecanceroustissuegroup,therewasapositivecorrelationbetweenstat3expressionandp STAT3expression ( 狉 = 0.307, 犘 =0.009).TheexpressionsofSTAT3,p STAT3 weresignificantpositivecorrelated with VEGFexpression ( 狉 =0.309, 犘 =0.008),( 狉 =0.381, 犘 =0.001). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 STATsignalingpathwaymightpromotethedevelop ment,invasionandmetastasisofnsclcbyregulatingtheexpressionofvegfandvegf C. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] non smalcellungcancer;signaltransducersandactivatorsoftranscription 3;p STAT3;vascularen dothelialgrowthfactor;lymphaticmetastasis 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,016,3(1): 中图分类号 R734. 文献标识码 A 文章编号 (016) 在恶性肿瘤的发生与发展过程中, 信号转导和转录激活因子 3 (signaltransducersandactivatorsof transcription 3,STAT3) 信号转导通路起着重要的作用 STAT3 信号通路在肿瘤细胞中的持续激活能够促进诱导血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelial growthfactor,vegf) [1] 血管内皮细胞生长因子 C (vascularendothelialgrowthfactor C,VEGF C) [] 等靶基因的表达, 促进肿瘤新生血管及淋巴管生成, 影响肿瘤细胞的免疫识别, 使正常细胞转化为癌细胞, 并促进癌细胞的侵袭转移 STAT3 信号在非小细胞肺癌 (non smalcellungcancer,nsclc) 组织中是否通过激活靶基因 VEGF 和 VEGF C 促进肿瘤的侵袭转移, 国内外鲜见报道 本研究应用免疫组化技术检测 STAT3 p STAT3 及其可能靶基因 VEGF VEGF C 在 NSCLC 组织的表达情况, 分析 STAT3 p STAT3 与 VEGF VEGF C 的相关性, 从而探讨 STAT3 信号通路在 NSCLC 发生发展中的可能发生机制 1 材料与方法 1.1 标本来源 收集 山东大学附属省立医院胸外科行肺癌手术并经病理学确诊为 NSCLC 的标本 7 例, 包括 7 例 NSCLC 组织和随机选取的 0 例癌旁正常肺组织 ( 距癌组织边缘 3cm, 病理未查见癌细胞 ) 患者男 41 例, 女 31 例 年龄 46~ 77 岁, 平均年龄 58.6 岁, 中位年龄 60.3 岁 其中鳞癌 38 例, 腺癌 34 例 高分化 11 例, 中分化 38 例, 低分化 3 例 TNM 分期按照国际抗癌联盟 (Unionfor InternationalCancer Control,UICC) 修订的肺癌 TNM 分期标准 (009 年, 第 7 版 ),pⅠ 期 17 例,pⅡ 期 37 例,pⅢA 期 18 例 肿瘤大小 :pt 18 例,pT 53 例, pt 311 例 有淋巴结转移 5 例, 无淋巴结转移 0 例 标本采集均与患者签署相关知情同意书 1. 主要试剂与仪器 兔抗人 STAT3 多克隆抗体 (SpringBioscienceCom panyusa) 兔抗人 VEGF C 多克隆抗体 兔抗人 VEGF 多克隆抗体及 SP 三步法免疫组化试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司 ; 兔抗人 p STAT3(Tyr705) 多克隆抗体 (SantaCruzCompanyUSA) 组织切片机购自上海莱卡仪器有限公司, 离心机购自德国 ThermoScien tific 公司, 数显式电热恒温箱购自上海跃进医疗器械厂, 电热干燥箱购自中国上海力申科学仪器公司, 光学显微镜购自日本 Olympus 公司 1.3 标本处理 将每例石蜡标本切片, 厚度 4μm, 常规于 60 温箱烘烤 ~3h, 捞片后置于 60 烤箱干燥 4h, 室温保存备用 1.4 免疫组织化学染色 将 7 例 NSCLC 和 0 例正常肺组织均进行免疫组织化学染色 常规二甲苯切片脱蜡, 经体积分数 100% 95% 85% 和 75% 浓度乙醇逐级水化 向微波盒中加入适量 ph6.0 柠檬酸盐缓冲液, 医用微波炉中高火 中低火分别加热切片 10 min 进行抗原修复, 将微波盒放入自来水中降至室温 各加 1 滴质量分数 3% 双氧水至每张切片, 覆盖组织, 在室温下孵育 10min 各切片加 1 滴稀释倍数 的一抗兔抗人 STAT3 多克隆抗体和兔抗人 p STAT3(Tyr705) 多克隆抗体, 4 冰箱过夜 而后分别加入二抗试剂盒中 A/B/C 液各 1 滴, 室温下各 30min, 加 1 滴新配制的二氨基联苯胺 (diaminobenzidine,dab) 至各切片显色 10 min, 苏木精复染细胞核 30s, 经各级浓度的乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封片 晾干切片后观察 1.5 结果判定标准 细胞质和 ( 或 ) 细胞核内出现棕黄色颗为 STAT3 表达阳性, 细胞核内出现棕黄色颗粒为 p STAT3 表达阳性 ;VEGF VEGF C 以细胞质出现棕黄色颗粒为

20 朱鹏冲 等 ７８２ 非小细胞肺癌组织 ＳＴＡＴ３ 信号与靶基因 ＶＥＧＦ 及 ＶＥＧＦ Ｃ 关系的研究 阳性细胞 图 １ 和 图 ２ 参 照 相 关 文 献 资 料 ３ 随 机 选取５ 个高倍视野 ４００ 计算１０００ 个肿瘤细胞 根 据染色强度与阳性 细 胞 数 进 行 综 合 分 析 １ 染 色 强 度 无着色为 ０ 分 浅棕色为 １ 分 棕黄色为 ２ 分 棕褐 色为 ３ 分 ２ 阳性细 胞 数 无 阳 性 细 胞 为 ０ 分 １ ２５ 为 １ 分 ２６ ５０ 为 ２ 分 ５１ ７５ 为 ３ 分 ０ 分 为 阴 性 ７５ 为 ４ 分 以上两项分 数相乘 １ ２ 分为 弱 阳 性 ３ ５ 分 为 阳 性 ６ 分 为强阳性 均 判 定 为 阳 性 表 达 ２ 名病 理 医 师 分 别 对 每 张 切 片 进 行 结 果 判 断 结 果 判 断不同时重新计数 注 Ａ ＳＴＡＴ３ Ｂ Ｐ ＳＴＡＴ３ Ｃ ＶＥＧＦ Ｄ ＶＥＧＦ Ｃ 图 ２ 肺腺癌组织 ＳＴＡＴ３ Ｐ ＳＴＡＴ３ 和 ＶＥＧＦ 及 ＶＥＧＦ Ｃ 的阳性表达 ＳＰ ２００ １ ６ 统计学方法 将患者的临床资 料 病 理 学 特 征 以 及 试 验 结 果 共 同建立数据库 通过 ＳＰＳＳ１３ ０对数据进行统计学分 析 计数资料采用 χ２ 检验 Ｓｐｅ ａ ｒｍ 等级 法进 行相 关 性分析 检验水准 α ０ ０５ ２ 结果 注 Ａ ＳＴＡＴ３ Ｂ Ｐ ＳＴＡＴ３ Ｃ ＶＥＧＦ Ｄ ＶＥＧＦ Ｃ 图 １ 肺鳞癌组织 ＳＴＡＴ３ Ｐ ＳＴＡＴ３ 和 ＶＥＧＦ 及 ＶＥＧＦ Ｃ 的阳性表达 ＳＰ ２００ ２ １ 犛犜犃犜３ 和 狆 犛犜犃犜３ 及 犞犈犌犉 表达 ７２ 例 ＮＳＣＬＣ 组 织 中 ＳＴＡＴ３ 表 达 阳 性 ６１ 例 ８４ ７ ＳＴＡＴ３ 表 达 阳 性 ３９ 例 ５４ ２ ２０ 例 ｐ

21 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 癌旁正常肺组织中,STAT3 表达阳性 9 例 (45%), p STAT3 表达阳性 4 例 (0.0%) NSCLC 癌组织中 STAT3 和 p STAT3 的表达均显著高于癌旁正常肺组织, 犘值分别为 和 表 1 示,STAT3 的表达与 NSCLC 患者肿瘤的 ptnm 分期显著相关 ( 犘 <0.05),STAT3 阳性表达率随 ptnm 分期的加重显著增高 p STAT3 表达与 NSCLC 患者肿瘤的病理分型 淋巴结转移及 ptnm 分期显著相关 38 例鳞癌组织中,p STAT3 表达阳性 13 例 (34.%);34 例腺癌组织中,p STAT3 表达阳性 6 例 (76.5%) 腺癌 p STAT3 表达显著高于鳞癌, 犘 = 例有淋巴结转移的癌组织中, p STAT3 表达阳性 34 例 (65.4%);0 例无淋巴结转移的癌组织中,p STAT3 表达阳性 5 例 (5.0%) 二者相比差异有统计学意义, 犘 =0.003 p STAT3 阳性表达率随 ptnm 分期的加重显著增高, 犘 <0.01 表 1 非小细胞肺癌组织 STAT3 和 p STAT3 的表达与临床病理特征的关系 临床病理特征 狀 - STAT3 表达 + χ 值 犘值 p STAT3 表达 - + χ 值 犘值 病理分型 鳞癌 腺癌 分化程度 高 中 低 肿瘤大小 (pt) pt pt pt 淋巴结转移 (pn) 无 有 ptnm 分期 pⅠ pⅡ pⅢa 表 示,VEGF VEGF C 在 NSCLC 组织与癌旁正常肺组织相比较,NSCLC 组织中 VEGF VEGF C 均呈高表达, 犘值分别为 0.01 和 项目 VEGF 表 NSCLC 组织及癌旁正常肺组织 VEGF 狀 和 VEGF C 表达情况 癌旁正常组织 ( 狀 =0) VEGF C 癌组织 ( 狀 =7) χ 值犘值 表 3 示,NSCLC 组织中 VEGF 的表达与肿瘤大小 (pt) 淋巴结转移 (pn) 及 ptnm 分期显著相关 VEGF 阳性表达率随肿瘤的增大显著增高, 犘 <0.01; VEGF 在有淋巴结转移组 (71.6%) 的表达显著高于无 淋巴结转移组 (40.0%), 犘 =0.08;VEGF 的表达随 ptnm 分期的加重显著增高, 犘 <0.05 NSCLC 组织中 VEGF C 的表达与淋巴结转移 (pn) 显著相关 VEGF C 在有淋巴结转移组的表达 (69.%) 与无淋巴结转移组 (30.0%) 相比, 差异有统计学意义, 犘 = 犛犜犃犜 3 狆 犛犜犃犜 3 与犞犈犌犉 犞犈犌犉 犆表达相关性 STAT3 蛋白阳性表达的 61 例 NSCLC 患者中, 有 35 例 VEGF C 蛋白表达阳性 ;p STAT3 蛋白阳性表达的 39 例 NSCLC 患者中, 有 7 例 VEGF C 蛋白表达阳性 Spearman 等级相关分析表明,NSCLC 组织中,STAT3 表达与 p STAT3 表达呈显著正相关 ( 狉 =0.307, 犘 =0.009), 与 VEGF 表达呈显著正相关, 狉 =0.309, 犘 =0.008 p STAT3 表达与 VEGF 表达呈显著正相关, 狉 =0.381, 犘 =0.001 STAT3 表达与 VEGF C 表达无显著相关, 狉 =0.113, 犘 =0.346

22 784 朱鹏冲, 等非小细胞肺癌组织 STAT3 信号与靶基因 VEGF 及 VEGF C 关系的研究 表 3 非小细胞肺癌组织 VEGF 和 VEGF C 表达水平与临床病理特征的关系 临床病理特征 狀 - VEGF 表达 + χ 值 犘值 VEGF C 表达 - + χ 值 犘值 病理分型 鳞癌 腺癌 分化程度 高 中 低 肿瘤大小 (pt) pt pt pt 淋巴结转移 (pn) 无 有 ptnm 分期 pⅠ pⅡ pⅢa 讨论肿瘤侵袭与转移过程中一个最重要事件是血管生成, 而 VEGF 是目前发现的最重要的血管生长因子, [4 5] 与人类的多种肿瘤的侵袭转移相关 如果没有血管提供营养, 肿瘤的生长一般不会超过 cm [6] 已有研究证实,VEGF 也参与了 NSCLC 演变与生长进 [7 8] 程 本研究检测了 7 例 NSCLC 组织和 0 例癌旁正常肺组织中 VEGF 的表达情况 结果发现, VEGF 的表达在 NSCLC 组织中显著升高, 这与上述文献报道结果基本一致, 再一次证实了 VEGF 是参与 NSCLC 发生发展过程中的重要因子 本研究检测结果显示,VEGF 的表达与患者肿瘤大小 淋巴结转移及 ptnm 分期显著相关, 因此认为,VEGF 不仅参与了 NSCLC 的发生发展, 还与 NSCLC 的侵袭 转移密切相关 STAT3 与 VEGF 关系密切, 激活的 STAT3 能够 [9] 调控 VEGF 的表达, 促进肿瘤新生血管生成 STAT3 信号是否通过调控 VEGF 促进 NSCLC 生长 [10] 转移, 文献报道较少 Das 等在肺腺癌细胞株的体外实验研究发现,STAT3 与 VEGF 呈显著正相关, 当细胞株内 STAT3 抑制后,VEGF 表达显著降低 [11 1] Zhao 等研究表明,STAT3 的激活与 VEGF 和 bfgf 的表达有关, 认为 STAT3 可能是抗 NSCLC 抗 [13] 血管形成的一个关键的分子靶标 Pan 等研究发现,IL 17 通过 STAT3/GIV 通路刺激 VEGF 促进 NSCLC 血管生成中的作用 关于 STAT3 通路与 [14] VEGF 在肿瘤血管生成中的作用,Wang 等也有相关报道 本研究发现,NSCLC 组织 STAT3 蛋白阳性 表达的 61 例 NSCLC 患者中, 有 37 例 p STAT3 蛋白表达阳性,4 例 VEGF 蛋白表达阳性 ;p STAT3 蛋白阳性表达的 39 例 NSCLC 中, 有 31 例 VEGF 蛋白表达阳性 ;NSCLC 组织中 STAT3 p STAT3 和 VEGF 三者呈显著性正相关 因此认为,STAT3 信号系统的激活增强促进了 VEGF 的表达, 从而促进了 NSCLC 的发生与发展 肿瘤的侵袭与转移除了依赖于新生血管的形成, 经淋巴循环转移也是一种非常重要的途径 淋巴转移恶性肿瘤是最常见的转移方式 VEGF C 是首个被识别的有特异性的促淋巴管新生作用的细胞因子, 与肿 [15] 瘤的淋巴转移密切相关 研究证实,VEGF C 在人 [16 18] 类多种肿瘤细胞中都存在显著表达 本研究发现,VEGF C 的表达在 NSCLC 组织中显著高于癌旁正常肺组织,VEGF C 的阳性表达率在有淋巴结转移的 NSCLC 组织中显著高于无淋巴结转移组, 提示 VEGF C 与了 NSCLC 的淋巴结转移密切相关 关于肿瘤中 STAT3 信号与 VEGF C 关系的研 [19] 究, 国内外文献报道较少 近来,Lee 等在胃腺癌的研究中发现, 激活的 STAT3(p STAT3) 通过调控下游靶基因 VEGF VEGF C 促进了肿瘤的侵袭与转 [0] 移, 给患者带来不良的预后 Huang 等在胰腺癌的研究中发现,p STAT3 通过激活靶基因 VEGF C 促 [1] 进了肿瘤淋巴结转移 Zhao 等用免疫组化检测了 18 例手术切除的小细胞肺癌患者癌组织中 STAT3 p STAT3 及 VEGF C 的表达情况, 结果提示, 高表达的 STAT3 p STAT3 及 VEGF C 均与淋巴结转移及肿瘤的分期显著相关, 癌组织中不仅 p STAT3 与 VEGF C 显著相关, 而且 STAT3 与 VEGF C 也显著

23 中华肿瘤防治杂志 016 年 6 月第 3 卷第 1 期 CHINJCANCERPREV TREAT,June016,Vol.3 No 相关, 认为 STAT3 信号通路有可能通过激活 VEGF C 促进小细胞肺癌的侵袭转移 关于 STAT3 信号与 VEGF C 在 NSCLC 中的关系, 目前国内外鲜见文献报道 本研究结果显示,NSCLC 组织 p STAT3 与 VEGF C 均与淋巴结转移显著相关 ;STAT3 p STAT3 与 VEGF C 的表达均有呈正相关的趋势, 但差异并无统计学意义 STAT3 可能通过作用于其他的靶底物, 以不同机制参与 NSCLC 的发生发展 STAT3 信号通路是否通过调控 VEGF C 促进 NSCLC 的侵袭转移, 还需大样本 多中心进一步探讨 综上所述,NSCLC 组织中 STAT3 p STAT3 及 VEGF 三者的表达呈显著正相关 STAT 信号通路可能通过调控 VEGF VEGF C 的表达促进 NSCLC 的发生发展 浸润转移 参考文献 [1] RathinaveluA,Narasimhan M,MuthumaniP.Anovelregula tionof VEGF expression by HIF 1α and STAT3in HDM transfectedprostatecancercels[j].jcelmolmed,01,16 (8): [] JinC,WangA,ChenJ,etal.Relationshipbetweenexpression andprognosticabilityofpten,stat3andvegf Cincolor ectalcancer[j].expthermed,01,4(4): [3] MizoguchiM,BetenskyRA,BatchelorTT,etal.Activationof STAT3,MAPK,andAKTinmalignantastrocyticgliomas:cor relationwith EGFR status,tumorgrade,andsurvival[j].j NeuropatholExpNeurol,006,65(1): [4] 谢晓斌, 陈小卫, 龙捷, 等.VEGF C 基因表达下调对乳腺癌增殖及淋巴转移抑制作用研究 [J]. 中华肿瘤防治杂志,014,1 (): [5] 王绍奎, 杨麟珂, 张爱云, 等. 胃腺癌组织 AnnexinⅡ 和 VEGF 蛋白表达的临床意义 [J]. 中华肿瘤防治杂志,015,(15): [6] AlevizakosM,KaltsasS,SyrigosKN.TheVEGFpathwayin lungcancer[j].cancerchemotherpharmacol,013,7(6): [7] ChakrabortyS,AdhikaryA,MazumdarM,etal.Capsaicin in ducedactivationofp53 SMAR1auto regulatoryloopdown regu latesvegfinnon smalcellungcancertorestrainangiogenesis [J/CD].PLoSOne,014,9(6):e [9] WagnerAD,ThomssenC,HaertingJ,etal.Vascular endothe lial growth factor(vegf)targetingtherapiesforendocrinere fractoryorresistantmetastaticbreastcancer[j].cochranedata basesystrev,01,(7):cd [10] DasJ,DasS,PaulA,etal.Assessmentofdrugdeliveryand anticancerpotentials of nanoparticles loaded sirna targeting STAT3inlungcancer,invitroandinvivo[J].ToxicolLet, 014,5(3): [11] ZhaoM,GaoFH,WangJY,etal.JAK/STAT3signalingpath wayactivation mediatestumorangionesis by upregulation of VEGFandbFGFinnon smal cellingcancer[j].lungcancer, 011,73(3): [1] ZhaoM,LiuF,WangJY,etal.EfectsofJAK/STAT3signa lingpathwayonangiogenesisinnon smalcellungcancer[j]. ZhonghuaYiXueZaZhi,011,91(6): [13] PanB,ShenJ,CaoJ,etal.Interleukin 17promotesangiogene sisby stimulating VEGF production ofcancercels viathe STAT3/GIV signaling pathwayin non smal cellung cancer [J].SciRep,015,5: [14] WangM,ChenGY,SongHT,etal.SignificanceofCXCR4,phospho rylatedstat3andvegf Aexpressioninresectednon smalcel lungcancer[j].expthermed,011,(3): [15] SuJL,YenCJ,ChenPS,etal.TheroleoftheVEGF C/VEG FR 3axisincancerprogression[J].BrJCancer,007,96(4): [16] JiangH,ShaoW,ZhaoW.VEGF Cinnon smalcellungcancer: meta analysis[j].clinchim Acta,014,47: [17] YangZ,WangYG,SuK.VEGF CandVEGF Dexpressionandits correlationwithlymphnodemetastasisinesophagealsquamouscel cancertissue[j].asianpacjcancerprev,015,16(1): [18] CaiS,HanK.Researchonexpressionandimportanceofp53, p16andvegf Cincervicalcancer[J].JGynecolObstetBiolRe prod,014,44(7): [19] LeeJ,Kang WK,ParkJO,etal.Expressionofactivatedsignal transducerandactivatoroftranscription3predictspoorclinical outcomeingastricadenocarcinoma[j].apmis,009,117(8): [0] HuangC,HuangR,Chang W,etal.Theexpressionandclini calsignificanceofpstat3,vegfand VEGF Cinpancreatic adenocarcinoma[j].neoplasma,01,59(1):5 61. [1] ZhaoX,SunX,LiXL.Expressionandclinicalsignificanceof STAT3,P STAT3,andVEGF Cinsmalcellungcancer[J]. AsianPacJCancerPrev,01,13(6): [8] QiL,ZhuF,LiSH,etal.Retinoblastomabindingprotein (RBP)promotes HIF 1α VEGF inducedangiogenesisofnon smalcellungcancerviatheaktpathway[j/cd].plosone, 014,9(8):e 收稿日期 : 修回日期 : ( 编辑 : 边莉 )