162 孙磊, 等 sirna 干扰 ARK5 蛋白表达对 U251 细胞侵袭潜能影响机制探讨 中图分类号 R739.4 文献标识码 A 文章编号 (2014) 腺苷酸活化蛋白激酶 5 (AMPK relatedprotein kinase5,ark5) 是 A

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1 中华肿瘤防治杂志 ２０１４ 年 ２ 月第 ２１ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｆｂ ｕ Ｖ ２１ Ｎ ３ ｙ２０１４ １６１ 前沿报道 论著 狊 犻犚犖犃 干扰 犃犚犓５ 蛋白表达对 犝２５１ 细胞 侵袭潜能影响机制探讨 孙磊１ 张宝刚１ 李小龙１ 刘清华２ 刘雨清１ １ 潍坊医学院病理教研室 山东 潍坊 ２６１０５３ ２ 宁阳县第一人民医院病理科 山东 泰安 ２７１４００ 摘要 目的 探讨 ＲＮＡ 干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶 ５ ＡＭＰＫ ｄｐ ｎｋ ｎ ５ ＡＲＫ５ 表达对 Ｕ２５１ 细胞 侵袭潜能的影响及其机制 方法 采用蛋白质印迹法检测 Ｕ２５１ 细胞 中 ＡＲＫ５ 表 达 应 用 ＲＮＡ 干 扰 技 术 转 染 Ｕ２５１ 细胞株 并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后 ＡＲＫ５ 蛋白表达情况 通过体外 侵 袭 实 验 检 测 细 胞 转 染 后 侵 袭 能 力 的 变 化 ＡＲＫ５ 下降后 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 间 质 细 胞 来 源 的 ＹＫＬ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ Ｖｍｎ ｎ 蛋 白 和 调 节 因 子 Ｓｎ Ｓ ｕｇ Ｔｗ １ 和 Ｚｂ１ 的表达 结果 转染 ＡＲＫ５ 质粒的 Ｕ２５１ 细胞 ＡＲＫ５ 表达下降 ＡＲＫ５ 表达降低的 Ｕ２５１ 细胞侵袭并穿 透 Ｍ 膜基质的细胞数量为 ２２ Ｕ２５１ 对照组为 ４１ ＳＣＲ Ｕ２５１ 对照组为 ４２ 两两比较 ＡＲＫ５ 表达降低的实验组透 ｇ 膜数比两对照组少 犘 ０ ００１ 同时蛋白质印迹法结果显示 ＹＫＬ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ 和 Ｖｍｎ ｎ 蛋 白 表 达 量 降 低 与 间 质 转化相关的转录因子仅 Ｓｎ 的表达降低 而转录 因 子 Ｓ ｕｇ Ｔｗ １ 和 Ｚｂ１ 表 达 无 明 显 改 变 结 论 应 用 ＲＮＡ 干 扰 技术降低 ＡＲＫ５ 蛋白的表 达 使 Ｕ２５１ 细 胞 侵 袭 转 移 能 力 降 低 同 时 ＹＫＬ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ 和 Ｖｍｎ ｎ蛋白和转录因子 Ｓｎ 的表达量降低 提示 ＡＲＫ５ 蛋白表达降低可通过调节间质转化影响 Ｕ２５１ 细胞的侵袭 关键词 Ｕ２５１ ＲＮＡ 干扰 腺苷酸活化蛋白激酶 ５ 间质转化 侵袭 中华肿瘤防治杂志 ２０１４ ２１ ３ １６１ １６４ 犐 狀 犳 犾 狌 犲狀犮 犲狅 犳狊 犻犚犖犃犻 狀 狋 犲 狉 犳 犲 狉 犲狀犮 犲犃犚犓５狅狀狋 犺 犲犻 狀狏 犪 狊 犻 狅狀狆狅 狋 犲狀 狋 犻 犪 犾 犻 狋 犳 狔狅 犝２５１犮 犲 犾 犾犪狀犱犻 狋 狊犿犲 犮犺犪狀 犻 狊犿 犛犝犖犔犲 犻１ 犣犎犃犖犌犅犪狅 犵犪狀犵１ 犔犐犡犻 犪狅 犾 狅狀犵１ 犔犐犝犙犻 狀犵 犺狌犪２ 犔犐犝犢狌 犻 狀犵１ 狇 １ 犇犲狆犪狉 狋犿犲狀 狋狅犳 犘犪 狋 犺狅 犾 狅犵狔 犠犲 犻犳犪狀犵 犕犲犱犻 犮犪 犾犝狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 犠犲 犻犳犪狀犵 ２６１０５３ 犘 犚 犆犺 犻 狀犪 狔 ２ 犇犲狆犪狉 狋犿犲狀 狋狅犳 犘犪 狋 犺狅 犾 狅犵狔 犖犻 狀犵狔犪狀犵犉犻 狉 狊 狋犘犲 狅狆犾 犲 狊犎狅 狊狆犻 狋 犪 犾 犜犪 犻 犪狀２７１４００ 犘 犚 犆犺 犻 狀犪 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｎｖ ｈ ｎ ｆ ｕｎ ｆ ｎｖ ｎｐ ｎ ｍ ｈｎ ｍｆ Ｕ２５１ ｂｙ Ｒ ｇ ｙｎｄ ＮＡ ｎ ｆ ｎ ｄｕ ｎｇａｒｋ５ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｗ ｎｂ ｗ ｕ ｄ ｄ ｈｘｐ ｎ ｆａｒｋ５ ｎｕ２５１ Ｓ Ｒ ＮＡｐ ｍ ｄｗ ｕ ｄ ｎ ｆ Ｕ２５１ ｈｎ Ｗ ｎｂ ｗ ｕ ｄ ｎ ｚ ｐ ｎｘｐ ｎ ｆａｒｋ５ 犐狀狏 犻 狋 狉 狅 ｙ ｍ ｎｖ ｎ ｙｗ ｕ ｄ ｄ ｈｖ ｎ ｆ ｎｖ ｖｎ ｎ ｈ ｂ ｎｇ ｎ ｆ ｄ Ｗ ｎｂ ｗ ｇ ｕ ｄ ｎ ｚ ｐ ｎｘｐ ｎ ｆｙｋｌ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ Ｖｍｎ ｎｎｄｘｐ ｎ ｆ ｎ ｎｆ Ｓｎ Ｓ ｕｇ ｙ ｐ Ｔｗ １ Ｚｂ１ ｐ ｖ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔｈｐ ｎｘｐ ｎ ｆａｒｋ５ ｎｕ２５１ ｈ ｈｄｂ ｎ ｎ ｆ ｄｂｙａｒｋ５ ｙ ｈｑｕｎ ｆｕ２５１ ｗｈ ｈ ｎｖｄｄｎｄｐｎ ｄｍ ｗ ２２ ｗ ｄ ｄ Ａｆ ｄｗｎ ｇｕ ｎ ｆａｒｋ５ ｙ ｇ Ｔｈｂ ｎｋ ｎ ｇ ｕｐｗ ４１ ｈ ｎ ｇ ｕｐ ｆｓｃｒ Ｕ２５１ｗ ４２ ｍｐ ｄｗ ｈ ｈｗ ｎ ｇ ｕｐ ｈｑｕｎ ｆｕ２５１ ｎｄ ｈｄｗｎ ｇｕ ｎ ｆａｒｋ５ ｗ ｄ ｄ 犘 ０ ００１ Ｔｈｐ ｎｘｐ ｎ ｆｙｋｌ ４０ ｙ Ｎ ｄｈ ｎ Ｖｍｎ ｎｎｄｎ ｎ ｆ ｎ ｎｆ Ｓｎ ｗ ｄ ｄ ｆ ｎ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 Ｓ ｎ ｙｘｐ ｐ ｇｎ ｙ ｎｇ ｆａｒｋ５ｍｐ ｇ ｍ ｎｖ ｎｎｄ ｈｘｐ ｎ ｆａｒｋ５ ｎｇ ｍｗ ｆ ｎ ｄｗ ｈ ｈｘｐ ｇｎ ｙ ｎ ｆｙｋｌ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ Ｖｍｎ ｎｎｄｓｎ ｕｇｇ ｎｇ ｈ ＡＲＫ５ ｎｐ ｙｋｙ ｎ ｈ ｎｖ ｖｎ ｆｕ２５１ｂｙ ｄ ｕ ｎｇ ＭＴ ｊ 犓犈犢犠犗犚犇犛 Ｕ２５１ ＲＮＡ ｎ ｆ ｎ ＡＲＫ５ ｍ ｎｈｙｍ ｎ ｎ ｎｖ ｎ 犆犺 犻 狀犑犆犪狀犮 犲 狉犘狉 犲狏犜狉 犲犪 狋 ２０１４ ２１ ３ １６１ １６４ 基金项目 国家自然科学基金 ８１０７２０６８ 山东省中青年科学家科研奖励基金 ２０１０ＢＳＢ１４０５０ 第一作者简介 孙磊 女 山东日照人 硕士 主要从事肿瘤病理的临床研究工作 Ｔ ８６ ５３６ ８４６２０３４ Ｅ ｍ ｚｈ ｕｂｙ １２６ ｍ 通讯作者简介 刘雨清 女 山东潍坊人 教授 主要从事肿瘤病理的临床研究工作 Ｔ ８６ ５３６ ８４６２０３４ Ｅ ｍ ｎｇ ｕ８９ ｈ ｍ ｍ ｙｕｑ

2 162 孙磊, 等 sirna 干扰 ARK5 蛋白表达对 U251 细胞侵袭潜能影响机制探讨 中图分类号 R739.4 文献标识码 A 文章编号 (2014) 腺苷酸活化蛋白激酶 5 (AMPK relatedprotein kinase5,ark5) 是 AMPK 亚家族的成员, 在肿瘤细 [1 2] 胞的侵袭中具有关键作用 本课题组前期研究表明,ARK5 在胶质瘤的浸润中具有重要作用, 并与胶 [3 4] 质瘤患者的生存时间密切相关 肿瘤细胞的上皮细胞间质转化 (epithelial mesenchymaltransition, EMT) 是肿瘤发生发展过程中的重要现象, 也被认为 [5] 是肿瘤发生侵袭转移的始动环节 胶质瘤源于神经胶质细胞的恶变, 也可发生间质转化, 类似 EMT, 被称之为间质转化 (mesenchymaltransition,mt) [6] 推测 ARK5 在胶质瘤侵袭中的作用可与 MT 有关 本实验用 sirna 干扰技术使 ARK5 蛋白表达降低, 通过体外侵袭实验检测 U251 细胞侵袭能力, 探讨 ARK5 蛋白表达降低对 U251 细胞侵袭潜能的影响及其机制 1 材料与方法 1.1 主要试剂一抗 ARK5 为美国 SantaCruz 公司产品 ; 二抗购自中杉公司, 二甲基亚枫 (DMSO) 0.1% fibronectin HEPES 和 BSA 均购自美国 Sigma 公司 ;RPMI1640 培养液购自美国 Hyclone 公司 ; 胰蛋白酶 彩色预染蛋白和 DOO18 质粒中量抽提试剂盒均购自碧云天 ; 胎牛血清为杭州四季青产品 ; 侵袭实验所用 24 孔细胞培养板购自美国 Corning 公司 ;Matrivgel 膜基质购自北京威格拉斯公司 ;24 孔趋化小室和细胞转染试剂购自康为世纪 1.2 方法 细胞培养胶质瘤细胞株 U251 购自美国 ATCC 细胞库 U251 细胞常规培养于 10% 胎牛血清中, 加入终浓度各为 100U/mL 的青霉素和链霉素, 置于 37 5% CO 2 孵育箱中传代培养 采用对数生长期的细胞进行实验 当细胞密度达到 85% 左右时, 分别转染插入 ARK5 目标片段 5 GAAGTTATGCTT TATTCAC 3 的小 RNA 干扰质粒和插入 SCR 序列的小 RNA 干扰质粒, 转染步骤参照转染试剂说明书 转染细胞株分别为对照组 SCR/U251 细胞和实验组 siark5/u251 细胞 蛋白质印迹法检测将转染后的 siark5/ U251 和 SCR/U251 细胞及 U251 细胞培养 72h 后提取充足蛋白, 制备 SDS PAGE 凝胶, 蛋白质变性后电泳, 转膜 封闭, 滴加一抗孵育 ( 均为 ARK5), 二抗孵育后显影 当转染成功后进行侵袭实验 然后取已提取的蛋白再次进行蛋白质印迹实验, 所加的一抗分别为 YKL 40 N cadherin Vimentin 和 Snail Slug Twist1 Zeb1 将所得结果分别进行分析 体外癌细胞侵袭能力检测按文献 [7] 操作, 应用 8μm 滤膜 Transwel 小室, 铺 Matrigel 使膜上所有的微孔被人工基质胶覆盖并在室温下干燥 将转染后 ARK5 减低的胶质瘤 U251 细胞和对照细胞 200μL 细胞悬液 ( 个 /ml) 加入 Boyden 小室上室 下室加入 300μL BM(RPMI1640,0.1% BSA, 25mmol/L HEPES) 37 5% CO 2 孵育 24h 然后取出培养板, 弃去 Boyden 小室内培养基, 用棉签擦尽上室面的人工基底胶和细胞, 下室面用甲醇固定 10min 后, 常规 HE 染色, 置 400 倍光镜下观察,5 个高倍镜视野, 计数 Boyden 小室下室面的细胞数即为穿透人工基膜的细胞数 每个实验重复 3 次, 取平均数作为实验结果 1.3 统计学方法 各组实验数据以狓 - ± 狊表示, 运用 SPSS16.0 做统计学处理 各组之间比较用单因素方差分析, 方差齐性时两两比较用 LSD 检验 检验水准 α= 结果 2.1 狊犻犃犚犓 5/ 犝 251 细胞中犃犚犓 5 蛋白的表达 如图 1 所示, 应用质粒转染细胞, 转染成功后 siark5/u251 细胞中 ARK5 蛋白表达降低 注 : 狏狊 U251 及 SCR/U251 细胞,siARK5/U251 细胞中 ARK5 蛋白的表达下降 2.2 体外侵袭实验 图 1 ARK5 蛋白在 U251 及 SCR/U251 和 siark5/u251 细胞中的表达 转染小 RNA 干扰质粒成功后, 进行侵袭实验, ARK5 降低组 ( 即转染实验组质粒细胞 ) 显示, 侵袭能力明显下降 ( 图 2A) 转染对 U251 细胞的影响显示, U251 SCR/U251 和 siark5/u2513 组的狓 - ± 狊测值分别为 41± ±1.197 和 22±1.160 方差齐性检验, 犉 =0.930, 犘 =0.407;3 组均数差异的显著性检验, 犉 =1.172, 犘 <0.001 两两比较 LSD 结果如图 2B 所示, 与 U251 对照组和 SCR/U251 对照组细胞

3 中华肿瘤防治杂志 ２０１４ 年 ２ 月第 ２１ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｆｂ ｕ Ｖ ２１ Ｎ ３ ｙ２０１４ １６３ 数目相比 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 实验组 穿 过 ８μｍ 微 孔 滤 膜 细胞数减少 差异有统计学意义 犘 ０ ００１ 而 Ｕ２５１ Ｕ２５１ 细胞中间 质细 胞来 源 的 ＹＫＬ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ和 Ｖｍｎ ｎ 蛋白表达下调 对照组 和 ＳＣＲ Ｕ２５１ 对 照 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 ２ ４ 狊 犻 犃犚犓５ 犝２５１ 细 胞 犛狀犪 犻 犾 犛 犾 狌犵 犜狑犻 狊 狋１ 和 犣犲犫１ 蛋白的表达 义 犘 ０ １９１ 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 了 转 录 因 子 Ｓｎ Ｓ ｕｇ Ｔｗ １ 和 Ｚｂ１ 结果如图 ４ 所示 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 细胞 中仅 ｎ 蛋白表达下调 注 狏 狊 Ｕ２５１ 及 ＳＣＲ Ｕ２５１ 细 胞 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 细 胞 中 ＹＫＬ ４０ Ｎ ｄｈ ｎ 和 Ｖｍｎ ｎ 蛋白的表达下降 图 ３ ＹＫＬ ４０ 和 Ｎ ｄｈ ｎ及 Ｖ ｍｎ ｎ在 Ｕ２５１ 及 ＳＣＲ Ｕ２５１ 和 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 细胞中的表达 注 狏 狊 Ｕ２５１ 及 ＳＣＲ Ｕ２５１ 细 胞 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 细 胞 中 仅 Ｓｎ 蛋 白的表达下降 图 ４ Ｓｎ Ｓ ｕｇ Ｔｗ １ 和 Ｚｂ１ 蛋白在 Ｕ２５１ 及 ＳＣＲ Ｕ２５１ 和 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 细胞中的表达 ３ 讨论 胶质瘤源于神经 胶 质 细 胞 的 恶 变 属 于 神 经 系 统 常见恶性肿瘤之一 由 于 其 浸 润 性 生 长 的 特 点 易 引 起颅内压升高 压迫 脑 组 织 导 致 中 枢 神 经 损 害 危 及 患者生命 ８９ 因此 研究胶质瘤的侵袭浸润对 指导胶 注 Ａ 狏 狊 Ｕ２５１ 对 照 组 和 ＳＣＲ Ｕ２５１ 对 照 组 ＡＲＫ５ Ｕ２５１ 实 验 组侵袭能力下降 Ｂ 透膜细胞数减少 图 ２ Ｕ２ ５ １及 ＳＣＲ Ｕ２ ５ １和 ＡＲＫ５ Ｕ２ ５ １细胞侵袭能力的变化 质瘤的治疗具有重要意义 ＭＴ 作为肿瘤 发生 发展过 程中的重要现象 可 促 进 肿 瘤 细 胞 的 侵 袭 目 前 本 课 题组前期研究已表 明 ＡＲＫ５ 在 胶 质 瘤 的 浸 润 中 具 有 重要的作用 并与胶质瘤患者的生存时间密切 相关 ３ ２ ３ 狊 犻犃犚犓５ 犝２５１ 细 胞 犢犓犔 ４０ 和 犖 犮犪犱犺犲 狉 犻 狀及 但关于 ＡＲＫ５ 蛋 白 表 达 对 胶 质 瘤 侵 袭 潜 能 的 影 响 及 犞 犻犿犲狀 狋 犻 狀 蛋白的表达 蛋白 质 印 迹 法 检 测 结 果 如 图 ３ 所 示 ＡＲＫ５ 其是否与 ＭＴ 有关的相关研究甚少 本研究通过小 ＲＮＡ 干扰技 术将 质粒 转染 进胶 质

4 164 孙磊, 等 sirna 干扰 ARK5 蛋白表达对 U251 细胞侵袭潜能影响机制探讨 瘤 U251 细胞株, 培养 72h 后, 蛋白质印迹法检测, 结果表明, 转染 ARK5 的 U251 细胞 ARK5 蛋白量降低 随后的体外癌细胞侵袭实验显示, 低表达 ARK5 的 U251 细胞侵袭并穿透 Matrigel 膜基质的细胞数量较对照组减少, 证明 ARK5 参与了癌细胞侵袭过程 这一结果与本课题组前期研究的结果相一致 为了研究 sirna 干扰降低 ARK5 蛋白表达对胶质瘤 U251 细胞侵袭潜能的影响机制, 判断 U251 细胞侵袭能力的变化是否与 MT 相关, 并结合目前已有文献报道的发生 MT 的胶质瘤细胞通常间质细胞来源的 YKL 40 [10] 神经型钙黏附素 N cadherin [11] 和 Vimen tin [12] 的表达反常增加 本研究结果显示, 转染后 U251 细胞中间质细胞来源的 YKL 40 N cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达下降 说明 ARK5 可通过调节 YKL 40 N cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达影响 U251 细胞的侵袭能力, 而作为间质细胞来源的 YKL 40 N cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达与 MT 密切相关, 因此推断 MT 与胶质瘤 U251 的侵袭能力关系密切 这一结论与上述所查文献所示结果相符合 为了进一步研究 sirna 干扰降低 ARK5 蛋白表达对 U251 细胞侵袭能力的分子机制, 本研究检测了与 MT 密切相关的转录因子 Snail Slug Twist1 和 Zeb1 蛋白在 U251 细胞中的表达情况 结果显示, 在转染 ARK5 后的 U251 细胞中仅有 Snail 蛋白的表达下降, 说明 ARK5 可通过调节 Snail 诱导 U251 细胞发生 MT Snail 属于转录抑制子中的 Snail 超家族, 可抑制 E cadherin 的表达从而导致上皮间连接的破坏, 使癌细胞间粘连松散, 易于侵袭 它是肿瘤浸润进展 [13] 过程中的一个重要的调节子 由此推断 Snail 的表达诱导了钙黏附素亚型间的转变 T cadherin 转为 N cadherin 使细胞转为浸润性的恶性表型, 说明在胶质瘤的发生发展中,Snail 表达上调可诱导肿瘤的发生和侵袭 此外, 目前已有研究表明, 磷酸酯酰肌醇 3 激酶 (PI3K Akt) 信号通路调控转录因子 Snail 的表达, 从而诱导 MT [14] ; 本课题组已有研究显示,ARK5 通 [3] 过调控 Akt ARK5 通路参与胶质瘤的侵袭 因此, 推测 ARK5 可能是通过调节 PI3K Akt ARK5 信号通路来调节 Snail 的合成, 进而诱导 MT, 参与胶质瘤 U251 细胞的侵袭 综合上述,siRNA 干扰降低 ARK5 蛋白表达可使胶质瘤 U251 细胞侵袭能力降低, 并可通过转录因子 Snail 的表达变化调控 MT 参与胶质瘤 U251 细胞的侵袭过程, 这对指导胶质瘤的治疗具有重要意义 参考文献 [1] SuzukiA,OguraT,EsumiH.NDR2actsastheupstreamkinase ofark5duringinsulin likegrowthfactor 1signaling[J].JBiol Chem,2006,281(20): [2] SuzukiA,LuJ,KusakaiG,etal.ARK5isatumorinvasion asso ciatedfactordownstream ofaktsignaling[j].molcelbiol, 2004,24(8): [3] LuS,NiuN,Guo H,etal.ARK5promotesgliomacelinvasion anditselevatedexpressioniscorrelated withpoorclinicalout come[j].eurjcancer,2013,49(3): [4] ShiL,SunX,ZhangJ,etal.Gab2expressioningliomaandits implicationsfortumorinvasion[j].acta Oncol,2013,52(8): [5] 燕慧, 王捷. 上皮间质转化与肿瘤转移的研究进展 [J]. 中华肿瘤防治杂志,2010,2(17): [6] LuKV,ChangJP,ParachoniakCA,etal.VEGFinhibitstumor celinvasionandmesenchymaltransitionthroughamet/veg FR2complex[J].CancerCel,2012,22(1): [7] ZhangB,GuF,SheC,etal.ReductionofAkt2inhibitsmigration andinvasionofgliomacels[j].intjcancer,2009,125(3): [8] 姜京超, 吕玉玲, 纪宇明, 等. 人脑胶质瘤 PENT 和 Survivin 及 HiF 1α 蛋白表达临床意义的探讨 [J]. 中华肿瘤防治杂志,2012, 19(20): [9] VanTrappenPO,Ryan A,CarrolM,etal.A modelforco ex pressionpaternanalysisofgenesimplicatedinangiogenesisand tumorcelinvasionincervicalcancer[j].brjcancer,2002,87 (5): [10] FanJT,SiXH,LiaoY,etal.Thediagnosticandprognosticvalue ofserum YKL 40inendometrialcancer[J].Arch GynecolOb stet,2013,287(1): [11] ZhangX,LiuG,KangY,etal.N cadherinexpressionisassociat edwithacquisitionofemtphenotypeandwithenhancedinva sioninerlotinib resistantlungcancercellines[j].plos One, 2013,8(3):e [12] RizviI,Gurkan UA,TasogluS,etal.Flowinducesepithelial mesenchymaltransition,celular heterogeneity and biomarker modulationin3dovariancancernodules[j].procnatlacadsci USA,2013,110(22): [13] BaqueroP,Sanchez HernandezI,Jimenez MoraE,etal.(V600E) BRAFpromotesinvasivenessofthyroidcancercelsbydecreasing E cadherinexpressionthroughasnail dependent mechanism [J]. CancerLet,2013,335(1): [14] BachelderRE,YoonSO,FranciC,etal.Glycogensynthaseki nase 3isanendogenousinhibitorofSnailtranscription:implica tionsfortheepithelial mesenchymaltransition[j].celbiol, 2005,168(1): 收稿日期 : 修回日期 : ( 编辑 : 张勋 )

5 中华肿瘤防治杂志 2014 年 2 月第 21 卷第 3 期 CHINJCANCERPREV TREAT,February2014,Vol.21 No 前沿报道 / 论著 靶向犆犡犆犚 4 特异性造影剂在骨肉瘤成像中的应用 马琼 1 ShiKe 2 Wang Wei 2 文艳华 1 刘云燕 1 范清宇 1 周勇 1 裘秀春 1 1. 第四军医大学唐都医院骨科骨肿瘤研究所, 陕西西安 贝勒医学院放射系, 美国休斯顿 摘要 目的 : 对骨肉瘤中趋化因子受体 4(chemokinereceptor4,CXCR4) 的表达进行非损伤性评价, 探讨 CXCR4 特异性造影剂在骨肉瘤成像及早期诊断中的作用 方法 : 采用化学合成的方法得到了带有 CXCR4 特异性造影剂的 1 条肽段, 通过近红外染料标记, 进行骨肉瘤细胞 SOSP 9607 的体外结合试验 ; 皮下接种裸鼠, 构建骨肉瘤的异体移植模型,7d 后对裸鼠进行体内光学成像, 并用免疫组织化学法检测发光团组织中 CXCR4 的表达 结果 : 体外细胞结合试验证明合成的近红外造影剂能够很好的与人的骨肉瘤细胞 SOSP 9607 相结合 近红外光学成像表明, 靶向 CXCR4 的特异性造影剂可用于小动物骨肉瘤的早期和晚期显影 免疫组化染色显示, 发光团组织中 CXCR4 表达呈阳性 结论 : 趋化因子受体 CXCR4 靶标特异性分子造影剂, 可用于早期和晚期骨肉瘤的显影, 对骨肉瘤的诊断及其预后意义重大 关键词 趋化因子受体 4; 分子成像 ; 多肽成像 ; 骨肉瘤 ; 靶标特异性成像 犃狆狆犾犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犡犆犚 4 狊狆犲犮犻犳犻犮犪犵犲狀狋狊犻狀狋犺犲犻犿犪犵犻狀犵狅犳狅狊狋犲狅狊犪狉犮狅犿犪 中华肿瘤防治杂志,2014,21(3): 犕犃犙犻狅狀犵, 犛犎犐犓犲 2, 犠犃犖犌犠犲犻 2, 犠犈犖犢犪狀 犺狌犪 1, 犔犐犝犢狌狀 1 狔犪狀, 犉犃犖犙犻狀犵 1 狔狌, 1 犣犎犗犝犢狅狀犵, 1 犙犐犝犡犻狌 犮犺狌狀 1. 犗狉狋犺狅狆犪犲犱犻犮犗狀犮狅犾狅犵狔犐狀狊狋犻狋狌狋犲, 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犗狉狋犺狅狆犪犲犱犻犮狊, 犜犪狀犵犱狌犎狅狊狆犻狋犪犾, 犉狅狌狉狋犺犕犻犾犻狋犪狉狔犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犡犻 犪狀 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 2. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犚犪犱犻狅犾狅犵狔, 犅犪狔犾狅狉犆狅犾犲犵犲狅犳犕犲犱犻犮犻狀犲, 犎狅狌狊狋狅狀 77030, 犝犛犃 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToevaluatetheexpressionofCXCR4inosteosarcomanoninvasively,andfurtherexplore theroleofcxcr4 specificagentsinimagingofosteosarcomaaswelasitsearlydetection. 犕犈犜犎犗犇犛 :Peptidebased CXCR4imagingagentswassynthesizedandlabeledwithnear infrareddyefor 犻狀狏犻狋狉狅 celbindingstudiesonosteosarco macellinesosp 9607anditwastransplantedtonudemicetoestablishanxenograftmodelbymeansofsubcutaneousin jection(s.c.). 犐狀狏犻狏狅 opticalimagingstudieswerecarriedoutsevendayslater.theexpressionofcxcr4intheluminous tissuewasdetectedbyimmunochemistry. 犚犈犛犝犔犜犛 :Celbindingstudiesdemonstratedthoseagentsboundtothehuman osteosarcomacelssosp 9607.Nearinfraredopticalimagingdemonstratedthoseagentscouldbeusedtodetectosteosar comaatearlyandlatestagesofthediseaseinmice.immunochemistrystainingdemonstratedthatcxcr4waspositivein theluminoustissue. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :Wecanimageosteosarcomainbothearlyandlatediseasestagesusingthismolecular imagingagentthatspecifictargetstochemokinereceptorcxcr4,anditissurelyofparamountindiagnosisandprognosis ofosteosarcoma. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] chemckinereceptor;molecularimaging;peptideimaging;osteosarcoma;target specificimaging 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,2014,21(3): 中图分类号 R738.1 文献标识码 A 文章编号 (2014) 基金项目 国家自然科学基金 ( ; ; ; ; ) 第一作者简介 马琼, 女, 陕西西安人, 硕士, 主管技师, 主要从事骨肿瘤的基础研究工作 Tel: E mail:mq0630@163.com 通讯作者简介 裘秀春, 女, 浙江嵊州人, 博士, 副主任技师, 主要从事骨肿瘤免疫治疗的基础研究工作 Tel: E mail:qiuxiuchun2009@live.cn

6 166 马琼, 等靶向 CXCR4 特异性造影剂在骨肉瘤成像中的应用 近红外光学成像在实体瘤的诊断中具有独特的优势, 它灵敏度高, 能借助不同的荧光探针检测到多种分 [1] 子靶标, 可在体内动态成像 实时监测 当近红外成像与分子靶向的荧光造影剂相结合, 既增强了信号值, 更体现了与肿瘤形成及发展相关分子的特异性表达 趋化因子 CXCL12 及其受体 4(chemokinereceptor4, CXCR4) 的相互作用在造血细胞生成 移行以及血管生成中起到重要的作用 众多研究表明, 趋化因子及其受体在肿瘤继发灶的定植和生长中同样起到重要的 [2 3] 作用 其中, 乳腺癌的恶性转移均伴有 CXCR4 的高表达 另外, 体外试验也证实, 缺失 CXCR4 基因的 [4] 癌细胞转移能力大大下降 故 CXCR4 是影响到肿瘤血管生成以及继发转移的重要因子, 与肿瘤的预后直接相关 本研究将近红外染料荧光团标记的 CXCR4 受体应用于骨肉瘤的分子成像, 以期对骨肉瘤的诊断起到指导作用 1 材料与方法 1.1 材料 靶向趋化因子受体 CXCR4 的近红外造影剂 CXCL12 IR 783 复合物由贝勒医学院放射系师克博士惠赠 ; 小动物活体成像系统 (FX,PRO) 由 Carestream 公司提供 ; 正置荧光显微镜 BX51 购自 Olympus 公司 ; 兔抗人多克隆抗体购自博士德生物工程有限公司 ; 兔鼠通用免疫组化试剂盒购自基因公司 1.2 细胞系和造影剂 人骨肉瘤细胞系 SOSP 9607 由第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所提供 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清 ( 四季青公司 ) 的 RPMI1640 培养液 (Gibco) 中, 在 37 5% CO 2 饱和湿度的孵箱内闭式培养 1.3 体外细胞结合试验 将 SOSP 9607 接种于 24 孔板内盖玻片上,RP MI1640 完全培养基 (0.5 ml/ 孔 ) 孵育过夜 每孔分别加入 CXCR4 特异性近红外荧光染料 ( 终浓度为 0.3μmol/L), 并以游离染料作阴性对照,37 孵育 1h,PBS 洗 2 遍,1μmol/LSytoxGreen 染色 15min PBS 洗 2 遍 荧光显微镜下观察 1.4 肿瘤的异体移植 饲养 4~6 周的无胸腺雌性 BALB/c 裸鼠备用 ( 上海斯莱克实验动物有限责任公司 ), 体质量为 18~ 22g, 喂以无菌水及无菌饲料, 收集 SOSP 9607 细胞, 900r/min, 离心 5min(r=20cm),PBS 重悬 1% 戊巴比妥那腹腔麻醉裸鼠后, 将细胞悬液注射于裸鼠右下肢皮下 ( 个细胞 / 只 ) 1.5 体内近红外光学成像 肿瘤细胞 SOSP 9607 打入裸鼠体内 7d 后, 新生肿瘤长至直径 7~8mm 将 5nmol 近红外染料标记的 CXCR4 特异性造影剂注入小鼠尾静脉 常规 X 射线成像 激光二极管照射 (35 mw,660nm) 裸鼠, 体内发射荧光由电子倍增 CCD 摄像机收集 像素 , 桢传递格式 带通滤波器 (710nm 中心波长 ) 用于传递发射荧光, 全息滤波器 (785nm 中心波长 ) 用于过滤反射的激发光 图像获取通过 V++ 软件完成, 数据处理和分析通过 Matlab 软件完成 注射造影剂 24 和 48h 后进行全身成像 之后处死裸鼠, 取发光组织团备用 1.6 免疫组化染色法检测犆犡犆犚 4 表达将发光团组织取出,10% 甲醛溶液固定 48h 后, 石蜡包埋 切片并进行病理观察 免疫组化 SP 法按照试剂盒说明书操作,CXCR4 抗体工作浓度为 1 50, DAB 染色,HE 复染 常规脱水 透明 中性树胶封片 PBS 液代替一抗作为阴性对照 胞质或胞核内含黄色颗粒为阳性细胞 2 结果 2.1 体外细胞结合试验图 1 显示了 SOSP 9607 细胞中,CXCR4 特异性造影剂与 CXCR4 表达阳性的肿瘤细胞的结合 红色部分显示特异性造影剂与膜表面 CXCR4 结合所发荧光, 游离染料的阴性结果显示非靶向性造影剂与骨肉瘤细胞不具有特异性结合 2.2 体内近红外光学成像图 2 显示了接种 SOSP 9607 的同一只裸鼠打入 CXCR4 特异性造影剂 24h 后, 对皮下形成肿瘤的 X 射线 近红外光学成像及其融合图像 X 射线下可见裸鼠的解剖学结构, 近红外光学成像显示了肿瘤部位对造影剂的摄取, 肿瘤与正常组织信号值之比 (tumor to backgroundratio,tbr) 为 1.83, 融合图像显示了肿瘤的解剖学位置 此外, 近红外光学成像显示裸鼠腹部区域对造影剂有强摄入, 从近红外平面成像推测大概是在肾脏和肠道的位置 给接种 SOSP 9607 骨肉瘤细胞的裸鼠尾静脉注入 5nmolCXCR4 特异性近红外造影剂, 图 2 为注射造影剂 24h 后成像, 肾脏与肠道位置的高信号强度显示了造影剂的排出途径 2.3 犆犡犆犚 4 蛋白在发光团组织中的表达免疫组化染色如图 3 所示,CXCR4 在发光团组织中表达的阳性信号为淡黄色或棕黄色, 位于细胞膜或细胞质中 阳性细胞胞核不染色, 胞膜 胞质呈现淡黄色或棕黄色颗粒, 细胞间质不染色

7 中华肿瘤防治杂志 ２０１４ 年 ２ 月第 ２１ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｆｂ ｕ Ｖ ２１ Ｎ ３ ｙ２０１４ １６７ 分子探针对肿瘤组织的高度特异性显示其标记的靶细 胞或与之相连的目的 基 因 的 表 达 是 目 前 分 子 成 像 的 主要成像机制 而绿色荧光蛋白基因的应用在国外已 成为分子影 像 研 究 的 新 一 轮 热 点 ５６ 近 期 国 内 有 学 者成功研制了偶联叶 酸 的 近 红 外 量 子 点 借 以 标 记 小 鼠肿瘤部位并用于小动物的活体成像 ７ 近红外量 子 点有强大的穿透和抗干扰能力 但没有最好的特异性 而 就 灵 敏 度 而 言 靶 向 肽 示 踪 的 敏 感 性 的 确 不 优 于 ＰＥＴ 然而 ＰＥＴ 的特异性亦较差 因此 如果能够将 荧 光染料标记的靶向 肽 和 ＰＥＴ 这 种 更 为 灵 敏 的 成 像 方 法相结合 必将在肿瘤研究领域中展现出巨大的潜力 对于肿瘤的早期诊断 疗效观察具有重要意义 作为非损伤性研究小动物体内受体表达的一个有 效工具 近红外光学 成 像 需 要 一 种 合 适 的 靶 标 特 异 性 探 针 本 实 验 在 骨 肉 瘤 的 异 体 移 植 模 型 中 用 ＣＸＣＬ１２ ＩＲ ７８３复合物对 ＣＸＣＲ４ 进 行 特 异 性 光 学 成 像 得到了较为满意的效果 趋化因子受体在肿瘤转移及发展的各个阶段都起 着至关重 要 的 作 用 是 新 兴 的 肿 瘤 治 疗 药 物 的 靶 点 其中 ＣＸＣＬ１２ 配体 与 其 特 异 性 受 体ＣＸＣＲ４间 的 作 用 已受到广大 肿 瘤 学 家 的 普 遍 关 注 ＣＸＣＲ４ 参 与 了 众 注 红色 近红外染料 代表造影剂与细胞的结合 Ａ 骨肉瘤细 胞 与 游离染料的结合 Ｂ 骨肉瘤细胞与 ＣＸＣＲ４ 靶向造影剂的结合 图 １ ＣＸＣＲ４ 阳性的人骨肉瘤细胞系 ＳＯＳＰ ９６０７ 与造影剂的结合 多恶性肿瘤的发展 在 器 官 特 异 性 肿 瘤 转 移 及 细 胞 迁 移中发挥着关键的作用 ８ 包括骨肉瘤在内 ２３ 种以 上 不同 类 型 的 肿 瘤 有 ＣＸＣＲ４ 高 表 达 ９ 特 别 值 得 注 意 的是 肿 瘤 转 移 灶 通 常 有 高 水 平 ＣＸＣＲ４ 的 表 达 １０ ３ 讨论 近 红外光可穿透 数厘米 的机体 组 织 利 用 近 红 外 临床与临床前试验表明 ＣＸＣＲ４在 肿 瘤 发 展 中 的 作 用 可能使其成为关键性的治疗靶点之一 １１１２ 注 Ａ 接种肿瘤细胞 ＳＯＳＰ ９６０７７ｄ 后 裸鼠 Ｘ 射线成像 Ｂ 近红外光学成像 Ｃ Ｘ 射线成像与近红外成像合并图 图 ２ 接种 ＳＯＳＰ ９６０７ 骨肉瘤细胞的裸鼠 Ｘ 射线 近红外光学成像及其融合图像

8 １６８ 马琼 等 靶向 ＣＸＣＲ４ 特异性造影剂在骨肉瘤成像中的应用 道蛋白 这种技术正 在 成 为 探 索 基 础 研 究 和 临 床 应 用 之间联系的重要纽带 １３ 可以预 见 随 着 进 一 步 的 优 化与发展 靶标特异 性 近 红 外 光 学 成 像 在 监 测 肿 瘤 生 长与转移 临床患者早期诊断与预后 以及评价抗肿瘤 药物和化疗疗效方面的优势将更加突出 参考文献 １ ＭｕＥＡ ＴｎＩＣ Ｒ ｍｕ ｎｊｃ Ｎ ｎ ｆ ｄｆ ｕ ｎ ｍｇ ｎｇ ｆ ｎｈ ｄｎｄｎ ｋ Ｊ ｙｍｐｈ ｙｍｐｈｄｍ ２０１２ ３４ ３ ４４８ ４５３ Ｈ ｄｎ ｋ ２ Ｓｋ Ｋ Ｓｋ Ｋ Ｅｘｐ ｎ ｆｃｘｃｒ４ ｎｄ ｙｒ ｊ ｙｍｈ ｐ ｐ ｇｎ ｎｐ ｎ ｗ ｈ ｎｍ ｆ ｈ Ｊ Ｈｕｍ Ｐ ｈ ２０１１ ４３ ６ ９０４ ９１０ ｖ ｙ ３ Ｌ ｎｇ ＹｎｇＲ Ｂｎ Ｌ Ｅｆ ｆ ｆ ｎｐ ｎ ｎ ｆｄ ｕ ｄ ｖｄ ｍ ｎｐ ｕｍ Ｊ Ｐ ｐ ２０１０ ７０ １０ １０６６ １０７３ ４ 李磊 石学涛 ＳＤＦ １ ＣＸＣＲ４ 与肝 细 胞 肝 癌 淋 巴 结 转 移 的 关 系 Ｊ 中华肿瘤防治杂志 ２０１１ １８ ９ ７３７ ７４０ ５ 郝钢跃 张维东 张月英 等 浅表 性 膀 胱 癌 模 型 的 建 立 及 其 活 体 注 Ａ 阴性对照 Ｂ ＣＸＣＲ４ 在发光团组织阳性表达 图 ３ ＣＸＣＲ４ 蛋白在发光团组织中的表达 ＳＰ ２００ 荧光成像 Ｊ 中华肿瘤防治杂志 ２００９ １６ ２４ １９３２ １９３４ ６ 严雪娇 刘乃丰 吴国 球 活 体 近 红 外 成 像 技 术 在 肿 瘤 研 究 中 的 应用 Ｊ 东南大学学报 ２０１１ ３０ ２ ３８０ ３８３ 本研究将 ＣＸＣＲ４ 特异 性 造 影 剂 成 功 应 用 于 骨 肉 瘤成像 体内外试验 结 果 均 表 明 该 造 影 剂 可 用 于 骨 肉瘤细胞及组织 的 光 学 成 像 具 有 靶 向 特 异 性 虽 然 肽结合没有抗体结合的亲和力高 但 ５ｎｍ 造影剂的 用量已足够我们观察到肿瘤部位的特异性结合 当然 在这一造影剂用于临 床 诊 断 之 前 大 量 可 重 复 的 小 动 物试验是必要的 最 优 的 使 用 剂 量 也 需 要 进 一 步 的 实 验数据支持和确定 在近红外光学成 像 中 除 了 肿 瘤 接 种 部 位 的 光 学 影像 在裸鼠腹部也存在有近红外染料的分布 主要位 于肾脏及肠道组织 推 测 这 或 许 与 造 影 剂 在 小 鼠 体 内 的消化 泌尿代谢途径有关 本研究前期预试验表明 ＣＸＣＲ４ 靶 向 肽 在 裸 鼠 体 内 的 半 衰 期 约 为 ４８ｈ ７２ｈ 后裸鼠体内的靶向肽将全部经由消化与泌尿系统代谢 完毕 与较大的抗体或蛋白相比 ＣＸＣＲ４ 靶向 肽用作 显影剂时循环清除 更 快 因 此 不 会 对 试 验 对 象 造 成 不 良毒副影响 综上所述 本研究运用近红外光学成像的方法 仅 ７ Ｃｈｎ ＬＮ ＷｎｇＪ Ｌ ＷＴ Ａｑｕｕｎ ｈ ｆ ｐ ｙｎ ＣｄＳｎ ｂ ｎｄｕ ｍ ＣｄＴ ｎ ｆ ｄ ｍ ｎｇｑｕｎ ｕｍ ｇｈ Ｊ Ｃｈｍ ｄ ｎｄ ｈ ｐｐ ｎｆ ｕｍ ｎｇ ｎｖ ｖ ｇ Ｃｍｍｕｎ ２０１２ ４８ ４１ ４９７１ ４９７３ ８ 张建波 仲伟 霞 胰 腺 癌 ＣＸＣＬ１２ ＣＸＣＲ４ 通 路 研 究 进 展 Ｊ 中 华肿瘤防治杂志 ２０１２ １９ ８ ６３４ ６３７ ９ ＷｕＢ Ｃｈ ｎｅｙ Ｍ ＣＤ Ｓ ｕ ｕ ｆ ｈｃｘｃｒ４ｈｍ ｋ ｎｇｐｃｒ ｗ ｈｍ ｍ ｕ ｎｄ ｐｐ ｄｎ ｇｎ ｙ Ｊ Ｓ ｎ ２０１０ ３３０ ６００７ １０６６ １０７１ １０ Ｓ ｖｕ Ｏ Ｂｕｈ ｄ Ａ Ｂ Ａ Ｔｈ ｆｃｘｃｒ４ ｐ ｘｐ ｎ ｎ ｂ ｎ ｕ ｍ ｙ ｇ ｕｄｙ Ｊ Ｂ Ｃｎ Ｒ Ｔ ２００６ ９７ ３ ２７５ ２８３ １１ Ｔ ｎｇ Ｄ Ｖ ｚ Ｍ ｄ ｎｄａ Ｂ ｗｎｊｍ Ｔ ｎｇ ＳＤＦ １ ＣＸ ｑｕ ｇ ＣＲ４ ｎｈ ｂ ｕｍｕ ｖ ｕ ｕ ｆ ｍ ｎ ｆｇ ｂ ｍ Ｊ ２０１１ １０４ １２ １８０５ １８０９ ＢＪＣ ｎ １２ Ｈ ｋｍｎｎｄ Ｌｕ ｆ Ｓ Ｍ Ｐ Ａ Ｌｎ ｖ ＣＸＣＲ４ｖ ｘｐ ｎｎｄｋｎ ｋｄｗｎ ｍｄ ｎ ｎ ｎ ｎｄｕ ｄ ｍ ｖ ｐ ｘ ｆ ｄｐｎｄｎ ｕｐｐ ｎ ｆｓｄｆ １α Ｊ Ｏｎｋ ｇ ２０１１ ３４ １０ ５０２ ５０８ ｎｎｄ ｎｖ ｎ ｇ １３ Ｗｈ ＡＧ Ｇ ｙｂｄ ＰｋＫＹ Ｄ ｐ ｄｆ ｕ ｎ ｍｇ ｎｇ ｂｆ ｂ Ｊ Ｂ ２０１２ ２２ ８ ２８３３ ｐ ｇｍｄｃｈｍｌ ２８３６ 使用少量的荧光集团 就可对骨肉瘤快速成像 不但提 供了一种非损伤性探测有特异性分子标记的肿瘤的方 收稿日期 ２０１３ １１ ０８ 修回日期 ２０１３ １２ ２６ 法 而且避免了核成像中放射性污染 是一种具有广阔 编辑 马骏 前景的分子成像方法 利用日臻完善的荧光探针和报

9 中华肿瘤防治杂志 2014 年 2 月第 21 卷第 3 期 CHINJCANCERPREV TREAT,February2014,Vol.21 No 前沿报道 / 论著 经典霍奇金淋巴瘤犕犝犕 1 和犆犇 99 及犘犚犇犕 1 表达与临床意义分析 周新华 1,2 黄学平 2 钟琳 2 赵彤 1,2 1. 南方医科大学南方医院病理科, 广东广州 南方医科大学基础医学院病理学系, 广东广州 摘要 目的 : 检测 MUM1 CD99 和 PRDM1 在经典霍奇金淋巴瘤 (classichodgkinlymphoma,chl) 肿瘤细胞中的表达以及相互关系, 分析其在 H/RS 细胞形成中的作用及临床意义 方法 : 采用免疫组化的方法检测 62 例 CHL 组织 MUM1 CD99 和 PRDM1 的表达, 蛋白质印迹法检测 CD99 和 PRDM1 在 6 株 B 细胞来源和 3 株 T 细胞来源淋巴瘤细胞的表达 ; 蛋白质印迹法检测 CHL 细胞株 L428 过表达 CD99 后以及重新抑制 CD99 后 PRDM1 表达 结果 :62 例 CHL 组织,61 例 (98.4%)MUM1 呈强阳性高表达,1 例 (1.6%)CD99 在 H/RS 细胞表达阳性, 且为 30% 以下的 H/RS 细胞表达,PRDM1 均呈阴性表达, 阳性表达率差异有统计学意义, χ 2 = , 犘 <0.001; 蛋白质印迹法结果显示,CD99 和 PRDM1 在多发性浆细胞性骨髓瘤细胞株 RPMI 8226 中表达较高, 在包括 L428 细胞在内的其他 B 细胞来源的淋巴瘤细胞株中表达较低 ;L428 过表达 CD99 后 PRDM1 表达增加 ; 重新抑制 CD99 表达后 PRDM1 表达消失 结论 :H/RS 细胞具有浆细胞分化潜能,CD99 和 PRDM1 在 H/RS 细胞的形成中存在紧密的内在联系, 上调 L428 中 CD99 的表达可能恢复 PRDM1 的失活, 诱导 H/RS 细胞向成熟 B 细胞方向分化, 结果对临床开展霍奇金淋巴瘤的诱导分化治疗具有指导意义 关键词 经典霍奇金淋巴瘤 ;H/RS 细胞 ;MUM1;CD99;PRDM1 犈狓狆狉犲狊犻狅狀犪狀犱犮犾犻狀犻犮犪犾狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀犮犲狅犳犕犝犕 1, 犆犇 99 犪狀犱犘犚犇犕 1 犻狀犮犾犪狊狊犻犮犎狅犱犵犽犻狀犾狔犿狆犺狅犿犪 1,2 犣犎犗犝犡犻狀 犺狌犪, 犎犝犃犖犌犡狌犲 2 狆犻狀犵, 犣犎犗犖犌犔犻狀 2 1,2, 犣犎犃犗犜狅狀犵 中华肿瘤防治杂志,2014,21(3): 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犪狋犺狅犾狅犵狔, 犖犪狀犳犪狀犵犎狅狊狆犻狋犪犾犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱狋狅犛狅狌狋犺犲狉狀犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 2. 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犪狋犺狅犾狅犵狔, 犛犮犺狅狅犾狅犳犅犪狊犻犮犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲, 犛狅狌狋犺犲狉狀犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToexplorediferencesofMUM1,CD99andPRDM1expressioninClassicHodgkinlympho maandtheinteractionbetweenthem,andrevealtheroleofthemin H/RScelgeneration. 犕犈犜犎犗犇犛 :Sixty twospeci mensofchlcases werecolectedandanalyzedbyimmunohistochemistryof MUM1,CD99and PRDM1.CD99and PRDM1proteinexpressionwerefurthermeasuredbyWesternblotandimmunocytochemistryinsixB celoriginandthree T celoriginlymphomacellines.theexpressionofprdm1proteinwasanalyzedbywesternblotinl428celswithover expressionofcd99andl428 CD99celswithtransfectionofansiRNAtargetedCD99. 犚犈犛犝犔犜犛 :PositiveforMUM1was highlyobservedin61(98.4%)of62chlcases( χ 2 = , 犘 <0.001).In1ofthe62CHLcases(1.6%)examined, positivityforcd99wasdetectedin30% orfeweroftheh/rscels.prdm1expressionwasnotfoundin H/RScelsof 62CHLcases.CD99andPRDM1werehighlyexpressedinmultiplemyeloma(MM)cellineRPMI 8226,andlowlyorab sentlyexpressedinl428celandotherb celoriginoflymphomacellines.wefoundthatl428celswithoverexpression ofcd99showedaconcomitantincreaseexpressionofprdm1proteinbywesternblotanalysis,whenansirnatargeted CD99wastransfectedintoL428 CD99cels.ThistransfectioninturncausedthedecreaseofPRDM1proteinlevel,asas sessedby WB. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖犛 :H/RScelshavethepotentialofplasma celdiferentiation.cd99andprdm1istightly 基金项目 国家自然科学基金 ( ; ); 广东省自然科学基金 (S ) 第一作者简介 周新华, 女, 江苏丹阳人, 博士, 讲师, 主要从事淋巴瘤发病机制的研究工作 Tel: E mail:balbc@163.com 通讯作者简介 赵彤, 女, 北京人, 教授, 博士生导师, 主要从事淋巴瘤发病机制的基础和临床研究工作 Tel: E mail:tongzhao@smu.edu.cn

10 170 周新华, 等经典霍奇金淋巴瘤 MUM1 和 CD99 及 PRDM1 表达与临床意义分析 relatedtogenerationanddevelopmentofchl,andcd99isabletoregulatetheprdm1toinduceh/rscelsdiferentia tiontowardsterminalbcels.ourstudymayprovideanewtherapeuticapproachforinducingchldiferentiation. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] classichodgkinlymphoma;hodgkin/reed sternberg;mum1;cd99;prdm1 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,2014,21(3): 中图分类号 R733.4 文献标识码 A 文章编号 (2014) 霍奇金淋巴瘤 (Hodgkinlymphoma,HL) 是一种常见的淋巴造血系统恶性肿瘤, 经典霍奇金淋巴瘤 (classichodgkinlymphoma,chl) 约占 HL 病例的 95%, 其肿瘤细胞 H/RS(Hodgkin/Reed sternberg) 细胞只占少数 (<1%) 目前该病的发病率呈逐年升高趋势, 尤其是中晚期 复发以及耐药患者的治疗, 仍然是一大难题, 究其原因主要是对 H/RS 细胞的发 [1] 生 发展机制还不清楚 目前有研究认为,H/RS 细 [2] 胞实质是生发中心 B 细胞分化过程受阻所致 MUM1 又称 IRF4, 是干扰素调节因子家族成员之一, 是一多步骤调控 B 细胞分化的重要核转录因子 CD99 是一 大小糖基化跨膜蛋白, 参与细胞黏 [3] 附 分化和凋亡等功能调节, 有研究表明,CD99 和 [4] H/RS 细胞的形成相关 核转录因子 PRDM1 (positiveregulatorydomainzincfingerprotein1) 蛋白, 又称为 Blimp1, 大小, 是 PR 区锌指蛋白 [5] 基因家族的一员, 调节 B 细胞向浆细胞分化过程 因此, 研究 MUM1 CD99 和 PRDM1 在 H/RS 细胞中的表达及关系, 将有利于探究 H/RS 细胞的来源和发生, 对临床 HL 的治疗具有指导意义 本研究检测了 62 例 CHL 组织和 9 株 B T 细胞来源淋巴瘤细胞的 MUM1 CD99 和 PRDM1 表达, 以及 CHL 细胞株 L428 过表达和重新抑制 CD99 后 PRDM1 的表达变化, 分析 MUM1 CD99 和 PRDM1 在 CHL 肿瘤细胞中的表达和相互关系, 以及在 H/RS 细胞形成中的作用及临床意义 1 材料与方法 1.1 组织标本与细胞株 组织标本 62 例 CHL 石蜡标本来源于 南方医院病理科 (36 例 ) 南昌大学第一附属医院病理科 (17 例 ) 和贵州省人民医院病理科 (9 例 ) 其中结节硬化型霍奇金淋巴瘤 (nodular sclerosinghodgkinlymphoma,nshl)30 例, 混合型霍奇金淋巴瘤 (mixedcelularityhodgkinlymphoma, MCHL)16 例, 富于淋巴细胞型霍奇金淋巴瘤 (lym phocyterichclassicalhodgkinlymphoma,lrchl) 16 例 标本来源患者术前未接受放化疗, 所有病例标本切片均经过 2 位病理科专家根据 WHO 淋巴瘤分类 [6] 标准复诊 反应性淋巴结增生 (reactivelymphoid hyperplasia,rh) 石蜡标本作为阳性对照, 来源于南方医院病理科 细胞株人 CHL 的细胞株 L428(B 细胞起源 ) 和 HDLM2(T 细胞起源 ) 伯基特 (Burkit s) 淋巴瘤细胞株 Raji 和急性 T 细胞白血病细胞株 Jurkat 生发中心样 (germinalcenterbcel like,gcb)oci Ly1 OCI Ly8 和活化 B 细胞样 (activatedbcel like,abc) OCI Ly10 弥漫大 B 细胞瘤 (difuselargeb cellym phomas,dlbcl) 间变性大细胞淋巴瘤细胞株 KAR PAS 299 EBV 转化的永生化 B 淋巴母细胞株 多发性浆细胞性骨髓瘤 (multiple myeloma,mm) 细胞株 RPMI8226 均由南方医科大学广东省分子肿瘤病理重点实验室所保存 L428 CD99 细胞亚系由课题组前期构建并保存 1.2 主要试剂与仪器 试剂 / 试剂盒 PRDM1 鼠抗人单克隆抗体 (3H2 E8) 和 CD99 兔抗人单克隆抗体 (EPR3097Y) 购自美国 Abcam 公司 ;MUM1 鼠抗人单克隆抗体 (SPM497) β actin 鼠抗人单克隆抗体 抗鼠二抗和抗兔二抗购自北京中衫金桥生物技术有限公司 仪器 CO 2 培养箱为 Thermo 公司产品 ; 光学显微镜和倒置相差显微镜为 Olympus 公司产品 ;680 型酶标分析仪和垂直凝胶电泳槽为 Bio Rad 公司产品 ; 高速冷冻离心机为 Heraeus Beckman 公司产品 ; 轮转式切片机为 Leica 公司产品 ; 紫外凝胶成像仪为 AlphaInnotech 公司产品 1.3 方法 细胞培养除 OCI Ly10 细胞株用 IMDM 培养基外, 以上所有细胞株均在含 10% 胎牛血清的 RP MI1640 培养基中, 置 37 5% CO 2 饱和湿度的培养箱内传代培养, 取对数期 生长状态良好的细胞进行实验 免疫组化检测 MUM1 CD99 和 PRDM1 的表达石蜡切片脱蜡至水,0.01 mol/l 枸橼酸缓冲液 (ph6.0) 中煮沸 3~4min 进行抗原修复 ; 滴加 3% 过氧化氢孵育 15min 进行封闭后冲洗, 加入 50~100μL 一抗工作液 (CD99 稀释比例 1 500,PRDM11 50, MUM11 150), 置 37 恒温孵箱中孵育 1~2h, PBS 冲洗 3 5min; 滴加 50~100μLA 液 (ChemMa te TM Envision+ HRP), 室温孵育 30 min,pbs 冲洗 3 5min;DAB 显色 复染 脱水, 中性树胶封片

11 中华肿瘤防治杂志 ２０１４ 年 ２ 月第 ２１ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｆｂ ｕ Ｖ ２１ Ｎ ３ ｙ２０１４ １ ３ ３ 蛋白质印迹法检测细胞株 ＣＤ９９ 和 ＰＲＤＭ１ 的 ｍ 表达 收集 培 养 细 胞 裂 解 后 ４ １２０００ ｎ 离 心 ３０ｍ ｎ ５ｍ 提取蛋白质并测定浓度 按常规方法 进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电 泳 转 膜 封 闭 加 入 一 抗 ＰＲＤＭ１ １７１ ６２ 例 ＣＨＬ 组 织 和 ２ 例 ＲＨ 阳 性 对 照 组 织 ＭＵＭ１ ＣＤ９９ 以 及 ＰＲＤＭ１ 的 表 达 结 果 见 图 １ ＭＵＭ１ 阳性定位于细胞核和少量的胞质 在 ＲＨ 组 织 生发中 心 和 生 发 中 心 外 呈 散 在 强 阳 性 表 达 ６２ 例 鼠抗人单克隆抗体 １ １０００ 稀释 ＣＤ９９ 兔抗 人单克 隆抗体 １ ５０００ 稀 释 和 β ｎ鼠抗人单克隆抗体 ＣＨＬ 组 织 ＭＵＭ１ 主 要 表 达 于 Ｈ ＲＳ 细 胞 ６１ 例 ９８ ４ 呈强 阳 性 表 达 背 景 细 胞 散 在 表 达 在 ＲＨ １ ５０００稀 释 ４ 孵 育 过 夜 次 日 再 室 温 孵 育 ３０ｍ ｎ 分别加入山羊抗小鼠 山羊抗兔二抗 １ ５０００ 组织 ＣＤ９９ 主要表达于 淋 巴 滤 泡 外 套 区 和 滤 泡 间 区 在 ６２ 例 ＣＨＬ 组 织 ＣＤ９９ 主 要 在 Ｈ ＲＳ 细 胞 周 围 的 稀释 室温孵育 １ｈ 然后进行化学发光检测 背景 Ｔ 细胞表达 仅有 １ 例 １ ６ ＣＤ９９ 在 Ｈ ＲＳ 细 胞表达阳性 且为 ３０ 以 下 的 Ｈ ＲＳ 细 胞 表 达 余 ６１ １ ４ 统计学方法 采 用 ＳＰＳＳ １３ ０ 进 行 统 计 分 析 ６２ 例 ＣＨＬ ＣＤ９９ 和 ＰＲＤＭ１ 的 阳 性 表 达 率 采 用 χ２ 检 ＭＵＭ１ 例 Ｈ ＲＳ 细胞均表达阴性 ＲＨ 组织 ＰＲＤＭ１ 在生发 中心的明带 呈 散 在 弱 阳 性 表 达 阳 性 定 位 于 胞 核 ６２ 例 ＣＨＬ 组 织 ＰＲＤＭ１ 均 呈 阴 性 表 达 ＭＵＭ１ 的 阳 验 检验水准 α ０ ０５ 性表达率 和 ＣＤ９９ ＰＲＤＭ１ 的 阳 性 表 达 率 相 比 差 异 ２ 结果 ２ 有统计学意义 １４５ 犘 ０ ００１ χ １７７ ２ １ 犆犎犔 组织 犕犝犕１ 和 犆犇９９ 及 犘犚犇犕１ 的表达 注 ＲＨ ＳＰ ２００ ＣＨＬ ＳＰ ４００ 插入小图 ＳＰ ４００ 五星标记生发 中 心 ＧＣ 左 图 箭 头 分 别 表 示 ＲＨ 中 ＣＤ９９ ＰＲＤＭ１ 和 ＭＵＭ１ 表 达 阳 性的细胞 右图箭头分别表示 ＣＨＬ 中 ＣＤ９９ ＰＲＤＭ１ 表达阴性和 ＭＵＭ１ 表达阳性的 Ｈ ＲＳ 细胞 图 １ 免疫组化检测 ＲＨ 和 ＣＨＬ 组织 ＣＤ９９ ＰＲＤＭ１ 以及 ＭＵＭ１ 的表达

12 周新华 等 １７２ 经典霍奇金淋巴瘤 ＭＵＭ１ 和 ＣＤ９９ 及 ＰＲＤＭ１ 表达与临床意义分析 ２ ２ 淋巴造血系细胞株 犆犇９９ 和 犘犚犇犕１ 的表达 蛋白质印迹法检测 ＣＤ９９ 和 ＰＲＤＭ１ 在 ６ 株 代 表 达 仅有 １ 例 ＣＤ９９ 在 Ｈ ＲＳ 细 胞 表 达 阳 性 ＰＲＤＭ１ 均呈阴性表达 ＭＵＭ１ 是 干 扰 素 调 节 因 子 家 族 成 员 不同分化阶段 的 Ｂ 细 胞 起 源 淋 巴 瘤 细 胞 株 和 ３ 株 Ｔ 之一 是一 调 控 多 步 骤 Ｂ 细 胞 分 化 的 重 要 核 转 录 因 细胞起源细胞株的表达见图 ２ 结果 显示 ＣＤ９９ 在多 子 在 浆 细 胞 中 表 达 水 平 较 高 ＭＵＭ１ 在 ＣＨＬ 组 织 发性浆细胞性骨髓瘤细胞株 ＲＰＭＩ ８２２６ 表 达较高 在 包括 Ｌ４２８ 细胞在内的其他 Ｂ 细胞起源 淋 巴 瘤 细 胞 株 Ｈ ＲＳ 细胞呈高 表 达 水 平 提 示 Ｈ ＲＳ 具 有 浆 细 胞 分 化潜能 Ｋｍ 等 ４ 提出 ＣＤ９９ 缺失在 Ｈ ＲＳ 细胞的形 中表达 较 低 此 外 ＣＤ９９ 在 Ｔ 细 胞 起 源 的 Ｊｕｋ 和 成中起着关键 作 用 ３ 而 ＰＲＤＭ１ 是 浆 细 胞 分 化 所 必 ＫＡＲＰＡＳ ２９９ 细胞株中也呈强阳性表达 在 Ｔ 细 胞起 源的 ＣＨＬ 细 胞 株 ＨＤＬＭ２ 中 阴 性 表 达 如 图 ２Ｂ 所 示 ＰＲＤＭ１ 的蛋白 质 印 迹 法 结 果 表 明 在 ＲＰＭＩ ８２２６ 需的 至 关 重 要 的 调 控 因 子 ６ ＣＤ９９ 和 ＰＲＤＭ１ 在 ＣＨＬ 组织均呈低表达或阴性表达 提示在 具有 浆细 胞 细胞 株 检 测 到 １ 条 ９５ １０ 大 小 的 很 强 的 条 带 在 ３ 分 化 潜 能 的 Ｈ ＲＳ 细 胞 的 形 成 过 程 中 ＣＤ９９ 和 ＰＲＤＭ１ 的表达可能存在着内在的联系 Ｌ４２８ 等其他 Ｂ 细胞和 Ｔ 细胞起源 的 淋 巴 瘤 细 胞 株 中 未见条带 注 Ａ 不同细胞株 ＣＤ９９ 的表达 Ｂ 细胞株 ＰＲＤＭ１ 的表达 图 ２ 蛋白质印迹法检测不同淋巴造血系细胞株中 ＣＤ９９ 和 ＰＲＤＭ１ 的表达 注 Ａ 不 同 Ｌ４２８ 过 表 达 ＣＤ９９ 后 ＰＲＤＭ１ 的 表 达 Ｂ Ｌ４２８ ＣＤ９９ 重新抑制 ＣＤ９９ 后 ＰＲＤＭ１ 的表达 ２ ３ 犔４２８ 过表 达 犆犇９９ 后 以 及 犔４２８ 犆犇９９ 重 新 抑 图 ３ 蛋白质印迹法检测 ＰＲＤＭ１ 的表达 制 犆犇９９ 后 犘犚犇犕１ 表达 蛋白 质 印 迹 法 检 测 到 Ｌ４２８ 过 表 达 ＣＤ９９ 后 ＰＲＤＭ１ 出 现 明 显 表 达 图 ３Ａ 如 图 ３Ｂ 所 示 Ｌ４２８ ＣＤ９９细胞重新抑制 ＣＤ９９ 表 达 后 ＰＲＤＭ１ 表 达 消失 ３ 讨论 Ｋüｐｐ 等 ２ 采用显微切割技术 通过单细 胞分 析 提示 绝大部 分 ＣＨＬ 中 的 肿 瘤 细 胞 Ｈ ＲＳ 细 胞 来 自 淋巴器官生 发 中 心 ＧＣ 残 疾 的 Ｂ ｍ ｎ ｎ ｇ ＣＤ９９ 在 淋 巴 造 血 系 统 中 参 与 造 血 干 细 胞 的 分 化 本课题 组 前 期 构 建 ｐｄｎａ３ １ ＣＤ９９ 真 核 表 达 载 体 并 稳 定 转 染 人 ＣＨＬ 细 胞 株 Ｌ４２８ 构 建 了 Ｌ４２８ ＣＤ９９细胞亚系 发 现 该 细 胞 出 现 了 明 显 Ｂ 细 胞 相关的表型 ７ 提 示 ＣＤ９９ 可 能 是 Ｈ ＲＳ 细 胞 发 生 中 导致 Ｂ 细 胞 分 化 受 阻 的 一 个 关 键 靶 点 上 调 ＣＤ９９ 后 解除了对 Ｈ ＲＳ 的 分 化 抑 制 恢 复 其 向 Ｂ 细 胞 分 化 ＰＲＤＭ１ 是 调 控 浆 细 胞 分 化 的 一 个 开 关 基 因 ８ ＰＲＤＭ１ 在生 发 中 心 后 期 开 始 表 达 且 表 达 量 逐 渐 增 淋巴细胞 因此 Ｈ ＲＳ 细胞的发生实质是生发中心 Ｂ 加 并调控其他相关 Ｂ 细胞分化 转录 因 子 促 使 Ｂ 细 胞 细胞分化过程受阻所致 最终发育分化为终末分化阶 段细 胞浆细 胞 并 分泌 功 能性的免疫球蛋白 诱 导 了 Ｂ 淋 巴 细 胞 向 早 期 浆 细 胞 ６２ 例 ＣＨＬ 组 织 ＭＵＭ１ ＣＤ９９ 以 及 ＰＲＤＭ１ 的 表达结果显示 ＭＵＭ１ 在 ６１ 例 ９８ ４ 呈 强 阳 性 表 分化 蛋白质印迹法检测 ６ 株代表不 同分 化阶 段的 Ｂ

13 中华肿瘤防治杂志 2014 年 2 月第 21 卷第 3 期 CHINJCANCERPREV TREAT,February2014,Vol.21 No 细胞起源淋巴瘤细胞株和 3 株 T 细胞起源细胞株的结果表明,CD99 和 PRDM1 的表达水平一致, 在包括 CHL 在内的 B 细胞起源淋巴瘤中表达较低, 在末端 B 细胞分化阶段起源的多发性浆细胞性骨髓瘤细胞株 RPMI 8226 中表达较高, 提示 CD99 可能和终末 B 细胞分化有关 本研究进一步采用蛋白质印迹法检测到了 CD99 对 PRDM1 表达的影响 L428 细胞过表达 CD99 后, PRDM1 表达增强 ; 而 L428 CD99 细胞重新抑制 CD99 表达后,PRDM1 表达降低, 表明在 H/RS 细胞中 PRDM1 的表达缺失和 CD99 下调相关,CD99 可以正向调控 PRDM1 的表达 有研究认为, 在淋巴造血系统中 PRDM1 是一个重要的肿瘤抑制基因, 其功能性失活阻断了 B 细胞向成熟浆细胞的分化, 可能是大多数来源于生发中心 B 细胞淋巴瘤的一个重要发病原 [9 10] [11] 因 Tam 等对 DLBCL 的 PRDM1 突变进行分析, 提示 PRDM1 的失活是一可恢复的遗传缺陷, 认为 PRDM1 可作为一个潜在的抑癌基因 因此, 来源于生发中心 B 细胞的 H/RS 细胞, 可能由于 CD99 的表达下调, 从而抑制了浆细胞分化的开关基因 PRDM1 的表达, 导致了 B 细胞的分化受阻, 而上调 CD99 的表达可能恢复 PRDM1 的失活, 进一步诱导 H/RS 细胞向终末 B 细胞方向分化 二者之间的确切调控机制, 值得深入研究, 研究结果将对临床开展 HL 的诱导分化治疗具有指导意义 参考文献 immunoglobulingenerearangementsandappeartobederivedfrom Bcelsatvariousstagesofdevelopment[J].ProcNatlAcadSciUS A,1994,91(23): [3] RocchiA,Manara MC,Sciandra M,etal.CD99inhibitsneural diferentiationofhumanewingsarcomacelsandtherebycon tributestooncogenesis[j].jclininvest,2010,120(3): [4] KimSH,ChoiEY,ShinYK,etal.GenerationofcelswithHodgkin sand Reed SternbergphenotypethroughdownregulationofCD99 (Mic2)[J].Blood,1998,92(11): [5] DiehlSA,SchmidlinH,NagasawaM,etal.STAT3 mediatedup regulationofblimp1iscoordinatedwithbcl6down regulation tocontrolhuman plasmaceldiferentiation[j].jimmunol, 2008,180(7): [6] OrackiSA,WalkerJA,HibbsML,etal.Plasmaceldevelopment andsurvival[j].immunolrev,2010,237(1): [7] 周新华, 黄学平, 黄作平, 等.CD99 调控经典霍奇金淋巴瘤细胞株 L428 向 B 细胞方向分化的初步研究 [J]. 南方医科大学学报, 2013,33(2): [8] MartínezMR,CorradinA,Klein U,etal.Quantitativemodeling oftheterminaldiferentiationofbcelsandmechanismsoflym phomagenesis[j].procnatlacadsciusa,2012,109(7): [9] MandelbaumJ,BhagatG,TangH,etal.BLIMP1isatumorsup pressorgenefrequentlydisruptedinactivatedbcel likedifuse largebcellymphoma[j].cancercel,2010,18(6): [10] CaladoDP,ZhangB,SrinivasanL,etal.Constitutivecanonical NF κbactivationcooperateswithdisruptionofblimp1inthe pathogenesisofactivatedbcel likedifuselargecellymphoma [J].CancerCel,2010,18(6): [11] Tam W,GomezM,ChadburnA,etal.MutationalanalysisofPRDM1 indicatesatumor suppressorroleindifuselargeb cellymphomas [J].Blood,2006,107(10): [1] 刘棋, 闫慧芝, 温振科.miRNA 与淋巴瘤发病机制的研究进展 [J]. 中华肿瘤防治杂志,2011,18(23): [2] KüppersR,RajewskyK,Zhao M,etal.Hodgkindisease:Hodgkin andreed Sternbergcelspickedfromhistologicalsectionsshowclonal 收稿日期 : 修回日期 : ( 编辑 : 边莉 ) 殣 檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺檺殣 中华肿瘤防治杂志编排规范摘要 要求摘要应具有独立性, 便于读者获取必要的信息 ; 应着重反映研究中的创新内容和作者的独到观点 ; 中文摘要应从第三人称角度撰写, 不加评论和解释 新术语或尚无合适汉语译名的术语, 可使用原文或在译名后加括号注明原文 字数以 300 字左右为宜 格式论著类文章摘要, 按照结构式摘要撰写 内容包括研究 目的 (Objective) 方法 (Meth ods) 结果 (Results) 结论 (Conclusion) 四部分 各要素英文小标题应根据实际情况确定单复数 综述类文章摘要, 其内容应包括综述的主要目的 资料来源 资料选择 数据提炼 数据综合和结论等 可以写成结构式摘要, 也可写成指示性或报道性摘要 殣 殣

14 174 李锋, 等经典型霍奇金淋巴瘤中大细胞与小细胞亚系生物学特性比较 经典型霍奇金淋巴瘤中大细胞与小细胞亚系生物学特性比较 李锋黄作平黄学平王志强朱梅刚赵彤 南方医科大学基础医学院病理学系, 广东广州 前沿报道 / 论著 摘要 目的 : 探究经典型霍奇金淋巴瘤细胞系 L428 中大小细胞亚系生物学特性差异及其意义 方法 : 应用有限稀释法分离出 L428 中大小细胞亚系并进行传代培养, 分别命名为 L428 big 和 L428 smal 细胞 免疫细胞化学实验检测 L428 中大小细胞亚系 CD15 和 CD30 表达差异,MTT 实验检测 L428 中大小细胞亚系增殖能力的差异 ; 流式细胞术检测 L428 中大小细胞亚系的凋亡差异 结果 : 成功分离出 L428 细胞株中大小细胞亚系并进行传代培养 ; 免疫组化显示 L428 big 细胞的 CD15 及 CD30 表达明显强于 L428 smal 细胞 ;MTT 实验显示,L428 big 细胞和 L428 smal 细胞之间增殖能力差异有统计学意义, 犉 = , 犘 <0.001,L428 smal 细胞增殖能力高于 L428 big 细胞, 犘 <0.001; 流式细胞术显示,L428 big 细胞的凋亡率为 (3.3±0.1)%, 明显多于 L428 smal 细胞 (0.4±0.1)%, 犘 <0.001 结论:L428 smal 细胞增殖能力强, 凋亡少, 为经典型霍奇金淋巴瘤细胞起源的进一步研究提供一定的实验基础 关键词 L428 细胞株 ; 大小细胞亚系 ; 有限稀释法 ; 霍奇金淋巴瘤 中华肿瘤防治杂志,2014,21(3): 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犫犻犵犮犲犾狊狌犫犾犻狀犲狊犪狀犱狊犿犪犾犮犲犾狊狌犫犾犻狀犲狊犻狀犮犾犪狊犻犮犪犾犎狅犱犵犽犻狀 狊犾狔犿狆犺狅犿犪犮犲犾犾犻狀犲狊犪狀犱犻狋狊狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀犮犲 犔犐犉犲狀犵, 犎犝犃犖犌犣狌狅 狆犻狀犵, 犎犝犃犖犌犡狌犲 狆犻狀犵, 犠犃犖犌犣犺犻 狇犻犪狀犵, 犣犎犝犕犲犻 犵犪狀犵, 犣犎犃犗犜狅狀犵犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犪狋犺狅犾狅犵狔, 犛犮犺狅狅犾狅犳犅犪狊犻犮犕犲犱犻犮犪犾犛犮犻犲狀犮犲, 犛狅狌狋犺犲狉狀犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犌狌犪狀犵狕犺狅狌 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :Toinvestigatediferencesofbiologicalcharacteristicsofbigandsmalcelsublinesinclassi calhodgkin slymphomacellinesl428anditssignificance. 犕犈犜犎犗犇犛 :Limiteddilutedmethodwasusedtoseparatethe bigandsmalcelsublinesapartincellinesofl428whichwerenamedasl428 bigandl428 smalcellines.immunohis tochemistywasappliedtodetecttheexpressionofcd15andcd30incellinesofl428 bigandl428 smal.mttassay wasusedtodeterminethediferencesofproliferationabilityincellinesofl428 bigandl428 smal.apoptosiswasana lyzedbyflowcytometryincellinesofl428 bigandl428 smal. 犚犈犛犝犔犜犛 :L428cellinesweresuccessfulyseparated withcellinesofl428 bigandl428 smal;immunohistochemistryshowedtheexpressionofcd15andcd30inl428 big celsweresignificantlystrongerthanthatinl428 smalcels;mttassayshowedthatthediferencesbetweenl428 big celsandl428 smalcelswerestatisticalysignificant( 犉 = , 犘 <0.001),withmuchhighermultiplicationcapacity inl428 samlcelsthanthatofl428 bigcels( 犘 <0.001);FlowcytometryshowedmoreapoptoticcelsinL428 bigcels (3.3±0.1)% thanthatofl428 smalcels(0.4±0.1)% ( 犘 <0.001). 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 :TheL428 smalcellinesshow highermultiplicationcapacityandlessapoptoticcels,whichisexpectedtoprovidetheexperimentalbasisforfurtherstudy oftheoriginsofclassicalhodgkinlymphomacels. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] L428celline;bigandsmalcelsublines;limiteddilutionmethod;Hodgkinlymphoma 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,2014,21(3): 中图分类号 R733.4 文献标识码 A 文章编号 (2014) 基金项目 国家自然科学基金 ( ) 第一作者简介 李锋, 男, 广东梅州人, 硕士, 住院医师, 主要从事淋巴瘤分子病理的研究工作 现工作于武警广东省总队医院肿瘤科 Tel: E mail:lifeng0107@126.com 通讯作者简介 赵彤, 女, 河北沧州人, 教授, 博士生导师, 主要从事淋巴瘤的基础与临床研究工作 Tel: E mail:zhaotongketizu@126.com

15 中华肿瘤防治杂志 2014 年 2 月第 21 卷第 3 期 CHINJCANCERPREV TREAT,February2014,Vol.21 No 霍奇金淋巴瘤 (Hodgkinlymphoma,HL) 是一种好发于儿童和中青年的淋巴造血系统恶性肿瘤, 其恶性细胞成分 H/RS 细胞一般只占肿瘤组织的极少部分 (<1%), 其余是大量以淋巴细胞为主的背景细 [1 2] 胞 随着分子生物学及分子遗传学的飞速发展, 近几年对 H/RS 细胞的起源及其克隆性 肿瘤细胞发生发展及肿瘤细胞存活的分子机制研究有了很大的进展 研究表明,HL 是一种特殊的 B 细胞起源的淋巴瘤, 而经典型霍奇金淋巴瘤 (classicalhodgkinlym phoma,chl) 细胞系 L428 在培养过程中可以观察到 [3 4] 形状大小不一的细胞 大小细胞亚系之间的关系, 以及它们在 CHL 发展过程中的作用, 是需要探讨及解决的问题 本研究在以往研究基础上, 采用有限稀释法 免疫细胞化学和流式细胞术等方法观察比较 HLL428 细胞株中大小细胞亚系生物学特性的差异及其意义, 从而明确 HL 中大小细胞亚系之间的关系, 为 HL 细胞起源的进一步研究提供一定的实验基础 1 材料与方法 1.1 细胞株 CHL 细胞株 L428 细胞由南方医科大学广东省分子肿瘤病理重点实验室保存 1.2 主要仪器与试剂 胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品 ; 兔抗人 CD15 和 CD30 单克隆抗体购自 Abcam 公司 ; 山羊抗兔 IgG/ 辣根酶标记购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ; 免疫组化 SP 试剂盒购自北京中杉金桥生物公司 ; 流术细胞仪为美国 BectonDickinsion 公司产品 1.3 方法 细胞培养 L428 细胞 L428 big 细胞和 L428 smal 细胞均用含 10% 胎牛血清 100 U/mL 青霉素和 100mg/L 链霉素的 RPMI1640 培养基培养, 置 37 5% CO 2 培养箱内培养, 取对数期 生长状态良好的细胞进行实验 细胞蜡块制作具体制作方法见参考文献 [5] 有限稀释法取 10μL HL 细胞株 L428 经细胞计数, 得到 个 /ml 后, 取 25 μl( 内含 3000 个细胞 ), 稀释并调整至 3000 个 /ml 取上述 3000 个 /ml 的细胞液 0.1mL, 即共有 300 个细胞, 将此细胞加入 60mL 的含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基 将此细胞悬液混匀, 于每个孔 200μL 加于 3 个 96 孔板培养, 即每个孔可平均可有 1 个细胞 于倒置显微镜下观察, 见 3 个 96 孔板中共有 33 个单细胞形成, 其中单个大细胞有 24 孔, 而单个小细胞有 9 个孔, 大细胞挑取单个细胞成功率为 72.7%(24/33), 小细胞挑取成功率为 27.3%(9/33), 将大小细胞各自传代培养 免疫细胞化学免疫细胞化学检测采用 SP 法, 具体操作如下 细胞蜡块 2μm 连续切片, 石蜡切片脱蜡水化 ; 用 3% H 2O 2 封闭内源性过氧化物酶 ; PBS 洗后, 分别用 EDTA 和柠檬酸溶液微波修复 6min 和 10min, 滴加一抗,37 孵育 1h,PBS 洗后, 滴加过氧化物酶标记的二抗,37 孵育 45min;PBS 洗后,DAB 显色 ; 苏木精复染 脱水 透明 中性树胶封片 MTT 检测细胞株的增殖能力 RPMI1640 培养液将 L428 big 细胞和 L428 smal 细胞悬液调整为 个 /ml, 接种到 96 孔板上, 每孔加细胞悬液 200μL, 每组共设置 3 个复孔 空白对照加 PBS 200μL 随后, 每孔加入 20μL5g/L 的 MTT 溶液, 继续培养 4h, 吸去上清, 每孔加 150μLDMSO, 振荡 10min, 酶联免疫仪检测 570nm 波长的光密度值 (A 值 ), 每组试验重复 3 次 流式细胞术检测细胞株凋亡取对数生长期 L428 big 细胞和 L428 smal 细胞,1500r/min, 离心 5min(r=17.2cm), 后去上清, 将 10 5 ~10 6 个细胞悬浮于 1 ml 的 RPMI1640 培养基中, 再加入 10 μl Heochst33342 染液, 混匀,37 孵育 15min 加入 1mL BuferA 工作液 ( 用双蒸水将 10 BuferA 稀释 10 倍 ) 悬浮细胞, 加入 5μL 碘化丙啶染液, 室温避光放置 5~ 15min 后混匀 上机, 流式细胞术检测细胞的凋亡 1.4 统计学方法 用 SPSS13.0 进行相关数据统计学处理 MTT 实验采用析因分析和流式细胞仪测定细胞凋亡实验采用 One WayANOVA 检验水准 α= 结果 2.1 犆犎犔细胞株犔 428 大小细胞形态学观察 光学显微镜下,L428 细胞培养可见大小不一的肿瘤细胞, 大的肿瘤细胞直径为 40~50μm, 小的肿瘤细胞直径为 15~20μm( 图 1A) 如图 1B 所示,HE 染色, 同样可以看到 L428 细胞中大小不一的细胞 2.2 有限稀释法分离犔 428 细胞中大小细胞 L428 细胞经有限稀释法稀释成单一的 L428 大细胞 ( 图 2A), 经 14d 培养, 可见 L428 大细胞传代培养出大小不一的 L428 肿瘤细胞, 将此传代培养细胞命名为 L428 big 细胞 ; 经有限稀释法稀释成单一的 L428 小细胞 ( 图 2B), 经 14d 培养, 可见 L428 小细胞传代培养出大小不一的 L428 肿瘤细胞, 将此传代培养细胞命名为 L428 smal 细胞

16 李锋 等 １７６ 经典型霍奇金淋巴瘤中大细胞与小细胞亚系生物学特性比较 多为膜点表达 ２ ４ 犕犜犜 实 验 检 测 犔４２８ 细 胞 大 小 细 胞 亚 系 的 增 殖能力 经析因设计方差分析 结果如图 ４ 所示 不同细胞 组之间差异有统计学意义 犉 ５６５ ２７３ 犘 ０ ００１ 不 同时间组对细胞体 外 增 殖 的 影 响 差 异 有 统 计 学 意 义 犉 ５２０ ４６７ 犘 ０ ００１ 细 胞 各 组 与 各 时 间 两 因 素 交 互效应差异有统计学意义 犉 ５１ ４５８ 犘 ０ ００１ 两 组细胞经析因分析 比 较 显 示 Ｌ４２８ ｂ ｇ细胞的增殖能 力低于 Ｌ４２８ ｍ 差异有统计学意义 犘 ０ ００１ ２ ５ 流式细胞术检测 犔４２８ 细胞大小细胞亚系凋亡 Ｌ４２８ ｂ ３ ３±０ １ 明 显 多 ｇ 细胞的凋亡率 为 于 Ｌ４２８ ｍ 细 胞 ０ ４±０ １ 差 异 有 统 计 学 意 义 犘 ０ ００１ ３ 讨论 ＨＬ 是一种好发于儿童和中青年的淋巴造血系统恶 具有非常独特的组织病理学特征 即大量的炎症 性肿瘤 注 Ａ 镜下表现 Ｂ ＨＥ 染色 图 １ 经典型霍奇金淋巴瘤 Ｌ４２８ 细胞中大小细胞亚系 ４００ 背景细胞存在少量特征性的 Ｈ ＲＳ 细胞 近年来单细胞 ２ ３ 犆犇１５ 和 犆犇３０ 在 犔４２８ 细 胞 中 大 小 细 胞 亚 系 的免疫细胞化学表现 的显微切割技术和分子遗传学研究证实了 Ｈ ＲＳ 细胞为 ＣＤ１５ 在 Ｌ４２８ ｍ 细胞中表达较弱 图 ３Ａ 而 在 Ｌ４２８ ｂ ｇ 细 胞 中 表 达 较 强 散 在 强 阳 性 表 达 表面抗原 ＣＤ１ ５ 和 ＣＤ３ ０ 是 ＣＨＬ 较敏感的抗原标志 几 图 ３Ｂ ＣＤ３０ 在 Ｌ４２８ ｍ 细 胞 中 为 部 分 阳 性 表 达 图 ３Ｃ 而 在 Ｌ４２８ ｂ ｇ 为 弥 漫 强 阳 性 表 达 图 ３Ｄ ＣＤ１５ 和 ＣＤ３０ 阳性 部 位 定 位 于 胞 膜 胞 质 表 达 形 式 起源于淋 巴器 官前 凋亡 生发 中心 的 Ｂ 细胞 淋巴 瘤 ６９ 乎所有 Ｈ ＲＳ细胞都表达 ＣＤ３ ０ ８ ０ 以上 Ｈ ＲＳ 细胞表 达 ＣＤ１ ５１０ 因此 ＣＨＬ 肿瘤细胞的独特性引起科学家 的浓厚兴趣 ＨＬ 的细胞起源及其发生发展机制一直成为 学术界悬而未决的问题 注 箭头所示为单细胞克隆位置 图 ２ 有限稀释法显示大小 Ｌ４２８ 细胞单克隆培养过程 ２００

17 中华肿瘤防治杂志 ２０１４ 年 ２ 月第 ２１ 卷第 ３ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｆｂ ｕ Ｖ ２１ Ｎ ３ ｙ２０１４ １７７ ＣＨＬＬ４２８ 细胞株在细胞培养过程中 发现 其具有 形状大小不一的细胞 本研究利用有限稀释法对上述 大小细胞 进 行 单 克 隆 稀 释 后 传 代 培 养 并 分 别 命 名 为 Ｌ４２８ ｂ ｍ 细 胞 应 用 免 疫 组 化 ｇ 细 胞 及 Ｌ４２８ 实验和流式细胞 术 等 方 法对这两种细胞生物学 ＭＴＴ 特性进行观 察 研 究 为 ＣＨＬ 的 细 胞 起 源 的 进 一 步 研 究提供一定的实验基础 关于肿瘤中不同 细 胞 亚 系 及 其 相 互 关 系 Ｗ ｎ ｂ等 １１ 根据细胞的生长特性及免疫表型在小细 胞肺 癌细胞株 ＳＣＬＣ ＭＯ 分选出 ＳＣＬＣ ＭＯＡ１ ＭＯＡ１ 和 ＳＣＬＣ ＭＯＡ２ ＭＯＡ２ 两 种 细 胞 亚 系 并 探 究 免 疫 表 型的差异的 原 因 可 能 是 ｍｙ 基 因 家 族 的 活 性 差 异 引 起的 杨泽 然 等 １２ 通 过 单 细 胞 分 离 克 隆 培 养 和 或 局部淋巴结转 移 灶 筛 选 的 方 法 建 立 两 种 不 同 淋 巴 转 移 能 力 ＨｐＡ 肝 癌 细 胞 亚 系 分 别 命 名 为 ＨｐＡＨ和 ＨｐＡＬ 并比较其生长 游 走 和 贴 壁 能 力 等生物学特性 结果发现这两种细胞在生长 游走和贴 壁能力等生物学特性方面也表现出明显的差异 提示 同一肿瘤细胞株即使 来 源 相 同 但 由 于 肿 瘤 异 质 性 的 原因也可有不同生物学特性细胞亚系的出现 正如本 研究经过单 克 隆 稀 释 后 传 代 培 养 的 Ｌ４２８ ｂ ｇ细胞及 Ｌ４２８ ｍ 细胞 由于 肿 瘤 异 质 性 导 致 这 两 种 细 胞 生 物 学 特 性 的 差 异 本 研 究 中 免 疫 组 化 结 果 显 示 Ｌ４２８ ｍ 细 胞 ＣＤ１５ 和 ＣＤ３０ 的 表 达 明 显 低 于 Ｌ４２８ ｂ ｇ细胞 而 ＣＤ３０ 在 早 期 Ｂ 细 胞 中 表 达 低 甚 至 不表达 表 明 Ｌ４２８ ｍ 细 胞 分 化 程 度 较 低 ＭＴＴ 实 验 显 示 Ｌ４２８ ｍ 细 胞 的 增 殖 能 力 明 显 强 于 Ｌ４２８ ｂ ｂ ｇ 细胞 而 其 凋 亡 率 明 显 低 于 Ｌ４２８ ｇ 细 胞 进一步推 测 Ｌ４２８ ｍ 细 胞 分 化 程 度 低 于 Ｌ４２８ ｂ ｇ 细胞 为 ＣＨＬ 细 胞 起 源 的 进 一 步 研 究 提 供 一 定 的 实 验基础 在培养过程中大细胞亚系和小细胞亚系也出 现了大小不一的细胞 至 于 此 时 出 现 的 大 小 细 胞 与 母 细胞系 Ｌ２８ 中 的 大 小 细 胞 是 何 种 关 系 还 不 得 而 知 注 Ａ ＣＤ１ ５在 Ｌ４ ２ ８ ｍ 细胞中表达 Ｂ ＣＤ１ ５ 在 Ｌ４ ２ ８ ｂ ｇ 细胞中表 达 Ｃ ＣＤ３ ０在 Ｌ４ ２ ８ ｍ 细胞中表达 Ｄ ＣＤ３ ０在 Ｌ４ ２ ８ ｂ ｇ细胞中表达 图 ３ 免疫细胞化学检测 Ｌ４２８ ｂ ｍ 细胞 ｇ 细胞和 Ｌ４２８ ＣＤ１５ 及 ＣＤ３０ 表达 ＳＰ ４００ 下一步本课题组会通过显微切割技术对大小细胞亚系 中大小细胞进行分离并进行生物学特性的检测 参考文献 １ Ｋüｐｐ Ｒ Ｔｈｂ ｇｙ ｆ Ｈｄｇｋ ｎ Ｊ Ｎ Ｒｖ ｙｍｐｈｍ Ｃｎ ２００９ ９ １ １５ ２７ ２ Ｋüｐｐ Ｒ Ｍ ｕ ｂ ｇｙ ｆｈｄｇｋ ｎ Ｊ Ｈｍ ｙｍｐｈｍ ｇｙａｍｓ Ｈｍ ＥｄｕＰ ｇ ｍ ２００９ ４９１ ４９６ ３ Ｋｕｐｐ Ｒ Ｓ ｈｍ ｚｒ Ｄ Ｖ Ｐ ｈ ｎ ｆ Ｈ ｄ ｎ ｇ ｇｋ Ｊ Ｅｕ ＪＨ ｍ Ｓｕｐｐ ２ ０ ０ ５ ６ ６ ２ ６ ３ ３ ｙｍｐｈｍ ４ Ｍ ｆ Ｔ Ｈｕｍｍ Ｍ Ｆ ＨＤ Ｈｄｇｋ ｎｎｄ ｄ ｎｂ ｐ ｎ ｎｘｐｎ ｎ ｆ ｎｇ ｎ ｎ ｇ ｇ ｎｇｆ ｍｇ ｍ ｎ ｎ Ｂ ｗ ｈｆ ｕｎ ｎ ｍｍｕｎｇ ｂｕ ｎｇｎ ｎｇｍｎ ｂｕ ｄ ｆ ｖｍｍｕｎｇ ｂｕ ｎ ｎ ｐ 图 ４ ＭＴＴ 实验检测细胞株 Ｌ４２８ ｍ 细胞 和 Ｌ４２８ ｂ ｇ 细胞的增殖能力差异 ｎ Ｊ Ｂ ｄ ２０００ ９５ ４ １４４３ １４５０ 下转第 １８２ 页

18 178 岑朝, 等百色市胃癌发病危险因素病例对照研究 流行病学研究 / 论著 百色市胃癌发病危险因素病例对照研究 岑朝王超周喜汉苏建伟胡静覃红梅右江民族医学院附属医院消化内科, 广西百色 摘要 目的 : 探讨广西百色市胃癌发病相关危险因素, 为当地胃癌的预防提供科学依据 方法 : 以广西百色市 新发确诊的 667 例胃癌作为观察组, 以相同的性别 年龄 (±5 岁 ) 居住地作为匹配条件, 按 1 1 配比随机抽取当地的健康人群作对照组, 自行设计调查问卷获取相关暴露资料, 应用条件 Logistic 回归模型进行单因素和多因素分析 结果 : 单因素分析发现, 文化教育 职业 居住村庄 家庭经济状况 居住地水源匮乏 ( 没有自来水 / 地下水 / 江河 ) 吸烟 饮食不规律 常食用煎炸食品 重盐口味 体力活动状况 发病前心理压抑 胃溃疡及幽门螺杆菌 ( 犎犲犻犮狅犫犪犮狋狅狉狆狔犾狅狉犻, 犎狆 ) 感染等因子与当地胃癌发病相关, 犘 <0.05 对单因素分析有意义的因子应用逐步向前法多因素分析发现,Hp 感染 重盐口味 水资源匮乏 饮食不规律 吸烟和胃溃疡史是胃癌的危险因素 结论 : 百色市居民胃癌发病与 Hp 感染 胃溃疡史 水源匮乏 吸烟 不良饮食及生活习惯有关 关键词 胃肿瘤 ; 危险因素 ; 幽门螺杆菌 ; 百色中华肿瘤防治杂志,2014,21(3): 犆狅狀狋狉狅犾狊狋狌犱狔狅狀狉犻狊犽犳犪犮狋狅狉狊狅犳犵犪狊狋狉犻犮犮犪狀犮犲狉犻狀犅犪犻狊犲犮犻狋狔 犆犈犖犆犺犪狅, 犠犃犖犌犆犺犪狅, 犣犎犗犝犡犻 犺犪狀, 犛犝犑犻犪狀 狑犲犻, 犎犝犑犻狀犵, 犙犐犖犎狅狀犵 犿犲犻犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犇犻犵犲狊狋犻狅狀, 犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犢狅狌犼犻犪狀犵犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔犳狅狉犖犪狋犻狅狀犪犾犻狋犻犲狊, 犅犪犻狊犲 , 犘. 犚. 犆犺犻狀犪 [ 犃犅犛犜犚犃犆犜 ] 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 :ToexploretheriskfactorsofgastriccancerinBaisecity,provideascientificbasisforthe preventionofgastriccancerofthelocals. 犕犈犜犎犗犇犛 :Totaly667newconfirmedcasesofgastriccancerfromJanuary1st, 2008toDecember31th,2011werechosenastheobservationgroup,andtheywerematchedas1 1withlocalhealthyresi dentsaccordingtotheirgender,age(±5years)andresidenceasthecontrolgroup.adoptingquestionnairestoobtainre lateddata,andsingle factorandmulti factoranalysiswereperformedbyconditionallogisticregressionmodel. 犚犈犛犝犔犜犛 : Single factoranalysisshowedthatlocalgastriccancerwascloselyrelatedtoeducationallevel,career,residentialvilage, families economicconditions,waterscarcity(withoutrunning water,groundwaterandrivers),smoking,irregulardiet, friedfood,high salttaste,physicalactivities,premorbidpsychologicaldepression,gastriculcerand 犎犲犾犻犮狅犫犪犮狋犲狉狆狔犾狅狉犻 ( 犎狆 )infection( 犘 <0.05).Theabovesingle factoranalysiswhichhadsignificantfactorswereconductedbystepwisefor wardsmultiple factoranalysismethod: 犎狆 infection,high salttaste,waterscarcity,irregulardiet,smoking,andhistoryof gastriculcerdiseasewereriskfactorsforgastriccancer. 犆犗犖犆犔犝犛犐犗犖 : 犎狆 infection,historyofgastriculcer,waterscar city,smoking,irregulardietandlivinghabitsarecloselyrelatedtogastriccancerofbaiseresidents. [ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ] stomachneoplasms;riskfactors; 犎犲犾犻犮狅犫犪犮狋犲狉狆狔犾狅狉犻 ;Baise 犆犺犻狀犑犆犪狀犮犲狉犘狉犲狏犜狉犲犪狋,2014,21(3): 中图分类号 R735.2 文献标识码 A 文章编号 (2014) 基金项目 广西壮族自治区卫生厅科研课题 (Z ) 第一作者简介 岑朝, 男, 壮族, 广西百色人, 副主任医师, 主要从事胃癌病因与发病机制方面的工作 Tel: E mail:cenchao2011@126.com 通讯作者简介 王超, 男, 广西钦州人, 教授, 主要从事胃癌早期诊断与预防方面的工作 E mail:yywangchao@163.com 广西百色市位于云贵高原边沿地带, 是以右江河谷为中心的多民族集居地, 以壮族为主, 地理环境和生活习俗独特, 其胃癌发病相关危险因素 流行病学特点 [1] 的相关研究极少 本研究旨在阐明当地胃癌发病的危险因素, 探讨发病机制, 为胃癌的防治工作提供线索和依据

19 中华肿瘤防治杂志 2014 年 2 月第 21 卷第 3 期 CHINJCANCERPREV TREAT,February2014,Vol.21 No 资料与方法 1.1 研究对象病例来源于百色市辖区内由南向北地处海拔不同的靖西县 ( 平均 700 米 ) 右江区 ( 河谷地区平均海拔 200 米 ) 和乐业县 ( 平均 1000 米 )3 个县区籍贯的居民, 在百色辖区内右江民族医学院附属医院 ( 右江区 291 例 ) 靖西县人民医院 (284 例 ) 和乐业县人民医院 (92 例 )3 家综合医院就诊, 经胃镜检查 + 病理活检确诊的新发胃癌病例为观察组 ; 以相同的性别 年龄 (±5 岁 ) 居住地作为匹配条件, 按 1 1 配比从健康档案中以整体随机抽样抽取 当地的健康人群作为对照组 入选的病例和对照均行血清幽门螺杆菌 ( 犎犲犾犻犮狅犫犪犮狋犲狉狆狔犾狅狉犻, 犎狆 ) 抗体检测 ( 酶联法检测, 试剂由北京贝尔生物工程有限责任公司提供 ), 结果阳性者视为犎狆感染 1.2 方法设计调查问卷, 内容包括一般情况 生活习惯 饮食习惯 居住环境 既往史 肿瘤家族史 精神状态 自我调节能力 经济状况 犎狆感染等共 26 项因素列入调查问卷, 其变量赋值见表 1 由经专门培训的调查员通过面对面询问的方式调查每位研究对象, 建立 SPSS 数据库 表 1 调查因素及变量赋值 因素 变量赋值 文化教育 1= 文盲,2= 小学 / 中学,3= 高等学历 职业 1= 农民,2= 工人,3= 公务 / 事业职员,4= 公司职员 / 商务,5= 自由职业 居住区 1= 村庄,2= 乡镇,3= 城区 家庭经济状况 1= 差,2= 中等,3= 好 居住地水源匮乏 1= 是 ( 没有自来水 / 地下水 / 江河 ),0= 否 饮用水类型 1= 自来水,2= 山泉水,3= 河水,4= 井水,5= 水柜蓄存的雨水 吸烟 0= 否,1= 是 (>20 支 / 周 ) 饮酒 0= 否,1= 是 ( 1 次 / 周 ) 饮食不规律 0= 否,1= 是 重盐口味 0= 否,1= 是 常食煎炸食品 0= 否,1= 是 常食辛辣食品 0= 否,1= 是 ( 3 次 / 周 ) 常食腊肉 0= 否,1= 是 ( 1 次 / 周 ) 常食腌菜食品 0= 否,1= 是 ( 3 次 / 周 ) 经常喝茶 0= 否,1= 是 ( 3 次 / 周 ) 常食蔬菜果品 0= 否,1= 是 ( 3 次 / 周 ) 饭前便后洗手 0= 否,1= 是 使用冰箱 0= 否,1= 是 性格 1= 内向,2= 外向 发病前心理压抑 0= 否,1= 是 运动习惯 1= 重体力劳动,2= 体育活动 1 次 / 周,3= 体育活动 <1 次 / 周 上消化道疾病 1= 胃溃疡,2= 慢性胃炎,3= 十二指肠溃疡,4= 息肉 其他全身疾病 0= 无,1= 有 肿瘤家族史 0= 无,1= 有 一级亲属胃癌病史 0= 无,1= 有 犎狆感染 0= 阴性,1= 阳性 1.3 统计学方法应用 SPSS13.0 进行统计分析, 正态性计量资料使用狋检验或方差分析 ; 对单因素条件 Logistic 回归分析差异有统计学意义 ( 犘 0.05) 的可能危险因素, 采用逐步向前法 ; 按 α=0.05 水准进行多因素条件 Logistic 回归分析, 得出与胃癌相关的独立危险因素 2 结果 2.1 一般情况 进行胃镜检查共 例, 明确诊断的新发病胃癌 941 例, 胃镜检出率为 1.80% 剔除不能配合调查或非当地籍贯病例, 实际完成调查纳入研究的观察组和对照组各 667 例, 男 483 例, 女 184 例 ; 观察组年龄 26~88 岁, 平均年龄 (59.15±12.62) 岁, 中位年龄 63 岁 ; 健康对照组年龄 27~85 岁, 平均年龄 (53.64± 11.98) 岁, 中位年龄 61 岁 年龄中位数检验 χ 2 = 0.432, 犘 =0.511 两组籍贯 性别 1 1 匹配, 一般情况具有可比性

20 180 岑朝, 等百色市胃癌发病危险因素病例对照研究 2.2 单因素条件犔狅犵犻狊狋犻犮回归分析结果如表 2 所示, 文化教育程度 ( 文盲 ) 职业 ( 农民 ) 居住区村庄 低经济收入 居住地水源匮乏 吸烟 饮食不规律 常食用煎炸食品 重盐口味 重体力劳动 发病前有心理压抑 胃溃疡 犎狆感染等 13 个因子与胃癌发病有正相关, 适当体育运动与胃癌有负相关, 犘 <0.05; 饮用水类型 饮酒 常食辛辣食品 常食腊 肉 常食腌菜食品 经常喝茶 常食用蔬菜果品 饭前便后洗手 使用冰箱 性格 其他全身疾病 肿瘤家族史 一级亲属胃癌病史无关, 犘 > 多因素条件犔狅犵犻狊狋犻犮回归分析如表 3 所示, 最终进入多因素回归模型的变量有犎狆感染 居住地水资源匮乏 胃溃疡 重盐口味 饮食不规律和吸烟等 6 个独立危险因素 表 2 百色市居民胃癌危险因素单因素条件 Logistic 回归分析 a 因素 观察组 ( 狀 ) 对照组 ( 狀 ) 参考估计 标准误 Waldχ 2 值 犘值 OR 95%CI 文化教育 文肓 ~2.06 小学 / 中学 ~1.44 高等学历 职业 农民 ~4.08 工人 ~3.13 公务 / 事业职员 ~3.45 公司职员 / 商务 ~2.59 自由职业 居住区 村庄 ~1.80 乡镇 ~1.30 城区 家庭经济状况 <0.001 差 < ~2.82 中等 < ~2.50 好 居住地水源匮乏 < ~2.16 吸烟 ~2.34 饮食不规律 < ~2.32 常食用煎炸食品 ~2.18 重盐口味 < ~2.04 运动习惯 <0.001 重体力劳动 < ~2.04 常体育煅炼 ~0.93 缺乏运动 发病前心理压抑 ~3.95 胃溃疡史 < ~4.18 犎狆感染 < ~2.84 注 : a 模型检验犘 <0.001, 回归方程差异有统计学意义 ; 统计学分析结果无意义 ( 犘 >0.05) 的因素未列出 ; 多分类变量的类间比较, 最后一个水 平不与其余水平的平均效应比较 表 3 百色市居民胃癌危险因素多因素 Logistic 回归分析 a 因素 参考估计 标准误 Waldχ 2 值 犘值 OR 95%CI 犎狆感染 < ~38.24 居住地水资源匮乏 ~15.10 胃溃疡 ~7.99 重盐口味 ~12.67 饮食不规律 ~3.16 吸烟 ~2.19 注 : a 模型检验 : 最终模型似然比检验, χ 2 =67.867, 犘 <0.0001, 回归方程差异有统计学意义

21 中华肿瘤防治杂志 2014 年 2 月第 21 卷第 3 期 CHINJCANCERPREV TREAT,February2014,Vol.21 No 讨论 胃癌是源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤, 是消化道最常见的恶性肿瘤之一 各地区生活环境不同, 发病危险因素也不尽相同, 对胃癌流行病学与病因学研究, 对胃癌预防和发病机制的研究有重要意义 本组单因素分析显示, 文化程度低 居住农村 家庭经济条件欠佳 水源匮乏 吸烟 饮食不规律 喜煎炸食品 喜重盐口味 从事重体力劳动 发病前心理压抑 胃溃疡和犎狆感染等可能是居住于滇 黔 桂三省交界的百色居民胃癌发病的危险因素, 而适当体育运动则有保护作用 文献报道饮酒为胃癌的高危因素之 [2 4] 一, 但本组显示胃癌与饮酒无相关 本地居民喜饮自酿米酒或低度酒类, 而在胃癌高发区的北方则喜饮高度白酒类, 其结果差异是否与酒精度有关, 有待进一步查明 此外, 饮用水类型 常食辛辣食品 常食腊肉 常食腌菜食品 经常喝茶 常食用蔬菜果品 饭前便后洗手 使用冰箱 性格及其他全身疾病等因素, 对当地 [1] 胃癌发病影响强度似乎正在弱化, 提示随着居住环境 饮水和生活条件改善以及生活习惯的改变, 发病危险因素也发生了改变 本研究 Logistic 回归模型多因素分析提示, 犎狆感染对胃癌发病的贡献最大 (OR=22.30,95%CI: [5 6] 3.60~38.24), 与文献报道相似 犎狆感染是全球 [7] 性问题, 至今其感染途径尚不明确 研究表明, 高胃癌年龄标化发生率 (agestandardrate,asr) 的国家具有较高的犎狆感染血清阳性率, 但亦有犎狆感染血清 [6] 阳性率高而胃癌 ASR 较低的国家, 如印度和泰国, 可见人群感染犎狆的结局并不一致, 这些差异可能系胃癌多病因共同作用以及犎狆细菌毒力差异有关 近来研究也提示, 致胃癌的犎狆菌株在不同地区其致胃癌的机制是相似的, 但胃癌高发区胃癌相关菌株可能 [8 9] 存在强于低发区的致胃癌作用 水源不足的居住环境依然是胃癌高危因素之一 (OR=8.04,95%CI:4.23~15.10) 因为缺水, 限制食品 手卫生 餐具和日常用品等的洗涤条件, 是否导致 犎狆感染率增高和致癌化学物质摄入增多, 有待研究 胃溃疡病史与胃癌发病密切相关 (OR=6.63, 95%CI:2.40~7.99), 动物实验和临床随访提示, 胃溃疡恶变危险不在溃疡本身, 而在其周围的慢性萎缩性胃炎 肠化生和不典型增生, 提示胃溃疡病史对胃癌有一定的预警作用, 是随访的重要对象之一 国内外已对吸烟在胃癌发生中的作用进行了大量 [10 12] 流行病学研究, 大多数表明吸烟与胃癌呈正相关 烟草及烟草烟雾中含有多种致癌物质和促癌物质, 如苯并芘 二甲基亚硝胺 酚类化合物和放射性元素等 其他严重有害物质包括尼古丁 一氧化碳和烟焦油, 吃 饭时吸烟可将烟草中的有害物质随食物吞下并与胃黏膜接触 多因素分析还提示, 高盐和饮食不规律的不良习惯, 对本地居民胃癌发病也有明显影响 绝大多数学者认为, 饮食因素与胃癌发生的关系最直接, 某些致癌物质通过人们的饮食 不良饮食习惯和方式不断侵袭 [13] 人体有关 许多国家先后进行了大量研究, 但尚未 [3,14 16] 找到符合所有胃癌高发区的特定食物 与胃癌相关的食品有以下几个基本特点 : 高盐 高淀粉 低脂 低 ( 动物 ) 蛋白 少食新鲜蔬菜及水果 ; 相关的食物加工方式有腌熏 发酵和煎炸等 相关的进食方式亦有影响, 如暴饮暴食 干 硬 烫和快食等 常食蔬菜 水果 [13] 和青葱类植物与胃癌呈负相关 本研究胃癌的胃镜检出率为 1.80%, 低于国内一 [17 19] 些地区, 但年龄分布状况却与高发地区极为相似, 平均年龄 (59.15±12.62) 岁, 显然胃癌的发生是由于某些人群长期暴露于病因的结果, 病因学研究应追朔到患者发病以前若干时间暴露于何种病因之下更为准确, 然而胃癌病因与时间累积关系目前知之甚少, 研究的切入点尚难把握, 如作为胃癌的主要高危因素之一的犎狆感染, 普遍认为其导致不可逆的胃癌前病变可 [6] 追朔到 10~20 年前, 但犎狆感染的途径尚未明了, 其导致胃黏膜发生癌前病变的级联事件 时间累积关系和最终发生胃癌的机制有待进一步研究 本研究未发现胃癌发病与肿瘤家族史及一级亲属胃癌家族史有相关, 这与有些国家和地区文献报道不 [3,7] 同 遗传因素对胃癌发病作用仍有争议, 胃癌易 [17,20] 感基因不同国家 民族不完全一致 人体对 外源性致癌剂的代谢能力和基因修复能力等因素将影响个体对胃癌的易感, 但其生物学机制也未明了 陈威 [21] 等对中国北方高发区和低发区的 HLA DPBl 基因多态性进行对照研究, 发现 HLA DPBl 0901 和 1701 等位基因多态存在胃癌高 低发区人群分布差异, 但未发现 HLA DPBl 等位基因多态与胃癌易感性 [3] 及犎狆感染有关 ;Zhang 等研究辽宁省居民谷胱甘肽 S 转移酶 P1(GSTP1)Val 等位基因多态性与吸烟 饮酒 尤其是犎狆感染的互动, 提示增加患胃癌的风险 但流行病学资料证实, 胃癌高发地区居民移居至胃癌低发地区的第一代发病率仍高, 但他们的下一代则发病率下降, 说明生命早期受到的环境和饮食因素影响很重要, 而遗传因素对胃癌的发病的贡献有 [22] 限, 在胃癌发病的过程中可能起到主导作用 总之, 胃癌是多因素共同作用的结果, 环境因素在胃癌发生中起主要作用, 同时也是可干预的因素, 预防和治疗犎狆感染仍是减少胃癌发病的中心环节, 除了 [6] 对高危人群犎狆感染病例的根除治疗, 推行良好的清洁卫生习惯, 降低犎狆感染率也是重要预防手段之

22 182 岑朝, 等百色市胃癌发病危险因素病例对照研究 一 此外, 改变不良生活和饮食习惯, 注意心理健康, 戒烟 清淡而规律饮食 劳逸结合等良好的生活方式, 均是胃癌预防健康教育工作中的重要内容 参考文献 [1] 岑朝. 广西壮族地区居民胃癌发病高危因素初探 [J]. 右江医学, 2006,34(1):9 11. [2] 王靖元, 朱丽, 吴德林, 等. 江苏省肿瘤低发地区主要恶性肿瘤相关影响因素配对病例对照研究 [J]. 中华肿瘤防治杂志,2008,15 (8): [3] ZhangY,SunLP,XingCZ,etal.InteractionbetweenGSTP1Val aleleand H.pyloriinfection,smokingandalcoholconsumption andriskofgastriccanceramongthe Chinesepopulation[J]. PLoSOne,2012,7(10):e [4] KimJ,ChoYA,ChoiIJ,etal.Efectsofinterleukin 10polymor phisms,helicobacterpyloriinfection,andsmokingontheriskof noncardiagastriccancer[j].plosone,2012,7(1):e [5] GohKL,CheahPL,MdNetal.Ethnicityand H.pyloriasrisk factorsforgastriccancerin Malaysia:aprospectivecasecontrol study[j].amjgastroenterol,2007,102(1): [6] FockKM,Taley N,MoayyediP,etal.Asia Pacificconsensusguide linesongastriccancerprevention[j].jgastroenterolhepatol,2008, 23(3): [7] MuhammadJS,ZaidiSF,SugiyamaT.Epidemiologicalinsandoutsof helicobacterpylori:areview[j].jpak MedAssoc,2012,62(9): [8] desablett,piazuelomb,shafercl,etal.phylogeographicori ginofhelicobacterpyloriisadeterminantofgastriccancerrisk [J].Gut,2011,60(9): [9] 刘琳娜, 张静, 丁士刚, 等. 胃癌高 低发区胃癌与慢性胃炎患者幽门螺杆菌差异蛋白质的比较 [J]. 北京大学学报 : 医学版, 2011,43(6): [10] 孙晓东, 黄育北, 王波, 等. 中国人群吸烟与胃癌发病关系的 Me ta 分析 [J]. 中国慢性病预防与控制,2009,17(3): [11] KoizumiY,TsubonoY,NakayaN,etal.Cigaretesmokingand theriskofgastriccancer:apooledanalysisoftwoprospective studiesinjapan[j].intjcancer,2004,112(6): [12] GonzálezCA,PeraG,AgudoA,etal.Smokingandtheriskof gastriccancerinthe European ProspectiveInvestigationInto CancerandNutrition (EPIC)[J].IntJCancer,2003,107(4): [13] 张栓虎. 中国居民饮食习惯与胃癌发病关系的 Meta 分析 [J]. 现代预防医学,2008,35(2): [14] 郑奎城, 林曙光, 钟文玲, 等. 福建省胃癌中高发地区居民健康和饮食调查研究 [J]. 海峡预防医学杂志,2010,16(2):4 7. [15] DeStefaniE,BofefaP,Bren nanp,etal.dietarycarotenoidsand riskofgastriccanceracase controlstudyinuruguay[j].eurjcancer Prev,2000,9(5): [16] PailD,RussoA,DecarliA.Dietarypaterns,nutrientintakeand gastriccancerinahigh riskareaofitaly[j].cancercausescon trol,2001,12(2): [17] YiGuo,JingFan,YanLin,etal.Associationbetweenpolymor phismrs andgastriccancerriskin Chinesepopulation [J].WorldJGastroenterol,2011,17(13): [18] 黄晓俊, 南寿山, 金安琴, 等. 甘肃省 30 年胃镜检出 例胃癌分析 [J]. 中华消化内镜杂志,2009,26(2): [19] 荆晓岳, 王建国, 周兵, 等. 近 10 年豫北地区胃癌临床流行病学特征 [J]. 中国普外基础与临床杂志,2010,17(1): [20] BufartTE,Louw M,vanGrieken NC,etal.Gastriccancersof WesternEuropeanandAfricanpatientsshowdiferentpaterns ofgenomicinstability[j].bmc MedGenomics,2011,4:7. [21] 陈威, 孙丽萍, 张晔, 等. 胃癌高发与低发区人群 HLA.DPB1 等位基因多态性的研究 [J]. 中华肿瘤病防治杂志,2008,15(11): [22] 刘厚钰. 胃癌 [M]// 陈灏珠. 实用内科学.10 版. 上海 : 人民卫生出版社,1997: 收稿日期 : 修回日期 : ( 编辑 : 杨靖 ) 檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸 ( 上接第 177 页 ) rusinfectionofahodgkin/reed Sternbergcelprecursorinagermi [5] 王志强, 黄学平, 黎相照, 等. 悬浮培养细胞的细胞块制作及其应 nalcenter[j].amjsurgpathol,2003,27(11): 用 [J]. 临床与实验病理学杂志,2009,25(6): [10] VockerodtM,MorganSL,Kuo M,etal.TheEpstein Barrvirus [6] Muschen M,KüppersR,SpiekerT,etal.Molecularsingle cela oncoprotein,latent membrane protein 1,reprograms germinal nalysisofhodgkin andreed Sternbergcelsharboringunmutat centrebcelstowardsa Hodgkin sreed Sternberg likepheno edimmunoglobulinvariableregiongenes[j].labinvest,2001, type[j].jpathol,2008,216(1): (3): [11] Watanabe H,TakahashiT,UedaR,etal.Antigenicphenotype [7] 肖崇娟, 袁君, 刘巍, 等. 经典型霍奇金淋巴瘤组织 CD20 和 CD68 表 andbiologicalcharacteristicsoftwo distinctsublines derived 达临床意义的研究 [J]. 中华肿瘤防治杂志,2012,19(5): fromasmalcellungcarcinomacelline[j].cancerres,1988, [8] BrauningerA,WackerHH,RajewskyK,etal.Typingthehisto 48(9): geneticorigin ofthetumorcels oflymphocyte rich classical [12] 杨泽然, 李继承. 两种不同淋巴转移能力小鼠肝癌细胞亚系的建 Hodgkin slymphomainrelationtotumorcelsofclassicaland 立和生物学特性 [J]. 实验生物学报,2003,36(2): lymphocyte predominance Hodgkin slymphoma[j].cancer Res,2003,63(7): 收稿日期 : 修回日期 : [9] TinguelyM,RosenquistR,SundstromC,etal.Analysisofaclonaly ( 编辑 : 张 ) relatedmantlecelandhodgkinlymphomaindicatesepstein Barvi