S04.FIT)

Size: px

Start display at page:

Download "S04.FIT)"

翕役卜
7 years ago
Views:

1 第 14 卷第 6 期生命科学研究灾燥造援员 4 晕燥援 6 圆园 10 年 12 月蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Dec. 圆园 10 RecA 蛋白介导的小粒野生稻 STK 类抗性基因富集文库的构建韩小霞袁崔玲玲 2 袁唐丽 3 袁陶小平 2 袁邢俊杰袁 3 袁李丁袁谢灵灵袁贺荣华袁左佳袁曹孟良袁 3* (1. 中南大学研究生院隆平分院, 中国湖南长沙 ;2. 湖南隆平高科基因科技有限公司, 中国湖南长沙 ; 3. 国家杂交水稻工程技术研究中心, 中国湖南长沙 ) 摘要院利用 RecA 蛋白的同源重组特性袁以生物素标记的 STK 类抗性基因 PCR 扩增产物为探针袁对小粒野生稻 DNA 文库进行富集袁构建了库容量为 1710 个的 STK 类抗性基因富集文库袁通过菌落原位杂交筛选获得 21 个阳性克隆. 其中 10 个阳性克隆进行了两端测序袁生物信息学分析表明院有 3 个阳性克隆可分别定位于粳稻抗性基因附近和抗性基因内袁可能是新的候选抗性基因曰有 2 个阳性克隆可以在粳稻上定位袁但周围无抗性基因片段曰其它 5 个阳性克隆由于与栽培稻有多处匹配袁不能精确定位. 关键词院 RecA 蛋白曰小粒野生稻曰菌落原位杂交曰抗性基因曰富集文库中图分类号院 Q781 文献标识码院 A 文章编号院 1007 鄄 7847 渊 2010 冤 06 鄄 0480 鄄 05 RecA Protein 鄄 mediated Enrichment Library Construction of Oryza minuta STK Class Resistance Genes HAN Xiao 鄄 xia 1,2,CUI Ling 鄄 ling 2,TANG Li 3,TAO Xiao 鄄 ping,xing Jun 鄄 jie 1,2,3, LI Ding 1,2,XIE Ling 鄄 ling 1,2,HE Rong 鄄 hua 1,2,ZUO Jia 1,2,CAO Meng 鄄 liang 1,2,3* (1. Longping Branch of Graduate School,Central South University,Changsha ,Hunan,China; 2. Hunan Yuan Longping Agricultural Hi 鄄 tech Gene Co.,Ltd.,Changsha ,Hunan,China; 3. China National Hybrid Rice R&D Center,Changsha ,Hunan,China) Abstract:By using the RecA protein in homologous recombination system and the PCR products of STK type biotin 鄄 labeled resistance genes as probe,an enriched library of Oryza minuta STK class resistance genes was constructed with acapacity of 1710 clones. 21 positive clones were screened by in situ hybridi 鄄 zation and 10 of them were terminally sequenced. By bioinformatic analysis,3 clones were well matched with cloned japonica rice resistance genes or located near by resistance genes,indicating they are possible candidate resistance genes;2 clones can be mapped in the japonica rice genome,without flanking by resistance gene fregments. The other 5clones can not be mapped into the cultivated rice genome because of mutiple matches. Key words:reca protein;oryza minuta;colony in situ hybridization;resistance genes;enriched library (Life Science Research,2010,14(6):480 耀 484) 收稿日期院 2010 鄄 06 鄄 29; 修回日期院 2010 鄄 11 鄄 01 基金项目院国家 973 项目 (2007CB109007); 国家 863 重点项目 (2006AA100101); 国家科技支撑计划项目 (2007BAD77B00); 国家转基因重大专项项目 (2008ZX08001, 2009ZX08001 鄄 010B) 作者简介院韩小霞 (1979 鄄 ), 女, 山东潍坊人, 博士研究生, 主要从事植物分子生物学研究,E 鄄 mail:xiaoxiahan54@gmail.com; * 通讯作者 : 曹孟良 (1965 鄄 ), 男, 湖南长沙人, 中南大学教授, 博士生导师, 主要从事植物分子生物学及作物遗传育种方面的研究,E 鄄 mail: mlcao@hhrrc.ac.cn.

2 第 6 期韩小霞等院 RecA 蛋白介导的小粒野生稻 STK 类抗性基因富集文库的构建 481 小粒野生稻 (OR. Minuta)( 4n=48,BBCC) 原产于亚洲, 主要分布于马来西亚菲律宾和印度尼西亚. 由于长期处于野生状态, 经受了各种逆境的选择, 具备对多种病虫害的抗性. 目前小粒野生稻对褐飞虱白飞虱黑尾叶蝉稻蓟马稻瘟病二化螟白叶枯病纹枯病和细菌性条斑病的抗性均已得到鉴定, 是栽培稻抗性育种的咱 1 暂优良材料年 Clark 和 Magulies 在研究大肠杆菌的同源重组和 DNA 损伤修复时, 发现了 RecA 咱 2 暂咱 3 暂蛋白. RecA 蛋白是一种 DNA 结合蛋白, 由 352 个氨基酸编码, 相对分子质量为 , 等电点为 5.2. RecA 蛋白具有重组酶活性和 ATP 酶咱 4 暂活性, 能特异地识别单链 DNA, 并能将其与同源双螺旋中的互补序列退火, 同时将另一条链咱 5 暂排挤出去, 形成所谓 D 环 (D 鄄 loop). 利用 RecA 蛋白可诱导单链 DNA 与其同源双链 DNA 配对, 在酌鄄 s 鄄 ATP 存在条件下形成稳定的异源三链结构的特性, 通过单链探针的富集, 将含同源区的片段或质粒浓度提高, 从而大大减少后期文库筛选的工作量. 本实验室利用 RecA 蛋白的同源重组特性, 将候选抗性基因克隆技术与磁珠富集文库技术相结合, 根据已克隆植物 STK 类抗性基因的氨基酸保守结构域设计引物,PCR 扩增获得探针, 构建了小粒野生稻 STK 类抗性基因富集文库, 并进一步通过菌落原位杂交筛选获得阳性克隆, 对其进行两端测序, 生物信息学比对, 确定阳性克隆在栽培稻上的定位信息, 最后将其转化并进行田间表型鉴定, 验证功能. 1 材料与方法 1.1 材料小粒野生稻基因组液体文库 ( 本实验室用双元可转化载体 pcambia1301 自行构建 ). 1.2 菌株和试剂农杆菌 EHA105 菌株, 大肠杆菌 DH10B 菌株, 均为本实验室保存. QIAEX 域胶纯化试剂盒和 Plasmid Midi Kit 质粒纯化试剂盒均购自 Qiagen, 酌鄄 s 鄄 ATP 购自 Sigma 公司,RecA 蛋白生物素标记探针杂交检测试剂盒 NEBlot Phototope Kit 和显色试剂盒 Phototope 鄄 Star Detection Kit 购自 NewEngland BioLabs 公司 ;Hybond 鄄 N+ membranes 购自 Amersham Biosciences 公司 ;Biotin 鄄 21 鄄 dutp Taq DNA 聚合酶 EcoR 吁限制性内切酶购自 Takara 公司. 磁力架购自 Promega 公司, 其它生化试剂均购自 Amresco 公司. 1.3 方法引物设计引物设计靶标序列参考水稻 STK 类抗性基咱 6 暂因蛋白序列氨基酸保守结构域, 上下游结构域分别为 :FG(K/V/I/S)VY(K/R)G 和 D(V/I)YS (F/Y)G(V/I/M), 结合普通野生稻密码子使用频率及水稻 STK 类抗性基因密码子使用偏好性设计. STK 类抗性基因上游引物 :STK1f1:5 忆鄄 TTC GGC AAG GTG TAC AAG GG 鄄 3 忆 ;STK1f2: 5 忆鄄 TTC GGC AAG GTG TAC AAA GG 鄄 3 忆 ; STK1f3:5 忆鄄 TTC GGC AAG GTC TAC AAG GG 鄄 3 忆 ;STK1f4:5 忆鄄 TTC GGC ATC GTG TAC AAG GG 鄄 3 忆.STK 类抗性基因下游引物 :STK1r1:5 忆鄄 AT GCC GAA GCT GTA GAT GTC 鄄 3 忆 ;STK1r2: 5 忆鄄 AT GCC GAA GCT GTA GAT ATC 鄄 3 忆 ;STK1r3: 5 忆鄄 AT GCC GAA GCT GTA CAC GTC 鄄 3 忆 ;STK1r4: 5 忆鄄 AT GCC GAA GCT GTA GAC GTC 鄄 3 忆. 分别将 STK1f1 STK1f2 STK1f3 和 STK1f4 等量混合作为上游引物, 将 STK1r1 STK1r2 STK1r3 和 STK1r4 等量混合作为下游引物富集文库筛选探针的制备咱 7 暂利用 CTAB 法提取小粒野生稻基因组 DNA, 作为制备探针的模板. 探针模板制备 PCR 反应体系为 25 滋 L:ddH 2 O17.25 滋 L,DNA 模板 1 滋 L (50 ng), 10 伊 PCR buffer( 含 Mg 2+ )2.5 滋 L,10 mmol/ldntps 2 滋 L,5 滋 mol/l 的上下游引物各 1.0 滋 L,5 U/ 滋 LTaq 酶 0.25 滋 L. PCR 扩增条件为 :95 益预变性 3min,95 益变性 1min,55 益退火 40 s,72 益延伸 1min, 共 34 个循环, 最后 72 益延伸 7min. PCR 扩增产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离, 用 QIAGEN 胶回收试剂盒回收目标片段, 再以回收片段作为探针制备模板, 探针制备 PCR 反应体系为 50 滋 L:ddH 2 O29.5 滋 L, DNA 模板 2 滋 L(100 ng),10 伊 PCR buffer( 含 Mg 2+ ) 5.0 滋 L,10 mmol/ldntps 4 滋 L,10 mmol/l Biotin 鄄 21 鄄 dutp 5 滋 L,5 滋 mol/l 上下游引物各 2.0 滋 L, 5U/ 滋 LTaq 酶 0.5 滋 L. 反应程序参照模板制备程序, 其中延伸时间由 1min 延长为 2min. PCR 反应产物用 QIAGEN 胶回收试剂盒回收, 并检测调整探针浓度至 50 mg/l.

1965 年 Clark 和 Magulies 在研究大肠杆菌的同源重组和 DNA 损伤修复时, 发现了 RecA 咱 2

3 482 生命科学研究圆园 10 年富集效率的检测富集效率检测参照试剂盒 RecActive TM Gene Enrichment Kit 提供的方法 ( 略有改动 ) 进行. 设置 1 颐内参文库, 采用长度分别为 bp 的生物素标记探针检测富集效率富集文库的构建富集文库构建步骤参照试剂盒 RecActive TM Gene Enrichment Kit 提供的方法 ( 略有改动 ) 进行. 获得的富集液体文库转化 DH10B 感受态细胞. 挑取单克隆并培养于 384 孔板, 获得基因组富集平板文库. 为提高富集效率, 采用 Plasmid Midi Kit 质粒纯化试剂盒回收全部克隆, 按照上述方法进行二次富集菌落原位杂交筛选富集文库杂交筛选探针制备模板同富集探针制备模板, 杂交探针标记步骤和富集文库筛选步骤参考 Biolabs 公司的 NEBlot Phototope Kit 及 Phototope 鄄咱 8 暂 Star Detection Kit 试剂盒 ( 略有改动 ) 进行富集阳性克隆的鉴定及序列分析采用 EcoR 吁酶切鉴定阳性克隆, 并挑取酶切图谱不同的克隆进行两端测序, 结果用 NCBI 数据库 Blast 软件与已测序水稻序列进行比对分析. 2 结果与分析 2.1 探针的制备与检测采用 STK 类抗性基因上下游混合引物扩增小粒野生稻 DNA, 扩增产物胶回收后浓度调至 50 mg/l, 做为生物素标记探针制备的模板, PCR 扩增获得长度约 500 bp 的生物素标记探针 ( 见图 1), 并将其纯化, 浓度调至 50 mg/l 备用. 1 2 bp 2.2 富集效率的检测利用自制的内参文库和长度分别为 625 bp 和 396 bp 的探针进行富集, 通过多次富集表明两种探针富集效率相差不大, 均稳定在 3000 耀 5000 之间. 故采用二次富集的方法, 以提高富集效率. 2.3 富集文库的制备和阳性克隆的获得通过二次富集的方法, 获得库容量为 1710 的富集文库. 对富集文库用菌落原位杂交法筛选, 获得 20 个阳性克隆 ( 见图 2). 图 2 小粒野生稻部分富集文库杂交检测结果 1 院探针模板阳性对照曰 2 院小粒野生稻富集文库 384 孔板原位杂交. Fig.2 Part of the Minuta enriched library hybridization results 1:The probe template positive control;2:384 鄄 pore plate in situ hybridization of the minuta enrichments. 2.4 富集阳性克隆的酶切分析挑取阳性克隆扩增并小规模抽提质粒, 经 EcoR 吁酶切后 1% 琼脂糖电泳并进行酶切图谱分析 ( 图 3). 20 个阳性克隆经酶切验证后, 去重复, 获得 10 个阳性克隆, 编号分别为 XES3 鄄 1E4 XES3 鄄 1F17 XES3 鄄 1G16 XES3 鄄 1K18 XES3 鄄 3B6 ES3 鄄 3H18 XES3 鄄 3M6 XES3 鄄 4B6 XES3 鄄 4H3 XES3 鄄 5D 图 1 STK 生物素标记探针电泳检测 1 院 Marker 玉曰 2 院 STK 生物素标记探针. Fig.1 Electrophoresis test of STK biotin 鄄 labeled probe 1:Marker 玉 ;2:STK biotin 鄄 labeled probe. 图 3 部分阳性克隆文库质粒 EcoR 吁酶切 1% 琼脂糖凝胶电泳 1 院 1 耀 10 kb Marker 曰 2 院 pcambia1301 空载体 EcoR 吁酶切曰 3 耀 10 院部分阳性克隆 EcoR 吁酶切曰 11 院 Lambda DNA/ Hind 芋 Marker. Fig.3 Part of positive clones digested by EcoRV and their electrophoresis in 1% agaros 1: 1 耀 10 kb Marker; 2: pcambia1301 by EcoR 吁 restriction digestion;3 耀 10:part of genomic plasmids by EcoR 吁 restriction digestion;11:lambda DNA /Hind 芋 Marker.

4 第 6 期韩小霞等院 RecA 蛋白介导的小粒野生稻 STK 类抗性基因富集文库的构建富集阳性克隆的测序分析对阳性克隆进行两端测序, 序列与栽培稻序列进行比对, 结果表明 :XES3 鄄 1G16 XES3 鄄 1E4 XES3 鄄 3B6 XES3 鄄 3H18 和 XES3 鄄 4H3 可以定位于粳稻相应染色体区段,XES3 鄄 1K18 XES3 鄄 4B6 XES3 鄄 3M6 XES3 鄄 5D3 XES3 鄄 1F17 由于与粳稻有多处匹配, 无法精确定位. 在上述 5 个可以定位的阳性克隆中,XES3 鄄 1G16 XES3 鄄 1E4 和 XES3 鄄 3H18 可定位于粳稻抗性基因附近或抗性基因内, 可能为新的候选抗病基因,XES3 鄄 4H3 XES3 鄄 3B6 可以在粳稻上定位, 但周围无抗性基因片段. 其中 XES3 鄄 1G16 左端与 XES3 鄄 3H18 右端均可定位于粳稻第 5 染色体 > ref NC_ 鄄区段, BLAST2 软件分析两端序列, 结果表明 2 个克隆应该是同一片段以不同方向插入载体造成的. 该定位区段包括基因 Os05g 末端 1kb 片断,Os05g 注释为蛋白激酶, 含有 STK 保守结构域 ; 定位点下游 6.6 kb 处有基因 Os05g , 该基因含有抗性基因候选片段 ; 两者另一端与栽培稻序列均无匹配, 推断该克隆极有可能包含抗性基因. XES3 鄄 1E4 可定位于粳稻第 6 染色体 >ref NC_ 鄄之间, 而鄄之间基因 Os06g 为候选抗性基因, 此克隆含有此抗性基因约 1.3 kb 的编码区片断, 因此该克隆可能为新的候选抗性基因. 另外两个阳性克隆 XES3 鄄 4H3 XES3 鄄 3B6 均可定位于粳稻第 6 染色体 >ref NC_ 鄄区段, BLAST2 软件分析表明此两克隆是同一片断正反插入载体造成的, 定位区段包括基因 Os06g 的全部和 Os06g 基因的大部分序列, 两基因注释均为假定的保守蛋白, 但保守结构域分析表明两基因并不含 STK 结构域. 5 个不能在栽培稻上精确定位的阳性克隆中,XES3 鄄 1K18 XES3 鄄 4B6 XES3 鄄 3M6 XES3 鄄 5D3 两端与粳稻均有多处匹配,XES3 鄄 1F17 左端与粳稻有多处高匹配, 右端与栽培稻序列无匹配. 3 讨论基于 RecA 的富集文库构建技术建立和完善经历了一系列过程. 早在 1986 年 Rigas 利用 RecA 的重组特性, 采用生物素标记的探针筛选质粒文库, 这是 RecA 蛋白用于文库筛选的初次咱 9 暂报道. Honiberg 利用 RecA 的重组特性, 对同源双链 DNA 筛选, 建立了富集方法, 随着研究的深入该技术得到不断细化和优化, 并被广泛应咱 10~14 暂用于文库和双链 DNA 的筛选年 Active motif 公司推出 RecActive TM Gene Enrichment Kit 试剂盒, 为研究者提供了一种全新高效的从文库溶液中快速分离和富集目的基因或基因组 DNA 克隆的手段. 本研究中的方法正是参考该试剂盒, 经过多次试验验证形成的技术路线, 但富集效率低于 RecActive TM Gene Enrichment Kit 试剂盒, 故采用二次富集以提高富集效率. 应用该技术只需知道目的基因的很短的序列 ( 约 200 耀 600 bp), 制备成生物素标记的双链 DNA 探针. RecA 蛋白介导探针 DNA 与文库中目的基因形成互补 DNA D 鄄 loop 结构, 再加入链霉亲和素包被的磁珠, 即可用磁力架捕获目的基因. 目的基因经转化和分离培养后, 可得到大量含有目的序列的克隆, 经菌落原位杂交筛选, 即可进一步获得目的基因克隆. 本研究直接采用 STK 类抗性基因 PCR 回收产物为探针, 与以 STK 类抗性基因 TA 克隆为探针相比, 省去了繁琐的 TA 克隆制备和测序工作, 也增加了产物的不可预测性, 本实验室对以 TA 克隆制备探针获得的阳性克隆进行测序, 结果表明测序的 5 个克隆中有 4 个含有抗性基因咱 15 暂的保守序列, 说明以包含抗性基因片段的 TA 克隆为探针, 具有效率高, 目标明确的优点. 而直接以 PCR 扩增产物为探针, 则增加了产物的不可预测性, 但同时也增加了获得新的抗性基因的可能性. 对获得的阳性克隆, 本研究进行了生物信息学方面的分析, 确定 3 个阳性克隆为新的候选抗咱 16 袁 17 暂病基因. 鉴于水稻白叶枯和稻瘟病病害流行, 研究条件也比较成熟, 我们计划重点对该 3 个克隆进行转化工作, 并对转基因植株进行田间白叶枯接种鉴定和室内稻瘟病接种鉴定, 以期获得抗性转基因植株. 参考文献渊 References 冤院 [1] 曹孟良. 利用全基因组基因嵌入突变体库发掘野生稻有利基因及其超级杂交稻分子育种应用 [J]. 分子植物育种 (CAO Meng 鄄 liang. Strategies on exploring the favorable genes of wild rice and developing super hybrid rice based on whole 鄄 genome knock 鄄 in mutant library[j]. Molecular Plant Breed 鄄

3M6 XES3 鄄 5D3 XES3 鄄 1F17 由于与粳稻有多处匹配, 无法精确定位.

5 484 生命科学研究圆园 10 年 ing),2005,3(6):869 鄄 876. [2] CLARK AJ,MARGULIES AD. Isolation and characteriza 鄄 tion of recombination 鄄 deficient mutants of Escherichia Coli K12[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1965,53(2):451 鄄 459. [3] ROCA AI,COX MM. RecA protein:structure,function, and role in recombinational DNA repair[j]. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology,1997,56(1): 129 鄄 223. [4] ROBERTS JW,ROBERTS CW,CRAIG NL. Escherichia coli reca gene product inactivates phage lambda repressor[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1978, 75(10):4714 鄄 [5] SHIBATA T,DASGUPTA C,CUNNINGHAM R P,et al. Purified Escherichia coli reca protein catalyzes homologous pairing of superhelical DNA and single 鄄 stranded fragments[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1979, 76(4):1638 鄄 [6] 刘继梅, 程在全, 杨明挚, 等. 云南三种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析 [J]. 中国农业科学 (LIU Ji 鄄 mei,cheng Zai 鄄 quan,yang Ming 鄄 zhi,et al. Cloning and sequence analysis of disease resistance gene analogues from three wild rice species in Yunnan[J]. Sinica),2003,36(3):273 鄄 280. Scientia Agricultura [7] 张凤娟, 张满良, 朱水芳. 一种改进的水稻总 DNA 的快速提取方法 [J]. 植物检疫 (ZHANG Feng 鄄 juan,zhang Man 鄄 liang,zhu Shui 鄄 fang. An improved rapid method of plant total DNA extraction[j]. Plant Quarantine),2004,18(6): 330 鄄 332. [8] 陶小平, 李磊, 李强, 等. 优化茵落原位杂交体系筛选野生稻基因组文库 [J]. 生命科学研究 (TAO Xiao 鄄 ping,li Lei,LI Qiang,et al. Optimized colony in situ hybridization system for screening wild rice genomic library[j]. Life Science Research),2008,12(4):328 鄄 332. [9] RIGAS B,WELCHER A A,WARD D C,et al. Rapid plasmid library screening using RecA 鄄 coated biotinylated probes[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1986,83(24):9591 鄄 [10] HONIGBERG SM,RAO BJ,RADDING CM. Ability of RecA to promote asearch for rare sequences in duplex DNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1986,83(24):9586 鄄 [11] TAIDI 鄄 LASKOWSKI B,TYAN D,HONIGBERG SM,et al. Use of RecA protein to enrich for homologous genes in a genomic library[j]. Nucleic Acids Research,1988,16(16): 8157 鄄 [12] HAKVOORT TB,SPIJKERS JA,VERMEULEN JL,et al. Preparation of a differentially expressed,full 鄄 length cdna expression Library by RecA 鄄 mediated triple 鄄 strand formation with subtractively enriched cdna Fragments[J]. Acids Research,1996,24(17):3478 鄄 Nucleic [13] ZHUMABAYEVA B,CHENCHIK A,SIEBERT PD. RecA 鄄 mediated affinity capture: a method for full 鄄 length cdna cloning[j]. Biotechniques,1999,27(4):834 鄄 838. [14] HASEGAWA Y,FUKUDA S,SHIMOKAWA K,et al. A RecA 鄄 mediated exon profiling method[j]. search,2006,34(13):e97. Nucleic Acids Re 鄄 [15] 曹孟良, 李磊, 韩小霞, 等. 野生稻基因组抗性基因富集文库的构建 [J]. 杂交水稻 (CAO Meng 鄄 liang,li Lei,HAN Xiao 鄄 xia,et al. The construction of wild rice genomic enrich 鄄 ment library of resistant genes[j]. (6):52 鄄 57. Hybrid Rice),2008,23 [16] REDDY APK. Bacterial Blight of Rice [M]. Manila:Inter 鄄 national Rice Research Institute, 鄄 12. [17] BAKER B, ZAMBRYSKI P, STASKAWICZ B, et al. Signaling in plant 鄄 microbe interactions[j]. 276(5313):726 鄄 733. Science,1997,

Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology,1997,56(1): 129 鄄 223. [4] ROBERTS JW,ROBERTS CW,CRAIG NL. Escherichia coli reca gene product inactivates phage lambda repressor[j].

供试材料试验试剂和仪器基因组提取分析方法反应体系最佳配比的筛选退火温度对扩增效果的影响

供试材料试验试剂和仪器基因组提取分析方法反应体系最佳配比的筛选退火温度对扩增效果的影响生物技术通报胡立敏陶兴林侯栋朱惠霞张东琴选取温敏花椰菜不育系与杂交组合的高可育和高不育单株构建基因池利用对随机引物对其进行标记同时采用正交设计对其反应体系及扩增条件进行优化试验结果表明在反应体系中含引物