1068 WORLDCHINESEMEDICINE August.2014,Vol.9,No.8 中 图 分 类 号 :R287;R587.2 文 献 标 识 码 :A doi: /j.isn 糖 尿 病 肾 病 (DiabeticNephro

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1 世界中医药 年 8月第 卷第 8期 降糖三黄片对早期糖尿病肾病大鼠肾组织 TGF β S m 信号通路的影响 江 丹 吴 伟 林明欣3 朱章志 广东省第二中医院广州 广州中医药大学广州 3 3中国中医科学院北京 广州中医药大学第一附属医院广州 摘要 目的 观察降糖三黄片对早期糖尿病肾病大鼠肾组织中转化生长因子 β TGF β S m C Ⅳ的影响探讨其对 肾脏的保护作用 方法 将 8 只 S D大鼠随机分为正常组 只 造模组 只 腹腔内注射链脲佐菌素 S TZ 复制糖尿病肾病 大鼠模型 造模成功的大鼠随机进一步分为模型组 厄贝沙坦组 给药量 降糖三黄片组 给药量 给药 8周后处死 于治疗前 模后 周 8周各组大鼠测血糖 称体重 造模成功后 实验结束前收集 尿液测 m Ⅳ型胶原 定尿微量白蛋白 实验结束后摘取肾脏去包膜称重 分别用免疫组化染色法及荧光定量 RT PCR法检测 C Ⅳ 用双抗体夹心法 ELAS A 检测肾组织 TGF β 结果 造模后各组大鼠体重明显减轻降糖三黄片 厄贝沙坦与模 型组比较肾重 体重指数下降 P 降糖三黄片 厄贝沙坦与模型组比较尿微量白蛋白水平下降 P 降糖三黄 片与模型组 厄贝沙坦组相比能较好地降低血糖 P 降糖三黄片 厄贝沙坦均能明显抑制糖尿病肾病大鼠肾组织中 TGF β的表达 P 免疫组化染色表明厄贝沙坦组和降糖三黄片组比模型组 m C Ⅳ阳性表达程度显著减弱 免疫组化图像染色指数及荧光定量 RT PCR法结果提示降糖三黄片能降低 m C Ⅳ水平 P 且与厄贝沙坦作 用相近 结论 降糖三黄片可通过抑制肾组织 TGF β m 通路的表达降低 C Ⅳ的沉积使肾脏的异常结构得到改善 延缓肾小球硬化 关键词 糖尿病肾病 降糖三黄片 转化生长因子 β S m 通路 C Ⅳ E J T TGF Sm S P K T R w E D N β J D WW L M 3Z Z G S T M H G C G U C M G C 3C A m C M S B j C T F A H G U C M G C A Oj T J J H w m C β TGF β S Ⅳ M E S D w m m m T m w w S TZ 3 m T m w DN I J H T m 8w R w w w 8w M m w DNm w W w m I mm m q RT PCRw m m C Aw m TGF A w m m J H ⅣELAS βr I w w P mm m P m DN J H T I DN P J H I TGF T m C β P Ⅳ m DN w m mm m m w J H I P A q RT PCR J H m C w I C J H TGF m C Ⅳ β Ⅳ m K W D J TGF S m C β Ⅳ 基金项目 国家中医药管理局 十一五 重点专科课题 编号 BAI B 通信作者 朱章志广东省广州市机场路 号广州中医药大学第一附属医院内分泌科邮编 电话 3 3 8E m m 林明欣北京市东城区东直门内南小街 号中国中医科学院中国医史文献研究所邮编 电话 E m m m

2 1068 WORLDCHINESEMEDICINE August.2014,Vol.9,No.8 中 图 分 类 号 :R287;R587.2 文 献 标 识 码 :A doi: /j.isn 糖 尿 病 肾 病 (DiabeticNephropathy,DN) 是 糖 尿 病 主 要 的 微 血 管 并 发 症 之 一, 糖 尿 病 病 程 25 年 以 上 患 者 中 DN 的 累 积 患 病 率 为 25% ~40% [1] DN 是 导 致 终 末 期 肾 病 (EndStageRenalDisease,ESRD) 的 重 要 原 因, 已 经 严 重 威 胁 糖 尿 病 患 者 的 生 命 健 康 ESRD 需 要 透 析 治 疗, 在 欧 洲 发 达 国 家 20% ~40% 的 糖 尿 病 患 者 最 终 发 展 为 DN, 成 为 透 析 治 疗 患 者 的 首 要 原 因 [2] 虽 然 DN 的 发 病 机 制 非 常 复 杂, 但 是 学 界 对 于 DN 肾 脏 病 变 的 发 生 和 发 展 与 一 些 细 胞 因 子 和 生 长 因 子 作 用 密 切 相 关 的 学 说, 已 基 本 取 得 了 共 识 在 生 长 因 子 和 细 胞 因 子 中 作 用 最 为 突 出 的 是 转 化 生 长 因 子 -β1(trans forminggrowthfactor-β1,tgf-β1), 它 能 够 调 节 细 胞 及 基 质 生 长 分 化, 刺 激 细 胞 外 基 质 (Extracelular Matrix,ECM) 的 分 泌 Smads 家 族 蛋 白 是 将 TGF-β 信 号 从 细 胞 表 面 受 体 转 导 至 细 胞 核 的 过 程 中 起 关 键 作 用 的 蛋 白 TGF-β/Smad 信 号 通 路 最 终 会 形 成 低 聚 体 复 合 物, 激 活 核 内 ECM 成 分 如 各 型 胶 原 Col-Ⅰ Col-Ⅳ 纤 维 粘 连 蛋 白 (FN) 等 启 动 子 的 活 性, 从 而 增 加 ECM 合 成, 导 致 肾 纤 维 化 降 糖 三 黄 片 以 桃 核 承 气 汤 为 底 方, 加 黄 芪 生 地 黄 玄 参 麦 冬 等 药 物 组 成, 具 有 益 气 养 阴 泄 热 逐 瘀 的 作 用, 对 2 型 糖 尿 病 及 其 并 发 症 具 有 一 定 的 疗 效 在 对 糖 尿 病 多 种 慢 性 并 发 症 的 研 究 中, 本 课 题 组 发 现 加 味 桃 核 承 气 汤 能 改 善 DN 患 者 糖 脂 代 谢 紊 乱, 减 少 24 h 尿 蛋 白 排 泄 量 提 高 内 生 肌 酐 清 除 率 [3], 减 轻 或 延 缓 糖 尿 病 鼠 肾 小 球 毛 细 血 管 基 底 膜 的 增 厚 [4] 降 糖 三 黄 片 能 改 善 胰 岛 素 抵 抗 降 低 DN 大 鼠 尿 蛋 白 AngⅡ 含 量, 抑 制 DN 大 鼠 PKC [5] 和 TGF-β1 的 过 度 表 达 [6], 从 而 减 少 肾 小 球 ECM 的 积 聚, 起 到 保 护 肾 脏 的 作 用 本 研 究 的 目 的 是 通 过 大 鼠 实 验 观 察 降 糖 三 黄 片 对 血 糖 24h 尿 微 白 蛋 白 ;TGF-β1 Smad1 Co1-Ⅳ 的 影 响, 以 进 一 步 研 究 其 对 ECM 的 影 响 及 机 制, 为 该 方 对 DN 的 临 床 运 用 提 供 更 加 充 分 的 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1 1 实 验 药 品 试 剂 及 仪 器 降 糖 三 黄 片 为 广 州 中 医 药 大 学 院 内 制 剂 ( 批 号 : 粤 药 制 字 Z ); 厄 贝 沙 坦 片 ( 赛 诺 菲 杭 州 制 药 有 限 公 司, 进 口 药 品 注 册 证 号 : H ); 链 脲 佐 菌 素 (Streptozin,STZ, 美 国 Sigma 公 司 ); 配 制 ph4 2,0 1mmol/L 柠 檬 酸 - 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 葡 萄 糖 试 剂 盒 ( 上 海 科 欣 生 物 技 术 研 究 所 ); TGF-β1 采 用 ELASA 试 剂 盒 ( 上 海 西 唐 生 物 科 技 有 限 公 司 ) 尿 微 量 白 蛋 白 用 全 自 动 生 化 分 析 仪 测 定 ; Smad1pAb 抗 体 试 剂 盒 (Bioword 技 术 公 司 );Anti- Smad3Antibody 试 剂 盒 Anti-ColagenⅠ Antibody 试 剂 盒 及 Anti-ColagenⅣ antibody 试 剂 盒 (Abcam 技 术 公 司 );DAB 显 色 液 UltraSensitive TM S-P 超 敏 试 剂 盒 ( 福 建 迈 新 生 物 技 术 开 发 有 限 公 司 ) TRIzol( 批 号 : 28223) M -MLV FirstStrandKit( 批 号 : ) Platinum SYBR GreenqPCRSuperMix-UDG( 批 号 : ) 均 由 美 国 Invitrogen 公 司 提 供 特 异 性 引 物 ( 上 海 英 潍 捷 基 贸 易 有 限 公 司 ) IQ TM 5 型 荧 光 定 量 PCR 仪 SmartSpecPlus 核 酸 蛋 白 测 定 仪 ( 美 国 Bio- Rad 公 司 ) MiliQPlus 超 级 纯 水 仪 ( 美 国 Milipore 公 司 ) BX51 型 光 学 显 微 镜 ( 日 本 Olympus) MSHOT 数 码 成 像 系 统 (MC-20, 广 州 市 明 美 光 电 技 术 有 限 公 司 ) MIAS 医 学 图 像 分 析 管 理 系 统 ( 北 京 航 空 航 天 工 业 大 学 ) 1 2 DN 动 物 模 型 的 复 制 SPF 级 SD 大 鼠 80 只, 雌 雄 各 半, 体 重 180~220g, 由 广 东 省 医 学 实 验 动 物 中 心 提 供 饲 养 于 广 东 省 中 医 药 工 程 技 术 研 究 院 SPF 级 动 物 实 验 室, 温 度 21~24, 湿 度 50% ~70%, 雌 雄 分 笼 饲 养, 每 笼 4~5 只 ; 喂 食 SPF 级 鼠 饲 料, 饮 用 无 菌 水 适 应 性 喂 养 2 周 后, 按 随 机 数 字 表 分 为 2 组, 空 白 对 照 组 ( 正 常 组 )11 只, 造 模 组 69 只 造 模 前 禁 食 12h, 造 模 组 按 30mg/kg 剂 量 腹 腔 内 注 射 STZ, 正 常 组 腹 腔 内 注 射 等 量 柠 檬 酸 缓 冲 液 72h 后 各 组 大 鼠 眼 眶 静 脉 采 血 测 定 空 腹 血 糖 (FBG) 16 7mmol/L, 且 出 现 多 饮 多 尿 多 食 现 象, 确 认 为 2 型 糖 尿 病 模 型 继 续 喂 养 8 周 至 出 现 糖 尿 病 大 鼠 的 肾 损 害 ( 电 镜 结 果 为 证 ) 1 3 分 组 给 药 及 喂 养 造 模 成 功 的 大 鼠 按 随 机 数 字 表 进 一 步 分 为 模 型 组 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 灌 胃 前 用 纯 净 水 配 制 成 1mL 混 悬 液 配 制 药 品 ( 实 验 动 物 与 人 用 药 量 换 算 公 式 : 大 鼠 用 量 = 生 药 量 ) 厄 贝 沙 坦 组 0 027g kg -1 d -1 剂 量 灌 胃,1 次 / d; 降 糖 三 黄 片 组 0 675g kg -1 d -1 的 剂 量 灌 胃,1 次 /d; 正 常 组 及 模 型 组 灌 服 等 剂 量 蒸 馏 水 给 药 8 周 后 处 死 中 途 死 亡 或 不 符 合 条 件 不 列 入 统 计 分 析, 共 35 只 大 鼠 完 成 实 验, 正 常 组 10 只, 模 型 组 8 只, 厄 贝 沙 坦 组 9 只, 降 糖 三 黄 片 组 8 只 1 4 观 察 指 标 一 般 生 化 指 标 检 测 分 别 在 治 疗 前 给 药 后 4 周 8 周 处 死 前 称 体 重 和 眼 眶 静 脉 窦 采 血 检 测 葡 萄 糖 于 DN 造 模 成 功 后 处 死 前, 分 别 用 代 谢 笼 收 集 24h 尿 液 计 算 尿 微 量 蛋 白 排 泄 量 处 死 后 摘 取 肾 脏, 右 侧 肾

3 世 界 中 医 药 2014 年 8 月 第 9 卷 第 8 期 1069 脏 去 包 膜 称 重, 计 算 肾 重 / 体 重 指 数 ( 肾 重 体 重 100%) 取 左 侧 肾 脏 一 部 分, 用 10% 甲 醛 固 定, 常 规 脱 水, 石 蜡 包 埋, 切 片, 以 便 进 行 免 疫 组 化 分 析 ; 另 一 部 分 置 -80 冰 箱 中 保 存 备 用 测 定 肾 组 织 TGF-β1 含 量 取 部 分 大 鼠 肾 组 织, 采 用 双 抗 体 夹 心 ELASA 法 测 定 TGF-β1 含 量 计 算 OD 值, 使 用 软 件 作 图, 根 据 样 品 OD 值 计 算 出 相 应 TGF-β1 含 量 本 次 实 验 TGF-β1 公 式 :R2= ,y=-7E-08x x 检 测 肾 组 织 Smad1 Col-Ⅳ 免 疫 组 化 染 色 表 达 取 石 蜡 切 片, 用 二 步 法 免 疫 组 化 染 色 检 测 肾 组 织 Smad1 Col-Ⅳ 表 达 取 200 倍 显 微 镜 视 野, 以 出 现 棕 黄 色 颗 粒 为 阳 性 性 号, 用 MIAS 医 学 图 像 分 析 管 理 系 统 进 行 统 计 分 析 荧 光 定 量 RT-PCR 法 检 测 肾 组 织 Smad1 Col -Ⅳ 基 因 表 达 量 取 肾 组 织 100mg, 液 氮 下 研 磨, 然 后 加 入 1mLTRIzol 试 剂, 混 匀 后 转 移 到 1 5mL 离 心 管 中, 在 室 温 下 放 置 5min 然 后 在 4 下 12000r/min, 离 心 10min 取 出 上 清 液, 转 入 新 的 1 5mL 离 心 管 中, 加 入 1/5 体 积 的 氯 仿, 用 力 混 匀 2min,4 下 r/min, 离 心 10min 上 清 液 转 移 到 新 的 1 5mL 离 心 管, 加 入 等 体 积 异 丙 醇, 放 入 -20 冰 箱 静 置 0 5 h 取 出 后 在 4 下 12000r/min, 离 心 10min 弃 上 清, 沉 淀 用 1mL75% 的 乙 醇 洗 涤 2 次 后, 在 室 温 下 干 燥 10min 最 后 用 200μL 灭 菌 超 纯 水 溶 解 沉 淀, 并 且 用 核 酸 蛋 白 测 定 仪 测 定 OD 260 /OD 280 比 值, 算 出 RNA 的 浓 度 和 纯 度 反 转 录 的 操 作 按 照 Invitrogen 公 司 M- MLVFirstStrandKit 提 供 的 实 验 方 法 进 行, 加 入 上 述 提 取 的 总 RNA, 合 成 第 一 链 cdna 根 据 GenBank 提 供 的 基 因 序 列 设 计 特 异 性 引 物, 引 物 设 计 利 用 Primer5 0 和 BeaconDesigner7 91 生 物 软 件, 用 于 扩 增 内 参 18S (GenBankAccesionno M11188) 以 及 Col-I(GenBank Accesionno NM_053304),Col-IV(GenBankAcces sionno NM_ ),Smad1(GenBankAccesion no NM_013130),Smad3(GenBankAccesionno NM_ ) 设 计 的 引 物 序 列 如 下 :18S 引 物 :R(5-3 ): CAGACTTGCCCTCCA F(5-3 ):ACGGCTACCA CATCC;Col-I 引 物 :F(5-3 ):CGATGGCGTGCTAT GC R(5-3 ):ACTTCTGCGTCTGGTGATA;Col-IV 引 物 :F(5-3 ):TACCTCACTGTCCACTATG R(5-3 ): CTGTCTGTCCTTCTCCTT;Smad1 引 物 :F(5-3 ):CGT GTTGGTGGATGGT R(5-3 ):GATGTGTCGCCTGG TAT;Smad3 引 物 :F(5-3 ):ACTACAGCCATTCCAT R (5-3 ):TTCTCCATCTTCACTCA 基 因 表 达 的 检 测 按 照 所 示 组 分 进 行 添 加, 然 后 放 入 荧 光 定 量 PCR 仪 进 行 反 应 将 上 述 反 应 混 合 物 放 入 PCR 仪 进 行 扩 增 步 骤 1:94 5min; 步 骤 2:94 30s 55 30s 72 50s(45 个 循 环 ); 步 骤 3:72 7min 每 组 10 个 样 品, 分 别 取 1μL 作 为 cnda 模 板 扩 增, 运 用 2 - Ct 法 计 算 各 组 基 因 相 对 表 达 量 具 体 计 算 公 式 为 : F=2-[( 待 测 组 目 的 基 因 平 均 Ct 值 - 待 测 组 内 参 基 因 平 均 Ct 值 )-( 对 照 组 目 的 基 因 平 均 Ct 值 - 对 照 组 内 参 基 因 平 均 Ct 值 )] 1 5 统 计 学 方 法 采 用 SPSS13 0 软 件 包 分 析 系 统, 实 验 所 得 数 值 以 均 数 加 减 标 准 差 ( x±s) 珋 表 示 多 组 间 均 值 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 或 重 复 测 量 设 计 的 方 差 分 析 若 方 差 齐, 组 间 均 值 两 两 比 较 采 用 LSD 法 ; 若 方 差 不 齐, 改 用 DunnetT3 检 验,α= 结 果 2 1 一 般 生 化 指 标 比 较 血 糖 比 较 : 治 疗 前 及 治 疗 后 第 4 周, 正 常 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P <0 01); 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 正 常 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01) 治 疗 后 第 8 周, 正 常 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01), 厄 贝 沙 坦 组 与 模 型 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 降 糖 三 黄 片 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01) 表 明 STZ 造 模 后 各 组 血 糖 明 显 升 高, 但 相 对 于 模 型 组 厄 贝 沙 坦 组, 表 明 降 糖 三 黄 片 能 一 定 程 度 降 低 血 糖, 减 轻 高 糖 毒 性 ( 见 表 1) 表 1 各 组 大 鼠 治 疗 前 后 血 糖 比 较 ( 珋 x±s) 血 糖 (mmol/l) 组 别 例 数 治 疗 前 4 周 8 周 正 常 ± ± ±1 28 模 型 ± ± ±5 51 厄 贝 沙 坦 ± ± ±6 14 降 糖 三 黄 片 ± ± ±5 09 F 值 P 值 注 : 两 两 比 较 用 DunnetT3 检 验 与 模 型 组 相 比, P<0 01; 与 厄 贝 沙 坦 比 较, P<0 01 治 疗 前 各 组 体 重 比 较, 差 异 无 统 计 学 意 义 (P> 0 05) 造 模 后 4 周 8 周 体 重 比 较 : 正 常 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01); 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P> 0 05) 降 糖 三 黄 片 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 肾 重 / 体 重 指 数 比 较 : 正 常 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具

4 1070 WORLDCHINESEMEDICINE August.2014,Vol.9,No.8 有 统 计 学 意 义 (P<0 01), 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05), 降 糖 三 黄 片 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P> 0 05) 肾 重 / 体 重 指 数 比 增 大 表 明 造 模 后 各 组 大 鼠 均 有 存 在 肾 肥 大 肾 损 伤 的 情 况, 降 糖 三 黄 片 与 厄 贝 沙 坦 同 样 具 有 减 轻 肾 脏 肥 大 的 作 用 ( 见 表 2) 组 别 例 数 表 2 各 组 大 鼠 治 疗 前 后 体 重 肾 重 / 体 重 指 数 比 较 ( 珋 x±s) 体 重 (g) 造 模 前 造 模 后 4 周 8 周 肾 重 (g) 肾 重 / 体 重 正 常 ± ± ± ± ± 模 型 ± ± ± ± ± 厄 贝 沙 坦 ± ± ± ± ± 降 糖 三 黄 片 ± ± ± ± ± F 值 P 值 注 : 体 重 用 两 两 比 较 用 LSD 法 肾 重 / 体 重 指 数 用 两 两 比 较 用 DunnetT3 检 验 与 模 型 组 相 比, P<0 01; 与 厄 贝 沙 坦 比 较, P<0 01 治 疗 前 各 组 尿 微 量 白 蛋 白 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 治 疗 后 第 8 周, 正 常 组 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P< 0 01 或 P<0 05), 正 常 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01), 降 糖 三 黄 片 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05) 表 明 降 糖 三 黄 片 能 有 效 降 低 早 期 DN 大 鼠 尿 微 量 白 蛋 白, 从 而 保 护 肾 功 能, 且 疗 效 与 厄 贝 沙 坦 片 接 近 ( 见 表 3) 表 3 各 组 大 鼠 治 疗 前 后 尿 微 量 白 蛋 白 比 较 ( 珋 x±s) 尿 微 量 白 蛋 白 (mg/24h) 组 别 例 数 治 疗 前 8 周 正 常 ± ±22 53 模 型 ± ± 厄 贝 沙 坦 ± ± 降 糖 三 黄 片 ± ±87 31 F 值 P 值 注 : 两 两 比 较 用 LSD 法 与 模 型 组 相 比, P<0 05, P<0 01; 与 厄 贝 沙 坦 比 较, P< 测 定 肾 组 织 TGF-β1 含 量 治 疗 后 第 8 周, 正 常 组 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 TGF-β1 含 量 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01) 正 常 组 模 型 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P< 0 01); 降 糖 三 黄 片 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P>0 05)( 见 表 4) 2 3 检 测 肾 组 织 Smad1 Col-Ⅳ 免 疫 组 化 染 色 表 达 光 镜 下 免 疫 组 化 染 色 显 示 smad1 阳 性 表 达 部 位 为 肾 小 管 上 皮 细 胞 胞 质 正 常 组 呈 弱 阳 性 表 达 ( 见 图 1A); 模 型 组 呈 阳 性 表 达 增 强, 阳 性 颗 粒 为 棕 黄 色 ( 见 图 1B); 厄 贝 沙 坦 组 和 降 糖 三 黄 片 组 比 模 型 组 阳 性 表 达 程 度 显 著 减 弱 ( 见 图 1C 图 1D) Smad1 染 色 指 数 比 较 : 正 常 组 模 型 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01 或 P<0 05) 正 常 组 模 型 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01 或 P<0 05); 降 糖 三 黄 片 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 08)( 见 表 4) 图 1A 正 常 组 图 1B 模 型 组 图 1C 厄 贝 沙 坦 组 图 1D 降 糖 三 黄 片 组 图 1 肾 组 织 Smad1 光 镜 下 免 疫 组 化 染 色 显 示 Col-Ⅳ 阳 性 表 达 部 位 为 肾 小 球 毛 细 血 管 和 肾 小 管 基 底 膜 正 常 组 呈 阳 性 表 达 ( 见 图 2A); 模 型 组 阳 性 表 达 增 强, 阳 性 颗 粒 为 棕 黄 色 ( 见 图 2B); 厄 贝 沙 坦 组 和 降 糖 三 黄 片 组 比 模 型 组 阳 性 表 达 程 度 减 弱 ( 见 图 2C 图 2D) 图 2A 正 常 组 图 2B 模 型 组 图 2C 厄 贝 沙 坦 组 图 2D 降 糖 三 黄 片 组 图 2 免 疫 组 化 染 色 表 达 表 4 各 组 大 鼠 治 疗 后 TGF-β1 含 量 Smad1 染 色 指 数 组 别 例 数 TGF-β1(pg/mg) 正 常 Col-Ⅳ 染 色 指 数 比 较 ( 珋 x±s) 染 色 指 数 = 平 均 光 密 度 值 面 密 度 值 Smad1 Col-Ⅳ ± ± ± 模 型 ± ± ± 厄 贝 沙 坦 ± ± ± 降 糖 三 黄 片 ± ± ± F 值 P 值 注 : 两 两 比 较 用 LSD 法 与 模 型 组 相 比, P<0 05, P<0 01; 与 厄 贝 沙 坦 比 较, P<0 05, P<0 01 Col-Ⅳ 染 色 指 数 比 较 : 正 常 组 模 型 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01 或 P<0 05) 正 常 组 模 型 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01 或 P<0 05); 降 糖 三 黄 片 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0 076)( 见

5 世 界 中 医 药 2014 年 8 月 第 9 卷 第 8 期 1071 表 4) 3 讨 论 TGF-β 的 分 布 有 一 定 的 组 织 特 异 性, 肾 脏 以 TGF-β1 为 主, 主 要 在 肾 小 管 上 皮 细 胞, 其 次 是 肾 小 球 TGF-β1 可 直 接 刺 激 FN Col-Ⅰ 型 和 Col-Ⅳ 的 形 成, 体 外 细 胞 培 养 表 明 持 续 或 间 断 的 高 糖 环 境 可 促 使 TGF-β1 的 产 生 和 活 化,TGF-β1 可 诱 导 I Ⅲ Ⅳ 型 胶 原 及 FN 的 表 达 [7] 此 外,TGF-β1 还 能 破 坏 肾 小 球 滤 过 屏 障, 参 与 炎 性 反 应 组 织 修 复, 促 使 肾 小 球 硬 化 和 肾 间 质 纤 维 化, 而 这 正 是 DN 肾 脏 损 害 的 基 本 病 理 机 制 [8] 本 实 验 结 果 显 示 : 造 模 后 各 组 TGF -β1 与 正 常 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P< 0 01), 正 常 组 模 型 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比 差 异 具 有 统 计 学 意 义 (P<0 01); 表 明 STZ 造 模 后 大 鼠 TGF -β1 含 量 增 加, 而 降 糖 三 黄 片 厄 贝 沙 坦 均 能 明 显 抑 制 DN 大 鼠 肾 组 织 中 TGF-β1 的 表 达, 与 既 往 研 究 结 果 一 致 [3] Smads 家 族 蛋 白 是 参 与 TGF-β 超 家 族 在 细 胞 内 信 号 转 导 的 一 组 蛋 白 质, 迄 今 为 止, 在 哺 乳 动 物 已 经 分 离 鉴 定 的 Smad 蛋 白 有 9 种 Smads 家 族 按 功 能 可 分 成 3 类 [9] :1) 受 体 活 化 性 或 通 路 限 制 性 Smad(R- Smads), 由 于 可 以 由 活 性 的 TβR 激 活 发 生 磷 酸 化 而 得 名, 是 专 门 转 导 TGF-β 家 族 中 某 条 信 号 通 路 的 Smad;2) 共 配 偶 体 Smad, 它 是 TGF-β 族 各 类 信 号 转 导 过 程 中 共 同 需 要 的 介 质 ;3) 抑 制 性 Smad, 它 们 也 可 与 Ⅰ 型 受 体 结 合, 结 合 反 应 的 稳 定 性 比 受 体 激 活 型 Smad 更 强, 因 而 限 制 受 体 激 活 型 Smad 被 磷 酸 化, 抑 制 信 号 转 导 过 程 其 中 Smad1 作 为 R-Smads, 参 与 BMP 信 号 转 导, 影 响 Col-Ⅳ 表 达 [10] Matsubara [11] 等 在 体 外 证 实 了 高 糖 状 态 下 Smad1 能 够 转 录 调 节 Col-Ⅳ 的 表 达 ; 同 时 证 实,STZ 诱 导 的 糖 尿 病 大 鼠 在 24 周 时 表 现 出 程 度 不 等 的 肾 小 球 硬 化 ; 通 过 Western blot 和 免 疫 组 化 检 测 及 相 关 性 分 析 证 实 大 鼠 肾 小 球 Smad1 的 表 达 水 平 与 肾 小 球 硬 化 的 程 度 呈 明 显 正 相 关, 且 与 肾 小 球 Col-Ⅳ 和 α 平 滑 肌 肌 动 蛋 白 (α- SMA) 的 表 达 密 切 相 关 本 实 验 治 疗 后 第 8 周 smad1 基 因 表 达 量 比 较 : 模 型 组 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 正 常 组 相 比 有 升 高 (P<0 05), 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 比 较 降 低 (P<0 05) 降 糖 三 黄 片 组 与 厄 贝 沙 坦 组 相 比,P=0 08, 虽 无 统 计 学 意 义, 但 分 析 数 据 考 虑 接 近 0 05, 可 能 与 实 验 例 数 过 少 有 关, 若 增 大 例 数 重 新 统 计, 可 能 有 统 计 学 意 义 Col-Ⅳ 是 构 成 ECM 的 重 要 生 化 成 分, 也 是 肾 小 球 基 底 膜 (GlomerularBasementMembrane,GBM) 的 主 要 构 成 蛋 白, 约 占 GBM 干 体 质 量 的 50%, 可 决 定 GBM 的 强 度 及 孔 径 选 择 性, 故 Ⅳ -C 合 成 和 降 解 异 常 势 必 影 响 肾 脏 结 构 与 功 能,DN 时 肾 脏 的 Ⅳ -C 表 达 增 加 [12] Ziyadeh 等 证 实 体 外 高 糖 培 养 的 肾 近 曲 小 管 细 胞 和 系 膜 细 胞 均 有 TGF-β1mRNA 表 达 及 生 物 活 性 增 加, 同 时 分 泌 col-Ⅰ 及 col-Ⅳ 增 多, 这 种 变 化 能 被 抗 TGF-β1 抗 体 抑 制 [13] 本 实 验 治 疗 后 第 8 周 Col -Ⅳ 基 因 表 达 量 比 较 : 模 型 组 厄 贝 沙 坦 组 降 糖 三 黄 片 组 与 正 常 组 相 比 有 升 高 (P<0 05), 厄 贝 沙 坦 组 与 模 型 组 比 较 降 低 有 统 计 学 意 义 (P<0 05); 降 糖 三 黄 片 组 与 模 型 组 相 比 有 下 降,P=0 076, 虽 无 统 计 学 意 义, 但 分 析 数 据 考 虑 接 近 0 05, 可 能 与 实 验 例 数 过 少 有 关, 若 增 大 例 数 重 新 统 计, 可 能 有 统 计 学 意 义 中 医 认 为 糖 尿 病 早 期 常 有 多 饮 多 食 多 尿 大 便 干 结 或 便 秘 等 胃 肠 燥 热 的 症 状 发 展 至 早 期 DN 时, 因 大 量 蛋 白 从 尿 中 丢 失, 出 现 尿 浊 ( 蛋 白 尿 ); 除 此, 多 伴 有 血 脂 代 谢 紊 乱 疲 倦 肢 麻 等 表 现 早 期 DN 病 机 以 气 阴 两 虚 为 本, 胃 肠 燥 热 为 标, 兼 夹 痰 湿 瘀 浊 [14] 从 伤 寒 论 六 经 辨 证, 提 出 DN 当 属 五 行 中 的 土 病 及 水 病, 因 胃 属 于 阳 明, 肾 属 于 少 阴 为 阳 明 少 阴 病 热 证, 宜 破 血 下 瘀, 急 下 存 少 阴 之 津, 以 求 泻 土 布 津 因 降 糖 三 黄 片 具 有 益 气 养 阴 泄 热 逐 瘀 的 作 用, 故 用 于 早 期 DN 治 疗 研 究 结 果 表 明 降 糖 三 黄 片 具 有 明 显 降 低 血 糖 尿 微 量 白 蛋 白 的 作 用, 与 既 往 采 用 加 味 桃 核 承 气 汤 水 煎 剂 灌 胃 治 疗 的 结 论 一 致 [3] 降 糖 三 黄 片 还 可 通 过 抑 制 肾 组 织 TGF-β1/smad1 通 路 的 表 达, 降 低 Col-Ⅳ 的 沉 积, 使 肾 脏 的 异 常 结 构 得 到 改 善, 降 低 肾 重 / 体 重 指 数 比, 延 缓 肾 小 球 硬 化 推 测 降 糖 三 黄 片 可 能 是 通 过 改 善 糖 脂 代 谢 紊 乱, 降 低 肾 组 织 AngⅡ 水 平 [5] ; 同 时, 通 过 增 加 胰 岛 素 敏 感 性 [15], 降 低 血 糖, 减 少 AGEs 沉 积, 从 而 抑 制 TGF-β1 表 达, 抑 制 肾 小 管 细 胞 肥 大 及 肾 间 质 成 纤 维 细 胞 合 成 ECM, 达 到 保 护 肾 功 能 延 缓 DN 发 展 的 目 的 这 一 结 论 是 对 降 糖 三 黄 片 疗 效 的 肯 定, 为 临 床 应 用 降 糖 三 黄 片 治 疗 早 期 DN 提 供 了 分 子 生 物 学 理 论 依 据 参 考 文 献 [1]AtsuhiroIchihara,MariyoSakoda,AsakoMito-Kurauchi,etal.Activa tedproreninasatherapeutictargetfordiabeticnephropathy[j].diabetes ResearchandClinicalPractice,2008,82(1):S63-S66. [2]DronavaliS,DukaI,BakrisGL.Thepathogenesisofdiabeticnephropa thy[j].jnatclinpractendocrinolmetab,2008,4(8): [3] 王 廷 春, 范 冠 杰, 欧 翠 柳. 加 味 桃 核 承 气 汤 治 疗 糖 尿 病 肾 病 138 例 临

6 WORLDCHI NES EMEDI CI NE A V N 8 床观察 国医论坛 熊曼琪苗理平加 味桃 核承气汤 对糖尿 病鼠肾 超微结 构的 影响 中国医药学报 陈云李赛美王保华降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠肾组织蛋白激 中医杂志 3 8 8 酶 C和转化生长因子 β的影响 陈云李赛美王保华降糖三黄片对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子 β表达的影 响 广 州 中 医 药 大 学 学 报 P ACS HWR m m m w Am JP 8 3P F 8 8 W Z FNM m m K I 33 马云肖炜候连兵转化生长因子 β信号通路与糖尿病肾病 第二军医大学学报 3 AGE m J B C m M TA HA H E Sm w M m L I 8 3 3 8 LI UYWANGZYI NW S m m m m E A m 3 O SA HT T A m JB C m 8 8 3 苏克雷朱篧郭立中国医大师周仲瑛治疗糖尿病肾病经验 中华中医药杂志 8 8 熊曼琪林安钟朱章志等加味桃核承气汤对Ⅱ型糖尿病大鼠胰 岛素抵抗的 影响 中 国 中西 医 结合 杂 志 3 8 收稿 责任编辑 徐颖 H A T M N I T I V S m 上接第 页 肺或肠病变的程度越加重则肺与肠之间的传变越明 显 肺脏病变程度越重则肠腑病变越重 肠腑病变程 度越重则肺脏病变程度越重 同时 肺 与 大肠 传变引起的病理损伤程度与 原病脏腑的病变时间成正比 肺与大肠之间的传变还 在一定程度上受时间的影响 一般而言原发病变部位 出现病变的时间越长则传变越明显 随着病变时日的 增加肺脏与肠腑的病变出现同步加重 参考文献 惠毅杨宇唐洪屈等从肺病模型大鼠胃肠动力学角度探讨 肺病 及肠 病理传变机制 中国中医基础医学杂志 3 惠毅基于肺病模型大鼠病理形态学及相关调控物质变化探讨 肺病 及肠 病理传变规律及其机制 D 成都 成都中医药大学 3 王佐吴正祥杨九华等白芍总甙对大鼠实验性结肠炎 T 细胞 世界华人消化杂志 8 8 88 相关因子的作用 陈奇中药药理学实验 M 贵阳 贵州人民出版社 3 李鸿涛高思华王柳青等藏象学说中 肺与大肠相表里 内涵及其 在温病辨治中的运用 中医杂志 王娜傅强赵二鹏 肺与大肠相表里 的中西医结合研究进展 辽宁中医杂志 3 8 3 郑旭锐杨宇叶建红等从 肺病 模型大鼠肠道形态学改变探讨 肺与大肠相表里 时珍国医国药 3 8 郑秀丽杨宇王宝家等过敏性哮喘大鼠模型结肠和肺组织 CCK P及 VI P变 化 观 察 中 国 中 西 医 结 合 杂 志 33 3 8 CGRP S 8 郑秀丽杨宇王宝家等从病理状态下肺功能与胃肠功能的变化探 讨 肺与大肠相表里 中华中医药杂志 3 郑旭锐杨宇叶建红等 肺病 模型大鼠肺 肠 S P VI P含量变化 辽宁中医杂志 38 3 的相关性研究 郑秀丽杨宇王宝家等从溃疡性结肠炎大鼠呼吸道与肠道微生 态同步动态变化探讨 肺与大肠相表里 世界中医药 8 郑秀丽杨宇唐洪屈等从肺与大肠的特异相关性探讨 肺与大肠 中华中医药杂志 3 8 相表里 3 郑秀丽杨宇郑旭锐等从肺肠菌群变化的相关性探讨 肺与大肠 中华中医药杂志 3 8 8 相表里 王宝家杨宇唐洪屈等慢性支气管炎大鼠结肠损害与肺肠组织 中 国 中 医 基 础 医 学 杂 志 3 内皮素表达 的 相 关 性 研 究 3 收稿 责任编辑 徐颖

(2015-2016-2)-0004186-04205-1 140242 信 号 与 系 统 Ⅰ 学 科 基 础 必 修 课 37 37 1 教 203 17 周 2016 年 06 月 13 日 (08:00-09:35) (2015-2016-2)-0004186-04205-1 141011

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