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- 矛 苍
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2 前 言 这 本 实 验 教 材 是 为 生 物 科 学 与 生 物 技 术 专 业 的 细 胞 生 物 学 教 学 而 编 写, 适 用 于 该 专 业 五 年 制 本 科 等 学 生 使 用 细 胞 生 物 学 实 验 课 的 教 学 目 的, 主 要 是 通 过 基 本 技 能 训 练 及 观 察 分 析 实 验 结 果, 使 学 生 了 解 掌 握 有 关 的 实 验 技 术 原 理 和 操 作 方 法, 进 而 提 高 学 生 动 手 实 践 观 察 分 析 和 解 决 问 题 的 能 力 基 于 生 物 技 术 专 业 的 学 生 已 完 成 基 本 的 实 验 操 作 训 练, 本 套 实 验 内 容 自 成 体 系, 着 眼 于 提 高 学 生 的 专 业 技 能 训 练, 及 观 察 分 析 问 题 和 科 学 思 维 能 力 的 培 养 全 部 实 验 采 用 活 细 胞 为 材 料, 由 学 生 自 己 动 手 取 材 和 实 验, 使 学 生 能 对 细 胞 获 得 主 动 的 认 识, 选 编 了 生 物 医 学 常 用 的 细 胞 生 物 学 科 研 技 术, 如 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 细 胞 的 冻 存 与 复 苏 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 基 因 表 达 载 体 的 构 建 基 因 的 表 达 与 定 位 检 测 等, 为 学 生 日 后 的 实 际 科 研 工 作 打 下 基 础 全 书 内 容 共 六 个 实 验, 分 三 次 授 课, 共 计 24 学 时, 与 理 论 课 授 课 内 容 相 辅 相 成, 互 为 补 充 所 有 实 验 由 学 生 自 己 动 手 操 作, 少 数 应 用 大 型 精 密 仪 器 的 内 容 进 行 示 教 本 教 材 由 细 胞 生 物 教 研 室 方 瑾 邵 阳 光 张 惠 丹 李 想 刘 芙 蓉 等 教 师 及 教 辅 人 员 参 与 编 写, 均 具 有 丰 富 的 理 论 和 实 验 课 教 学 经 验 由 于 经 验 不 足, 本 教 材 还 有 很 多 亟 需 改 进 之 处, 敬 请 使 用 者 批 评 指 正 中 国 医 科 大 学 细 胞 生 物 教 研 室 2006 年 9 月
3 目 录 实 验 一 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 和 计 数 1 实 验 二 细 胞 的 冻 存 与 复 苏 5 实 验 三 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 7 实 验 四 放 线 菌 素 D 诱 导 HL-60 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 11 实 验 五 含 有 目 的 基 因 真 核 表 达 pegfp-c1 载 体 的 构 建 15 实 验 六 目 的 基 因 在 真 核 系 统 中 的 表 达 及 细 胞 内 的 定 位 24
4 实 验 一 培 养 细 胞 的 形 态 观 察 和 计 数 实 验 目 的 1. 了 解 培 养 中 的 动 物 细 胞 的 一 般 形 态 和 生 长 状 态 2. 掌 握 细 胞 计 数 的 基 本 方 法 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 培 养 中 HeLa 细 胞 NIH3T3 HL60 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 倒 置 显 微 镜 细 胞 计 数 板 普 通 光 学 显 微 镜 乳 头 吸 管 盖 片 3. 试 剂 0.3% 台 盼 兰 染 液 0.25% 胰 蛋 白 酶 -0.02%EDTA 混 合 消 化 液 实 验 原 理 体 外 培 养 的 细 胞 主 要 有 两 种 状 态 一 种 是 能 贴 附 在 培 养 支 持 物 上 的 细 胞, 如 HeLa 细 胞 NIH3T3 等, 叫 贴 壁 型 细 胞, 体 外 培 养 的 细 胞 大 多 属 于 这 种 细 胞 另 一 种 细 胞 并 不 贴 附 在 容 器 的 壁 上, 而 是 悬 浮 在 培 养 液 中 生 长, 如 HL60 细 胞, 叫 做 悬 浮 型 细 胞, 这 类 细 胞 主 要 是 血 液 原 性 或 癌 原 性 细 胞 在 细 胞 生 物 学 的 实 验 中, 往 往 要 进 行 活 细 胞 的 鉴 定 和 细 胞 的 计 数 调 整 细 胞 的 密 度, 是 进 行 实 验 不 可 缺 少 的 一 种 基 本 技 能 实 验 内 容 一 培 养 细 胞 形 态 观 察 1. 将 细 胞 培 养 瓶 从 37ºC 二 氧 化 碳 培 养 箱 ( 或 温 箱 ) 中 取 出, 瓶 口 稍 稍 向 上 倾 斜 以 免 瓶 内 液 体 接 触 瓶 塞 或 流 出 瓶 口, 注 意 观 察 细 胞 培 养 液 的 颜 色 和 清 澈 度 然 后, 将 细 胞 培 养 瓶 平 稳 地 放 在 倒 置 显 微 镜 载 物 台 上 2. 打 开 倒 置 镜 光 源, 用 10X 物 镜 观 察, 通 过 双 筒 目 镜 将 视 野 调 到 合 适 的 亮 度, 并 调 节 双 目 镜 的 光 瞳 间 距, 使 左 右 两 个 视 场 象 合 而 为 一 3. 调 节 载 物 台 高 度 进 行 对 焦, 在 看 到 细 胞 层 之 后, 用 细 调 节 器 将 物 像 调 清 楚, 注 意 观 察 细 胞 的 轮 廓 形 状 和 内 部 结 构 在 观 察 时, 经 常 使 用 的 是 十
5 倍 的 物 镜 4. 结 果 贴 壁 细 胞 一 般 有 两 种 形 态, 即 上 皮 细 胞 型 和 成 纤 维 细 胞 型 细 胞 上 皮 细 胞 型 细 胞 呈 扁 平 的 不 规 则 多 角 形, 圆 形 核 位 于 中 央, 生 长 时 常 彼 此 紧 密 连 接 成 单 层 细 胞 片, 如 HeLa 细 胞 成 纤 维 细 胞 型 细 胞 形 态 与 体 内 成 纤 维 细 胞 形 态 相 似, 胞 体 呈 梭 形 或 不 规 则 三 角 形, 中 央 有 卵 圆 形 核, 胞 质 向 外 伸 出 2~3 个 长 短 不 同 的 突 起, 细 胞 群 常 借 原 生 质 突 连 接 成 网, 细 胞 生 长 时 多 呈 放 射 状 或 漩 涡 状, 如 NIH3T3 贴 壁 细 胞 在 生 长 状 态 良 好 时, 细 胞 均 质 而 透 明, 细 胞 内 颗 粒 少, 看 不 到 空 泡, 细 胞 边 缘 清 楚, 培 养 基 内 看 不 到 悬 浮 的 细 胞 和 碎 片, 培 养 液 清 澈 透 明, 而 当 细 胞 内 颗 粒 较 多, 透 明 差, 空 泡 多, 细 胞 轮 廓 增 强 反 差 较 大 时, 表 明 细 胞 机 能 状 态 不 良, 生 长 较 差 当 培 养 瓶 内 培 养 基 混 浊 时, 应 想 到 细 菌 真 菌 污 染 的 可 能 悬 浮 细 胞 边 缘, 透 明 发 亮 时, 生 长 较 好 ; 反 之, 则 较 差 或 已 死 亡 由 于 培 养 基 内 有 PH 指 示 剂 的 存 在, 因 此 它 的 颜 色 往 往 可 以 间 接 地 表 明 细 胞 的 生 长 状 态 呈 橙 黄 色 时, 细 胞 一 般 生 长 状 态 较 好 ; 呈 淡 黄 色 时, 则 可 能 是 培 养 时 间 过 长, 营 养 不 足, 死 亡 细 胞 过 多 ; 如 呈 紫 红 色, 则 可 能 是 细 胞 生 长 状 态 不 好, 或 已 死 亡 实 际 上 一 种 细 胞 在 培 养 中 的 形 态 并 不 是 永 恒 不 变 的, 它 随 营 养 PH 生 长 周 期 而 改 变, 但 在 比 较 稳 定 的 条 件 下 形 态 是 基 本 一 致 的 在 贴 壁 细 胞 的 培 养 中, 镜 下 折 光 率 高, 圆 而 发 亮 的 一 般 被 认 为 是 分 裂 期 细 胞 肿 瘤 细 胞 有 重 叠 生 长 的 特 征 二 培 养 细 胞 的 计 数 及 活 细 胞 的 鉴 定 1. 准 备 计 数 板 用 95% 酒 精 棉 球 擦 干 净 计 数 板, 把 盖 片 覆 在 计 数 板 上 面 2. 制 备 细 胞 悬 液 将 培 养 瓶 中 的 培 养 液 倒 入 干 净 试 管 中, 向 培 养 瓶 中 加 入 0.25% 胰 蛋 白 酶 -0.02%EDTA 混 合 消 化 液 1ml, 静 置 3~5 分 钟, 待 见 到 细 胞 变 圆, 彼 此 不 连 接 为 止 将 试 管 中 的 培 养 液 倒 回 培 养 瓶 中, 并 轻 轻 进 行 吹 打, 制 成 细 胞 悬 液 3. 染 色 取 细 胞 悬 液 0.5ml, 加 入 0.3% 台 盼 兰 染 液 0.5ml, 混 合 后 染 色 3~5 分 钟 4. 滴 加 悬 液
6 将 悬 液 摇 匀 后, 沿 盖 片 边 缘 缓 缓 滴 加 少 许 已 染 色 的 细 胞 悬 液 于 细 胞 计 数 板 的 斜 面 上, 使 液 体 自 然 充 满 整 个 计 数 室 小 室 内 有 气 泡 或 液 体 过 多 使 盖 片 漂 移 时, 要 重 新 滴 加 5. 计 数 在 普 通 光 学 显 微 镜 10X 物 镜 下 计 数 四 个 大 格 内 的 细 胞 数, 压 线 者 数 上 不 数 下, 数 左 不 数 右 6. 结 果 按 下 式 进 行 细 胞 浓 度 的 计 算 : 4 大 格 中 细 胞 总 数 稀 释 倍 数 = 细 胞 数 /ml 悬 液 4 4 大 格 中 细 胞 总 数 - 染 色 细 胞 数 稀 释 倍 数 = 活 细 胞 数 /ml 悬 液 4 注 1 由 于 四 大 格 中 每 一 大 格 体 积 为 0.1mm 3,1ml=10,000 大 格, 因 此,1 大 格 细 胞 数 10 4 = 细 胞 数 /ml 注 2 染 色 标 本 在 15 分 钟 内 计 数, 因 为 台 盼 兰 染 液 可 使 死 细 胞 迅 速 染 色, 拖 延 计 数 时 间 活 细 胞 也 被 着 色 进 行 细 胞 计 数 时 应 力 求 准 确, 因 此, 在 科 研 中, 往 往 将 计 数 板 两 侧 都 加 上 细 胞 悬 液, 并 同 时 滴 加 几 块 计 数 板 ( 或 反 复 滴 加 一 块 计 数 板 数 次 ), 最 后 取 计 数 的 平 均 值 作 业 一 下 面 是 某 贴 壁 细 胞 培 养 数 天 后 观 察 计 数 的 结 果 : 瓶 培 养 基 镜 下 观 察 计 数 清 晰 度 颜 色 细 胞 界 限 胞 内 颗 粒 空 泡 碎 片 总 死 甲 混 浊 黄 不 清 多 多 大 满 视 野 乙 清 橙 黄 清 楚 少 少 无 丙 清 黄 清 楚 较 多 有 有 丁 清 紫 红 不 清 多 多 多
7 1. 根 据 上 表 分 析 各 瓶 细 胞 的 生 长 情 况 : A 细 胞 生 长 状 态 良 好 ; B 培 养 时 间 太 短 ; C 细 胞 污 染 可 能 性 大 ; D 细 胞 与 环 境 生 长 不 适 ; E 细 胞 营 养 不 足 甲 ( ) 乙 ( ) 丙 ( ) 丁 ( ) 2. 根 据 你 的 判 断 应 采 取 的 措 施 是 : A 将 细 胞 弃 去 ; B 立 即 换 新 鲜 培 养 液 ; C 立 即 传 代 ; D 放 置 继 续 观 察 ; E 换 到 新 的 培 养 瓶 中 甲 ( ) 乙 ( ) 丙 ( ) 丁 ( ) 二 作 图 将 你 观 察 到 的 培 养 细 胞 作 一 草 图 三 计 算 将 你 计 算 的 每 毫 升 悬 液 中 的 细 胞 总 数, 死 活 细 胞 的 百 分 比 例 计 算 出 来
8 实 验 目 的 1. 了 解 冻 存 与 复 苏 的 原 理 ; 实 验 二 细 胞 的 冻 存 与 复 苏 2. 熟 悉 细 胞 冻 存 与 复 苏 的 方 法 步 骤 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 对 数 生 长 期 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 吸 管, 离 心 管, 冻 存 管 ( 塑 料 活 玻 璃 安 瓶 ), 培 养 瓶, 记 号 笔, 纱 布 小 口 袋, 温 度 计, 砂 轮 3. 试 剂 消 化 液, 培 养 液, 甘 油 ( 优 质 无 色 或 DMSO), 75% 酒 精, 热 水 实 验 原 理 目 前 长 时 间 保 存 细 胞 的 方 法 是 将 细 胞 低 温 冻 结 保 存 在 液 氮 中 (-196 ), 保 存 时 间 可 长 达 一 年 甚 至 几 年, 用 时 解 冻, 大 多 数 细 胞 仍 能 生 长 繁 殖, 为 妥 善 起 见, 细 胞 冻 存 一 年 后 应 复 苏 培 养 后 再 冻 存 冻 存 细 胞 时 应 加 入 保 护 剂, 否 则, 细 胞 内 外 的 水 会 结 成 冰 晶, 使 细 胞 发 生 机 械 损 伤 加 入 保 护 剂 后, 可 使 冰 点 降 低, 在 缓 慢 冻 结 的 条 件 下, 细 胞 内 的 水 分 在 冻 结 前 渗 出 到 细 胞 外, 避 免 冰 晶 的 损 伤 目 前 常 用 的 保 护 剂 为 甘 油 和 二 甲 基 亚 砜 (DMSO), 它 们 对 细 胞 无 毒, 分 子 量 小 溶 解 度 大, 易 穿 透 细 胞, 使 用 浓 度 甘 油 为 10%~20%, 二 甲 基 亚 砜 5%~15%, 常 用 为 10% 另 外, 冻 存 液 中 还 要 加 入 培 养 液, 以 提 供 营 养, 渗 透 压,pH 细 胞 复 苏 指 融 化 冻 存 的 细 胞, 重 新 培 养 解 冻 细 胞 速 度 要 快, 使 之 迅 速 通 过 最 易 损 伤 的 -5~0 实 验 内 容 一 细 胞 冻 存 1. 细 胞 悬 液 制 备
9 选 对 数 生 长 期 细 胞,10ml 培 养 瓶 面, 几 乎 成 单 层 时 可 冻 存 一 管 ; 收 集 细 胞 24 小 时 前 换 液 一 次 ; 按 传 代 方 法 制 成 细 胞 悬 液 2. 收 集 细 胞 将 细 胞 悬 液 移 入 无 菌 离 心 管 中,1000rpm, 离 心 5 分 钟, 去 上 清 3. 冻 存 液 将 培 养 液 和 甘 油 按 9:1 的 比 例 配 成 10% 的 冻 存 液, 取 1~1.5ml 到 离 心 管 中, 轻 轻 吹 打 使 细 胞 悬 混 4. 装 瓶 用 吸 管 吸 取 细 胞 悬 液 1.5ml, 装 入 安 瓶 中, 尽 量 不 使 液 体 碰 到 安 瓶 口 5. 封 口 将 安 瓶 在 火 焰 最 热 处 封 好, 如 用 冻 存 管 将 盖 儿 拧 紧 即 可 6. 标 记 用 记 号 笔 记 好 细 胞 名 称, 冻 存 年 月 日 7. 冻 结 和 保 存 将 安 瓶 装 在 纱 布 袋 中, 置 4 2~4 小 时,-20 2~4 小 时, 液 氮 的 气 相 部 分 -130 ~-180, 浸 入 液 氮 液 氮 量 一 定 要 充 分, 以 使 温 度 恒 定 二 细 胞 复 苏 1. 用 大 镊 子 取 出 液 氮 中 的 安 瓶, 投 入 盛 有 37~42 的 水 中, 不 时 摇 动, 使 之 快 速 通 过 -5~0 2. 在 超 净 台 中, 用 砂 轮 擦 安 瓶 颈 并 用 酒 精 棉 球 消 毒, 打 开 安 瓶, 吸 出 细 胞 悬 液 装 入 培 养 瓶 中, 并 以 10 稀 释, 放 CO 2 培 养 箱 中 进 行 培 养, 第 二 天 换 新 鲜 培 养 液, 以 换 掉 冻 存 剂
10 实 验 目 的 1. 了 解 原 代 培 养 的 原 理 实 验 三 细 胞 的 原 代 和 传 代 培 养 ( 一 ) 细 胞 的 原 代 培 养 2. 初 步 掌 握 哺 乳 动 物 细 胞 的 原 代 培 养 的 基 本 操 作 过 程, 为 生 物 工 程 在 医 学 上 的 应 用 打 下 基 础 3. 掌 握 无 菌 操 作 技 术 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 胎 大 鼠 2. 器 材 和 仪 器 手 术 器 械, 平 皿, 培 养 瓶, 吸 管, 离 心 管 灭 菌 后 备 用 ; 煤 气 灯, 烧 杯, 超 净 工 作 台, 二 氧 化 碳 培 养 箱, 倒 置 显 微 镜 3. 试 剂 含 10% 小 牛 血 清 的 1640 培 养 液,0.01mol/LPBS,0.25% 胰 蛋 白 酶 %EDTA 混 合 消 化 液,75% 乙 醇 实 验 原 理 细 胞 培 养 (Cell culture) 是 模 拟 机 体 内 生 理 条 件, 将 细 胞 从 机 体 中 取 出, 在 人 工 条 件 下 使 其 生 存 生 长 繁 殖 和 传 代, 进 行 细 胞 生 命 过 程 细 胞 癌 变 细 胞 工 程 等 问 题 的 研 究 近 年 来, 广 泛 地 应 用 于 分 子 生 物 学 遗 传 学 免 疫 学 肿 瘤 学 细 胞 工 程 等 领 域, 发 展 成 一 种 重 要 生 物 技 术, 并 取 得 显 著 成 就 由 体 内 直 接 取 出 组 织 或 细 胞 进 行 培 养 叫 原 代 培 养 原 代 培 养 细 胞 离 体 时 间 短, 性 状 与 体 内 相 似, 适 用 于 研 究 一 般 说 来, 幼 稚 状 态 的 组 织 和 细 胞, 如 : 动 物 的 胚 胎 幼 仔 的 脏 器 等 更 容 易 进 行 原 代 培 养 实 验 内 容 1. 取 材 用 颈 椎 脱 位 法 使 胎 大 鼠 迅 速 死 亡 然 后, 把 整 个 动 物 浸 入 盛 有 75% 乙 醇 的 烧 杯 中 数 秒 钟 消 毒, 取 出 后 放 在 大 平 皿 中 携 入 超 净 台 用 消 过 毒 的
11 剪 刀 剪 开 用 碘 酒 和 乙 醇 再 次 消 毒 后 的 皮 肤, 剖 腹 取 出 肝 脏 或 肾 脏, 置 于 无 菌 平 皿 中 2. 切 割 用 灭 菌 的 PBS 液 将 取 出 的 脏 器 清 洗 三 次, 然 后 用 眼 科 手 术 剪 刀 仔 细 将 组 织 反 复 剪 碎, 直 到 成 1mm 3 左 右 的 小 块, 再 用 PBS 清 洗, 洗 到 组 织 块 发 白 为 止 移 入 无 菌 离 心 管 中, 静 置 数 分 钟, 使 组 织 块 自 然 沉 淀 到 管 底, 弃 去 上 清 3. 消 化 接 种 培 养 吸 取 0.25% 胰 蛋 白 酶 一 0.02%EDTA 混 合 消 化 液 1ml, 加 入 离 心 管 中, 与 组 织 块 混 匀 后, 加 上 管 口 塞 子,37 水 浴 中 消 化 8~10 分 钟, 每 隔 几 分 钟 摇 动 一 下 试 管, 使 组 织 与 消 化 液 充 分 接 触, 静 止, 吸 去 上 清, 向 离 心 管 中 加 入 5~10ml 含 10% 小 牛 血 清 的 1640 培 养 基, 用 吸 管 吹 打 混 匀, 移 入 二 个 培 养 瓶 中, 置 于 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 培 养 4. 结 果 细 胞 接 种 后 一 般 几 小 时 内 就 能 贴 壁, 并 开 始 生 长, 如 接 种 的 细 胞 密 度 适 宜,5 天 到 一 周 即 可 形 成 单 层 实 验 目 的 1. 了 解 传 代 培 养 的 原 理 及 一 般 方 法 2. 熟 悉 传 代 培 养 的 操 作 步 骤 3. 进 一 步 掌 握 无 菌 操 作 技 术 ( 二 ) 细 胞 的 传 代 培 养 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 原 代 培 养 的 HeLa 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 培 养 瓶, 吸 管, 离 心 管 灭 菌 后 备 用 ; 煤 气 灯, 超 净 工 作 台, 二 氧 化 碳 培 养 箱, 倒 置 显 微 镜 3. 试 剂 含 10% 小 牛 血 清 的 1640 培 养 液,0.01mol/LPBS,0.25% 胰 蛋 白 酶 %EDTA 混 合 消 化 液
12 实 验 原 理 体 外 培 养 的 原 代 细 胞 或 细 胞 株 要 在 体 外 持 续 地 培 养 就 必 须 传 代, 以 便 获 得 稳 定 的 细 胞 株 或 得 到 大 量 的 同 种 细 胞, 并 维 持 细 胞 种 的 延 续 培 养 的 细 胞 形 成 单 层 汇 合 以 后, 由 于 密 度 过 大 生 存 空 间 不 足 而 引 起 营 养 枯 竭, 将 培 养 的 细 胞 分 散, 从 容 器 中 取 出, 以 1:2 或 l:3 以 上 的 比 率 转 移 到 另 外 的 容 器 中 进 行 培 养, 即 为 传 代 培 养 细 胞 一 代 指 从 细 胞 接 种 到 分 离 再 培 养 的 一 段 期 间, 与 细 胞 世 代 或 倍 增 不 同 在 一 代 中, 细 胞 培 增 3~6 次 细 胞 传 代 后, 一 般 经 过 三 个 阶 段 : 游 离 期 指 数 增 生 期 和 停 止 期 常 用 细 胞 分 裂 指 数 表 示 细 胞 增 殖 的 旺 盛 程 度, 即 细 胞 群 的 分 裂 相 数 / 100 个 细 胞 一 般 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.2%~0.5%, 肿 瘤 细 胞 可 达 3~5% 细 胞 接 种 2~3 天 分 裂 增 殖 旺 盛, 是 活 力 最 好 时 期, 称 指 数 增 生 期 ( 对 数 生 长 期 ), 适 宜 进 行 各 种 试 验 实 验 内 容 1. 将 长 成 单 层 的 原 代 培 养 细 胞 或 HeLa 细 胞 从 二 氧 化 碳 培 养 箱 中 取 出, 在 超 净 工 作 台 中 倒 掉 瓶 内 的 培 养 液, 加 入 少 许 消 化 液 ( 以 液 面 盖 住 细 胞 为 宜 ), 静 置 5~10 分 钟 2. 在 倒 置 镜 下 观 察 被 消 化 的 细 胞, 如 果 细 胞 变 圆, 相 互 之 间 不 再 连 接 成 片, 这 时 应 立 即 在 超 净 台 中 将 消 化 液 倒 掉, 加 入 3~5ml 新 鲜 培 养 液, 吹 打, 制 成 细 胞 悬 液 3. 将 细 胞 悬 液 吸 出 2ml 左 右, 加 到 另 一 个 培 养 瓶 中 并 向 每 个 瓶 中 分 别 加 3ml 左 右 培 养 液, 盖 好 瓶 塞, 送 回 二 氧 化 碳 培 养 箱 中, 继 续 进 行 培 养 4 结 果 一 般 情 况, 传 代 后 的 细 胞 在 2 小 时 左 右 就 能 附 着 在 培 养 瓶 壁 上,2~4 天 就 可 在 瓶 内 形 成 单 层, 需 要 再 次 进 行 传 代 ( 三 ) 器 材 及 液 体 的 准 备 和 无 菌 操 作 的 注 意 事 项 1. 器 材 和 液 体 的 准 备 细 胞 培 养 用 的 玻 璃 器 材, 如 : 培 养 瓶 吸 管 等 在 清 洗 干 净 以 后, 装 在 铝 盒 和 铁 筒 中,120,2 小 时 干 烤 灭 菌 后 备 用 ; 手 术 器 材 瓶 塞 配 制 好
13 的 PBS 液 用 灭 菌 锅 15 磅,20 分 钟 蒸 气 灭 菌 ;1640 培 养 液 小 牛 血 清 消 化 液 用 G6 滤 器 负 压 抽 滤 后 备 用 2. 无 菌 操 作 中 的 注 意 事 项 在 无 菌 操 作 中, 一 定 要 保 持 工 作 区 的 无 菌 清 洁 为 此, 在 操 作 前 要 认 真 地 洗 手 并 用 75% 乙 醇 消 毒 操 作 前 20~30 分 钟 起 动 超 净 台 吹 风 操 作 时, 严 禁 说 话, 严 禁 用 手 直 接 拿 无 菌 的 物 品, 如 瓶 塞 等, 而 要 用 器 械, 如 止 血 钳 镊 子 等 去 拿 培 养 瓶 要 在 超 净 台 内 才 能 打 开 瓶 塞, 打 开 之 前 用 乙 醇 将 瓶 口 消 毒, 打 开 后 和 加 塞 前 瓶 口 都 要 在 酒 精 灯 上 烧 一 下, 打 开 瓶 口 后 的 操 作 全 部 都 要 在 超 净 台 内 完 成 操 作 完 毕 后, 加 上 瓶 塞, 才 能 拿 到 超 净 台 外 使 用 的 吸 管 在 从 消 毒 的 铁 筒 中 取 出 后 要 手 拿 末 端, 将 尖 端 在 火 上 烧 一 下, 戴 上 胶 皮 乳 头, 然 后 再 去 吸 取 液 体 总 之, 在 整 个 无 菌 操 作 过 程 中 都 应 该 在 酒 精 灯 的 周 围 进 行 作 业 1. 原 代 细 胞 和 传 代 细 胞 培 养 有 哪 些 区 别? 2. 怎 样 才 能 既 迅 速, 又 保 证 无 菌 操 作
14 实 验 四 放 线 菌 素 D 诱 导 HL-60 细 胞 凋 亡 的 实 验 观 察 实 验 目 的 1. 掌 握 基 因 组 DNA 提 取 方 法 2. 掌 握 凋 亡 细 胞 DNA 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 原 理 过 程 和 染 色 方 法 3. 熟 悉 DNA 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 的 带 形 4. 了 解 凋 亡 细 胞 的 形 态 及 生 化 特 征 5. 熟 悉 Hoechst33258 及 Giemsa 染 色 方 法 6. 熟 悉 荧 光 显 微 镜 下 凋 亡 细 胞 的 形 态 变 化 实 验 用 品 1. 材 料 和 标 本 HL-60 细 胞 2. 器 材 和 仪 器 微 量 加 样 器 枪 头 离 心 管 三 角 烧 瓶 电 泳 仪 电 泳 槽 高 速 冷 冻 离 心 机 水 浴 锅 涡 流 振 荡 器 微 波 炉 紫 外 透 射 仪 载 玻 片 3. 试 剂 放 线 菌 素 D 琼 脂 糖 TAE( 电 泳 缓 冲 液 ) 异 丙 醇 70% 乙 醇 DNA 提 纯 试 剂 盒 ( Nuclei lysis solution, RNAase solution, protein precipitation solution, DNA rehydration solution) DNA marker 溴 化 乙 锭 (EB) 6 loading buffer 染 液,Giemsa 染 液 工 作 液, 甲 醇,PBS 液 等 实 验 原 理 放 线 菌 素 D(actinomycin D) 是 抗 肿 瘤 类 抗 生 素, 其 主 要 作 用 是 通 过 与 DNA 结 合, 阻 断 依 赖 DNA 的 mrna 的 合 成, 从 而 阻 碍 蛋 白 质 合 成, 抑 制 瘤 细 胞 分 裂, 引 起 细 胞 凋 亡 细 胞 凋 亡 时, 其 核 染 色 质 的 DNA 出 现 缺 口 甚 至 断 裂, 致 使 染 色 质 凝 聚 边 缘 化 甚 至 呈 现 DNA 碎 片 利 用 与 DNA 结 合 的 荧 光 染 料 染 色 后, 在 荧 光 显 微 镜 下 即 可 观 察 到 上 述 变 化 Hoechst33258 为 与 A-T 结 合 的 特 异 性 DNA 染 料, 对 活 细 胞 和 固 定 细 胞 均 能 染 色 实 验 内 容
15 一 细 胞 基 因 组 DNA 提 取 1. 药 物 处 理 : 取 处 于 对 数 生 长 期 的 HL-60 细 胞 ( 个 /ml) 加 入 放 线 菌 素 D 至 终 浓 度 5ug/ml,37 孵 育 20 小 时 2. 收 集 细 胞 :4,1500 g, 离 心 5min, 弃 上 清 3. 清 洗 细 胞 : 加 入 600ulPBS 重 悬 细 胞,1500 g, 离 心 5min, 弃 上 清 4. 加 入 600ul Nuclei lysis solution, 来 回 吸 打 数 次 5. 加 入 3ul RNAase solution, 颠 倒 离 心 管 5 次, 混 合 样 品 6.37, 水 浴 30min, 室 温 静 置 5min 7. 加 入 200ul protein precipitation solution, 涡 振 20sec, 置 冰 中 5min 8.4,13000 g 离 心 5min 小 心 吸 上 清 于 另 一 离 心 管 中 9. 向 上 清 液 中 加 入 600ul 异 丙 醇, 颠 倒 混 合 4,13000 g, 离 心 5min 弃 上 清, 收 集 沉 淀 DNA 10. 加 入 600ul 70% 乙 醇, 颠 倒 数 次, 清 洗 DNA 4,13000 g, 离 心 2min 小 心 弃 上 清, 室 温 干 燥 沉 淀 10-15min 11. 加 入 10ul DNA rehydration solution,65, 水 浴 30-60min, 并 定 期 轻 柔 振 荡 离 心 管 使 沉 淀 溶 解 12. 溶 解 液 ( 即 DNA 提 取 样 品 )4 保 存 备 用 二 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 细 胞 凋 亡 1. 灌 制 琼 脂 糖 凝 胶 (1) 备 好 注 胶 槽, 插 上 梳 子 称 1g 琼 脂 糖, 加 100mlTAE, 微 波 炉 加 热 溶 解 (2) 向 胶 槽 中 注 入 温 热 的 1% 琼 脂 糖 胶, 胶 层 厚 度 约 3-5mm (3) 室 温 静 置 30-45min, 使 琼 脂 糖 胶 完 全 凝 结 小 心 拔 出 梳 子, 将 凝 胶 放 入 电 泳 槽, 使 梳 孔 端 靠 近 阴 极 ( 黑 色 ) (4) 向 电 泳 槽 中 加 入 TAE, 让 液 面 刚 好 没 过 凝 胶 约 1mm 2. 加 样, 电 泳 (1) 在 蜡 膜 上 分 别 加 3 滴 6 loading buffer, 每 滴 2ul (2) 从 4 冰 箱 中 取 出 制 备 好 的 未 经 放 线 菌 素 D 和 经 放 线 菌 素 D 处 理 的 DNA 样 品 各 10ul, 加 入 到 loading buffer 中 在 余 下 的 一 滴 loading buffer 中 加 5ul DNA marker 和 5ul 灭 菌 去 离 子 水, 反 复 吸 打, 充
16 分 混 合 (3) 用 加 样 器 分 别 把 上 述 样 品 缓 慢 加 至 琼 脂 糖 凝 胶 的 加 样 孔 中 (4) 盖 上 电 泳 槽 盖, 接 好 电 极 插 头, 打 开 电 源, 电 压 调 至 V, 电 泳 45-60min (5) 将 电 压 调 至 零, 关 电 源, 拔 出 电 极 插 头, 打 开 电 泳 槽 盖 3. 染 色 观 察 (1) 取 出 凝 胶, 放 入 含 有 EB(0.5ug/ml) 的 溶 液 中, 室 温 浸 染 20min (2) 于 暗 室 中, 在 紫 外 灯 下 进 行 观 察 (3) 染 色 结 果 : 经 放 线 菌 素 D 处 理 的 细 胞 在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 呈 现 阶 梯 状 DNA 区 带 图 谱 (DNA ladder), 这 是 细 胞 凋 亡 的 重 要 生 化 特 征 而 未 经 处 理 的 细 胞 则 没 有 DNA 凋 亡 所 特 有 的 梯 形 条 带 DNA 断 裂 情 况 可 与 对 照 比 较, 断 裂 程 度 用 DNAmarker 所 显 条 带 度 量 三 凋 亡 细 胞 普 通 光 镜 下 形 态 观 察 Giemsa 染 色 法 1. 收 集 凋 亡 细 胞 悬 液 于 1.5ml 离 心 管 中,4,500rpm, 离 心 5min 2. 弃 上 清, 将 细 胞 重 悬 于 PBS 液 中, 制 成 细 胞 悬 液 3. 取 100ml 细 胞 悬 液, 涂 于 载 玻 片 上, 晾 干 4. 用 甲 醇 固 定 1min, 充 分 晾 干 5. 滴 加 Giemsa 染 液 ( 工 作 液 浓 度 ), 室 温 染 色 5min. 6. 用 流 水 轻 轻 洗 去 染 液, 室 温 晾 干 7. 用 二 甲 苯 浸 泡 3min, 去 除 杂 质, 待 载 片 透 明 后, 以 树 脂 封 片 8. 普 通 纤 维 镜 下 观 察 9. 结 果 观 察 :Giemsa 染 色 的 标 本, 细 胞 核 红 紫 色, 细 胞 质 蓝 色, 凋 亡 细 胞 的 核 染 色 质 固 缩 边 集, 染 色 较 深 或 核 破 裂 ; 细 胞 膜 皱 褶 卷 曲, 或 出 泡 芽 生, 形 成 凋 亡 小 体 四 凋 亡 细 胞 的 荧 光 显 微 镜 下 形 态 观 察 1. 培 养 细 胞, 诱 导 凋 亡 ( 在 超 净 台 进 行 ) 2. 收 集 细 胞 :1000g/min 离 心 5min, 其 上 清 3. PBS(37 ) 漂 洗 悬 浮 细 胞 4. 固 定 液 (4 ) 固 定 5min,500~1000g/min 离 心 5min, 弃 上 清 5. 蒸 馏 水 洗,500~1000g/min 离 心 5min, 弃 上 清
17 6. 调 整 细 胞 数 至 0.5~ /ml 7. 取 100µl 细 胞 悬 液, 加 入 1µl Hoechst33258 染 液, 染 色 10min 8. 将 10µl 染 色 的 悬 浮 细 胞 涂 于 载 玻 片, 加 盖 玻 片 9. 放 于 荧 光 显 微 镜 下 观 察 选 用 UV 激 发 滤 片 和 nm 阻 断 滤 片 10. 结 果 观 察 : 细 胞 核 呈 蓝 色 凋 亡 细 胞 的 核 染 色 质 凝 聚 且 边 缘 化, 或 玻 珠 化, 并 可 呈 现 DNA 荧 光 碎 片 注 意 事 项 1. 对 大 片 段 DNA 不 能 振 荡, 应 轻 轻 反 复 翻 动 离 心 管, 以 免 机 械 剪 切 力 损 伤 DNA 链 2. 收 集 沉 淀 DNA( 特 别 是 凋 亡 细 胞 的 DNA) 时 需 格 外 小 心 ; 3. 样 品 加 入 样 孔 的 位 置 应 该 合 适 ; 4. 溴 化 乙 锭 为 较 强 的 致 突 变 剂, 应 带 乳 胶 手 套 操 作 ; 5. 紫 外 光 能 损 伤 眼 睛, 不 要 直 视 光 源 ; 6. 污 染 物 须 放 入 专 用 容 器 内, 妥 善 处 理 7.Hoechst33258 染 液 应 4 避 光 保 存 学 生 作 业 请 简 述 细 胞 凋 亡 的 生 化 特 征
18 实 验 五 含 有 目 的 基 因 真 核 表 达 pegfp-c1 载 体 的 构 建 一 PCR 反 应 扩 增 目 的 基 因 片 段 实 验 原 理 以 DNA 为 模 板, 在 4 种 核 苷 酸 存 在 的 条 件 下, 借 助 DNA 聚 合 酶 作 用 出 现 的 酶 促 合 成, 依 赖 于 在 加 热 条 件 下, 双 链 DNA 解 离 成 单 链 ( 变 性 ), 降 温 ( 复 性 ), 使 引 物 与 单 链 特 异 性 结 合, 同 时 使 4 种 核 苷 酸 在 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 发 生 以 引 物 为 起 点 进 行 聚 合 的 现 象, 使 DNA 链 不 断 延 伸, PCR 反 应 进 行 反 应 步 骤 包 括 : 变 性 ( 常 规 采 用 94 高 温 条 件 下 使 待 扩 增 的 模 板 DNA 氢 键 断 裂, 解 链 成 为 单 链 模 板 ) 退 火 ( 人 工 合 成 的 引 物 在 低 温 下 分 别 与 模 板 DNA 单 链 形 成 杂 交 链 ) 延 伸 ( 在 72 条 件 下,DNA 聚 合 酶 将 单 核 苷 酸 在 引 物 3' 端 掺 入, 延 模 板 3' 5' 方 向 延 伸, 合 成 新 的 DNA 链 ) 以 上 三 步 反 应 构 成 一 个 周 期, 每 一 周 期 产 生 的 DNA 均 可 成 为 下 一 个 循 环 的 模 板, PCR 产 物 以 指 数 方 式 增 加 实 验 材 料 质 粒 ( 模 板 ); Taq DNA 聚 合 酶 ; 引 物 ; dntp 混 合 物 ; PCR Buffer( Mg 2+ ); PCR 扩 增 仪 等 实 验 方 法 1. 按 下 列 组 分 配 制 PCR 反 应 液 : 10 PCR Buffer( Mg 2+ Plus) dntp 混 合 物 ( 各 2.5mM) 模 板 DNA( 质 粒 ) 引 物 1( 20uM) 引 物 2( 20uM) Taq DNA polymerase( 5U/ul) ddh 2 O 5 μl 4 μl 1 μl 1 μl 1 μl 0.25μl μl
19 2. PCR 反 应 条 件 95 5min 95 30sec 55 30sec 30 Cycles 72 1min 72 10min 4 forever 3. 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 结 果 共 50μl 注 意 事 项 PCR 反 应 液 在 冰 中 配 制, 然 后 置 于 PCR 反 应 仪 上 进 行 PCR 反 应, 这 样 可 增 强 PCR 扩 增 的 特 异 性, 减 少 PCR 过 程 中 的 非 特 异 性 反 应, 能 得 到 良 好 的 PCR 结 果
20 二 凝 胶 回 收 PCR 反 应 片 段 实 验 原 理 从 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 中 回 收 纯 化 DNA 片 段 的 试 剂 盒 试 剂 盒 采 用 了 独 特 的 凝 胶 融 解 系 统, 结 合 DNA 制 备 膜 技 术, 具 有 高 效 快 速 的 特 点 本 试 剂 盒 纯 化 DNA 片 段 纯 度 高, 完 整 性 好 可 直 接 用 于 连 接 反 应, PCR 扩 增 实 验 材 料 PCR 产 物 电 泳 后 目 的 DNA 片 段 ; Biospin 胶 回 收 试 剂 盒 等 实 验 方 法 1. 将 含 有 目 的 DNA 片 段 的 琼 脂 糖 凝 胶 切 下, 并 放 入 2.0 ml 离 心 管 中 2. 按 1:3 的 比 例 ( 凝 胶 质 量 毫 克 数 : 融 胶 液 体 积 微 升 数 ) 加 入 Extraction Buffer ( 每 次 加 入 的 Extraction Buffer 最 大 体 积 不 宜 超 过 1.2ml) 例 如 :100mg 凝 胶 应 加 入 300μlExtraction Buffer 3. 于 恒 温 水 浴 或 金 属 浴 中 55 孵 育, 直 到 凝 胶 融 化 低 熔 点 凝 胶 可 于 50 孵 育, 一 般 孵 育 时 间 不 多 于 10 分 钟, 孵 育 过 程 中 每 隔 2-3 分 钟 混 匀 一 次 4. 可 选 : 按 1:1 的 比 例 ( 凝 胶 质 量 毫 克 数 : 异 丙 醇 体 积 微 升 数 ) 加 入 异 丙 醇, 并 混 合 均 匀 一 般 大 于 120bpDNA 片 段, 不 需 要 加 异 丙 醇 5. 将 混 合 液 全 部 转 移 到 Spin column 内, 于 6,000g 离 心 1 分 钟, 并 弃 去 接 液 管 内 液 体 如 混 合 液 体 积 大 于 750μl 可 先 转 移 750μl, 其 余 的 液 体 待 离 心 弃 液 后, 再 转 移 6. 向 Spin column 内 加 500μl Extraction Buffer, 于 12,000g 离 心 秒, 并 弃 去 接 液 管 内 液 体 7. 向 Spin column 内 加 650μl Wash Buffer, 于 12,000g 离 心 秒, 并 弃 去 接 液 管 内 液 体 8. 重 复 第 7 步 一 次 9. 再 次 于 12,000rpm 离 心 1 分 钟, 然 后 将 Spin column 转 移 到 无 菌 的 1. 5ml 离 心 管 中 如 不 进 行 该 步 离 心, 则 无 法 保 证 离 心 柱 内 残 液 被 彻 底 清 除
21 10. 向 Spin column 内 加 50μl Elution Buffer 去 离 子 水 或 TE 溶 液, 并 于 室 温 静 置 1 分 钟 可 根 据 实 验 的 实 际 需 要 决 定 Elution Buffer 用 量 11. 于 12,000g 离 心 1 分 钟,1. 5ml 离 心 管 内 溶 液 中 含 有 目 的 DNA 片 段 12. 回 收 的 DNA 可 直 接 用 于 各 类 下 游 分 子 生 物 学 实 验, 如 果 不 立 即 使 用, 请 保 存 于 -20 注 意 事 项 1. 使 用 前 按 瓶 身 标 签 标 明 体 积 加 入 无 水 乙 醇, 并 将 其 混 匀 2. 结 合 液 用 好 后 立 即 盖 好 盖 子 3. 本 试 剂 盒 最 适 洗 脱 液 体 积 为 50μl, 洗 脱 液 用 量 可 根 据 客 户 实 验 具 体 情 况 灵 活 调 整 常 见 问 题 及 对 策 没 有 回 收 到 DNA 片 段 如 在 洗 脱 后, 发 现 洗 脱 液 中 没 有 DNA 片 段, 请 检 查 是 否 按 瓶 身 标 签, 在 洗 涤 液 中 加 入 了 无 水 乙 醇 提 取 率 低 1) Extraction Buffer 为 酸 性 缓 冲 液, 如 融 胶 后, 其 ph 值 升 高 将 影 响 提 取 得 率 请 加 入 0.1 倍 体 积 的 3M 乙 酸 钾 (ph5.0) 2) 长 时 间 使 用 后 没 有 更 换 的 电 泳 缓 冲 液, 其 ph 值 较 高, 将 影 响 DNA 的 吸 附 请 更 换 新 的 电 泳 缓 冲 液 后, 再 进 行 电 泳, 然 后 切 胶 3) 在 洗 脱 前, 将 洗 脱 液 于 30~60 温 浴, 可 提 高 提 取 效 率 吸 光 度 测 量 结 果 问 题 吸 光 度 测 量 的 是 未 知 样 品 与 调 零 标 准 之 间 的 相 对 吸 光 度, 所 以 请 用 与 洗 脱 液 体 相 同 的 液 体, 对 测 量 样 品 进 行 稀 释 和 调 零 如 何 计 算 提 取 率 1) 由 于 回 收 前 样 品 中, 往 往 含 有 非 目 的 DNA 片 段 引 物 dntp 等, 所 以 不 能 用 测 回 收 前 后 吸 光 度 的 的 方 法 计 算 回 收 率 2) 可 将 回 收 前 后 DNA 片 段 一 起 电 泳, 使 用 凝 胶 成 像 系 统 拍 照 后, 用 配 套 的 软 件 进 行 电 泳 条 带 灰 度 对 比
22 3) 注 意, 电 泳 条 件 及 拍 摄 条 件 将 对 灰 度 对 比 结 果 造 成 很 大 影 响, 请 仔 细 操 作, 以 减 小 误 差 三 将 目 的 片 段 克 隆 到 pegfp-c1 载 体 中 实 验 原 理 在 设 计 引 物 时, 一 对 引 物 两 端 分 别 加 了 两 个 酶 切 位 点, 这 两 个 酶 切 位 点 与 pegfp-c1 载 体 多 克 隆 位 点 中 的 酶 切 位 点 相 吻 合, 且 位 置 和 方 向 都 合 适 这 样, 目 的 基 因 片 段 和 pegfp-c1 载 体 经 双 酶 切 后, 由 于 酶 切 位 点 一 致, 在 T4 DNA 连 接 酶 的 作 用 下 就 可 以 连 接 实 验 材 料 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 ; pegfp-c1 载 体 ; 限 制 性 核 酸 内 切 酶 ; 10 Ligation Buffer; T4 DNA Ligase; 冰 盒 等 实 验 方 法 1. 双 酶 切 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 和 pegfp-c1 载 体 反 应 体 系 : 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 Xμl 10 Kbuffer 10 μl EcoRI 2.5μl BamHI 2.5μl ddh 2 O 至 100μl pegfp-c1 载 体 Xμl 10 Kbuffer 10 μl EcoRI 2.5μl BamHI 2.5μl ddh 2 O 至 100μl 反 应 条 件 : 37 o C 2hrs 至 过 夜
23 2. 回 收 后 电 泳 检 测 浓 度, 然 后 进 行 连 接 反 应 反 应 体 系 : 10 Liga tion Buffer 1μl pegfp-c1 载 体 Xμl 纯 化 的 目 的 DNA 片 段 Yμl T4 DNA Ligase 0.5μl ddh 2 O 至 10μl 反 应 条 件 : 室 温 2hrs, 或 者 4 o C 过 夜 注 意 事 项 Ligation Buffer 用 之 前 要 震 荡 混 匀
24 pegfp-c1 载 体 图 谱 四 转 化 感 受 态 细 胞 实 验 原 理 转 化 过 程 所 用 的 受 体 细 胞 一 般 是 限 制 修 饰 系 统 缺 陷 的 变 异 株, 即 不 含 限 制 性 内 切 酶 和 甲 基 化 酶 的 突 变 体 ( Rˉ, Mˉ), 它 可 以 容 忍 外 源 DNA 分 子 进 入 体 内 并 稳 定 地 遗 传 给 后 代 受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 ( 如 电 击 法, CaCl 2 ) 处 理 后, 细 胞 膜 的 通 透 性 发 生 了 暂 时 性 的 改 变, 成 为 能 允 许 外 源 DNA 分 子 进 入 的 感 受 态 细 胞 ( Competent cells ) 进 入 受 体 细 胞 的 DNA 分 子 通 过 复 制, 表 达 实 现 遗 传 信 息 的 转 移, 使 受 体 细 胞 出 现 新 的 遗 传 性 状 将 经 过 转 化 后 的 细 胞 在 筛 选 培 养 基 中 培 养, 即 可 筛 选 出 转 化 子 ( Trans formant), 即 带 有 异 源 DNA 分 子 的 受 体 细 胞 ) 实 验 材 料 待 转 化 的 重 组 质 粒 ; SOC 液 体 培 养 基 或 LB 液 体 培 养 基 ;JM109 或 DH5α 感 受 态 细 胞 ; 带 有 抗 生 素 ( Amp 或 Kan ) 的 LB 平 板 等 实 验 方 法 ul 感 受 态 细 胞 在 冰 中 融 化 2. 分 装 2 管, 50ul/ 管
25 3. 加 入 转 化 的 DNA Xul 4. 冰 中 放 置 30min 放 置 90sec 6. 冰 中 放 置 2~ 3min 7. 加 入 4 倍 体 积 的 SOC 液 体 培 养 基 或 LB 液 体 培 养 基 振 荡 培 养 1hrs 9. 涂 平 板, 37 温 箱 培 养 12~ 16hrs 注 意 事 项 1. 加 入 DNA 的 量 要 小 于 10ng,DNA 的 量 过 高 影 响 转 化 效 率 2. SOC 培 养 基 可 以 用 LB 培 养 基 替 代, 但 是 转 化 率 低 于 使 用 SOC 培 养 基 3. 热 激 温 度 42 o C 一 定 要 准 确, 否 则 影 响 转 化 效 率 五 提 取 质 粒 并 进 行 酶 切 鉴 定 实 验 材 料 质 粒 提 取 试 剂 盒 ; 限 制 性 核 酸 内 切 酶 ; 离 心 机 ; 振 荡 培 养 箱 ; 电 泳 装 置 ; 冰 盒 ; 恒 温 水 浴 箱 等 实 验 方 法 1. 挑 取 含 有 目 的 DNA 重 组 体 的 单 个 菌 落 接 种 在 3ml L B( 含 有 Amp 或 Kan) 液 体 培 养 基 中,37,225rpm 培 养 12~ 16hrs 2. 提 取 质 粒 ⑴ 离 心 菌 液, 废 弃 上 清 ⑵ 加 入 250ul BufferP1, 使 菌 片 重 悬, 务 必 使 片 状 物 不 可 见 ⑶ 加 入 250ul BufferP2, 上 下 颠 倒 EP 管 4~ 6 次, 操 作 时 间 要 少 于 5min ⑷ 加 入 350ul BufferN3, 上 下 颠 倒 EP 管 4~ 6 次, 可 见 絮 状 沉 淀
26 ⑸ 离 心 13000rpm, 10min ⑹ 离 心 后 的 上 清 液 移 入 Prep Spin Column ⑺13000rpm 离 心 30~ 60Secs, 弃 滤 液 ⑻ 加 入 0.5ml Buffer PB, 13000rpm 离 心 30~ 60Secs, 弃 滤 液 ⑼ 加 入 0.75ml Buffer PE,13000rpm 离 心 30~ 60Secs, 弃 滤 液 ⑽13000 rpm 再 离 心 1min, 弃 滤 液 ⑾ 将 Prep Spin Column 加 到 新 的 1.5ml EP 管 上 ⑿ 加 50ul Buffer EB 至 滤 膜 中 央, 室 温 静 置 1min,13000rpm 离 心 1min 即 获 得 所 需 质 粒 3. 酶 切 鉴 定 反 应 体 系 ( 20ul 体 系 ): 提 取 的 质 粒 2ul 10 KBuffer 2ul BamHI 0.5ul EcoRI 0.5ul ddh 2 O 15ul 反 应 条 件 : 37 o C 2-3hrs 4. 电 泳 : 观 察 酶 切 结 果
27 实 验 六 目 的 基 因 在 真 核 系 统 中 的 表 达 及 细 胞 内 的 定 位 一 磷 酸 钙 法 瞬 时 转 染 实 验 原 理 将 氯 化 钙,DNA 和 磷 酸 缓 冲 液 混 合, 形 成 包 含 DNA 且 极 小 的 不 溶 的 磷 酸 钙 颗 粒 ( 沉 淀 ) 磷 酸 钙 -DNA 复 合 物 粘 附 到 细 胞 膜 并 通 过 胞 饮 进 入 目 的 细 胞 的 细 胞 质 实 验 材 料 2 HBS(pH7.10);2M CaCl 2 ;TE (ph8.0); 质 粒 DNA; 培 养 的 真 核 细 胞 ;CO 2 培 养 箱 等 实 验 方 法 1. 转 染 的 前 一 天 在 35mm 培 养 皿 中 植 入 细 胞 ( 约 个 细 胞 ), 使 得 第 二 天 转 染 时 细 胞 汇 合 率 达 到 50-80%; 2. 转 染 前 1-4 小 时, 换 成 不 含 血 清 和 双 抗 的 培 养 基 ; 3. 在 1.5ml 无 菌 的 离 心 管 中 混 合 下 列 药 品 : 15.5 l 2M CaCl 2 最 多 10 g 质 粒 DNA 补 加 TE (ph 8.0) 至 125 l; 4. 在 无 菌 的 35mm 平 皿 中 加 入 125 l 2 HBS(pH7.10), 然 后 逐 滴 加 入 上 述 混 合 物, 一 边 加 一 边 充 分 混 合, 使 磷 酸 钙 沉 淀 均 匀, 室 温 放 置 20 分 钟, 这 时 溶 液 将 有 非 常 小 的 磷 酸 钙 沉 淀 颗 粒 形 成 ; 5.20 分 钟 后, 将 混 合 物 加 入 细 胞 中,37 C 培 养 箱 中 培 养 4-8 小 时 ; 小 时 后, 用 含 血 清 的 完 全 培 养 基 替 换 旧 培 养 基,37 C 培 养 箱 中 继 续 培 养 ; 7. 在 转 染 后 小 时 将 细 胞 置 于 荧 光 显 微 镜 下 观 察 目 的 蛋 白 的 表 达 注 意 事 项 1. 所 有 操 作 都 必 须 在 无 菌 条 件 下 进 行 ;
28 2.2 HBS 2M CaCl 2 和 TE 须 经 0.22 m 滤 器 滤 菌 分 装 后 使 用 ; 3. 沉 淀 的 大 小 和 质 量 对 于 磷 酸 钙 转 染 的 成 功 至 关 重 要 在 实 验 中 使 用 的 每 种 试 剂 都 必 须 小 心 校 准, 保 证 质 量, 因 为 甚 至 偏 离 最 优 条 件 十 分 之 一 个 ph 都 会 导 致 磷 酸 钙 转 染 的 失 败 二 荧 光 法 确 定 含 有 目 的 基 因 的 EGFP 融 合 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 实 验 原 理 绿 色 荧 光 蛋 白 (Green fluorecent protein,gfp) 最 早 是 在 海 洋 生 物 水 母 (Aequorea victoria) 中 发 现 的 GFP 蛋 白 的 多 肽 链 中 含 有 特 殊 的 生 色 团 结 构, 可 在 紫 外 光 源 下 发 出 稳 定 的 绿 色 荧 光, 而 且 这 种 荧 光 发 射 无 需 外 加 辅 助 因 子 或 进 行 任 何 特 殊 处 理 GFP 标 记 分 子 最 常 作 为 标 记 物 来 追 踪 结 合 分 子 的 表 达 水 平 和 定 位, 或 作 为 检 测 环 境 变 化 或 蛋 白 相 互 作 用 的 指 标 目 前 广 泛 用 于 分 子 和 细 胞 生 物 学 各 个 领 域 实 验 材 料 转 染 后 的 真 核 细 胞 ; 倒 置 荧 光 显 微 镜 实 验 方 法 取 转 染 后 24-72hrs 的 细 胞, 置 于 倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察 含 有 目 的 基 因 的 EGFP 融 合 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 注 意 事 项 GFP 处 于 低 PH 值 环 境 中 可 能 失 去 荧 光 效 应
0 年 上 半 年 评 价 与 考 核 细 则 序 号 部 门 要 素 值 考 核 内 容 考 核 方 式 考 核 标 准 考 核 ( 扣 原 因 ) 考 评 得 3 安 全 生 产 目 30 无 同 等 责 任 以 上 道 路 交 通 亡 人 事 故 无 轻 伤 责 任 事 故 无 重 大 质 量
0 年 上 半 年 评 价 与 考 核 细 则 序 号 部 门 要 素 值 考 核 内 容 考 核 方 式 考 核 标 准 无 同 等 责 任 以 上 道 路 交 通 亡 人 事 故 3 无 轻 伤 责 任 事 故 目 标 30 及 事 无 重 大 质 量 工 作 过 失 故 管 无 其 他 一 般 责 任 事 故 理 在 公 司 文 明 环 境 创 建 中, 无 工 作 过 失 及 被 追 究 的
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( 一 ) 系 统 整 体 操 作 流 程 简 述 3 ( 二 ) 系 统 中 各 角 色 操 作 功 能 说 明 5 1. 学 院 管 理 员 5 2. 教 学 院 长 8 3. 指 导 教 师 10 4. 答 辩 组 组 长 12 5. 学 生 12 6. 系 统 管 理 员 15 ( 一 ) 论 文 系 统 常 见 问 题 16 ( 二 ) 论 文 查 重 常 见 问 题 22 1 2 主
龚 亚 夫 在 重 新 思 考 基 础 教 育 英 语 教 学 的 理 念 一 文 中 援 引 的 观 点 认 为 当 跳 出 本 族 语 主 义 的 思 维 定 式 后 需 要 重 新 思 考 许 多 相 连 带 的 问 题 比 如 许 多 发 音 的 细 微 区 别 并 不 影 响 理 解 和
语 音 语 篇 语 感 语 域 林 大 津 毛 浩 然 改 革 开 放 以 来 的 英 语 热 引 发 了 大 中 小 学 英 语 教 育 整 体 规 划 问 题 在 充 分 考 虑 地 区 学 校 和 个 体 差 异 以 及 各 家 观 点 的 基 础 上 遵 循 实 事 求 是 逐 级 定 位 逐 层 分 流 因 材 施 教 的 原 则 本 研 究 所 倡 导 的 语 音 语 篇 语 感 语 域
说 明 为 了 反 映 教 运 行 的 基 本 状 态, 为 校 和 院 制 定 相 关 政 策 和 进 行 教 建 设 与 改 革 提 供 据 依 据, 校 从 程 资 源 ( 开 类 别 开 量 规 模 ) 教 师 结 构 程 考 核 等 维 度, 对 2015 年 春 季 期 教 运 行 基
内 部 资 料 东 北 师 范 大 教 运 行 基 本 状 态 据 报 告 2015 年 春 季 期 教 务 处 2015 年 10 月 27 日 说 明 为 了 反 映 教 运 行 的 基 本 状 态, 为 校 和 院 制 定 相 关 政 策 和 进 行 教 建 设 与 改 革 提 供 据 依 据, 校 从 程 资 源 ( 开 类 别 开 量 规 模 ) 教 师 结 构 程 考 核 等 维 度,
(2015-2016-2)-0004186-04205-1 140242 信 号 与 系 统 Ⅰ 学 科 基 础 必 修 课 37 37 1 教 203 17 周 2016 年 06 月 13 日 (08:00-09:35) (2015-2016-2)-0004186-04205-1 141011
关 于 2015-2016 学 年 第 二 学 期 期 末 周 内 考 试 时 间 地 点 安 排 选 课 课 号 班 级 名 称 课 程 名 称 课 程 性 质 合 考 人 数 实 际 人 数 考 试 教 室 考 试 段 考 试 时 间 (2015-2016-2)-0006178-04247-1 130101 测 试 技 术 基 础 学 科 基 础 必 修 课 35 35 1 教 401 17 周
文 化 记 忆 传 统 创 新 与 节 日 遗 产 保 护 根 据 德 国 学 者 阿 斯 曼 的 文 化 记 忆 理 论 仪 式 与 文 本 是 承 载 文 化 记 忆 的 两 大 媒 体 在 各 种 仪 式 行 为 中 节 日 以 其 高 度 的 公 共 性 有 组 织 性 和 历 史 性 而 特 别 适 用 于 文 化 记 忆 的 储 存 和 交 流 节 日 的 文 化 功 能 不 仅 在 于
科 学 出 版 社 科 学 出 版 社 前 言 本 书 是 针 对 普 通 高 等 院 校 经 济 类 和 工 商 管 理 类 本 科 专 业 财 务 管 理 学 的 教 学 需 求, 结 合 教 育 部 经 济 管 理 类 本 科 财 务 管 理 学 课 程 教 学 大 纲 编 写 而 成 的 本 书 执 笔 者 都 是 长 期 工 作 在 财 务 管 理 教 学 一 线 的 专 业 教 师,
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- 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - 做 四 个 全 面 的 宣 传 者 实 践 者 - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - - 18 - - 19 - - 20 - 创 新 调 处 新 机 制 构 筑 稳 定 防 火 墙 - 21 - - 22 - - 23
何 秋 琳 张 立 春 视 觉 学 习 研 究 进 展 视 觉 注 意 视 觉 感 知
第 卷 第 期 年 月 开 放 教 育 研 究 何 秋 琳 张 立 春 华 南 师 范 大 学 未 来 教 育 研 究 中 心 广 东 广 州 随 着 图 像 化 技 术 和 电 子 媒 体 的 发 展 视 觉 学 习 也 逐 步 发 展 为 学 习 科 学 的 一 个 研 究 分 支 得 到 研 究 人 员 和 教 育 工 作 者 的 广 泛 关 注 基 于 此 作 者 试 图 对 视 觉 学 习
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: 周 晓 虹 : - -., - - - -. :( ), -,.( ),,, -. - ( ).( ) ', -,,,,, ( ).( ),,, -., '.,, :,,,, :,,,, ,,,,, :,, (.,, );, (, : ), (.., ;. &., ;.. &.., ;, ;, ),,,,,,, ( ) ( ),,,,.,,,,,, : ;, ;,.,,,,, (., : - ),,,,
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中 国 应 对 气 候 变 化 的 政 策 与 行 动 2013 年 度 报 告 国 家 发 展 和 改 革 委 员 会 二 〇 一 三 年 十 一 月 100% 再 生 纸 资 源 目 录 前 言... 1 一 应 对 气 候 变 化 面 临 的 形 势... 3 二 完 善 顶 层 设 计 和 体 制 机 制... 4 三 减 缓 气 候 变 化... 8 四 适 应 气 候 变 化... 20
抗 战 时 期 国 民 政 府 的 银 行 监 理 体 制 探 析 % # % % % ) % % # # + #, ) +, % % % % % % % %
抗 战 时 期 国 民 政 府 的 银 行 监 理 体 制 探 析 王 红 曼 抗 战 时 期 国 民 政 府 为 适 应 战 时 经 济 金 融 的 需 要 实 行 由 财 政 部 四 联 总 处 中 央 银 行 等 多 家 机 构 先 后 共 同 参 与 的 多 元 化 银 行 监 理 体 制 对 战 时 状 态 下 的 银 行 发 展 与 经 营 安 全 进 行 了 大 规 模 的 设 计 与
第 期 王 兴 涛 等 猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 种 猪 精 液 分 离 株 的 鉴 定 及 进 化 分 析 病 料 毒 株 及 细 胞 试 剂 引 物 设 计 提 取 及 基 因 克 隆 及 测 序
河 南 农 业 科 学 王 兴 涛 罗 俊 滕 蔓 樊 剑 鸣 鄂 巍 禹 斌 刘 力 张 改 平 利 用 技 术 对 河 南 省 某 规 模 化 猪 场 乙 脑 疑 似 病 例 的 种 猪 精 液 进 行 分 析 从 部 分 样 本 中 扩 增 出 与 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 基 因 和 基 因 具 有 高 度 同 源 性 的 预 期 产 物 在 日 龄 乳 鼠 脑 内 接 种 种 猪
人 工 抗 原 的 鉴 定
生 物 技 术 通 报 张 海 棠 王 自 良 刘 耀 东 传 统 的 理 化 分 析 方 法 在 食 品 污 染 检 测 方 面 发 挥 了 重 要 的 作 用 但 均 存 在 一 定 的 缺 陷 急 需 建 立 快 速 高 效 的 检 测 方 法 食 品 污 染 免 疫 检 测 是 一 种 新 型 的 分 析 方 法 与 理 化 分 析 方 法 相 比 具 有 省 时 省 力 费 用 低 廉 便
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机 电 一 级 注 册 建 造 师 继 续 教 育 培 训 广 东 培 训 点 网 上 报 名 操 作 使 用 手 册 (2013 年 1 月, 第 一 版 ) 第 一 章 个 人 注 册 与 个 人 信 息 管 理 1. 个 人 注 册 ( 请 每 人 只 申 请 一 个 注 册 号, 如 果 单 位 批 量 报 班 单 位 帮 申 请 注 册, 不 需 个 人 再 注 册 ) 首 次 报 班,
18 上 报 该 学 期 新 生 数 据 至 阳 光 平 台 第 一 学 期 第 四 周 至 第 六 周 19 督 促 学 习 中 心 提 交 新 增 专 业 申 请 第 一 学 期 第 四 周 至 第 八 周 20 编 制 全 国 网 络 统 考 十 二 月 批 次 考 前 模 拟 题 第 一 学
1 安 排 组 织 全 国 网 络 统 考 九 月 批 次 网 上 考 前 辅 导 第 一 学 期 第 一 周 统 考 考 前 半 个 月 2 下 发 全 国 网 络 统 考 九 月 批 次 准 考 证 第 一 学 期 第 一 周 导 出 下 半 年 成 人 本 科 学 士 学 位 英 语 统 一 考 试 报 考 3 信 息 第 一 学 期 第 一 周 4 教 学 计 划 和 考 试 计 划 上 网,
国债回购交易业务指引
附 件 1 上 海 证 券 交 易 所 新 质 押 式 国 债 回 购 交 易 业 务 指 引 一 总 述 根 据 上 海 证 券 交 易 所 债 券 交 易 实 施 细 则, 上 证 所 将 于 2006 年 5 月 8 日 起 推 出 新 质 押 式 国 债 回 购 新 质 押 式 回 购 与 现 行 质 押 式 回 购 相 比 区 别 主 要 在 以 下 几 个 方 面 :1 新 质 押 式
编号：
编 号 : 企 业 内 高 技 能 人 才 培 养 评 价 实 施 方 案 ( 仅 适 用 于 企 业 特 有 行 业 特 有 工 种 ) 实 施 单 位 ( 公 章 ) 申 报 日 期 年 _ 月 日 1 企 业 内 高 技 能 人 才 培 养 评 价 项 目 实 施 方 案 申 报 表 项 目 名 称 等 级 项 目 性 质 课 时 申 报 单 位 联 系 人 通 讯 地 址 电 话 手 机 电
中 中 中 中 部 中 岗 位 条 件 历 其 它 历 史 师 地 理 师 生 物 师 体 与 健 康 师 04 05 06 07 从 事 中 历 史 工 从 事 中 地 理 工 从 事 中 生 物 工 从 事 中 体 与 健 康 工 2. 课 程 与 论 ( 历 史 ); 2. 科 ( 历 史 )
中 中 中 部 中 26 年 系 统 事 业 公 开 计 划 岗 位 条 件 历 其 它 数 师 英 语 师 物 理 师 02 0 从 事 中 数 工 从 事 中 英 语 工 从 事 中 物 理 工 2. 课 程 与 论 ( 数 ); 2. 科 ( 数 );. 数 ; 4. 基 础 数 ; 5. 计 算 数 ; 6. 概 率 论 与 数 理 统 计 ; 7. 应 用 数 ; 8. 数. 课 程 与
2015-2016 学 年 第 二 学 期 集 中 考 试 安 排 (18 周 ) 考 试 日 期 :6 月 27 日 星 期 一 8:10-9:50 第 二 公 共 教 学 楼 A 区 A303 10811046 高 等 数 学 ( 理 二 2) 复 材 1501-2 材 料 科 学 与 工 程
考 试 时 间 2015-2016 学 年 第 二 学 期 集 中 考 试 安 排 (18 周 ) 考 试 日 期 :6 月 27 日 星 期 一 考 场 所 在 教 学 楼 ( 教 学 区 ) 考 试 教 室 课 程 号 课 程 名 考 生 所 在 专 业 ( 班 级 ) 考 生 所 属 学 院 8:10-9:50 第 二 公 共 教 学 楼 A 区 A101 10811026 高 等 数 学 (
HSK( 一 级 ) 考 查 考 生 的 日 常 汉 语 应 用 能 力, 它 对 应 于 国 际 汉 语 能 力 标 准 一 级 欧 洲 语 言 共 同 参 考 框 架 (CEF) A1 级 通 过 HSK( 一 级 ) 的 考 生 可 以 理 解 并 使 用 一 些 非 常 简 单 的 汉 语
新 汉 语 水 平 考 试 HSK 为 使 汉 语 水 平 考 试 (HSK) 更 好 地 服 务 于 汉 语 学 习 者, 中 国 国 家 汉 办 组 织 中 外 汉 语 教 学 语 言 学 心 理 学 和 教 育 测 量 学 等 领 域 的 专 家, 在 充 分 调 查 了 解 海 外 实 际 汉 语 教 学 情 况 的 基 础 上, 吸 收 原 有 HSK 的 优 点, 借 鉴 近 年 来 国
Microsoft Word - 第7章 图表反转形态.doc
第 七 章 图 表 反 转 形 态 我 们 知 道 市 场 趋 势 共 有 三 种 : 上 升 趋 势 下 降 趋 势 和 横 向 整 理 市 场 的 价 格 波 动 都 是 运 行 在 这 三 种 趋 势 中, 所 有 的 走 势 都 是 这 三 种 趋 势 的 排 列 组 合 如 图 市 场 趋 势 结 构 示 意 图 7-1 所 示 市 场 趋 势 结 构 示 意 图 7-1 图 市 场 趋
Microsoft Word - 中节能_工业项目节能评估审查导则Draft.doc
0 -------------------------------------------------------------------------------- 2 ----------------------------------------------------------------------------- 2 节 评 ----------------------------------------------------------------------------------------------------
修改版-操作手册.doc
职 称 信 息 系 统 升 级 指 南 须 使 用 IE9 及 其 以 上 版 本 浏 览 器 或 谷 歌 浏 览 器 登 录 www.njrs.gov.cn 南 京 市 职 称 ( 职 业 资 格 ) 工 作 领 导 小 组 办 公 室 2016 年 5 月 目 录 一 申 报 人 员 操 作 指 南...1 1.1 职 称 初 定 申 报...1 1.1.1 职 称 初 定 基 础 信 息 填
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附 件 1 国 际 中 药 专 业 高 级 技 术 职 称 评 审 条 件 及 报 名 材 料 一 系 列 ( 一 ) 中 1 高 级 专 科 ( 副 ) 高 级 专 科 ( 副 ) 1 取 得 中 专 科 职 称 后, 独 立 从 事 中 临 床 实 践 5 年 以 上 2 取 得 中 博 士 学 位 后, 临 床 实 践 2 年 以 上 3 取 得 中 硕 士 学 位 后, 临 床 实 践 7
张 荣 芳 中 山 大 学 历 史 系 广 东 广 州 张 荣 芳 男 广 东 廉 江 人 中 山 大 学 历 史 系 教 授 博 士 生 导 师 我 们 要 打 破 以 前 学 术 界 上 的 一 切 偶 像 以 前 学 术 界 的 一 切 成 见 屏 除 我 们 要 实 地 搜 罗 材 料 到 民 众 中 寻 方 言 到 古 文 化 的 遗 址 去 发 掘 到 各 种 的 人 间 社 会 去
( 二 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 培 养 人 的 创 新 精 神,,,,,,,,,,,,, [ ],,,,,,,,,,, :, ;,,,,,,? ( 三 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 全 体 学 生 都 获 得 全 面 发 展,, [ ],,,,,,,,,,,
![( 二 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 培 养 人 的 创 新 精 神,,,,,,,,,,,,, [ ],,,,,,,,,,, :, ;,,,,,,? ( 三 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 全 体 学 生 都 获 得 全 面 发 展,, [ ],,,,,,,,,,,](/thumbs/39/20125331.jpg "( 二 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 培 养 人 的 创 新 精 神,,,,,,,,,,,,, [ ],,,,,,,,,,, :, ;,,,,,,? ( 三 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 全 体 学 生 都 获 得 全 面 发 展,, [ ],,,,,,,,,,,")
( ) ( )... 李 雪 岩, 龙 耀 (. 广 西 民 族 大 学 商 学 院, 广 西 南 宁 ;. 中 山 大 学 教 育 学 院, 广 东 广 州 ) : 高 等 教 育 是 专 业 教 育 高 考 是 为 高 等 教 育 服 务 的, 是 为 高 等 专 业 教 育 选 拔 有 专 业 培 养 潜 质 的 人 才 现 行 高 考 制 度 忽 略 专 业 潜 质 的 因 素, 过 份 强
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国 内 各 期 货 交 易 所 关 于 合 约 限 仓 方 面 的 规 定 上 海 期 货 交 易 所 经 纪 会 员 非 经 纪 会 员 和 客 户 的 期 货 合 约 在 不 同 时 期 限 仓 的 具 体 比 例 和 数 额 如 下 : ( 单 位 : ) 合 约 挂 牌 至 交 割 月 前 第 二 月 的 最 后 一 个 交 易 日 交 割 月 前 第 一 月 交 割 月 份 某 一 期 货
金 不 少 于 800 万 元, 净 资 产 不 少 于 960 万 元 ; (3) 近 五 年 独 立 承 担 过 单 项 合 同 额 不 少 于 1000 万 元 的 智 能 化 工 程 ( 设 计 或 施 工 或 设 计 施 工 一 体 ) 不 少 于 2 项 ; (4) 近 三 年 每 年
工 程 设 计 与 施 工 资 质 标 准 一 总 则 建 筑 智 能 化 工 程 设 计 与 施 工 资 质 标 准 ( 一 ) 为 了 加 强 对 从 事 建 筑 智 能 化 工 程 设 计 与 施 工 企 业 的 管 理, 维 护 建 筑 市 场 秩 序, 保 证 工 程 质 量 和 安 全, 促 进 行 业 健 康 发 展, 结 合 建 筑 智 能 化 工 程 的 特 点, 制 定 本 标
一 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 的 概 述 学 位 论 文 是 对 研 究 生 进 行 科 学 研 究 或 承 担 专 门 技 术 工 作 的 全 面 训 练, 是 培 养 研 究 生 创 新 能 力, 综 合 运 用 所 学 知 识 发 现 问 题, 分 析 问 题 和 解 决
上 海 市 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 基 本 要 求 和 评 价 指 标 体 系 ( 试 行 ) 上 海 市 学 位 委 员 会 办 公 室 二 O 一 二 年 三 月 一 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 的 概 述 学 位 论 文 是 对 研 究 生 进 行 科 学 研 究 或 承 担 专 门 技 术 工 作 的 全 面 训 练, 是 培 养 研 究 生 创
2 任 务 目 标 任 务 实 施 学 一 学 1.1.1 安 全 用 电 1. 安 全 用 电 的 意 义 2. 人 体 触 电 的 基 本 知 识 1 2 1mA 10 30mA 50mA 100mA 750ms 40 100Hz
项 目 1 安 全 用 电 及 触 电 急 救 项 目 内 容 电 有 电 老 虎 之 称, 从 事 电 气 操 作 的 人 员 不 但 应 该 拥 有 一 定 的 操 作 技 能, 还 必 须 首 先 掌 握 进 行 电 气 作 业 时 的 人 身 安 全 电 气 消 防 与 触 电 急 救 常 识 本 项 目 的 主 要 内 容 有 : 安 全 用 电 常 识 节 约 用 电 的 意 义 和 措
随着执业中医师资格考试制度的不断完善，本着为我校中医学专业认证服务的目的，本文通过对我校中医类毕业生参加2012年和2013年的中医执业医师考试成绩及通过率、掌握率进行分析，并与全国的平均水平进行差异比较分析，以此了解我校执业中医师考试的现状，进而反映我校中医类课程总体教学水平，发现考核知识模块教学中存在的不足，反馈给相关学院和教学管理部门，以此提高教学和管理水平。
2012-2013 中 医 类 别 执 业 医 师 综 合 笔 试 成 绩 分 析 反 馈 报 告 教 务 处 二 零 一 三 年 三 月 1 目 录 1 前 言 3 2 2012-2013 中 医 类 别 执 业 医 师 综 合 笔 试 成 绩 分 析 反 馈 报 告 4 附 件 1:2012 年 中 医 类 别 医 师 资 格 综 合 笔 试 院 校 学 科 成 绩 分 析 报 告 附 件 2:2013
黄 金 原 油 总 持 仓 增 长, 同 比 增 幅 分 别 为 4.2% 和 4.1% 而 铜 白 银 以 及 玉 米 则 出 现 减 持, 减 持 同 比 减 少 分 别 为 9.4%,9.4% 以 及 6.5% 大 豆, 豆 粕 结 束 连 续 4 周 总 持 仓 量 增 长, 出 现 小 幅
小 麦 净 多 持 仓 增 加, 豆 油 豆 粕 净 多 持 仓 减 少 美 国 CFTC 持 仓 报 告 部 门 : 市 场 研 究 与 开 发 部 类 型 : 量 化 策 略 周 报 日 期 :212 年 5 月 7 日 电 话 :592-5678753 网 址 :www.jinyouqh.com 主 要 内 容 : 根 据 美 国 CFTC 公 布 的 数 据, 本 报 告 中 的 11 个
课程类 别
美 声 演 唱 方 向 培 养 方 案 一 培 养 目 标 本 方 向 要 求 学 生 德 智 体 美 全 面 发 展, 培 养 能 在 文 艺 团 体 从 事 声 乐 演 唱 及 能 在 艺 术 院 校 从 事 本 方 向 教 学 的 高 级 门 人 才 二 培 养 规 格 本 方 向 学 生 应 系 统 掌 握 声 乐 演 唱 方 面 的 理 论 和 技 能, 具 备 较 高 的 声 乐 演 唱
一 从 分 封 制 到 郡 县 制 一 从 打 虎 亭 汉 墓 说 起
县 乡 两 级 的 政 治 体 制 改 革 如 何 建 立 民 主 的 合 作 新 体 制 县 乡 人 大 运 行 机 制 研 究 课 题 组 引 言 一 从 分 封 制 到 郡 县 制 一 从 打 虎 亭 汉 墓 说 起 二 密 县 在 周 初 是 两 个 小 国 密 国 和 郐 国 三 密 县 的 第 一 任 县 令 卓 茂 四 明 清 时 代 的 密 县 二 从 集 中 的 动 员 体
评 委 : 李 炎 斌 - 个 人 技 术 标 资 信 标 初 步 审 查 明 细 表 序 号 投 标 单 位 投 标 函 未 按 招 标 文 件 规 定 填 写 漏 填 或 内 容 填 写 错 误 的 ; 不 同 投 标 人 的 投 标 文 件 由 同 一 台 电 脑 或 同 一 家 投 标 单
评 委 : 李 炎 斌 - 个 人 清 标 评 审 明 细 表 评 审 因 素 序 号 投 标 单 位 清 标 评 审 1 深 圳 市 创 捷 科 技 有 限 合 格 2 四 川 川 大 智 胜 软 件 股 份 有 限 合 格 3 北 京 航 天 长 峰 科 技 工 业 集 团 有 限 公 司 合 格 4 深 圳 中 兴 力 维 技 术 有 限 合 格 5 深 圳 键 桥 通 讯 技 术 股 份 有
抗 日 战 争 研 究 年 第 期
田 子 渝 武 汉 抗 战 时 期 是 国 共 第 二 次 合 作 的 最 好 时 期 在 国 共 合 作 的 基 础 上 出 现 了 抗 日 救 亡 共 御 外 侮 的 局 面 这 个 大 好 局 面 的 出 现 与 中 共 长 江 局 的 丰 功 伟 绩 是 分 不 开 的 但 长 期 以 来 由 于 有 一 个 王 明 的 右 倾 错 误 直 接 影 响 了 对 它 的 全 面 科 学 准 确
第 期 马 海 燕 等 臭 氧 水 和 超 声 波 协 同 作 用 在 速 冻 西 兰 花 中 的 应 用 研 究 材 料 与 方 法 臭 氧 水 的 制 取 臭 氧 水 处 理 超 声 波 处 理 超 声 波 和 臭 氧 水 协 同 处 理 对 照 处 理 邻 苯 二 胺 分 光 光 度 法 测
第 卷 第 期 年 月 食 品 与 生 物 技 术 学 报 臭 氧 水 和 超 声 波 协 同 作 用 在 速 冻 西 兰 花 中 的 应 用 研 究 马 海 燕 张 慜 孙 金 才 食 品 科 学 与 技 术 国 家 重 点 实 验 室 江 南 大 学 江 苏 无 锡 海 通 食 品 集 团 股 份 有 限 公 司 浙 江 慈 溪 由 于 速 冻 蔬 菜 加 工 过 程 中 的 热 烫 处 理 对
全国建筑市场注册执业人员不良行为记录认定标准（试行）.doc
- 1 - - 2 - 附 件 全 国 建 筑 市 场 注 册 执 业 人 员 不 良 记 录 认 定 标 准 ( 试 行 ) 说 明 为 了 完 善 建 筑 市 场 注 册 执 业 人 员 诚 信 体 系 建 设, 规 范 执 业 和 市 场 秩 序, 依 据 相 关 法 律 法 规 和 部 门 规 章, 根 据 各 行 业 特 点, 我 部 制 订 了 全 国 建 筑 市 场 注 册 执 业 人
1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路 2
简 略 版 本 :2015 3 10 2016 2021 全 球 卫 生 部 门 病 毒 性 肝 炎 战 略 2016 2021 2015 3 12 2012 2010 2014 2015 2016 2021 140 55% 35% 5 15% 5 20% 2.4 1.3 1.5 1 1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路
导 数 和 微 分 的 概 念 导 数 的 几 何 意 义 和 物 理 意 义 函 数 的 可 导 性 与 连 续 性 之 间 的 关 系 平 面 曲 线 的 切 线 和 法 线 导 数 和 微 分 的 四 则 运 算 基 本 初 等 函 数 的 导 数 复 合 函 数 反 函 数 隐 函 数 以
2015 年 考 研 数 学 二 考 试 大 纲 考 试 科 目 : 高 等 数 学 线 性 代 数 考 试 形 式 和 试 卷 结 构 一 试 卷 满 分 及 考 试 时 间 试 卷 满 分 为 150 分, 考 试 时 间 为 180 分 钟. 二 答 题 方 式 答 题 方 式 为 闭 卷 笔 试. 三 试 卷 内 容 结 构 高 等 教 学 约 78% 线 性 代 数 约 22% 四 试 卷
物 流 从 业 人 员 职 业 能 力 等 级 证 书 分 为 四 个 级 别, 分 别 为 初 级 助 理 级 中 级 和 高 级 ; 采 购 从 业 人 员 职 业 能 力 等 级 证 书 分 为 三 个 级 别, 分 别 为 中 级 高 级 和 注 册 级 请 各 有 关 单 位 按 照 通
物 联 培 字 2016 16 号 各 有 关 单 位 : 为 适 应 国 家 一 带 一 路 战 略 实 施 和 物 流 产 业 转 型 升 级 对 人 才 的 新 要 求, 确 保 物 流 采 购 人 才 培 养 工 作 有 序 衔 接 和 持 续 健 康 发 展, 参 照 国 际 惯 例, 中 国 物 流 与 采 购 联 合 会 ( 以 下 简 称 中 物 联 ) 经 研 究 决 定, 以 物
¹ º ¹ º 农 业 流 动 人 口 是 指 户 口 性 质 为 农 业 户 口 在 流 入 地 城 市 工 作 生 活 居 住 一 个 月 及 以 上 的 流 动 人 口 非 农 流 动 人 口 是 指 户 口 性 质 为 非 农 户 口 在 流 入 地 城 市 工 作 生 活 居 住 一 个
¹ 改 革 开 放 年 来 人 口 流 动 规 模 持 续 增 加 对 我 国 社 会 经 济 的 持 续 发 展 起 到 了 重 要 作 用 为 全 面 了 解 我 国 流 动 人 口 生 存 状 况 准 确 把 握 流 动 人 口 发 展 规 律 和 趋 势 不 断 加 强 流 动 人 口 服 务 管 理 引 导 人 口 有 序 流 动 合 理 分 布 国 家 人 口 计 生 委 于 年 月 启
3 复 试 如 何 准 备 4 复 试 成 绩 计 算 5 复 试 比 例 6 复 试 类 型 7 怎 么 样 面 对 各 种 复 试 04 05
1 复 试 流 程 2 复 试 考 查 形 式 02 03 3 复 试 如 何 准 备 4 复 试 成 绩 计 算 5 复 试 比 例 6 复 试 类 型 7 怎 么 样 面 对 各 种 复 试 04 05 2 怎 样 给 导 师 留 下 良 好 的 第 一 印 象 把 握 进 门 时 机 1 面 试 中 穿 着 的 瞒 天 过 海 3 无 声 胜 有 声 的 肢 体 语 言 育 4 眼 睛 是 心
网 球 / 排 球 1 教 师 硕 士 四 级 男 性 诊 断 教 研 室 1 教 师 博 士 或 硕 士 六 级 本 科 阶 段 为 临 床 医 学 专 业, 男 士 温 病 教 研 室 2 教 师 博 士 或 硕 士 六 级 中 医 专 业 中 医 诊 断 教 研 室 诊 断 学 / 中 医 诊
校 本 部 工 程 项 目 管 理 或 土 木 工 程 医 学 类 / 计 算 机 / 图 书 馆 专 业 1 专 技 硕 士 以 上 六 级 1 专 技 硕 士 以 上 六 级 1 年 以 上 工 程 造 价 管 理 或 现 场 施 工 管 理 经 验 的 ( 限 男 性 ) 中 医 药 类 专 业 1 编 辑 博 士 六 级 医 学 或 生 物 学 专 业 医 学 或 生 物 学 专 业 2 实
工 程 勘 察 资 质 标 准 根 据 建 设 工 程 勘 察 设 计 管 理 条 例 和 建 设 工 程 勘 察 设 计 资 质 管 理 规 定, 制 定 本 标 准 一 总 则 ( 一 ) 本 标 准 包 括 工 程 勘 察 相 应 专 业 类 型 主 要 专 业 技 术 人 员 配 备 技 术
住 房 和 城 乡 建 设 部 关 于 印 发 工 程 勘 察 资 质 标 准 的 通 知 建 市 [2013]9 号 各 省 自 治 区 住 房 和 城 乡 建 设 厅, 北 京 市 规 划 委, 天 津 上 海 市 建 设 交 通 委, 重 庆 市 城 乡 建 设 委, 新 疆 生 产 建 设 兵 团 建 设 局, 总 后 基 建 营 房 部 工 程 局, 国 务 院 有 关 部 门 建 设 司,
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工 程 硕 士 数 学 考 试 大 纲 与 要 求 ( 包 括 高 等 数 学 和 线 性 代 数 ) 一 函 数 极 限 与 连 续 第 一 部 分 : 高 等 数 学 考 试 内 容 函 数 的 概 念 及 表 示 法 函 数 的 有 界 性 单 调 性 周 期 性 和 奇 偶 性 复 合 函 数 反 函 数 分 段 函 数 和 隐 函 数 基 本 初 等 函 数 的 性 质 及 其 图 形 初
评 委 : 徐 岩 宇 - 个 人 技 术 标 资 信 标 初 步 审 查 明 细 表 序 号 投 标 单 位 投 标 函 未 按 招 标 文 件 规 定 填 写 漏 填 或 内 容 填 写 错 误 的 ; 不 同 投 标 人 的 投 标 文 件 由 同 一 台 电 脑 或 同 一 家 投 标 单
评 委 : 徐 岩 宇 - 个 人 清 标 评 审 明 细 表 评 审 因 素 序 号 投 标 单 位 清 标 评 审 1 深 圳 市 创 捷 科 技 有 限 合 格 2 四 川 川 大 智 胜 软 件 股 份 有 限 合 格 3 北 京 航 天 长 峰 科 技 工 业 集 团 有 限 公 司 合 格 4 深 圳 中 兴 力 维 技 术 有 限 合 格 5 深 圳 键 桥 通 讯 技 术 股 份 有
附件1：
附 件 5 增 列 硕 士 专 业 学 位 授 权 点 申 请 表 硕 士 专 业 学 位 类 别 ( 工 程 领 域 ): 工 程 硕 士 ( 控 制 工 程 领 域 ) 申 报 单 位 名 称 : 上 海 工 程 技 术 大 学 一 申 请 增 列 硕 士 专 业 学 位 授 权 点 论 证 报 告 申 请 增 列 硕 士 专 业 学 位 授 权 点 论 证 报 告 一 专 业 人 才 需 求
深圳市新亚电子制程股份有限公司
证 券 代 码 :002388 证 券 简 称 : 新 亚 制 程 公 告 编 号 :2016-053 深 圳 市 新 亚 电 子 制 程 股 份 有 限 公 司 2016 年 第 二 次 临 时 股 东 大 会 决 议 公 告 本 公 司 及 董 事 会 全 体 成 员 保 证 公 告 内 容 真 实 准 确 和 完 整, 不 存 在 虚 假 记 载 误 导 性 陈 述 或 者 重 大 遗 漏 特
中 国 软 科 学 年 第 期!!!
山 寨 模 式 的 形 成 机 理 及 其 对 组 织 创 新 的 启 示 山 寨 模 式 的 形 成 机 理 及 其 对 组 织 创 新 的 启 示 陶 厚 永 李 燕 萍 骆 振 心 武 汉 大 学 经 济 与 管 理 学 院 武 汉 大 学 中 国 产 学 研 合 作 问 题 研 究 中 心 湖 北 武 汉 北 京 大 学 经 济 研 究 所 光 华 天 成 博 士 后 工 作 站 北 京 本
一 六 年 级 下 册 教 科 书 总 体 说 明 ( 一 ) 教 学 内 容 本 册 教 科 书 一 共 安 排 了 5 个 教 学 单 元, 其 中 前 4 个 单 元 为 新 知 识, 第 五 单 元 是 对 整 个 小 学 阶 段 所 学 数 学 知 识 系 统 的 整 理 和 复 习
西 南 师 大 版 小 学 数 学 六 年 级 下 册 教 科 书 分 析 及 教 学 建 议 重 庆 市 教 育 科 学 研 究 院 李 光 树 一 六 年 级 下 册 教 科 书 总 体 说 明 ( 一 ) 教 学 内 容 本 册 教 科 书 一 共 安 排 了 5 个 教 学 单 元, 其 中 前 4 个 单 元 为 新 知 识, 第 五 单 元 是 对 整 个 小 学 阶 段 所 学 数 学
一 开 放 性 的 政 策 与 法 规 二 两 岸 共 同 的 文 化 传 承 三 两 岸 高 校 各 自 具 有 专 业 优 势 远 见 杂 志 年 月 日
河 北 师 范 大 学 学 报 新 时 期 海 峡 两 岸 高 校 开 放 招 生 问 题 探 讨 郑 若 玲 王 晓 勇 海 峡 两 岸 高 校 开 放 招 生 是 新 时 期 推 进 海 峡 两 岸 高 等 教 育 交 流 与 合 作 的 重 要 尝 试 系 统 梳 理 改 革 开 放 以 来 两 岸 招 生 政 策 与 就 学 人 数 发 展 变 化 的 历 史 进 程 可 发 现 促 进 两
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附 件 4: 药 品 补 充 申 请 注 册 事 项 及 申 报 资 料 要 求 一 注 册 事 项 ( 一 ) 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 审 批 的 补 充 申 请 事 项 : 1. 持 有 新 药 证 书 的 药 品 生 产 企 业 申 请 该 药 品 的 批 准 文 号 2. 使 用 药 品 商 品 名 称 3. 增 加 中 药 的 功 能 主 治 天 然 药 物 适 应 症
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工 业 品 专 刊 浙 江 出 入 境 检 验 检 疫 局 政 策 研 究 室 (WTO 研 究 室 ) 2010 年 05 月 27 日 目 录 工 作 动 态 浙 江 检 验 检 疫 局 专 家 参 加 欧 盟 洗 衣 机 洗 碗 机 能 效 及 生 态 设 计 通 报 评 议 会 1 浙 江 检 验 检 疫 局 举 办 出 口 玩 具 检 验 监 管 工 作 研 讨 会 2 台 州 出 口 鞋
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有 限 理 性 动 物 精 神 及 市 场 崩 溃 对 情 绪 波 动 与 交 易 行 为 的 实 验 研 究 林 树 俞 乔 资 本 市 场 的 经 验 表 明 市 场 参 与 主 体 投 资 者 的 情 绪 波 动 对 资 产 交 易 与 价 格 决 定 产 生 了 不 可 忽 视 的 影 响 但 是 现 有 文 献 尚 缺 乏 对 这 一 重 要 因 素 的 研 究 因 此 本 文 的 目 的
3. 稀 释 样 本 通 常 在 送 检 的 样 本 中, 各 种 细 胞 相 互 重 叠 分 析 仪 无 法 在 此 情 况 下 准 确 地 计 算 血 细 胞 的 数 目 或 统 计 血 细 胞 的 体 积 分 布 因 此, 在 分 析 仪 计 数 或 统 计 体 积 分 布 之 前, 需 要
1. 概 述 本 分 析 仪 采 用 电 阻 抗 法 检 测 红 细 胞 白 细 胞 和 血 小 板 的 数 目 以 及 体 积 分 布, 采 用 比 色 法 测 量 血 红 蛋 白 浓 度 在 此 基 础 之 上, 分 析 仪 计 算 出 其 余 参 数 的 结 果 2. 吸 取 样 本 在 全 血 工 作 模 式 下, 操 作 者 可 直 接 将 全 血 样 本 送 至 分 析 仪 进 行 采
作 为 生 产 者 式 文 本 的 女 性 主 义 通 俗 小 说 梅 丽 本 文 借 鉴 文 化 研 究 理 论 家 约 翰 费 斯 克 的 生 产 者 式 文 本 这 一 概 念 考 察 女 性 主 义 通 俗 小 说 的 文 本 特 征 写 作 策 略 和 微 观 政 治 意 义 女 性 主 义 通 俗 小 说 通 过 对 传 统 通 俗 小 说 的 挪 用 和 戏 仿 传 播 女 性 主 义
所 属 团 岗 位 名 称 研 究 方 向 应 聘 条 件 具 有 肉 品 科 学 与 技 术 食 品 科 学 专 业 背 景, 熟 悉 畜 禽 屠 宰 副 产 物 加 工 领 域 科 学 发 展 前 沿, 在 海 外 取 得 博 士 学 位 或 有 3 年 以 上 国 外 博 士 后 科 研 工
中 国 农 业 科 学 院 农 产 品 加 工 研 究 所 2016 年 青 年 英 才 计 划 人 才 招 聘 岗 位 和 应 聘 条 件 所 属 团 岗 位 名 称 研 究 方 向 应 聘 条 件 熟 悉 粮 油 加 工 品 质 学 植 物 蛋 白 质 工 程 活 性 短 肽 与 多 糖 等 研 究 领 域, 在 海 外 获 得 博 士 学 位 或 获 得 博 油 料 加 工 与 品 粮 油 加
对 当 前 小 说 艺 术 倾 向 的 分 析 陈 晓 明 人 民 性 是 一 个 现 代 性 概 念 近 年 来 艺 术 上 趋 于 成 熟 的 一 批 作 家 倾 向 于 表 现 底 层 民 众 苦 难 的 生 活 这 使 他 们 的 作 品 具 有 现 实 主 义 的 显 著 特 征 在 对 苦 难 生 活 的 把 握 中 对 人 物 性 格 和 命 运 的 展 示 中 这 些 小 说 在 人
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北 京 市 中 医 管 理 局 二 一 五 年 四 月 ... 1... 18 2015... 30 京 中 医 政 字 [2014]160 号 1 2 一 充 分 认 识 中 医 健 康 乡 村 建 设 工 作 的 重 要 意 义 二 建 立 健 全 工 作 保 障 机 制 2014 12 15 三 做 好 工 作 启 动 的 准 备 事 宜 1 2014 12 15 5-10 2014 12 15
第二讲 数列
Togisu XueD Persolized Eduio Developme Ceer 高 考 中 不 等 式 问 题 的 解 决 方 法 通 润 达 久 王 力 前 言 : 近 年 来 不 等 式 问 题 正 越 来 越 多 的 出 现 在 调 研 题 和 高 考 试 题 中 而 且 大 多 出 现 在 江 苏 高 考 的 填 空 压 轴 题 中 是 高 考 考 察 的 重 点 和 难 点 由 于
西 南 大 学 硕 士 学 位 论 文 网 络 购 物 动 机 问 卷 的 编 制 及 实 测 姓 名 : 曹 建 英 申 请 学 位 级 别 : 硕 士 专 业 : 基 础 心 理 学 指 导 教 师 : 张 进 辅 20090401 网 络 购 物 动 机 问 卷 的
上证指数
上 证 与 修 正 方 法 一 ( 一 ) 计 算 公 式 1. 上 证 指 数 系 列 均 采 用 派 许 加 权 综 合 价 格 指 数 公 式 计 算 2. 上 证 180 指 数 上 证 50 指 数 等 以 成 份 股 的 调 整 股 本 数 为 权 数 进 行 加 权 计 算, 计 算 公 式 为 : 报 告 期 指 数 =( 报 告 期 样 本 股 的 调 整 市 值 / 基 期 )
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名 称 生 命 科 学 学 院 083001 环 境 科 学 1 生 物 学 仅 接 收 院 内 调 剂, 初 试 分 数 满 足 我 院 生 物 学 复 试 最 低 分 数 线 生 命 科 学 学 院 071300 生 态 学 5 生 态 学 或 生 物 学 生 命 科 学 学 院 040102
华 中 师 范 大 学 2016 年 接 收 校 内 外 优 秀 硕 士 研 究 生 调 剂 信 息 表 名 称 经 济 与 工 商 管 理 学 院 020101 政 治 经 济 学 1 经 济 学 类 毕 业 学 校 与 报 考 学 校 不 低 于 我 校 办 学 层 次 经 济 与 工 商 管 理 学 院 020105 世 界 经 济 学 1 经 济 学 类 毕 业 学 校 与 报 考 学 校
ETF、分级基金规模、份额变化统计20130816
ETF 分 级 基 金 规 模 份 额 变 化 统 计 截 至 上 周 末, 全 市 场 股 票 型 ETF 规 模 约 1451 亿, 份 额 约 1215 亿,ETF 总 份 额 及 规 模 的 周 变 动 值 分 别 为 -23-44 亿, 份 额 与 规 模 均 下 降 ; 分 级 基 金 规 模 约 438 亿, 份 额 572 亿, 总 份 额 及 规 模 的 周 变 动 值 分 别 为
附 件 : 上 海 市 建 筑 施 工 企 业 施 工 现 场 项 目 管 理 机 构 关 键 岗 位 人 员 配 备 指 南 二 一 四 年 九 月 十 一 日 2
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朱 丽 明 柯 美 云 周 丽 雅 袁 耀 宗 罗 金 燕 候 晓 华 陈 旻 湖 滥 用 安 非 他 命 会 增 加 得 心 脏 病 的 风 险 据 美 国 科 技 新 闻 网 报 道 根 据 纽 约 路 透 社 报 道 一 份 新 的 研 究 显 示 青 年 及 成 年 人 若 滥 用 安 非 他 命 会 增 加 得 心 脏 病 的 风 险 美 国 德 州 大 学 西 南 医 学 中 心
六 业 年 限 四 年 制 本 科,3~6 年 弹 性 制 七 授 予 位 工 士 八 毕 业 分 要 求 生 物 工 程 专 业 分 及 比 例 分 配 总 计 通 识 必 科 基 础 必 专 业 必 必 选 践 专 业 公 共 小 计 理 论 其 他 小 计 理 论 验 小 计 理 论 验 选
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2006年顺德区高中阶段学校招生录取分数线
2014 年 顺 德 区 高 中 阶 段 学 校 考 试 提 前 批 第 一 批 第 二 批 学 校 录 取 根 据 佛 山 市 办 提 供 的 考 生 数 据, 现 将 我 区 2014 年 高 中 阶 段 学 校 考 试 提 前 批 第 一 批 第 二 批 学 校 的 录 取 公 布 如 下 : 一 顺 德 一 中 录 取 分 第 1 志 愿, 总 分 585, 综 合 表 现 评 价 A, 考
马 克 思 主 义 公 正 观 的 基 本 向 度 及 方 法 论 原 则!! # #
马 克 思 主 义 公 正 观 的 基 本 向 度 及 方 法 论 原 则 马 俊 峰 在 社 会 公 正 问 题 的 大 讨 论 中 罗 尔 斯 诺 齐 克 哈 耶 克 麦 金 泰 尔 等 当 代 西 方 思 想 家 的 论 述 被 反 复 引 用 和 申 说 而 将 马 克 思 恩 格 斯 等 经 典 作 家 的 观 点 置 于 一 种 被 忽 视 甚 至 被 忘 却 的 状 态 形 成 这 种
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四 川 大 学 博 士 学 位 论 文 三 武 一 宗 灭 佛 研 究 姓 名 : 张 箭 申 请 学 位 级 别 : 博 士 专 业 : 中 国 古 代 史 指 导 教 师 : 杨 耀 坤 20020101 三
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收 入 支 出 项 目 2016 年 预 算 项 目 2016 年 预 算 预 算 01 表 单 位 : 万 元 ( 保 留 两 位 小 数 ) 一 公 共 财 政 预 算 拨 款 50.06 一 人 员 经 费 23.59 1 一 般 财 力 50.06 1 人 员 支 出 21.95 2 成 品
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梁 运 文 霍 震 刘 凯 本 文 利 用 奥 尔 多 中 心 的 调 查 数 据 从 三 个 方 面 对 我 国 城 乡 居 民 财 产 分 布 状 况 进 行 了 详 细 的 实 证 分 析 首 先 刻 画 了 我 国 城 乡 居 民 财 产 分 布 的 总 体 统 计 特 征 然 后 从 财 产 构 成 出 发 对 我 国 城 乡 居 民 财 产 分 布 进 行 了 结 构 分 解 最 后 通
公 开 刊 物 须 有 国 内 统 一 刊 (CN), 发 表 文 章 的 刊 物 需 要 在 国 家 新 闻 出 版 广 电 总 局 (www.gapp.gov.cn 办 事 服 务 便 民 查 询 新 闻 出 版 机 构 查 询 ) 上 能 够 查 到 刊 凡 在 有 中 国 标 准 书 公 开
杭 教 人 2014 7 杭 州 市 教 育 局 关 于 中 小 学 教 师 系 列 ( 含 实 验 教 育 管 理 ) 晋 升 高 级 专 业 技 术 资 格 有 关 论 文 要 求 的 通 知 各 区 县 ( 市 ) 教 育 局 ( 社 发 局 ), 直 属 学 校 ( 单 位 ), 委 托 单 位 : 为 进 一 步 规 范 杭 州 市 中 小 学 教 师 系 列 ( 含 实 验 教 育 管
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行 测 高 分 冲 刺 练 习 题 资 料 分 析 ( 共 15 题, 参 考 时 限 10 分 钟 ) 材 料 题 - 1 2012 年 1 月 某 小 区 成 交 的 二 手 房 中, 面 积 为 60 平 方 米 左 右 的 住 宅 占 总 销 售 套 数 的 ( ) A.25% B.35% C.37.5% 长 沙 市 雨 花 区 侯 家 塘 佳 天 国 际 大 厦 北 栋 20 楼 第 1
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审 核 人 员 资 格 管 理 规 范 版 次 :F/0 附 表 1: QMS/EMS/OHSMS 管 理 体 系 审 核 员 通 用 要 求 申 请 条 件 初 次 综 合 素 质 考 核 越 级 晋 升 条 件 实 习 审 核 员 审 核 员 主 任 审 核 员 1. 高 等 教 育 : 大 学 本 科 以 上 学 历, 或 大 专 学 历 及 相 2. 工 作 1 : ; 3. 专 业 工 作
反 学 校 文 化 与 阶 级 再 生 产 小 子 与 子 弟 之 比 较 周 潇 作 者 通 过 对 北 京 某 打 工 子 弟 学 校 的 田 野 调 查 后 发 现 在 农 民 工 子 弟 中 间 盛 行 着 类 似 学 做 工 中 所 描 述 的 工 人 阶 级 小 子 的 反 学 校 文 化 但 是 由 于 制 度 安 排 与 社 会 条 件 的 差 异 子 弟 与 小 子 的 反 学 校
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( 一 ) 深 刻 认 识 学 习 教 育 的 重 大 意 义 : - 3 - ( 二 ) 明 确 学 习 教 育 的 任 务 目 标 ( 三 ) 把 握 特 点 方 法 - 4 - ( 四 ) 坚 持 六 项 原 则 在 - 5 - ( 五 ) 着 力 解 决 问 题 - 6 - - 7 - - 8 - ( 一 ) 学 党 章 党 规, 进 一 步 明 确 党 员 标 准 树 立 行 为 规 范
类 似 地, 又 可 定 义 变 下 限 的 定 积 分 : ( ). 与 ψ 统 称 为 变 限 积 分. f ( ) d f ( t) dt,, 注 在 变 限 积 分 (1) 与 () 中, 不 可 再 把 积 分 变 量 写 成 的 形 式 ( 例 如 ) 以 免 与 积 分 上 下 限 的
5 ( 一 ) 微 积 分 学 基 本 定 理 当 函 数 的 可 积 性 问 题 告 一 段 落, 并 对 定 积 分 的 性 质 有 了 足 够 的 认 识 之 后, 接 着 要 来 解 决 一 个 以 前 多 次 提 到 过 的 问 题 在 定 积 分 形 式 下 证 明 连 续 函 数 必 定 存 在 原 函 数. 一 变 限 积 分 与 原 函 数 的 存 在 性 设 f 在 [,] 上
一、资质申请
二 工 程 监 理 企 业 资 质 有 关 问 答 111 什 么 样 的 企 业 可 以 在 本 省 申 请 工 程 监 理 企 业 资 质? 答 : 在 鄂 取 得 法 人 营 业 执 照 或 合 伙 企 业 营 业 执 照 的 企 业, 都 可 依 法 向 工 商 注 册 所 在 省 或 市 建 设 行 政 主 管 部 门 行 政 审 批 部 门 申 请 工 程 监 理 企 业 资 质 取 得
上海工程技术大学教学管理工作流
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立 场 反 思 教 育 学 与 哲 学 和 科 学 的 对 话 杨 小 微 从 某 种 意 义 上 说 教 育 学 是 在 与 哲 学 等 相 关 学 科 的 对 话 中 成 长 起 来 的 它 先 后 经 历 了 亲 哲 学 和 亲 科 学 阶 段 而 今 正 在 走 向 事 理 知 识 时 期 对 话 使 教 育 学 从 马 克 思 主 义 哲 学 自 然 科 学 及 系 统 方 法 论 人 本
中 日 信 息 化 的 比 较 与 合 作 一 中 日 信 息 化 的 规 模 比 较
中 日 信 息 化 的 比 较 与 合 作 冯 昭 奎 信 息 化 或 信 息 技 术 革 命 正 进 入 一 个 新 阶 段 与 日 本 相 比 中 国 的 信 息 化 与 信 息 产 业 存 在 着 互 联 网 和 手 机 用 户 数 量 大 与 普 及 率 低 的 不 平 衡 硬 件 与 软 件 发 展 的 不 平 衡 信 息 产 业 的 生 产 规 模 与 出 口 规 模 的 不 平 衡 国
测 谱 学 基 础 宽 波 段 遥 感
燕 守 勋 武 晓 波 周 朝 宪 刘 朝 晖 庄 永 成 曹 春 香 魏 欣 欣 于 彩 虹 肖 春 生 中 国 科 学 院 遥 感 应 用 研 究 所 北 京 有 色 金 属 矿 产 地 质 调 查 中 心 北 京 青 海 西 部 资 源 公 司 西 宁 青 海 青 海 省 地 质 调 查 院 西 宁 青 海 根 据 年 出 版 的 专 辑 近 年 来 发 表 的 相 关 文 献 以 及 研 究
解 决 困 扰 事 业 单 位 高 效 运 行 的 人 员 编 制 难 题 应 摒 弃 既 有 经 验 化 判 断 的 思 维 限 囿 经 由 规 范 化 程 式 化 维 度 专 注 于 事 业 单 位 人 员 编 制 的 标 准 管 理 考 虑 到 事 业 单 位 人 员 编 制 的 复 杂 性 和 公 益 导 向 宜 在 编 制 标 准 定 位 上 确 定 整 体 性 发 展 性 公 益 性 取
国家职业标准：网络课件设计师
国 家 职 业 标 准 : 网 络 设 师 1. 职 业 概 况 1.1 职 业 名 称 网 络 设 师 1.2 职 业 定 义 运 用 学 习 理 论 和 教 学 设 原 理, 依 托 多 媒 体 与 网 络 技 术, 从 事 网 络 内 容 分 设 制 作 和 评 价 等 工 作 的 人 员 1.3 职 业 等 级 本 职 业 共 设 三 个 等 级, 分 别 为 : 四 级 网 络 设 师 (
2016年南开大学MBA招生信息
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上海证券交易所会议纪要
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第 期 李 伟 等 用 方 法 对 中 国 历 史 气 温 数 据 插 值 可 行 性 讨 论
李 伟 李 庆 祥 江 志 红 使 用 插 值 方 法 对 已 经 过 质 量 控 制 和 均 一 化 的 年 月 年 月 中 国 全 部 基 本 基 准 站 气 温 资 料 逐 月 进 行 空 间 插 值 通 过 站 点 的 实 际 序 列 与 插 值 后 格 点 序 列 进 行 比 较 针 对 相 关 系 数 和 线 性 趋 势 等 多 个 量 来 检 验 方 法 对 气 候 资 料 插 值 的