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1 营养卫生食品科学, Vol., No. 植物乳杆菌 NDC 757 的降胆固醇作用王今雨,, 满朝新, 杨相宜, 董鑫悦, 郎友, 闫天文, 姜毓君,, * (. 东北农业大学国家乳业工程技术研究中心, 黑龙江哈尔滨 5;. 东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室, 黑龙江哈尔滨 5) 摘要 : 植物乳杆菌 NDC 757 分离自中国内蒙古传统发酵乳制品本实验对其体外环境耐受性及其降胆固醇作用进行研究采用活菌计数法检测植物乳杆菌 NDC 757 在 ph.~. 的酸性环境胆盐质量浓度.g/mL NaCl 质量浓度 ~7g/mL 以及模拟人工消化液环境下的耐受情况 ; 同时以邻苯二甲醛法测定其体外降胆固醇能力结果表明 : 植物乳杆菌 NDC 757 可耐受 ph. 及.g/mL 胆盐环境 ; 在 7g/mL 的高盐质量浓度条件活菌数仍可达 CFU/mL; 可以通过胃进入肠道而保持活性, 在肠道处理 h 后存活率为 5.7% 体外降胆固醇实验测得细菌发酵上清液菌体洗涤液和细胞破碎液中的胆固醇脱除率分别为.%.5% 和.7% 植物乳杆菌 NDC 757 环境耐受能力良好, 具有体外降胆固醇作用, 该菌株可以作为降胆固醇的潜在益生菌关键词 : 植物乳杆菌 ; 降胆固醇 ; 消化道耐受性 Cholesterol-Lowering Capability of Probiotic Lactobacillus plantarum NDC757 WANG Jin-yu,,MAN Chao-xin,YANG Xiang-yi,DONG Xin-yue,LANG You,YAN Tian-wen,JIANG Yu-jun,, * (. National Research Center of Dairy Engineering and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 5, China;. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, College of Food Science and Engineering, Northeast Agricultural University, Harbin 5, China) Abstract:Lactobacillus plantarum NDC 757 was isolated from traditional dairy products in Inner Mongolia of China. The aim of this study is to evaluate the environment-tolerant capability and cholesterol-lowering effect of L. plantarum NDC757. Viable count was firstly used in this study to detect the tolerance characteristics under simulated gastrointestinal tract environment ph.-.. Additionally, bacterial growth was evaluated in the presence of. g/ ml bile salt and -7 g/ ml sodium chloride. O-phthalaldehyde was used to detect its cholesterol-lowering capability. The results showed that L. plantarum NDC757 had tolerance characteristics against ph. and. g/ ml bile salt. The viable bacteria can be up to CFU/mL at sodium chloride of 7 g/ ml. L. plantarum NDC757 kept vitality from stomach to intestines. After h incubation in artificial intestinal fluid, the survival rate of the strain remained up to 5.7%. Its cholesterol-lowering rates in bacterial fermentation supernatant, bacteria washing solution and cell disruption solution were.%,.5% and.7%, respectively. These results indicated that L. plantarum NDC757 had environment-tolerant characteristics and could be as the probiotics with cholesterol-lowering activity. Key words:lactobacillus plantarum;cholesterol-lowering effect;tolerance 中图分类号 :R5. 文献标志码 :A 文章编号 :-()--5 高血压冠心病动脉粥样硬化等心血管疾病是当前导致人类死亡的主要原因, 研究发现, 血脂中总胆固醇的减少能降低高血脂人群患心血管疾病的风险 [] 益生菌是一类能够对人体健康起到促进作用的活体微生物迄今为止, 已发现其具有多种生物活性, 降低血清胆固醇水平是其重要的生理活性之一 [] 已有研究证明, 适量饮用含有乳酸菌的发酵乳可使血液胆固醇含量降低, 其中, 乳酸杆菌是一类对人体有重要益生功能的细菌, 作为胃肠道生态系统固有菌种, 其益生功能被广泛研究 [-] 本实验以分离自中国内蒙古传统发酵乳制品的植物收稿日期 :-- 基金项目 : 国家计划项目 (AA9); 国家自然科学基金项目 (77); 黑龙江省教育厅科学技术研究重点项目 (5z5); 教育部长江学者和创新团队发展计划项目 (IRT-959-); 黑龙江省青年科学基金项目 (QC9C55) 作者简介 : 王今雨 (97 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品微生物与生物技术 @qq.com * 通信作者 : 姜毓君 (97 ), 男, 教授, 博士, 研究方向为食品微生物与生物技术 yujun_jiang@.com - 营养卫生 -.indd -- 5:9:9

ph.~. 的酸性环境胆盐质量浓度.g/mL NaCl 质量浓度 ~7g/mL 以及模拟人工消化液环境下的耐受情况 ; 同时以邻苯二甲醛法测定其体外降胆固醇能力结果表明 : 植物乳杆菌 NDC 757 可耐受 ph. 及.g/mL 胆盐环境 ; 在 7g/mL 的高盐质量浓度条件活菌数仍可达 CFU/mL; 可以通过胃进入肠道而保持活性, 在肠道处理 h 后存活率为 5.

2 , Vol., No. 食品科学营养卫生乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)ndc 757 为研究对象, 对其体外耐受能力及其体外降胆固醇作用进行研究, 以期为开发具有降胆固醇特性的发酵乳提供参考材料与方法. 材料与试剂植物乳杆菌 NDC 757 分离自内蒙古通辽地区的牧民自制发酵酸奶胆盐胆固醇 ( 分析纯 ) 美国 Sigma 公司 ; 邻苯二甲醛巯基乙酸钠冰醋酸正己烷 ( 分析纯 ) 国药集团化学试剂有限公司 MRS 培养基 : 蛋白胨.5g 牛肉膏.5g 酵母粉.5g 胰蛋白胨.g 吐温 -.ml 葡萄糖.g 磷酸氢二钾.g 柠檬酸氢二铵.g 乙酸钠.5g 硫酸镁.5g 硫酸锰.5g, 蒸馏水定容至 ml, 调 ph 值至 5. MRS-CHOL-THIO 培养基 :MRS 液体培养基中加入.% 的巯基乙酸钠.g/mL 胆盐和 μg/ml 胆固醇, 加热溶解, 灭菌 5min 后备用. 仪器与设备 BCN 型生物洁净工作台北京东联哈尔仪器公司 ;DU 紫外分光光度计美国 Beckman 公司 ;TGL- G 离心机上海安亭科技仪器厂 ; 灭菌锅上海三申医疗器械有限公司 ; 超声波破碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司 ;DHP-9 型电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司. 方法.. 环境耐受性实验... 耐酸性实验菌株以 % 的接种量接种至 MRS 液体培养基,7 活化培养两代, 生理盐水洗涤次, 离心收集菌体, 制备菌悬液将菌悬液按 % 重悬于 ph. 和 ph. 的液体 MRS 培养基 (.mol/l HCl 调整 ), 置于 7 培养箱中分别培养 h 后取样取菌液用灭菌生理盐水进行倍稀释, 取适量稀释液涂布 MRS 琼脂培养基平板,7 培养 h, 采用平板计数法进行菌落计数 [7], 每个梯度设个平行, 以 MRS 培养基中培养的菌体做对照, 计算存活率 () 式中 : 为低 ph 值 MRS 培养不同时间后的活菌数 ; 为 ph5. MRS 中培养不同时间后的活菌数... 耐胆盐实验菌株 7 活化培养两代后, 以生理盐水洗涤次, 离心 (5r/min,min) 收集菌体, 制备菌悬液将菌悬液以 % 接种量接至含.g/mL 胆酸盐的 MRS 液体培养基中 7 培养 h 取菌液用灭菌生理盐水进行倍稀释, 取适当稀释液涂布 MRS 琼脂培养基平板,7 培养 h, 进行菌落计数, 每个梯度设个平行, 以 MRS 培养基中培养的菌体做对照, 计算存活率 () 式中 : 为含.g/mL 牛胆酸钠的 MRS 培养基中活菌数 ; 为 MRS 培养基中的活菌数... 耐盐实验菌株以 % 的接种量接种至 MRS 液体培养基,7 活化培养两代, 生理盐水洗涤次, 离心收集菌体, 制备菌悬液将菌悬液按 % 分别接种至 NaCl 质量浓度为 ~7g/mL 的 MRS 液体培养基中, 置于 7 培养箱中分别培养 h 后取样取菌液用灭菌生理盐水进行倍稀释, 取适当稀释液涂布 MRS 琼脂培养基平板,7 培养 h, 进行菌落计数, 每个梯度设个平行, 以 MRS 培养基中培养的菌体做对照, 计算存活率 () 式中 : 为不同 NaCl 质量浓度的 MRS 培养基中活菌数 ; 为 MRS 培养基中的活菌数... 人工胃液和人工肠液耐受性实验菌株以 % 的接种量接种至 MRS 液体培养基,7 活化培养两代, 生理盐水洗涤次, 离心收集菌体, 制成菌悬液备用将制备好的菌悬液按 % 接种量接种至过滤除菌的 ph. 的人工胃液中 7 培养 h 后取样, 测定其活菌数然后, 分别无菌吸取处理 h 后的含菌人工胃液 [], 以 % 接种量接种至过滤除菌的 ph. 的人工肠液中 [9], 继续置 7 培养, 分别在 5 7 h 后测定活菌数人工胃液 :NaCl.% 胃蛋白酶.5%, 用 mol/l HCl 调整 ph 值为. 后,.μm 滤膜过滤除菌备用人工肠液 : 将下述 a 液和 b 液以 : 混合即为人工肠液 a 胰腺液 :NaHCO.% NaCl.% 胰蛋白酶.%, 调整 ph 值为. 后, 过滤除菌备用 b 胆液 : 胆盐.%, 调整 ph 值为. 后, 过滤除菌备用 () 式中 : 为菌体在人工消化液培养不同时间后的活菌数 ; 为菌体在 MRS 培养基中培养不同时间后的活菌数.. 体外降胆固醇能力的测定... 绘制胆固醇标准曲线取质量浓度为 ~μg/ml 的胆固醇溶液 ml, 加入 ml 质量浓度为.5mg/mL 的邻苯二甲醛溶液及 ml 浓硫酸, 振荡混匀后, 室温条件下显色 min, 在波长 55nm 处测吸光度以胆固醇的质量浓度为横坐标, 吸光度为 - 营养卫生 -.indd -- 5:9:9

5g 酵母粉.5g 胰蛋白胨.g 吐温 -.ml 葡萄糖.g 磷酸氢二钾.g 柠檬酸氢二铵.g 乙酸钠.5g 硫酸镁.5g 硫酸锰.5g, 蒸馏水定容至 ml, 调 ph 值至 5. MRS-CHOL-THIO 培养基 :MRS 液体培养基中加入.% 的巯基乙酸钠.

3 , Vol., No. 5 食品科学营养卫生纵坐标绘制标准曲线进行函数拟合得到曲线回归方. 5. 通常维持在.左右 [] 食物在胃中的消化时程用于计算胆固醇的质量浓度间相对较短一般为 h 因此实验选择个不同pH值... (..) 培养时间为 h 胆固醇质量浓度的测定由图可知植物乳杆菌NDC 757不能耐受植物乳杆菌NDC 757菌液(%的接种量)接入MRSCHOL-THIO培养基培养h后5r/min离心min ph. 在pH.条件下处理 h 存活率分别为取上清液.5mL于干净试管中依次加入mL体积分数为 5.%.%和.57% 对pH.具有较强的耐受能 95%的乙醇和 ml质量分数为%的氢氧化钾溶液漩力可见该菌株具备一定的耐受胃中酸性环境的能力涡振荡混匀后置于水浴中皂化min 迅速冷却后加.. 耐胆盐实验结果入5mL正己烷漩涡振荡进行萃取加入mL水重复菌株本身的特性以及胆盐质量浓度可决定菌株对胆振荡混匀后在室温静置5min使各相分层准确吸取正盐的耐受能力人体小肠存在一定质量浓度的胆盐维己烷层.5mL于洁净试管中置于水浴中用氮气吹持在.g/mL 本实验选用.g/mL胆酸盐质量浓干溶剂加入mL邻苯二甲醛显色剂漩涡振荡后静置度下来考察菌株的胆盐耐受情况结果表明在此条件 min 加入mL浓硫酸立即混匀室温静置 min 后下存活率能达到.% 这表明该菌株对胆盐表现在9min内于波长55nm 处测吸光度根据胆固醇与吸光出较强的耐受性度标准曲线回归方程计算胆固醇的质量浓度同时测定.. 菌体洗涤液和菌体破碎液中胆固醇的含量计算胆固醇耐盐实验结果人体细胞的外环境为人的体液随着饮食变化体液中的Na +和Cl 等浓度会随之升高从而改变人体渗透的脱除率菌体洗涤液倾出上清液加入5.mL质量分数为压 [] 微生物对渗透压有一定的适应能力若渗透压改.5%的生理盐水悬浮 r/min离心min 取上清变较大则对微生物的生长不利甚至死亡人体胃肠液即为菌体洗涤液道中NaCl质量浓度在 g/ml的范围波动本实验细胞破碎液倾出菌体洗涤液再加入5.mL质量将植物乳杆菌NDC 757按%接种量分别接入NaCl质量分数为.5%的生理盐水悬浮置于冰浴中并在超声波破浓度为 7g/mL的MRS液体培养基中恒温培养h后碎仪中破碎(%输出 s/次间隔5s)min 破碎后采用MRS固体培养基进行活菌计数胆固醇脱除率/%=( ρ/ρ) 菌落总数 (lg(cfu/ml)) 5r/min离心min 上清液即为菌体破碎液 (5) 式中 ρ为菌种接至mrs-chol-thio培养后培养上清液(或菌体洗涤液细胞破碎液)中胆固醇的质量浓度 ρ为初始培养基总胆固醇的质量浓度. 结果与分析 9 图环境耐受性实验结果.. Fig. 耐酸性实验结果 5 7 NaCl质量 ᑺ/(g/mL) 植物乳杆菌NDC 757对NaCl的耐受性 Tolerance of L. plantarum NDC757 to sodium chloride 㦠㨑ᘏ (lg(cfu/ml)) 由图可知培养h后植物乳杆菌NDC 757活菌数随NaCl的质量浓度增加而降低但在7g/mL的高盐浓度下菌数仍然可以达到 CFU/mL以上卜永士等[]研究表明干酪乳杆菌(L.casae)BDⅡ能够耐受.5% 的NaCl 徐义刚等 [9] 研究表明重组干酪乳杆菌在盐 7.%的条件下仍可以生长由此说明植物乳杆菌NDC 图 Fig. ph. ph. 植物乳杆菌NDC 757对酸的耐受性 Tolerance of L. plantarum NDC757 to acid 757耐高渗环境能力较强可在人体内良好的生存.. 人工胃液和人工肠液耐受性实验结果... 人工胃液耐受性实验结果益生菌发挥益生功能的基本条件是以活菌状态通过通常活菌定植肠道的前提条件是其能够耐受胃中的胃肠道从口腔到肠道过程中益生菌首先必须以活菌 ph值酸环境胃液pH值因饮食结构不同而有较大波动状态通过胃才有可能进入肠道食物在胃中的停留时间如空腹时胃液的pH值为.9. 进食过程中pH值在一般为 h 人体胃液的pH值随饮食结构的不同而发生 -营养卫生-.indd :9:5

具有较强的耐受能 95%的乙醇和 ml质量分数为%的氢氧化钾溶液漩力可见该菌株具备一定的耐受胃中酸性环境的能力涡振荡混匀后置于水浴中皂化min 迅速冷却后加.. 耐胆盐实验结果入5mL正己烷漩涡振荡进行萃取加入mL水重复菌株本身的特性以及胆盐质量浓度可决定菌株对胆振荡混匀后在室温静置5min使各相分层准确吸取正盐的耐受能力人体小肠存在一定质量浓度的胆盐维己烷层.

4 , Vol., No. 食品科学变化通常维持在pH.左右[] 胃蛋白酶原会在胃液的. 酸性环境下被激活从而杀死随食物进入胃内的细菌.. 营养卫生体外降胆固醇实验结果标准曲线因此益生菌若在人体内发挥益生作用就必须具有一以胆固醇质量浓度(μg/mL)为横坐标吸光度定的耐酸和耐胃蛋白酶的能力本实验采用植物乳杆菌 (A 55nm )为纵坐标绘制曲线回归方程为y=.9x NDC 757在pH.条件下与人工胃液作用不同时间.(R=.99) 式中 y为吸光度(a55nm) x为胆固醇后检测到的活菌数变化的质量浓度/(μg/mL).. 㦠㨑 ᘏ (lg(cfu/ml)) 图 Fig. 不同介质中胆固醇的降解情况乳酸菌降胆固醇的作用机理一直是讨论的热点有关乳酸菌降胆固醇机制主要有以下几种同化作用[-5] 共沉淀作用[5] 胆盐水解酶作用[7-] 但是随着进一步的研究乳酸菌降低胆固醇的现象又有了新的解释如Lye 等 [9] 提出了5种降胆固醇作用机理并认为是同时起作用本实验采用邻苯二甲醛法 []测定菌体发酵上清液菌体洗涤液以及细胞破碎液种不同介质中植物乳杆NDC 植物乳杆菌NDC 757对人工胃液的耐受性 Tolerance of L. plantarum NDC757 to artificial gastric fluid 757对胆固醇的降解情况㚚䝛㜅䰸 /% 由图可知植物乳杆菌NDC 757在pH.的人工胃液中作用 h 存活率分别可达到.%.%.9% 在人工胃液中存活率较高说明其能耐受胃液酸性及胃蛋白酶环境可以通过胃进入肠道并保持活性 থ䝉Ϟ 㦠ԧ 㒚㚲人工肠液耐受性实验结果图5 食物经过胃液消化后进入肠道肠道微生物数量大 Fig.5 且种类繁多肠道菌群的生长受肠液中水分消化酶不同介质中胆固醇降解情况 Cholesterol degradation in different media 胆汁酸等成分所影响所以生存在小肠中的益生菌必须由图5可知植物乳杆菌NDC 757在不同介质中的具有一定的耐肠液能力并保持一定数量的活菌数才能发胆固醇降解率分别是发酵上清液为.% 菌体洗涤液挥其益生作用小肠内是pH值大约为7.的碱性环境食中为.5% 细胞破碎液中为.7% 由此胆固醇降解物在小肠中的停留时间一般为 h 本实验选取植物乳率可间接说明乳酸菌可以同化胆固醇到自身细胞内杆菌NDC 757经过pH.的人工肠液作用不同时间后㦠㨑 ᘏ (lg(cfu/ml)) 检测其菌数变化以判定其对肠液的耐受能力图 Fig 植物乳杆菌NDC 757对人工肠液的耐受性 Tolerance of L. plantarum NDC757 to artificial intestinal fluid 由图可知植物乳杆菌NDC 757经人工胃液处理后在人工肠液中分别作用 5 7 h后存活率分别可达到.5%.5%.9% 5.7% 这表明在模拟小肠中食物消化吸收的时间内植物乳杆菌 NDC 757可在肠液中保持一定活性对肠液的耐受性能较好 -营养卫生-.indd 结论本实验首先对植物乳杆菌NDC 757的耐酸胆盐人工消化液能力进行了研究在pH.条件下处理 h 存活率分别为5.%.%和.57% 对胆盐耐受率可达到.% 在7g/mL的高盐浓度下菌数仍然可以达到CFU/mL以上对高渗环境有较强耐受能力植物乳杆菌NDC 757可以通过胃进入肠道而保持活性在肠道处理h后存活率为5.7% 综上植物乳杆菌NDC 757具有较强的体外环境耐受能力本研究通过体外降胆固醇研究发现植物乳杆菌NDC 757在体外表现出良好的降胆固醇能力测定发酵上清液菌体洗涤液以及细胞破碎液中的胆固醇降解率分别为.%.5%和.7% 由于对其降胆固醇基因等层面的作用机理还不明确有待进一步研究由以上结果可知植物乳杆菌NDC 757具有体外降胆固醇能力为进一步研究植物乳杆菌NDC 757的降胆固醇作用机理以及开发具有降胆固醇特性的发酵乳提供理论依据 -- 5:9:5

不同介质中胆固醇的降解情况乳酸菌降胆固醇的作用机理一直是讨论的热点有关乳酸菌降胆固醇机制主要有以下几种同化作用[-5] 共沉淀作用[5] 胆盐水解酶作用[7-] 但是随着进一步的研究乳酸菌降低胆固醇的现象又有了新的解释如Lye 等 [9] 提出了5种降胆固醇作用机理并认为是同时起作用本实验采用邻苯二甲醛法 []测定菌体发酵上清液

5 营养卫生食品科学, Vol., No. 7 参考文献 : [] YUNG L C, LUCY S H. Cholesterol-lowering effect of phytosterolcontaining lactic-fermented milk powder in hamsters[j]. Food Chemistry,, 9: -. [] MANN G V, SPOERRY A. Study of surfactant and cholsteremia in the Massi[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 97, 7: -9. [] 李常营, 杨贞耐. 酸菜来源植物乳杆菌 S-5 的降胆固醇作用 [J]. 食品科学,, (7): 9-7. [] PEREIRA D, Mc CARTNRY A L, GIBSON G R. An in vitro study of the probiotic potential of a bile-salt-hydrolyzing Lactobacillus fermentum strain, and determination of its cholesterol-lowering properties[j]. Appl Environ Microbiol,, 9: [5] KIMOTO H, OHMOMO S, OKAMOTO T. Cholesterol removal from media by lactococci[j]. Journal of Dairy Science,, 5: -. [] MITCHELL L J, SATYA P. Microencapsulated Genetically Engineered Lactobacillus plantarum (pcbh) for bile acid deconjugation and its implication in lowering cholesterol[j]. Journal of Biomed & Biotech,,: -9 [7] CHINGWEN Y, JIH T H. Relationship of somatic cell count, physical, chemical and enzymatic properties to the bacterial standard plate count in dairy goat mil[j]. Livestock Production Science,,7 (): -7. [] 中华人民共和国卫生部. 中华人民共和国药典 [S]. 广州 : 广东科技出版社, 995: 附录. [9] 徐义刚, 崔立春, 赵丽丽, 等. 重组干酪乳杆菌在模拟消化环境中生存性能的研究 [J]. 中国微生物期刊,, (): -. [] PEREIRA D, GIBSON G R. Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria and bifidobacteria isolated from the human gut[j]. Appl Environ Microbiol,, : 9-9. [] 孟丽, 唐善虎. 干酪乳杆菌在模拟人体消化道环境及高盐环境中生长活力的研究 [J]. 食品研究与开发, 9, (): -9. [] 卜永士, 郭本恒. 一株干酪乳杆菌的生物学特性研究 [J]. 乳业科学与技术, (): 9-5. [] HUEY S L, MIN T L. Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract[j]. International Dairy Journal,, : [] DAMBEKODI P C, GILLILAND S E. Incorporation of cholesterol into the cellular membrane of Bifidobacterium longum[j]. Journal of Dairy Science, 99, (7): -. [5] LAY G O, MIN T L. Cholesterol-lowering effects of probiotics and prebiotics: a review of in vivo and in vitro findings[j]. International Journal of Molecular Sciences,, : [] 严玉婷, 潘道东. 发酵乳杆菌 SM-7 的筛选及对小鼠降胆固醇作用 [J]. 食品科学,, (9): -. [7] 邓凯波, 柳国霞, 霍贵成. 乳酸菌胆酸盐耐受性及降胆固醇能力研究 [J]. 食品工业科技,, (): -9. [] NGUYEN T D T, KANG J H, LEE M S. Characterization of Lactobacillus plantarum PH, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects[j]. International Journal of Food Microbiology, 7, (): 5-. [9] LYE H S, RAHMAT-ALI G R, LIONG M T. Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that mimic the human gastrointestinal tract[j]. International Dairy Journal,, (): [] RUDEL L L, MORRIS M D. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde[j]. J Lipid Research, 97, : -. - 营养卫生 -.indd :9:5

食品科学,, (7): 9-7. [] PEREIRA D, Mc CARTNRY A L, GIBSON G R.

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