附 件 1: 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 脂 質 氧 化 產 物 : 丙 二 醛 或

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1 關 於 印 發 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 等 9 個 保 健 功 能 評 價 方 法 的 通 知 國 食 藥 監 保 化 [2012]107 號 2012 年 04 月 23 日 發 佈 各 省 自 治 區 直 轄 市 食 品 藥 品 監 督 管 理 局 ( 藥 品 監 督 管 理 局 ), 有 關 單 位 : 為 貫 徹 落 實 食 品 安 全 法 及 其 實 施 條 例 對 保 健 食 品 實 行 嚴 格 監 管 的 要 求, 加 強 保 健 食 品 准 入 管 理, 切 實 提 高 准 入 門 檻, 國 家 食 品 藥 品 監 督 管 理 局 組 織 修 訂 了 抗 氧 化 等 9 個 功 能 的 評 價 方 法, 已 經 保 健 食 品 安 全 專 家 委 員 會 審 議 通 過, 現 予 印 發 自 2012 年 5 月 1 日 起, 對 受 理 的 申 報 註 冊 保 健 食 品 的 相 關 產 品 檢 驗 申 請, 保 健 食 品 註 冊 檢 驗 機 構 應 當 按 照 新 發 佈 的 9 個 功 能 評 價 方 法 開 展 產 品 功 能 評 價 試 驗 等 各 項 工 作 附 件 :1. 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 2. 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 評 價 方 法 3. 輔 助 降 血 糖 功 能 評 價 方 法 4. 緩 解 視 疲 勞 功 能 評 價 方 法 5. 改 善 缺 鐵 性 貧 血 功 能 評 價 方 法 6. 輔 助 降 血 脂 功 能 評 價 方 法 7. 促 進 排 鉛 功 能 評 價 方 法 8. 減 肥 功 能 評 價 方 法 9. 清 咽 功 能 評 價 方 法 國 家 食 品 藥 品 監 督 管 理 局 二 一 二 年 四 月 二 十 三 日 1

2 附 件 1: 抗 氧 化 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 脂 質 氧 化 產 物 : 丙 二 醛 或 血 清 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 蛋 白 質 氧 化 產 物 : 蛋 白 質 羰 基 抗 氧 化 酶 : 超 氧 化 物 歧 化 酶 或 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 抗 氧 化 物 質 : 還 原 性 谷 胱 甘 肽 1.2 人 體 試 食 試 驗 脂 質 氧 化 產 物 : 丙 二 醛 或 血 清 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 超 氧 化 物 歧 化 酶 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 的 指 標 均 為 必 測 專 案 2.2 脂 質 氧 化 產 物 指 標 中 丙 二 醛 和 血 清 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 任 選 其 一 進 行 指 標 測 定, 動 物 實 驗 抗 氧 化 酶 指 標 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 和 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 任 選 其 一 進 行 指 標 測 定 2.3 氧 化 損 傷 模 型 動 物 和 老 齡 動 物 任 選 其 一 進 行 生 化 指 標 測 定 2.4 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 脂 質 氧 化 產 物 蛋 白 質 氧 化 產 物 抗 氧 化 酶 抗 氧 化 物 質 四 項 指 標 中 三 項 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 抗 氧 化 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 脂 質 氧 化 產 物 超 氧 化 物 歧 化 酶 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 三 項 指 標 中 二 項 陽 性, 且 對 機 體 健 康 無 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 抗 氧 化 功 能 的 作 用 2

3 抗 氧 化 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 動 物 實 驗 1.1 實 驗 動 物 選 用 10 月 齡 以 上 老 齡 大 鼠 或 8 月 齡 以 上 老 齡 小 鼠, 也 可 用 氧 化 損 傷 模 型 鼠 單 一 性 別, 小 鼠 每 組 只, 大 鼠 8-12 只 1.2 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 溶 劑 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 10 倍 ( 小 鼠 ) 或 5 倍 ( 大 鼠 ) 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 兩 個 劑 量 組, 高 劑 量 一 般 不 超 過 30 倍, 必 要 時 設 陽 性 對 照 組 空 白 對 照 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 1.3 實 驗 方 法 老 齡 動 物 選 用 10 月 齡 以 上 大 鼠 或 8 月 齡 以 上 小 鼠, 按 血 中 MDA 水 準 分 組, 隨 機 分 為 1 個 溶 劑 對 照 組 和 3 個 受 試 樣 品 劑 量 組 3 個 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 實 驗 結 束 時 處 死 動 物 測 脂 質 氧 化 產 物 含 量 蛋 白 質 羰 基 含 量 還 原 性 谷 胱 甘 肽 含 量 抗 氧 化 酶 活 力 D- 半 乳 糖 氧 化 損 傷 模 型 原 理 D- 半 乳 糖 供 給 過 量, 超 常 產 生 活 性 氧, 打 破 了 受 控 於 遺 傳 模 式 的 活 性 氧 產 生 與 消 除 的 平 衡 狀 態, 引 起 過 氧 化 效 應 造 模 方 法 選 25-30g 健 康 成 年 小 鼠, 除 空 白 對 照 組 外, 其 餘 動 物 用 D- 半 乳 糖 40mg-1.2g/kg BW 頸 背 部 皮 下 注 射 或 腹 腔 注 射 造 模, 注 射 量 為 0.1mL/10g, 每 日 1 次, 連 續 造 模 6 周, 取 血 測 MDA, 按 MDA 水 準 分 組 隨 機 分 為 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 受 試 樣 品 劑 量 組,3 個 劑 量 組 經 口 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 在 給 受 試 樣 品 的 同 時, 模 型 對 照 組 和 各 劑 量 組 繼 續 給 予 相 同 劑 量 D- 半 乳 糖 頸 背 部 皮 下 或 腹 腔 注 射, 實 驗 結 束 處 死 動 物 測 脂 質 氧 化 產 物 含 量 蛋 白 質 羰 基 含 量 還 原 性 谷 胱 甘 肽 含 量 抗 氧 化 酶 活 力 乙 醇 氧 化 損 傷 模 型 原 理 3

4 乙 醇 大 量 攝 入, 啟 動 氧 分 子 產 生 自 由 基, 導 致 組 織 細 胞 過 氧 化 效 應 及 體 內 還 原 性 谷 胱 甘 肽 的 耗 竭 造 模 方 法 選 25-30g 健 康 成 年 小 鼠 ( g 大 鼠 ), 隨 機 分 為 4 個 組,1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 受 試 樣 品 劑 量 組, 必 要 時 可 增 設 1 個 空 白 對 照 組 3 個 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 連 續 灌 胃 30 天, 末 次 灌 胃 後, 模 型 組 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 禁 食 16 小 時 ( 過 夜 ), 然 後 1 次 性 灌 胃 給 予 50% 乙 醇 12ml/kgBW,6 小 時 後 取 材 ( 空 白 對 照 組 不 作 處 理, 不 禁 食 取 材 ), 測 血 清 或 肝 組 織 脂 質 氧 化 產 物 含 量 蛋 白 質 羰 基 含 量 還 原 性 谷 胱 甘 肽 含 量 抗 氧 化 酶 活 力 脂 質 氧 化 產 物 測 定 血 中 過 氧 化 脂 質 降 解 產 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 測 定 血 中 過 氧 化 脂 質 降 解 產 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 可 採 用 螢 光 法 和 比 色 法 測 定, 方 法 任 選 其 一 螢 光 法 螢 光 法 原 理 MDA(malondiadehycle) 是 細 胞 膜 脂 質 過 氧 化 的 終 產 物 之 一, 測 其 含 量 可 間 接 估 計 脂 質 過 氧 化 的 程 度 1 個 丙 二 醛 (MDA) 分 子 與 2 個 硫 代 巴 比 妥 酸 (TBA) 分 子 在 酸 性 條 件 下 共 熱, 形 成 粉 紅 色 複 合 物 以 波 長 536nm 為 激 發 光, 在 550nm 有 最 強 螢 光 強 度 可 用 螢 光 法 進 行 微 量 測 定 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 螢 光 分 光 光 度 計 微 量 加 樣 器 恒 溫 水 浴 鍋 普 通 離 心 機 混 旋 器 具 塞 離 心 管 試 劑 : 10mmol/L 四 乙 氧 基 丙 烷 ( 貯 備 液, 棕 色 瓶 4 保 存 12 個 月 ), 臨 用 前 用 純 水 稀 釋 成 1nmol/mL 29mmol/L 硫 代 巴 比 妥 酸 工 作 液 硫 代 巴 比 妥 酸 0.209g EDTA.2H20 25mg 谷 胱 甘 肽 ( 還 原 型 ) 1mg 用 0.02mol/L NaOH 50 ml 溶 解 ( 微 溫 助 溶, 棕 色 瓶 4 保 存 2 周 ) 酸 水 解 液 0.1mol/L H2SO4 125mL 0.1mol/L Na2SO4 125mL 加 水 150mL 用 H2SO4 調 ph 1.5, 加 水 稀 釋 至 500mL 正 丁 醇 以 上 所 用 玻 璃 器 皿 均 需 經 50% 硝 酸 浸 泡 24h 後, 再 經 蒸 餾 水 雙 蒸 水 淋 洗 乾 燥, 試 劑 4

5 ( 選 AR 級 ) 最 好 用 雙 蒸 水 配 製 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 全 血 上 清 液 : 取 血 50μl 加 入 0.5mL 生 理 鹽 水,2000r/min 離 心 10min, 取 上 清 液 待 測 血 清 樣 品 : 取 血 0.5mL 室 溫 靜 置 10min,2000r/min 離 心 10min, 取 上 清 液 待 測 標 準 曲 線 製 作 將 10nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷, 用 雙 蒸 水 稀 釋 成 nmol/mL 分 別 取 0.1mL 加 入 酸 水 解 液 2mL TBA 工 作 液 0.5mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min 流 水 冷 卻 至 室 溫 3mL 正 丁 醇 振 盪 抽 提 1min 3000r/min 離 心 5min 取 上 清 液 ( 正 丁 醇 層 ) 測 螢 光 強 度 ( 入 射 狹 縫 1.5nm, 出 射 狹 縫 5nm, 激 發 波 長 536nm, 發 射 波 長 550nm) 以 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 為 橫 坐 標, 螢 光 強 度 為 縱 坐 標 作 圖 樣 品 測 定 試 劑 空 白 管 樣 本 管 標 準 管 10mL 具 塞 離 心 管 0.1mL 蒸 餾 水 0.1mL 血 清 * 0.1mL 標 準 # 酸 水 解 液 2mL 2mL 2mL TBA 工 作 液 0.5mL 0.5mL 0.5mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min, 流 水 冷 卻 正 丁 醇 3mL 3mL 3mL 振 盪 抽 提 1min,3000r/min 離 心 5min * 全 血 上 清 液 0.5mL( 空 白 管 加 蒸 餾 水 0.5mL, 標 準 管 加 標 準 0.1mL 蒸 餾 水 0.4mL) #1nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷 ( 標 準 ) 血 清 0.1mL( 或 全 血 上 清 液 0.5mL) 加 入 酸 水 解 液 2mL TBA 工 作 液 0.5mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min 流 水 冷 卻 至 室 溫 3mL 正 丁 醇 振 盪 抽 提 1min 3000r/min 離 心 5min 取 上 清 液 ( 正 丁 醇 層 ) 測 螢 光 強 度 ( 入 射 狹 縫 1.5nm, 出 射 狹 縫 5nm, 激 發 波 長 536nm, 發 射 波 長 550nm) 計 算 公 式 : B-A B-A 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml 血 清 )= C K = 1 1 F-A F-A B-A B-A 1 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml 血 液 )= C K = 1 F-A F-A 0.05 A: 空 白 管 螢 光 度 B: 樣 品 螢 光 度 F: 四 乙 氧 基 丙 烷 螢 光 度 C: 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 (1nmol/mL) K: 稀 釋 倍 數 5

6 比 色 法 比 色 法 原 理 MDA(malondiadehycle) 是 細 胞 膜 脂 質 過 氧 化 的 終 產 物 之 一, 測 其 含 量 可 間 接 估 計 脂 質 過 氧 化 的 程 度 1 個 丙 二 醛 (MDA) 分 子 與 2 個 硫 代 巴 比 妥 酸 (TBA) 分 子 在 酸 性 條 件 下 共 熱, 形 成 粉 紅 色 複 合 物 該 物 質 在 波 長 532nm 有 極 大 吸 收 峰 可 用 分 光 光 法 進 行 測 定 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 恒 溫 水 浴 鍋 普 通 離 心 機 混 旋 器 具 塞 離 心 管 試 劑 :0.2M 乙 酸 鹽 緩 衝 液 ph M 乙 酸 溶 液 185mL 0.2M 乙 酸 鈉 溶 液 15mL 1mmol/L 四 乙 氧 基 丙 烷 ( 貯 備 液,4 保 存 3 個 月 ), 臨 用 前 用 水 稀 釋 成 40nmol/mL 8.1% 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 SDS 0.8% 硫 代 巴 比 妥 酸 TBA 0.2M 磷 酸 鹽 緩 衝 液 ph M 磷 酸 氫 二 鈉 1920mL 0.2M 磷 酸 二 氫 鉀 480mL 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 溶 血 液 樣 品 : 取 血 20μL 加 入 0.98mL 蒸 餾 水 製 成 2% 溶 血 液 樣 品 測 定 試 劑 空 白 管 樣 品 管 標 準 管 2% 溶 血 液 * 0.2mL 40nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷 0.2mL 8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2M 乙 酸 鹽 緩 衝 液 1.5mL 1.5mL 1.5mL 0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL H2O 0.8mL 0.6mL 0.6mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min, 流 水 冷 卻, 於 532nm 比 色 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 * 若 用 血 清, 樣 品 管 0.15mL, 標 準 管 0.15mL 計 算 B A B A 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml2% 溶 血 液 )= C K = 40 1 F A F A B A B A 過 氧 化 脂 質 含 量 (nmol/ml 血 清 )= C K = 40 1 F A F A 6

7 A: 空 白 管 吸 光 度 B: 樣 品 吸 光 度 F: 四 乙 氧 基 丙 烷 吸 光 度 C: 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 (40nmol/mL) K: 稀 釋 倍 數 組 織 中 過 氧 化 脂 質 降 解 產 物 丙 二 醛 (MDA) 含 量 測 定 原 理 見 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 恒 溫 水 浴 鍋 普 通 離 心 機 混 旋 器 具 塞 離 心 管 組 織 勻 漿 器 試 劑 : 見 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 組 織 勻 漿 樣 品 : 取 一 定 量 的 所 需 臟 器, 生 理 鹽 水 沖 洗 拭 幹 稱 重 剪 碎, 置 勻 漿 器 中, 加 入 0.2M 磷 酸 鹽 緩 衝 液, 以 20000r/min 勻 漿 10s, 間 歇 30s, 反 復 進 行 3 次, 製 成 10% 組 織 勻 漿 (W/V), 3000r/min 離 心 5-10min, 取 上 清 液 待 測 樣 品 測 定 試 劑 空 白 管 樣 品 管 標 準 管 10% 組 織 勻 漿 0.2mL 40nmol/mL 四 乙 氧 基 丙 烷 0.2mL 8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2M 乙 酸 鹽 緩 衝 液 1.5mL 1.5mL 1.5mL 0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL H2O 0.8mL 0.7mL 0.7mL 混 勻, 避 光 沸 水 浴 60min, 流 水 冷 卻, 於 532nm 比 色 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 計 算 B - A B- A 1 過 氧 化 脂 質 含 量 = C K = 40 (nmol/mg 組 織 ) F - A F - A % 1000 A: 空 白 管 吸 光 度 B: 樣 品 管 吸 光 度 F: 四 乙 氧 基 丙 烷 吸 光 度 C: 四 乙 氧 基 丙 烷 濃 度 (40nmol/mL) K: 稀 釋 倍 數 血 清 中 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 測 定 原 理 7

8 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 是 體 內 脂 質 氧 化 應 激 反 應 穩 定 而 具 有 特 異 性 的 標 誌 物, 其 含 量 能 間 接 反 應 因 機 體 內 自 由 基 的 產 生 而 導 致 組 織 細 胞 的 脂 質 過 氧 化 程 度 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 酶 標 儀 生 化 培 養 箱 微 量 振 盪 器 微 量 加 樣 器 洗 板 機 試 劑 :8-Isoprostane KIA Kit ( 酶 聯 免 疫 試 劑 盒 ) 8-Isoprostane EIA 抗 體 血 清 8-Isoprostane AChE 示 蹤 物 8-Isoprostane EIA 標 準 品 EIA 緩 衝 液 洗 滌 緩 衝 液 吐 溫 20 鼠 抗 - 兔 IgG 抗 體 EIA 示 蹤 染 色 劑 EIA 抗 體 血 清 染 色 劑 Ellman s 試 劑 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 小 鼠 眼 內 眥 靜 脈 叢 取 血,3000r/min 離 心 10min 取 上 清 液, 用 EIA 緩 衝 液 稀 釋 15 倍 備 用 樣 品 測 定 按 試 劑 盒 說 明 操 作 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 標 準 孔 濃 度 分 別 為 :500 pg/ml 200 pg/ml 80 pg/ml 32 pg/ml 12.8 pg/ml 5.1 pg/ml 2.0 pg/ml 0.8pg/mL 步 驟 試 劑 空 白 TA NSB B0 標 準 / 樣 品 1. 加 試 劑 EIA 緩 衝 液 μL 50μL - 標 準 / 樣 品 μL AChE 示 蹤 物 μL 50μL 50μL 抗 體 血 清 μL 50μL 2. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 4 避 光 條 件 下 培 養 18 小 時 3. 清 洗 清 洗 所 有 反 應 孔 五 次 4. 加 試 劑 AChE 示 蹤 物 - 5μL Ellman s 200μL 200μL 200μL 200μL 200μL 5. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 常 溫 避 光 條 件 下 培 養 分 鐘 6. 讀 數 在 波 長 412nm 處 測 量 各 孔 吸 光 度 (B0 在 A.U 範 圍 ) 標 準 或 樣 品 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 %B/B0= 100 B0 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 以 標 準 物 的 濃 度 的 對 數 (log) 為 橫 坐 標,%B/B0 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 亦 可 將 資 料 轉 換 成 logit(b/b0) 或 ln[b/b0/(1-b/b0)] 做 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 計 算 回 歸 方 程 將 樣 品 的 %B/B0 值, 代 入 方 程 式, 計 算 出 樣 品 的 濃 度, 再 乘 以 稀 釋 倍 數, 即 為 樣 品 中 的 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 濃 度 蛋 白 質 氧 化 產 物 測 定 H2O2 或 O2 ˉ 自 由 基 對 蛋 白 質 氨 基 酸 側 鏈 的 氧 化 可 導 致 羰 基 產 物 的 積 累 羥 自 由 基 也 可 直 接 作 用 於 肽 鏈, 使 肽 鏈 斷 裂, 引 起 蛋 白 質 一 級 結 構 的 破 壞, 在 斷 裂 處 產 生 羰 基 羰 基 化 蛋 8

9 白 極 易 相 互 交 聯 聚 集 為 大 分 子 從 而 降 低 或 失 去 原 有 蛋 白 質 的 功 能, 蛋 白 質 羰 基 含 量 可 直 接 反 映 蛋 白 質 損 傷 的 程 度 蛋 白 質 羰 基 形 成 是 多 種 氨 基 酸 在 蛋 白 質 的 氧 化 修 飾 過 程 中 的 早 期 標 誌, 它 隨 著 年 齡 的 增 長 而 增 加 血 清 中 蛋 白 質 羰 基 測 定 原 理 被 氧 化 後 的 蛋 白 質 羰 基 含 量 增 多, 羰 基 可 與 2,4- 二 硝 基 苯 肼 反 應 生 成 2,4- 二 硝 基 苯 腙,2,4. 二 硝 基 苯 腙 為 紅 棕 色 的 沉 澱, 將 沉 澱 用 鹽 酸 胍 溶 解 後 即 可 在 分 光 光 度 計 上 讀 取 370 nm 下 的 吸 光 度 值, 從 而 測 定 蛋 白 質 的 羰 基 含 量 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 紫 外 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 生 化 培 養 箱 恒 溫 水 浴 鍋 低 溫 高 速 離 心 機 混 旋 器 2ml 離 心 管 試 劑 :10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 99 毫 克 2,4- 二 硝 基 苯 肼 用 50ml 2 mol/l HCL 溶 解,4 避 光 保 存 2 mol/l HCL 200 g/l 三 氯 乙 酸 (TCA) 6 mol/l 鹽 酸 胍 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 將 無 水 乙 醇 和 乙 酸 乙 酯 按 照 體 積 比 1:1 的 比 例 配 置 成 混 合 溶 液, 現 用 現 配 操 作 步 驟 試 劑 測 定 管 對 照 管 血 清 ( 血 漿 ) 0.1ml 0.1ml 10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 0.4ml 2 mol/l HCL 0.4ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘,37 準 確 避 光 反 應 30 分 鐘 200 g/l 三 氯 乙 酸 0.5ml 0.5ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 6 mol/l 鹽 酸 胍 1.25ml 1.25ml 混 勻 後,37 準 確 水 浴 15 分 鐘 渦 旋 混 勻, 將 全 部 沉 澱 溶 解, 以 12000r/min 離 心 15min, 取 上 清 液 在 370nm 處 比 色,6 mol/l 鹽 酸 胍 試 劑 調 零, 測 定 OD 值 用 雙 縮 脲 法 測 定 血 清 ( 或 血 漿 ) 蛋 白 質 含 量 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 9

10 計 算 公 式 測 定 管 OD- 對 照 管 OD 蛋 白 質 羰 基 含 量 = (nmol/mgprot) 22 比 色 光 徑 (cm) 樣 本 蛋 白 濃 度 (mg/l) 組 織 中 蛋 白 質 羰 基 測 定 原 理 見 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 紫 外 分 光 光 度 計 酶 標 儀 微 量 加 樣 器 生 化 培 養 箱 恒 溫 水 浴 鍋 天 平 勻 漿 器 低 溫 高 速 離 心 機 混 旋 器 2ml 離 心 管 試 劑 : 10 mmol/l HEPES 緩 衝 液 ph 克 N-2- 羥 乙 基 呱 嗪 -2 - 乙 磺 酸 (HEPES) 溶 入 1000ml 雙 蒸 餾 水, 用 ln NaOH 調 ph 至 7.4,4 保 存 100 g/l 硫 酸 鏈 黴 素 1g 硫 酸 鏈 黴 素, 溶 入 10ml 雙 蒸 餾 水,4 避 光 保 存 10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 (DNPH) 99 毫 克 2,4- 二 硝 基 苯 肼 用 50ml 2 mol/l HCL 溶 解,4 避 光 保 存 2 mol/l HCL 200 g/l 三 氯 乙 酸 (TCA) 6 mol/l 鹽 酸 胍 實 驗 步 驟 樣 品 處 理 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 將 無 水 乙 醇 和 乙 酸 乙 酯 按 照 體 積 比 1:1 的 比 例 配 置 成 混 合 溶 液, 現 用 現 配 取 0.1g 組 織, 在 冰 的 生 理 鹽 水 中 漂 洗, 以 去 掉 表 面 的 血 跡 加 人 0.9ml 的 冰 的 10 mmol/l HEPES 緩 衝 液 (ph7.4), 製 成 10% 的 勻 漿 將 勻 漿 液 以 3000r/min 的 轉 速, 離 心 10 min, 保 留 上 清 取 100g/L 的 硫 酸 鏈 黴 素 溶 液 50µl, 加 入 上 清 液 450µl(v/v,1:9), 室 溫 放 置 10 min 後, 以 11000r/min 的 轉 速, 離 心 10 min, 取 上 清 液 待 測 操 作 步 驟 試 劑 測 定 管 對 照 管 組 織 勻 漿 上 清 液 0.1ml 0.1ml 10 mmol/l 2,4- 二 硝 基 苯 肼 0.4ml 2 mol/l HCL 0.4ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘,37 準 確 避 光 反 應 30 分 鐘 200 g/l 三 氯 乙 酸 0.5ml 0.5ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 10

11 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 無 水 乙 醇 乙 酸 乙 酯 混 合 應 用 液 1.0ml 1.0ml 渦 旋 混 勻 1 分 鐘, 以 4 下, 以 12000r/min 離 心 10min, 棄 上 清, 留 沉 澱 6 mol/l 鹽 酸 胍 1.25ml 1.25ml 混 勻 後,37 準 確 水 浴 15 分 鐘 渦 旋 混 勻, 將 全 部 沉 澱 溶 解, 以 12000r/min 離 心 15min, 取 上 清 液 在 370nm 處 比 色,6 mol/l 鹽 酸 胍 試 劑 調 零, 測 定 OD 值 用 雙 縮 脲 法 測 定 勻 漿 上 清 液 蛋 白 質 含 量 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 計 算 公 式 測 定 管 OD- 對 照 管 OD 蛋 白 質 羰 基 含 量 = (nmol/mgprot) 22 比 色 光 徑 (cm) 樣 本 蛋 白 濃 度 (mg/l) 注 意 事 項 加 入 硫 酸 鏈 黴 素 : 在 勻 漿 上 清 液 中 加 人 硫 酸 鏈 黴 素 溶 液 的 作 用 是 沉 澱 核 酸 核 酸 中 的 一 些 堿 基 如 鳥 嘌 呤 胞 嘧 啶 尿 嘧 啶 和 胸 腺 嘧 啶 等 也 含 有 羰 基, 如 不 去 除 核 酸, 這 些 堿 基 就 會 與 DNPH 結 合, 並 反 應 生 成 有 色 物 質, 這 些 物 質 會 增 加 最 後 溶 液 的 吸 光 度, 使 結 果 偏 大 DHPH 的 溶 解 :DNPH 不 溶 于 水, 只 能 溶 於 稀 酸 和 稀 堿 等 溶 液, 因 此, 用 2 mol/l HC1 來 溶 解 DNPH 設 對 照 管 是 為 了 避 免 HC1 與 反 應 液 中 一 些 物 質 反 應 生 成 對 比 色 有 影 響 的 物 質 反 應 體 系 應 避 光 : 當 蛋 白 質 溶 液 中 加 人 DNPH 進 行 反 應 時, 反 應 體 系 需 置 於 黑 暗 中, 因 為 DNPH 不 穩 定, 見 光 會 分 解 如 果 反 應 體 系 遇 到 光,DNPH 分 解, 體 系 中 會 有 剩 餘 的 沒 有 變 成 蛋 白 質 腙 衍 生 物, 對 反 應 比 色 有 影 響 去 除 未 與 蛋 白 質 結 合 的 DNPH: 由 於 DNPH 在 370nm 左 右 有 強 烈 的 光 吸 收, 因 而 用 乙 醇 和 乙 酸 乙 脂 混 合 物 反 復 洗 滌 沉 澱, 去 掉 未 與 蛋 白 質 結 合 的 DNPH, 否 則, 會 增 加 吸 光 值 抗 氧 化 酶 活 力 測 定 SOD 催 化 超 氧 陰 離 子 自 由 基 (O2 ˉ) 生 成 H2O2, 再 由 其 它 抗 氧 化 酶 如 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-PX) 和 過 氧 化 氫 酶 作 用 生 成 水, 這 樣 可 以 清 除 O2 ˉ 對 細 胞 的 毒 害 作 用 SOD GSH-Px 在 動 物 某 些 器 官 和 人 體 血 紅 細 胞 中 的 含 量 均 有 明 顯 的 增 齡 變 化, 酶 活 性 與 生 物 年 齡 的 增 長 成 反 比 消 除 自 由 基 的 能 力 與 酶 活 性 成 正 比 血 或 組 織 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 活 力 測 定 原 理 O2 ˉ 氧 化 羥 胺 的 最 終 產 物 為 亞 硝 酸 鹽, 後 者 在 對 氨 基 苯 磺 酸 及 甲 萘 胺 作 用 下 呈 現 紫 紅 色, 在 波 長 530nm 處 有 極 大 吸 收 峰, 可 用 分 光 光 度 法 進 行 測 定, 當 SOD 消 除 O2 ˉ 後 形 成 的 亞 硝 酸 鹽 減 少 儀 器 與 試 劑 儀 器 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 離 心 機 恒 溫 水 浴 勻 漿 器 試 劑 65mM 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (PBS) ph7.8 11

12 10mmol/L 鹽 酸 羥 胺 鹽 酸 羥 胺 6.95mg, 加 PBS 至 10mL 7.5mmol/L 黃 嘌 呤 黃 嘌 呤 11.41mg, 加 0.1M NaOH 2.5mL 溶 解, 加 PBS 至 10mL 0.2g/L 黃 嘌 呤 氧 化 酶 取 10g/L 黃 嘌 呤 氧 化 酶 0.2mL 加 冰 冷 PBS 9.8mL 至 10mL 0.1% 甲 萘 胺 取 0.2gα- 甲 萘 胺 溶 於 40mL 沸 蒸 餾 水, 涼 至 室 溫 加 50mL 冰 醋 酸, 再 加 110mL 涼 蒸 餾 水 至 200mL 0.33% 對 氨 基 苯 磺 酸 取 0.66g 對 氨 基 苯 磺 酸 溶 于 150mL 溫 蒸 餾 水, 加 50mL 冰 醋 酸 至 200mL SOD 標 準 品 三 氯 甲 烷 95% 乙 醇 (v/v) 0.9% 生 理 鹽 水 實 驗 步 驟 紅 細 胞 抽 提 液 製 備 :10μl 全 血 沖 入 0.5mL 生 理 鹽 水,2000r/min 離 心 3min, 棄 上 清, 加 冰 冷 的 雙 蒸 水 0.2mL 混 勻, 加 入 95% 乙 醇 0.1mL, 振 盪 30s, 加 入 三 氯 甲 烷 0.1mL, 置 快 速 混 合 器 抽 提 1min,4000r/min 離 心 3min, 分 層, 上 層 為 SOD 抽 提 液, 中 層 為 血 紅 蛋 白 沉 澱 物, 下 層 為 三 氯 甲 烷, 記 錄 上 清 液 體 積 待 測 組 織 勻 漿 的 製 備 : 剪 取 一 定 量 的 所 需 臟 器, 生 理 鹽 水 沖 洗 拭 幹 稱 重 剪 碎, 至 玻 璃 勻 漿 器 中 加 入 冷 生 理 鹽 水 20000r/min 勻 漿 10s, 間 歇 30s, 反 復 進 行 三 次, 製 成 1% 組 織 勻 漿,( 最 好 用 超 聲 波 發 生 器 處 理 30s), 使 線 粒 體 振 破, 以 中 性 紅 - 詹 鈉 氏 綠 B 染 色 證 明 線 粒 體 已 振 碎 以 4000r/min 離 心 5min, 取 上 清 液 20μl 待 測 SOD 標 準 抑 制 曲 線 將 SOD 標 準 品 用 磷 酸 鹽 緩 衝 液 配 製 成 750U/mL 的 溶 液, 再 稀 釋 到 50 倍, 即 SOD 量 為 15U/mL(1.5μg/mL), 用 本 法 測 定 不 同 量 的 SOD 標 準 液 的 百 分 抑 制 率, 以 百 分 抑 制 率 為 縱 坐 標, 以 SOD 活 力 單 位 U/mL 為 橫 坐 標 繪 製 標 準 曲 線 對 照 管 OD- 測 定 管 OD SOD 百 分 抑 制 率 = 100% 對 照 管 OD 計 算 每 ml 反 應 液 中 SOD 抑 制 率 達 50% 時 所 對 應 的 SOD 量 為 一 個 單 位 ( 對 照 管 OD- 測 定 管 OD) 100% 對 照 管 OD 反 應 液 總 量 (6mL) SOD 活 力 (U/mL)= 樣 品 稀 釋 倍 數 50% 取 液 量 也 可 用 酶 比 活 法 即 以 每 管 樣 品 的 百 分 抑 制 率 從 SOD 標 準 曲 線 查 出 相 應 的 SOD U/mL, 乘 以 稀 釋 倍 數 (1mL/ 取 樣 量 ) 若 樣 品 為 組 織 勻 漿 液, 根 據 勻 漿 濃 度 或 組 織 蛋 白 質 含 量, 將 單 位 換 算 為 U/g 組 織 或 U/mg 蛋 白 若 樣 品 為 紅 細 胞 抽 提 液, 根 據 血 紅 蛋 白 含 量, 可 換 算 為 U/g Hb 12

13 樣 品 測 定 步 驟 : 試 劑 測 定 管 對 照 管 1/15mol/L 磷 酸 鹽 緩 衝 液 ph7.8(ml) 樣 品 A * 10mmol/L 鹽 酸 羥 胺 (ml) mmol/L 黃 嘌 呤 (ml) mg/mL 黃 嘌 呤 氧 化 酶 (ml) 雙 蒸 水 (ml) 混 勻,37 恒 溫 水 浴 30min 0.33% 對 氨 基 苯 磺 酸 (ml) % 甲 萘 胺 (ml) 混 勻 15min 後, 倒 入 1cm 光 徑 比 色 杯, 以 蒸 餾 水 調 零,530nm 處 比 色 測 定 OD 值 * A 所 用 樣 品 的 量 紅 細 胞 抽 提 液 10 μl 血 清 ( 或 血 漿 ) μl( 溶 血 樣 品 剔 除 ) 1% 組 織 勻 漿 μl 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 血 或 組 織 中 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 活 力 測 定 原 理 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 是 體 內 存 在 的 一 種 含 硒 清 除 自 由 基 和 抑 制 自 由 基 反 應 的 系 統 對 防 止 體 內 自 由 基 引 起 膜 脂 質 過 氧 化 特 別 重 要, 其 活 力 以 催 化 GSH 氧 化 的 反 應 速 度, 及 單 位 時 間 內 GSH 減 少 的 量 來 表 示,GSH 和 5,5 - 二 硫 對 硝 基 苯 甲 酸 (DTNB) 反 應 在 GSH-Px 催 化 下 可 生 成 黃 色 的 5- 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子, 於 423nm 波 長 有 最 大 吸 收 峰, 測 定 該 離 子 濃 度, 即 可 計 算 出 GSH 減 少 的 量, 由 於 GSH 能 進 行 非 酶 反 應 氧 化, 所 以 最 後 計 算 酶 活 力 時, 必 須 扣 除 非 酶 反 應 所 引 起 的 GSH 減 少 試 劑 和 儀 器 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 低 溫 高 速 離 心 機 勻 漿 器 恒 溫 水 浴 鍋 微 量 加 樣 器 試 劑 : 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 ph7.0 NaN mg 終 濃 度 2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 終 濃 度 0.2mmol/L Na2HPO g 終 濃 度 0.2mol/L NaH2PO g 終 濃 度 0.2mol/L 加 蒸 餾 水 至 100mL, 用 少 量 HCL NaOH 調 ph7.0,4 保 存 1mmol/L 谷 胱 甘 肽 ( 還 原 型 GSH) 溶 液 GSH 30.7mg 加 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 至 100mL, 臨 用 前 配 製, 冰 凍 保 存 1-2 日 mmol/LH2O2 溶 液 取 30%H2O mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 100mL, 作 為 貯 備 液,4 避 光 保 存, 臨 用 13

14 前 將 貯 備 液 用 雙 蒸 水 稀 釋 10 倍 即 可 偏 磷 酸 沉 澱 液 HPO3 16.7g( 先 用 蒸 餾 水 溶 解 ) EDTA 0.5g NaCl 280g 加 蒸 餾 水 至 1000mL, 用 普 通 濾 紙 過 濾, 室 溫 保 存 0.32mol/LNa2HPO4 溶 液 : Na2HPO4 22.7g 加 蒸 餾 水 至 500mL, 室 溫 保 存 DTNB 顯 色 液 DTNB 40mg 檸 檬 酸 三 鈉 1.0g 加 蒸 餾 水 至 100mL,4 避 光 保 存 1 個 月 0.2M 磷 酸 緩 衝 液 ph % 生 理 鹽 水 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 溶 血 液 : 取 鼠 血 10μl 加 入 到 1mL 雙 蒸 水 中, 充 分 振 搖, 使 之 全 部 溶 血 1:100 待 測,4h 內 測 定 酶 活 力 若 當 天 來 不 及 測 定, 將 肝 素 抗 凝 全 血 置 -20 凍 存,3d 內 測 定, 若 4 存 放, 28h 內 必 須 測 完 測 前 取 出 樣 品 室 溫 自 然 解 凍 組 織 上 清 液 : 動 物 禁 食 過 夜, 處 死 後, 立 即 取 出 所 需 臟 器, 放 入 冷 生 理 鹽 水 中 洗 去 浮 血, 剔 除 脂 肪 及 結 締 組 織, 濾 紙 吸 幹 後, 在 冰 浴 上 剪 成 碎 塊, 稱 取 適 量 組 織, 加 冷 0.2M 磷 酸 緩 衝 液, 以 20000r/min 勻 漿 10s, 間 歇 30s, 反 復 3 次 製 成 5% 組 織 勻 漿, 操 作 在 冰 浴 中 進 行, 勻 漿 以 g 離 心 10min( 低 溫 高 速 離 心 機 ), 以 沉 澱 為 破 碎 的 細 胞 細 胞 碎 片 核 及 線 粒 體, 上 清 液 用 以 測 胞 液 中 的 酶 活 力, 最 好 當 天 測, 否 則 加 20%(v/v) 甘 油 分 裝 於 塑 膠 管, 放 置 , 可 保 存 數 周, 而 酶 活 力 不 減 GSH 標 準 曲 線 的 製 作 : 取 1.0mmol/LGSH 溶 液 mL, 分 別 置 於 10mL 小 容 器 瓶 中, 各 加 入 偏 磷 酸 沉 澱 劑 8mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 10mL 刻 度, 即 得 到 濃 度 為 μmol/L 的 GSH 標 準 液 取 上 述 不 同 濃 度 標 準 液 各 2mL, 放 入 試 管 中, 加 入 0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL, 比 色 前 加 入 DTNB 顯 色 液 0.5mL 用 光 徑 1cm 杯,5min 內 在 可 見 光 423nm 波 長 測 OD 值, 以 雙 蒸 水 調 零 點 以 GSH 含 量 (μmol/l) 為 橫 坐 標,OD423 值 為 縱 坐 標, 繪 製 標 準 曲 線 測 定 步 驟 : 試 劑 樣 品 管 (ml) 非 酶 管 (ml) 空 白 管 (ml) 1.0mmol/LGSH 樣 品 ** 0.4 雙 蒸 水 *

15 37 水 浴 預 溫 5min H2O2(37 預 熱 ) 水 浴 準 確 反 應 3min ( 嚴 格 控 制 時 間 ) 偏 磷 酸 沉 澱 液 r/min 離 心 10min 離 心 上 清 液 2 2 雙 蒸 水 0.4 偏 磷 酸 沉 澱 液 mol/LNa2HPO DTNB 顯 色 液 顯 色 反 應 1min 後 於 423nm 波 長 (1cm 光 徑 ), 讀 OD 值,5min 之 內 讀 數 準 確 * 樣 品 為 組 織 上 清 液 時, 非 酶 管 改 為 加 熱 使 酶 失 活 的 組 織 上 清 液 ** 溶 血 液 mL 組 織 上 清 液 1:20 稀 釋, 取 稀 釋 液 0.4mL 注 : 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 計 算 鼠 全 血 GSH-Px 活 力 單 位 規 定 每 1mL 全 血, 每 分 鐘, 扣 除 非 酶 反 應 的 log[gsh] 降 低 後, 使 log[gsh] 降 低 1 為 一 個 酶 活 力 單 位 非 酶 管 log[gsh]- 樣 品 管 log[gsh] 鼠 全 血 GSH-Px 活 力 單 位 (U/mL 全 血 )= 3min 0.004mL log[ 非 酶 管 OD- 空 白 管 OD]-log[ 樣 品 管 OD- 空 白 管 OD] = 3min 0.004mL 組 織 GSH-Px 比 活 力 單 位 規 定 每 毫 克 蛋 白 質, 每 分 鐘, 扣 除 非 酶 反 應, 使 GSH 濃 度 降 低 1μmol/L 為 一 個 酶 活 力 單 位 ( 非 酶 管 OD- 樣 品 管 OD) A ** 5 組 織 GSH-Px 比 活 力 單 位 (U/mg 蛋 白 ) = 3min 樣 品 蛋 白 質 的 mg 數 * * Folin 法 或 雙 縮 脲 法 測 樣 品 蛋 白 質 含 量 標 準 GSH 濃 度 (μmol/l) ** A= 即 標 準 曲 線 斜 率 標 準 GSH 光 密 度 (OD) 注 意 事 項 由 於 H2O2 易 分 解 導 致 濃 度 改 變, 臨 用 時 取 貯 備 液 用 分 光 光 度 計 測 其 濃 度, 取 貯 備 液 3mL, 測 定 1cm 光 徑 的 240nm 處 OD 值 OD 濃 度 (mmol/l)= 0.036( 消 光 係 數 ) 若 OD 值 為 0.45, 則 表 明 H2O2 濃 度 為 12.5mmol/L 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子 的 顯 色 不 僅 與 整 個 反 應 體 系 中 氫 離 子 濃 度 有 15

16 關, 還 受 反 應 時 間 限 制 加 入 顯 色 劑 後, 反 應 體 系 ph 為 6.5 時,11min 開 始 顯 色, 此 時 比 色 5min 內 讀 數 準 確 抗 氧 化 物 質 還 原 型 谷 胱 甘 肽 (GSH) 測 定 谷 胱 甘 肽 是 一 種 低 分 子 清 除 劑, 它 可 清 除 O2 - H2O2 LOOH 谷 胱 甘 肽 是 谷 氨 酸 甘 氨 酸 和 半 胱 氨 酸 組 成 的 一 種 三 肽, 是 組 織 中 主 要 的 非 蛋 白 質 的 巰 基 化 合 物, 是 GSH-PX 和 GST 兩 種 酶 類 的 底 物, 為 這 兩 種 酶 分 解 氫 過 氧 化 物 所 必 需, 它 能 穩 定 含 巰 基 的 酶, 和 防 止 血 紅 蛋 白 及 其 它 輔 助 因 數 受 氧 化 損 傷, 缺 乏 或 耗 竭 GSH 會 促 使 許 多 化 學 物 質 或 環 境 因 素 產 生 中 毒 作 用,GSH 量 的 多 少 是 衡 量 機 體 抗 氧 化 能 力 大 小 的 重 要 因 素 血 或 組 織 中 還 原 型 谷 胱 甘 肽 (GSH) 測 定 方 法 原 理 GSH - 和 5,5'- 二 硫 對 硝 基 甲 酸 (DTNB) 反 應 在 GSH-Px 催 化 下 可 生 成 黃 色 的 5- 硫 代 2- 硝 基 甲 酸 陰 離 子, 於 420nm 波 長 有 最 吸 收 峰, 測 定 該 離 子 濃 度, 即 可 計 算 GSH 的 含 量 儀 器 和 試 劑 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 低 溫 高 速 離 心 機 勻 漿 器 恒 溫 水 浴 鍋 微 量 加 樣 器 試 劑 :0.9% 生 理 鹽 水 4% 磺 基 水 楊 酸 溶 液 0.1mol/L PBS 溶 液 (ph=8.0): 稱 取 Na2HPO g,KH2PO g, 加 蒸 餾 水 至 1000mL 0.004%DTNB 溶 液 : 稱 取 DTNB 40mg 溶 於 1000mL 的 0.1mol/L PBS 溶 液 (ph=8.0) 中 疊 氮 納 緩 衝 液 : NaN mg EDTA-Na mg Na2HPO g NaH2PO g 加 蒸 餾 水 至 1000mL, 用 少 量 HCl NaOH 調 ph7.0,4 保 存 標 準 溶 液 : 稱 取 還 原 型 GSH 15.4mg, 加 疊 氮 納 緩 衝 液 至 50mL, 終 濃 度 為 1mmol/L, 臨 用 前 配 製 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 : 溶 血 液 上 清 液 : 取 0.1mL 抗 凝 全 血 加 雙 蒸 水 0.9mL(1:9 溶 血 液 ), 充 分 混 勻, 直 至 透 亮 為 止 取 溶 血 液 0.5mL 加 4% 磺 基 水 楊 酸 0.5mL 混 勻, 室 溫 下 3500rpm 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 備 用 血 清 上 清 液 : 取 0.1mL 血 清 加 4% 磺 基 水 楊 酸 0.1mL 混 勻, 室 溫 下 3500rpm 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 備 用 組 織 上 清 液 : 取 組 織 0.5g 加 生 理 鹽 水 4.5mL 充 分 研 磨 成 細 漿 (10% 肝 勻 漿 ), 混 勻 後 取 16

17 漿 液 0.5mL 加 4% 磺 基 水 楊 酸 0.5mL 混 勻, 室 溫 下 3500rpm 離 心 10 分 鐘, 取 上 清 液 備 用 樣 品 測 定 : 溶 血 液 或 組 織 樣 品 測 定 : 測 定 管 空 白 管 上 清 液 0.5mL - 4% 磺 基 水 楊 酸 - 0.5mL DTNB 4.5mL 4.5mL 混 勻, 室 溫 放 置 10 分 鐘 後,420nm 處 測 定 吸 光 度 血 清 樣 品 測 定 : 測 定 管 空 白 管 上 清 液 0.1mL - 4% 磺 基 水 楊 酸 - 0.1mL DTNB 0.9mL 0.9mL 混 勻, 室 溫 放 置 10 分 鐘 後,420nm 處 測 定 吸 光 度 注 : 該 指 標 檢 測, 需 新 鮮 樣 品 取 材 後 當 天 完 成 用 雙 縮 脲 法 測 定 血 清 ( 或 溶 血 液 ) 組 織 勻 漿 蛋 白 質 含 量 如 用 試 劑 盒, 可 按 試 劑 盒 的 操 作 要 求 進 行 標 準 曲 線 取 1mmol/L GSH 標 準 溶 液 µL, 分 別 加 入 生 理 鹽 水 至 0.5mL, 即 得 到 µmol/L 的 GSH 標 準 液 系 列, 各 管 加 入 DTNB4.5mL, 混 勻, 室 溫 放 置 10 分 鐘 後, 空 白 管 調 零,420nm 處 測 定 吸 光 度 以 濃 度 為 橫 坐 標, 吸 光 度 為 縱 坐 標, 做 標 準 曲 線 mmol/L GSH(mL) 生 理 鹽 水 (ml) DTNB(mL) GSH 量 ( mol/l) 計 算 樣 品 GSH 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 溶 血 液 稀 釋 倍 數 上 清 液 稀 釋 倍 數 ( mol /L 全 血 ) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 10 2 樣 品 GSH 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 上 清 液 稀 釋 倍 數 ( mol /L 血 清 ) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 2 樣 品 GSH 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 上 清 液 稀 釋 倍 數 上 清 液 組 織 含 量 ( mol /g 組 織 ) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 2 100g 組 織 /L 樣 品 GSH 含 量 ( mol /gprot) = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 上 清 液 稀 釋 倍 數 上 清 液 蛋 白 含 量 = 對 應 曲 線 濃 度 值 ( mol/l) 2 勻 漿 gprot/l 17

18 1.4 資 料 處 理 與 結 果 判 定 資 料 處 理 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值, F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 指 標 判 定 脂 質 氧 化 產 物 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較, 過 氧 化 脂 質 ( 丙 二 醛 或 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 ) 含 量 降 低 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 降 低 脂 質 過 氧 化 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 蛋 白 質 氧 化 產 物 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較, 蛋 白 質 羰 基 含 量 降 低 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 降 低 蛋 白 質 過 氧 化 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 抗 氧 化 酶 活 力 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較, 抗 氧 化 酶 (SOD 或 GSH-PX) 活 力 升 高 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 升 高 抗 氧 化 酶 活 力 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 抗 氧 化 物 質 GSH 受 試 樣 品 組 與 模 型 ( 或 老 齡 ) 對 照 組 比 較,GSH 含 量 升 高 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 有 升 高 抗 氧 化 物 質 GSH 作 用, 該 項 指 標 結 果 陽 性 結 果 判 定 過 氧 化 脂 質 含 量 蛋 白 質 羰 基 抗 氧 化 酶 活 性 還 原 性 谷 胱 甘 肽 四 項 指 標 中 三 項 指 標 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 抗 氧 化 動 物 實 驗 結 果 陽 性 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 納 入 標 準 選 年 齡 在 歲, 身 體 健 康 狀 況 良 好, 無 明 顯 腦 心 肝 肺 腎 血 液 疾 患, 無 長 期 服 藥 史, 志 願 受 試 保 證 配 合 的 人 群 2.2 排 除 受 試 者 標 準 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女, 對 保 健 食 品 過 敏 者 合 併 有 心 肝 腎 和 造 血 系 統 等 嚴 重 疾 病 患 者 短 期 內 服 用 與 受 試 功 能 有 關 的 物 品, 影 響 到 對 結 果 的 判 斷 者 不 符 合 納 入 標 準, 未 按 規 定 食 用 受 試 樣 品, 無 法 判 定 功 效 或 資 料 不 全 影 響 功 效 或 安 全 18

19 性 判 斷 者 2.3 受 試 者 分 組 對 受 試 者 按 MDA SOD GSH-Px 水 準 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 生 活 飲 食 習 慣 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.4 試 驗 方 法 採 用 自 身 和 組 間 兩 種 對 照 設 計 試 驗 組 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 每 日 服 用 受 試 產 品, 對 照 組 可 服 用 安 慰 劑 或 採 用 陰 性 對 照 受 試 樣 品 給 予 時 間 3 個 月, 必 要 時 可 延 長 至 6 個 月 試 驗 期 間 對 照 組 和 試 食 組 原 生 活 飲 食 不 變 2.5 觀 察 指 標 各 項 指 標 在 試 驗 開 始 及 結 束 時 各 檢 測 1 次 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 功 效 指 標 過 氧 化 脂 質 含 量 觀 察 試 驗 前 後 MDA 的 變 化 及 MDA 下 降 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 ) 試 驗 前 MDA 試 驗 後 MDA MDA 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 MDA 觀 察 試 驗 前 後 8-Isoprostane 的 變 化 及 8-Isoprostane 下 降 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 2.8) 試 驗 前 8-Isoprostane 試 驗 後 8-Isoprostane 8-Isoprostane 下 降 百 分 率 = 100% 試 驗 前 8-Isoprostane 超 氧 化 物 歧 化 酶 觀 察 試 驗 前 後 SOD 的 變 化 及 SOD 升 高 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 ) 試 驗 前 SOD 試 驗 後 SOD SOD 升 高 百 分 率 = 100% 試 驗 前 SOD 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 觀 察 試 驗 前 後 GSH-PX 的 變 化 及 GSH-PX 升 高 百 分 率 ( 測 定 方 法 見 2.7) 19

20 試 驗 前 GSH-PX 試 驗 後 GSH-PX GSH-PX 升 高 百 分 率 = 100% 試 驗 前 GSH-PX 2.6 資 料 處 理 和 結 果 判 定 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 ; 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗 ; 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 在 試 驗 前 組 間 比 較 差 異 無 顯 著 性 的 前 提 下, 可 進 行 試 驗 後 組 間 比 較 各 功 效 觀 察 指 標 試 驗 前 後 自 身 比 較 和 試 食 後 組 間 比 較 均 有 統 計 學 意 義, 方 可 判 定 該 指 標 陽 性 過 氧 化 脂 質 含 量 超 氧 化 物 歧 化 酶 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 三 項 實 驗 中 任 二 項 實 驗 結 果 陽 性, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 抗 氧 化 功 能 作 用 2.7 血 中 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 活 力 測 定 原 理 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (GSH-Px) 是 體 內 存 在 的 一 種 含 硒 清 除 自 由 基 和 抑 制 自 由 基 反 應 的 系 統 對 防 止 體 內 自 由 基 引 起 膜 脂 質 過 氧 化 特 別 重 要, 其 活 力 以 催 化 GSH 氧 化 的 反 應 速 度, 及 單 位 時 間 內 GSH 減 少 的 量 來 表 示,GSH 和 5,5 - 二 硫 對 硝 基 苯 甲 酸 (DTNB) 反 應 在 GSH-Px 催 化 下 可 生 成 黃 色 的 5- 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子, 於 423nm 波 長 有 最 大 吸 收 峰, 測 定 該 離 子 濃 度, 即 可 計 算 出 GSH 減 少 的 量, 由 於 GSH 能 進 行 非 酶 反 應 氧 化, 所 以 最 後 計 算 酶 活 力 時, 必 須 扣 除 非 酶 反 應 所 引 起 的 GSH 減 少 試 劑 和 儀 器 儀 器 : 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 恒 溫 水 浴 鍋 微 量 加 樣 器 離 心 機 試 劑 : 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 ph7.0 NaN mg 終 濃 度 2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 終 濃 度 0.2mmol/L Na2HPO g 終 濃 度 0.2mol/L NaH2PO g 終 濃 度 0.2mol/L 加 蒸 餾 水 至 100mL, 用 少 量 HCL NaOH 調 ph7.0,4 保 存 1mmol/L 谷 胱 甘 肽 ( 還 原 型 GSH) 溶 液 GSH 30.7mg 加 疊 氮 鈉 磷 酸 緩 衝 液 至 100mL, 臨 用 前 配 製, 冰 凍 保 存 1-2 日 mmol/L H2O2 溶 液 取 30%H2O mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 100mL, 作 為 貯 備 液,4 避 光 保 存, 臨 用 前 將 貯 備 液 用 雙 蒸 水 稀 釋 10 倍 即 可 偏 磷 酸 沉 澱 液 20

21 HPO3 16.7g( 先 用 蒸 餾 水 溶 解 ) EDTA 0.5g NaCl 280g 加 蒸 餾 水 至 1000mL, 用 普 通 濾 紙 過 濾, 室 溫 保 存 0.32mol/L Na2HPO4 溶 液 : Na2HPO4 22.7g 加 蒸 餾 水 至 500mL, 室 溫 保 存 DTNB 顯 色 液 DTNB 40mg 檸 檬 酸 三 鈉 1.0g 加 蒸 餾 水 至 100mL,4 避 光 保 存 1 個 月 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 溶 血 液 : 取 血 20μl 加 入 到 1mL 雙 蒸 水 中, 充 分 振 搖, 使 之 全 部 溶 血 1:100 待 測,4 小 時 內 測 定 酶 活 力 若 當 天 來 不 及 測 定, 將 肝 素 抗 凝 全 血 置 -20 凍 存,3 天 內 測 定, 若 4 存 放,28 小 時 內 必 須 測 完 測 前 取 出 樣 品 室 溫 自 然 解 凍, GSH 標 準 曲 線 的 製 作 : 取 1.0mmol/L GSH 溶 液 mL, 分 別 置 於 10mL 小 容 器 瓶 中, 各 加 入 偏 磷 酸 沉 澱 劑 8mL, 用 雙 蒸 水 稀 釋 至 10mL 刻 度, 即 得 到 濃 度 為 μmol/L 的 GSH 標 準 液 取 上 述 不 同 濃 度 標 準 液 各 2mL, 放 入 試 管 中, 加 入 0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL, 比 色 前 加 入 DTNB 顯 色 液 0.5mL 用 光 徑 1cm 杯,5min 內 在 可 見 光 423nm 波 長 測 OD 值, 以 雙 蒸 水 調 零 點 以 GSH 含 量 (μmol/l) 為 橫 坐 標,OD423 值 為 縱 坐 標, 繪 製 標 準 曲 線 測 定 步 驟 : 試 劑 樣 品 管 (ml) 非 酶 管 (ml) 1.0mmol/L GSH 血 樣 稀 釋 液 0.4 雙 蒸 水 * 水 浴 預 溫 5min H2O2(37 預 熱 ) 水 浴 準 確 反 應 5min( 嚴 格 控 制 時 間 ) 偏 磷 酸 沉 澱 液 r/min 離 心 10min 離 心 上 清 液 2 2 雙 蒸 水 偏 磷 酸 沉 澱 液 21

22 計 算 0.32mol/L Na2HPO DTNB 顯 色 液 顯 色 反 應 1min 後 於 423nm 波 長 (1cm 光 徑 ), 讀 OD 值,5min 之 內 讀 數 準 確 全 血 GSH-Px 活 力 單 位 規 定 每 8μl 全 血, 在 37 反 應 5min, 扣 除 非 酶 反 應 後, 使 GSH 濃 度 降 低 1μmol/L 濃 度 為 一 個 酶 活 力 單 位 全 血 GSH-Px 活 力 U/mL 血 =( 非 酶 管 OD- 樣 品 管 OD) A * 5 ** 標 準 GSH 濃 度 (μmol/l) * A= 即 標 準 曲 線 的 斜 率 標 準 GSH 光 密 度 (OD) ** 5 換 算 成 1mL 反 應 液 中 GSH 濃 度 時, 需 乘 以 稀 釋 倍 數 注 意 事 項 由 於 H2O2 易 分 解 導 致 濃 度 改 變, 臨 用 時 取 貯 備 液 用 分 光 光 度 計 測 其 濃 度, 取 貯 備 液 3mL, 測 定 1cm 光 徑 的 240nm 處 OD 值 OD 濃 度 (mmol/l)= 0.036( 消 光 係 數 ) 若 OD 值 為 0.45, 則 表 明 H2O2 濃 度 為 12.5mmol/L 硫 代 2- 硝 基 苯 甲 酸 陰 離 子 的 顯 色 不 僅 與 整 個 反 應 體 系 中 氫 離 子 濃 度 有 關, 還 受 反 應 時 間 限 制 加 入 顯 色 劑 後, 反 應 體 系 ph 為 6.5 時,11min 開 始 顯 色, 此 時 比 色 5min 內 讀 數 準 確 2.8 血 清 中 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 測 定 原 理 8- 表 氫 氧 - 異 前 列 腺 素 (8-Isoprostane) 是 體 內 脂 質 氧 化 應 激 反 應 穩 定 而 具 有 特 異 性 的 標 誌 物, 其 含 量 能 間 接 反 應 因 機 體 內 自 由 基 的 產 生 而 導 致 組 織 細 胞 的 脂 質 過 氧 化 程 度 儀 器 與 試 劑 儀 器 : 酶 標 儀 生 化 培 養 箱 微 量 振 盪 器 微 量 加 樣 器 洗 板 機 試 劑 :8-Isoprostane KIA Kit ( 酶 聯 免 疫 試 劑 盒 ) 8-Isoprostane EIA 抗 體 血 清 8-Isoprostane AChE 示 蹤 物 8-Isoprostane EIA 標 準 品 EIA 緩 衝 液 洗 滌 緩 衝 液 吐 溫 20 鼠 抗 - 兔 IgG 抗 體 EIA 示 蹤 染 色 劑 EIA 抗 體 血 清 染 色 劑 Ellman s 試 劑 實 驗 步 驟 樣 品 製 備 靜 脈 取 血,3000r/min 離 心 10min 取 上 清 液, 用 EIA 緩 衝 液 稀 釋 15 倍 備 用 22

23 樣 品 測 定 按 試 劑 盒 說 明 操 作 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 標 準 孔 濃 度 分 別 為 :500 pg/ml 200 pg/ml 80 pg/ml 32 pg/ml 12.8 pg/ml 5.1 pg/ml 2.0 pg/ml 0.8pg/mL 步 驟 試 劑 空 白 TA NSB B0 標 準 / 樣 品 1. 加 試 劑 EIA 緩 衝 液 μL 50μL - 標 準 / 樣 品 μL AChE 示 蹤 物 μL 50μL 50μL 抗 體 血 清 μL 50μL 2. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 4 避 光 條 件 下 培 養 18 小 時 3. 清 洗 清 洗 所 有 反 應 孔 五 次 4. 加 試 劑 AChE 示 蹤 物 - 5μL Ellman s 200μL 200μL 200μL 200μL 200μL 5. 培 養 用 封 板 膜 蓋 好 酶 標 板, 並 在 常 溫 避 光 條 件 下 培 養 分 鐘 6. 讀 數 在 波 長 412nm 處 測 量 各 孔 吸 光 度 (B0 在 A.U 範 圍 ) 標 準 或 樣 品 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 %B/B0= 100 B0 孔 吸 光 度 NSB 孔 吸 光 度 以 標 準 物 的 濃 度 的 對 數 (log) 為 橫 坐 標,%B/B0 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 亦 可 將 資 料 轉 換 成 logit(b/b0) 或 ln[b/b0/(1-b/b0)] 做 為 縱 坐 標 繪 製 標 準 曲 線, 計 算 回 歸 方 程 將 樣 品 的 %B/B0 值, 代 入 方 程 式, 計 算 出 樣 品 的 濃 度, 再 乘 以 稀 釋 倍 數, 即 為 樣 品 中 的 8- 表 氫 氧 異 前 列 腺 素 濃 度 23

24 附 件 2: 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 體 重 胃 粘 膜 大 體 損 傷 狀 況 胃 粘 膜 病 理 損 傷 積 分 1.2 人 體 試 食 試 驗 臨 床 症 狀 體 征 胃 鏡 觀 察 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 無 水 乙 醇 消 炎 痛 致 急 性 胃 粘 膜 損 傷 模 型 或 冰 醋 酸 致 慢 性 胃 粘 膜 損 傷 模 型 任 選 其 一 進 行 動 物 實 驗 2.3 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 3.1 動 物 實 驗 : 實 驗 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 大 體 觀 察 評 分 與 病 理 組 織 學 檢 查 評 分 結 果 均 表 明 胃 粘 膜 損 傷 明 顯 改 善, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 試 食 組 與 對 照 組 比 較, 臨 床 症 狀 體 征 積 分 明 顯 減 少, 胃 鏡 複 查 結 果 有 改 善, 可 判 定 該 受 試 樣 品 對 胃 粘 膜 有 輔 助 保 護 功 能 24

25 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Protection of Gastric Mucosa Function 1 動 物 實 驗 1.1 原 理 在 一 定 時 間 內 給 予 一 定 量 的 受 試 樣 品, 用 對 胃 粘 膜 有 損 傷 作 用 的 物 質 造 成 急 性 胃 粘 膜 損 傷 模 型, 觀 察 各 劑 量 組 胃 粘 膜 的 損 傷 程 度 ; 或 用 對 胃 粘 膜 有 損 傷 作 用 的 物 質 造 成 慢 性 胃 潰 瘍 模 型, 在 一 定 時 間 內 給 予 一 定 量 的 受 試 樣 品, 觀 察 各 劑 量 組 胃 潰 瘍 的 面 積 和 體 積, 反 映 受 試 樣 品 對 胃 粘 膜 的 保 護 作 用 1.2 實 驗 動 物 選 用 SD 或 Wistar 健 康 大 鼠, 單 一 性 別, 克, 每 組 8-12 只 1.3 實 驗 設 計 及 劑 量 分 組 受 試 物 設 三 個 劑 量 組, 其 中 一 個 應 為 人 體 推 薦 量 的 5 倍 劑 量 組, 並 同 時 設 置 正 常 對 照 組 不 同 的 損 傷 模 型, 還 應 設 置 相 應 的 模 型 對 照 組 慢 性 潰 瘍 模 型 應 先 造 模, 手 術 次 日 再 分 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 一 般 為 天, 必 要 時 可 以 延 長 至 45 天 1.4 胃 粘 膜 損 傷 模 型 急 性 胃 粘 膜 損 傷 酒 精 模 型 實 驗 動 物 : 選 用 Wistar 或 SD 健 康 大 鼠, 單 一 性 別 實 驗 器 材 及 試 劑 : 解 剖 器 械, 遊 標 卡 尺, 酒 精 或 醋 酸, 病 理 製 片 系 統, 生 物 顯 微 鏡 等 實 驗 方 法 : 動 物 隨 機 分 正 常 對 照 組 模 型 組 和 受 試 樣 品 三 個 劑 量 組 各 劑 量 組 灌 胃 樣 品 30 天 后, 全 部 動 物 嚴 格 禁 食 24 小 時 ( 不 禁 水 ), 此 期 間 亦 禁 止 給 予 受 試 物 除 空 白 對 照 外, 所 有 試 驗 組 動 物 給 予 無 水 乙 醇 1.0ml/ 只,1 小 時 後 處 死 動 物, 暴 露 完 整 胃, 結 紮 幽 門, 灌 注 適 量 10% 甲 醛 溶 液, 固 定 20min, 然 後 沿 胃 大 彎 剪 開, 洗 淨 胃 內 容 物, 展 開 胃 粘 膜, 在 體 視 解 剖 顯 微 鏡 下 或 肉 眼 下 用 遊 標 卡 尺 測 量 出 血 點 或 出 血 帶 的 長 度 和 寬 度 因 寬 度 所 代 表 損 傷 的 嚴 重 性 遠 較 長 度 大, 故 雙 倍 積 分 其 評 分 標 準 見 表 1 表 1 急 性 酒 精 損 傷 肉 眼 觀 查 評 分 標 準 損 傷 程 度 1 分 2 分 3 分 4 分 出 血 點 1 個 出 血 帶 長 度 1-5mm 6-10mm 10-15mm >15mm 出 血 帶 寬 度 1-2mm >2mm 總 積 分 = 出 血 點 分 值 + 長 度 分 值 +( 寬 度 分 值 2) 25

26 觀 察 指 標 : 各 實 驗 組 胃 粘 膜 損 傷 程 度 以 損 傷 發 生 率 (%) 損 傷 積 分 指 數 和 損 傷 抑 制 率 表 示 損 傷 發 生 率 (%)= 某 組 出 現 出 血 或 潰 瘍 的 大 鼠 數 量 / 該 組 大 鼠 數 量 100%; 損 傷 積 分 指 數 = 組 損 傷 評 分 總 和 / 組 動 物 數 量 ; 損 傷 抑 制 率 (%)= (A-B) /A 100%(A B 分 別 為 模 型 組 與 試 驗 組 的 損 傷 積 分 ) 病 理 組 織 學 觀 察 及 評 分 : 大 體 檢 查 完 畢, 將 每 只 動 物 胃 粘 膜 損 傷 最 嚴 重 的 部 位 切 下, 固 定 於 10% 甲 醛 溶 液, 常 規 製 片,HE 染 色, 鏡 下 觀 察 注 意 選 擇 胃 粘 膜 正 橫 切 面, 包 括 粘 膜 全 層 的 區 域 觀 察 評 分 方 法 : 以 充 血 出 血 粘 膜 細 胞 變 性 壞 死 在 整 個 粘 膜 上 皮 層 的 累 及 程 度 分 為 5 級 充 血 權 重 為 1, 出 血 權 重 為 2, 上 皮 細 胞 變 性 壞 死 權 重 為 3, 評 分 標 準 及 病 變 總 積 分 公 式 見 表 2 表 2 急 性 胃 粘 膜 損 傷 鏡 下 評 分 標 準 病 變 1 分 2 分 3 分 4 分 5 分 充 血 < 1/5 1/5-2/5 2/5-3/5 3/5-4/5 上 皮 全 層 出 血 < 1/5 1/5-2/5 2/5-3/5 3/5-4/5 上 皮 全 層 上 皮 細 胞 變 性 壞 死 < 1/5 1/5-2/5 2/5-3/5 3/5-4/5 上 皮 全 層 病 變 總 積 分 = 充 血 積 分 + 出 血 積 分 2+ 上 皮 細 胞 變 性 壞 死 積 分 急 性 胃 粘 膜 損 傷 消 炎 痛 模 型 實 驗 動 物 : 選 用 Wistar 或 SD 健 康 大 鼠, 單 一 性 別 實 驗 器 材 及 試 劑 : 解 剖 器 械 或 遊 標 卡 尺, 病 理 製 片 系 統 ; 消 炎 痛, 甲 醛 等 實 驗 方 法 : 動 物 隨 機 分 正 常 對 照 組 模 型 組 和 受 試 樣 品 三 個 劑 量 組, 灌 胃 給 予 動 物 受 試 物 30 天 后, 禁 食 不 禁 水 24 小 時, 模 型 組 和 劑 量 組 給 予 消 炎 痛 40mg/kg 一 次 性 腹 腔 注 射 5 小 時 後 處 死 動 物, 剖 腹 將 胃 取 出, 結 紮 幽 門 和 賁 門, 從 十 二 指 腸 與 幽 門 部 結 合 處 注 入 10% 甲 醛 溶 液 5 ml, 固 定 20 分 鐘 後, 沿 胃 大 彎 剪 開, 洗 淨 胃 內 容 物, 展 開 胃 粘 膜, 用 紙 吸 幹, 觀 察 胃 粘 膜 損 傷 程 度 用 遊 標 卡 尺 測 量 胃 出 血 或 潰 瘍 的 最 大 長 度 及 寬 度, 以 出 血 或 潰 瘍 的 最 大 長 寬 徑 作 為 損 傷 指 標 評 分 消 炎 痛 所 致 胃 粘 膜 損 傷 的 潰 瘍 一 般 較 小, 肉 眼 觀 查 以 點 狀 多 見, 其 評 分 標 準 見 表 3 表 3 急 性 胃 粘 膜 損 傷 消 炎 痛 模 型 評 分 標 準 損 傷 形 態 1 分 2 分 3 分 4 分 出 血 點 1 個 - - 出 血 帶 長 度 1-2mm 2-4mm 4-6mm >6mm 出 血 帶 寬 度 1-2mm >2mm 總 積 分 = 出 血 點 分 值 + 長 度 分 值 +( 寬 度 分 值 2) 注 : 長 度 和 寬 度 均 以 最 大 徑 計 觀 察 指 標 : 各 實 驗 組 胃 粘 膜 損 傷 程 度 以 損 傷 發 生 率 (%) 損 傷 指 數 和 損 傷 抑 制 率 表 示 損 傷 發 生 率 (%)= 某 組 出 現 出 血 或 潰 瘍 的 大 鼠 數 量 / 該 組 大 鼠 數 量 100%; 損 傷 指 數 = 組 損 傷 評 分 總 和 / 組 動 物 數 量 ; 損 傷 抑 制 率 (%)=(A-B)/A 100%(A B 分 別 為 模 型 組 與 試 驗 組 的 損 傷 積 分 ) 病 理 組 織 學 觀 察 及 評 分 : 同 急 性 胃 粘 膜 損 傷 酒 精 模 型 慢 性 胃 潰 瘍 模 型 動 物 : 選 用 Wistar 或 SD 健 康 大 鼠, 單 一 性 別 26

27 實 驗 器 材 及 試 劑 : 帶 尺 規 的 解 剖 鏡 微 量 注 射 器, 醋 酸 半 胱 氨 酸 等 實 驗 方 法 : 醋 酸 注 射 法 : 將 動 物 禁 食 不 禁 水 24 小 時, 乙 醚 或 1% 巴 比 妥 鈉 麻 醉 後 實 施 剖 腹 手 術, 消 毒 腹 部, 於 劍 突 下 切 開 腹 腔, 將 胃 輕 拉 出 腹 腔 外, 用 微 量 注 射 器 於 胃 幽 門 處 漿 膜 下 注 射 l 的 30% 冰 醋 酸, 縫 合 切 口, 術 後 正 常 餵 食 和 水 第 二 天 將 手 術 後 狀 態 良 好 的 動 物 按 體 重 隨 機 分 為 模 型 組 和 受 試 樣 品 三 個 劑 量 組 各 劑 量 組 按 相 應 劑 量 灌 胃, 連 續 14 天 模 型 組 灌 胃 蒸 餾 水 或 溶 劑 禁 食 24 小 時 後 處 死, 取 出 整 個 胃 浸 泡 於 10% 的 甲 醛 內, 浸 泡 20 分 鐘 後 沿 胃 大 彎 剪 開, 洗 淨 內 容 物, 取 腺 胃 區 展 開 平 鋪 於 玻 璃 板 上, 用 紙 吸 幹 潰 瘍 內 的 水 分, 測 量 其 面 積 和 體 積 潰 瘍 面 積 和 體 積 測 量 法 : 於 帶 尺 規 的 解 剖 顯 微 鏡 下 計 數 潰 瘍 所 占 的 方 格 數, 換 算 成 面 積 然 後 用 微 量 注 射 器 將 有 色 墨 水 注 入 潰 瘍 內, 將 潰 瘍 填 滿 與 周 邊 平 齊, 讀 取 微 量 注 射 器 上 刻 度 即 為 潰 瘍 的 體 積 冰 醋 酸 浸 漬 法 : 將 動 物 禁 食 不 禁 水 24 小 時, 乙 醚 或 1% 巴 比 妥 鈉 麻 醉 後 實 施 剖 腹 手 術, 消 毒 腹 部, 於 劍 突 下 切 開 腹 腔, 將 內 徑 5mm 長 30mm 的 玻 璃 管 垂 直 放 置 胃 體 部 粘 膜 上, 向 管 腔 加 入 冰 醋 酸 0.2ml,1.5 分 鐘 後 用 棉 簽 蘸 出 冰 醋 酸, 縫 合 手 術 切 口, 術 後 正 常 餵 食 和 水, 第 二 天 將 手 術 後 狀 態 良 好 的 動 物 按 體 重 隨 機 分 組 給 藥, 動 物 處 置 和 測 量 等 操 作 同 上 1.5 資 料 處 理 和 結 果 判 定 資 料 可 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 F 值 F0.05, 即 P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 受 試 物 一 個 或 一 個 以 上 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 進 行 比 較, 大 體 觀 察 評 分 與 病 理 組 織 學 檢 查 評 分 結 果 均 表 明 胃 粘 膜 損 傷 明 顯 改 善, 可 判 定 該 受 試 樣 品 動 物 實 驗 結 果 為 陽 性 1.6 注 意 事 項 動 物 禁 食 應 完 全, 應 嚴 格 控 制 動 物 禁 食 期 間 食 糞 便 皮 毛 墊 料 等 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 受 試 者 的 選 擇 標 準 納 入 受 試 者 標 準 : 符 合 慢 性 淺 表 性 胃 炎 診 斷 標 準 且 經 胃 鏡 篩 選 確 診 為 胃 粘 膜 損 傷 的 自 願 受 試 者 慢 性 淺 表 性 胃 炎 診 斷 標 準 : 病 程 遷 延, 有 不 同 程 度 的 消 化 不 良 上 腹 痛 燒 心 噯 氣 反 酸 腹 脹 等 臨 床 症 狀, 可 有 上 腹 部 輕 度 壓 痛 符 合 慢 性 淺 表 性 胃 炎 纖 維 胃 鏡 診 斷 標 準 及 活 體 組 織 檢 查 診 斷 標 準 排 除 胃 潰 瘍 患 者 排 除 受 試 者 標 準 : 年 齡 在 18 歲 以 下 或 65 歲 以 上, 妊 娠 或 哺 乳 期 婦 女, 過 敏 體 質 及 對 本 樣 品 過 敏 者 繼 發 性 慢 性 胃 炎 合 併 有 心 血 管 腦 血 管 肝 腎 和 造 血 系 統 嚴 重 疾 病, 精 神 病 患 者 27

28 經 常 用 藥 嗜 酒 吸 煙,4 周 內 參 加 過 其 它 實 驗 個 月 內 用 過 已 知 對 胃 腸 功 能 有 損 害 的 藥 物 症 狀 體 征 分 級 為 重 症 者 有 嚴 重 消 化 系 統 潰 瘍 的 病 人 正 在 服 用 其 它 治 療 藥 物 或 接 受 其 它 治 療 者 未 按 規 定 服 用 樣 品, 無 法 判 斷 功 效, 或 資 料 不 全 等 影 響 功 效 或 安 全 性 判 斷 者 2.2 試 驗 設 計 及 服 樣 期 限 採 用 組 間 和 自 身 兩 種 對 照 設 計 按 受 試 者 的 症 狀 輕 重 隨 機 分 為 試 食 組 和 對 照 組, 盡 可 能 考 慮 影 響 結 果 的 主 要 因 素 如 年 齡 性 別 病 程 等, 進 行 均 衡 性 檢 驗, 以 保 證 組 間 的 可 比 性 每 組 受 試 者 不 少 於 50 例 2.3 受 試 樣 品 的 劑 量 和 使 用 方 法 試 食 組 按 推 薦 服 用 方 法 服 用 量 服 用 受 試 產 品, 在 試 驗 期 間 停 用 其 它 用 於 慢 性 胃 病 的 物 品, 對 照 組 服 有 相 同 作 用 的 陽 性 物 按 雙 盲 法 進 行 試 食 試 驗 觀 察 時 間 不 少 於 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 試 驗 期 間 不 改 變 原 來 的 飲 食 習 慣, 正 常 飲 食 2.4 觀 察 指 標 安 全 性 指 標 一 般 狀 況 : 包 括 精 神 睡 眠 飲 食 大 小 便 血 壓 等 血 尿 便 常 規 檢 查 肝 腎 功 能 檢 查 胸 透 心 電 圖 腹 部 B 超 檢 查 ( 僅 在 試 驗 開 始 前 檢 查 一 次 ) 功 效 指 標 症 狀 觀 察 胃 痛 噯 氣 反 酸 腹 脹 食 欲 不 振 少 食 等 臨 床 症 狀 體 征 觀 察 劍 突 下 壓 痛 程 度 按 症 狀 輕 重 統 計 積 分 ( 重 症 3 分, 中 度 2 分, 輕 度 1 分 ), 見 表 4 胃 痛 表 4 人 體 試 食 試 驗 症 狀 輕 重 分 級 表 症 狀 輕 (1 分 ) 中 (2 分 ) 重 (3 分 ) 輕 微, 持 續 時 間 短, 不 影 響 工 作 及 休 息 疼 痛 時 間 較 長, 每 日 超 4 小 時, 尚 能 忍 受, 但 對 工 作 及 休 息 有 一 定 影 響 疼 痛 較 重, 持 續 難 忍, 需 服 藥 才 能 減 輕 噯 氣 偶 有 發 作 經 常 發 作, 引 及 兩 脅 不 適 頻 繁 發 作, 引 及 兩 脅 疼 痛 反 酸 偶 有 吐 酸 飲 食 不 適 即 吐 酸 頻 繁 吐 酸 腹 脹 腹 脹 輕 微, 時 作 時 止, 在 短 時 間 內 可 較 甚 腹 脹 較 甚 或 發 作 頻 繁, 在 較 長 時 間 內 不 緩 解, 影 響 工 作 及 休 息 腹 脹 難 忍, 持 續 時 間 長, 需 服 藥 才 能 減 輕 28

29 少 食 食 欲 較 差, 飯 量 減 少 1/2 以 內 胃 鏡 檢 查 與 體 征 觀 察 飯 量 減 少 1/2-2/3 無 食 欲, 飯 量 減 少 2/3 以 上 劍 突 下 壓 痛 程 度 檢 查, 根 據 疼 痛 程 度 分 為 輕 (1 分 ) 中 (2 分 ) 重 (3 分 ) 輕 度 : 用 力 時 才 出 現 疼 痛, 壓 痛 輕 微 1 分 中 度 : 用 力 即 出 現 疼 痛, 但 疼 痛 尚 能 忍 受, 壓 痛 明 顯 2 分 重 症 : 稍 微 用 力 即 出 現 疼 痛, 疼 痛 不 能 忍 受, 壓 痛 劇 烈 3 分 隨 機 選 擇 試 食 組 和 對 照 組 各 15 例 受 試 者 進 行 胃 鏡 檢 查, 比 較 試 食 試 驗 前 後 的 改 變 2.5 資 料 處 理 和 結 果 判 定 統 計 症 狀 和 體 征 積 分 值 試 驗 資 料 為 計 量 資 料, 可 用 t 檢 驗 進 行 分 析 凡 自 身 對 照 資 料 可 以 採 用 配 對 t 檢 驗, 兩 組 均 數 比 較 採 用 成 組 t 檢 驗, 後 者 需 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 對 非 正 態 分 佈 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 方 差 齊 後, 用 轉 換 的 資 料 進 行 t 檢 驗 若 轉 換 資 料 仍 不 能 滿 足 正 態 方 差 齊 要 求, 改 用 t 檢 驗 或 秩 和 檢 驗, 但 變 異 係 數 太 大 ( 如 CV>50%) 的 資 料 應 用 秩 和 檢 驗 結 果 判 定 : 試 食 前 後 試 食 組 自 身 比 較 及 試 食 後 試 食 組 與 對 照 組 組 間 比 較, 臨 床 症 狀 體 征 積 分 明 顯 減 少, 胃 鏡 複 查 結 果 有 改 善 或 不 加 重, 可 判 定 該 受 試 樣 品 對 胃 粘 膜 損 傷 有 輔 助 保 護 功 能 29

30 附 件 3: 輔 助 降 血 糖 功 能 評 價 方 法 試 驗 專 案 試 驗 原 則 及 結 果 判 定 Items, Principles and Result Assessment 1 試 驗 項 目 1.1 動 物 實 驗 分 為 方 案 一 ( 胰 島 損 傷 高 血 糖 模 型 ) 和 方 案 二 ( 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 ) 兩 種 方 案 一 ( 胰 島 損 傷 高 血 糖 模 型 ) 體 重 空 腹 血 糖 糖 耐 量 方 案 二 ( 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 ) 體 重 空 腹 血 糖 糖 耐 量 胰 島 素 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 1.2 人 體 試 食 試 驗 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 糖 化 血 紅 蛋 白 (HbA1c) 或 糖 化 血 清 蛋 白 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 2 試 驗 原 則 2.1 動 物 實 驗 和 人 體 試 食 試 驗 所 列 指 標 均 為 必 做 專 案 2.2 根 據 受 試 樣 品 作 用 原 理 不 同, 方 案 一 和 方 案 二 動 物 模 型 任 選 其 一 進 行 動 物 實 驗 2.3 除 對 高 血 糖 模 型 動 物 進 行 所 列 指 標 的 檢 測 外, 應 進 行 受 試 樣 品 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 影 響 的 觀 察 2.4 人 體 試 食 試 驗 應 在 臨 床 治 療 的 基 礎 上 進 行 2.5 應 對 臨 床 症 狀 和 體 征 進 行 觀 察 2.6 在 進 行 人 體 試 食 試 驗 時, 應 對 受 試 樣 品 的 食 用 安 全 性 作 進 一 步 的 觀 察 3 結 果 判 定 30

31 3.1 動 物 實 驗 : 方 案 一 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 且 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 方 案 二 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 血 脂 ( 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 ) 無 明 顯 升 高, 且 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 3.2 人 體 試 食 試 驗 : 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 糖 化 血 紅 蛋 白 ( 或 糖 化 血 清 蛋 白 ) 血 脂 四 項 指 標 均 無 明 顯 升 高, 且 空 腹 血 糖 餐 後 2 小 時 血 糖 兩 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 對 機 體 健 康 無 影 響, 可 判 定 該 受 試 樣 品 具 有 輔 助 降 血 糖 功 能 的 作 用 31

32 輔 助 降 血 糖 功 能 檢 驗 方 法 Method for the Assessment of Assisting Blood Sugar Reduction Function 1. 動 物 實 驗 1.1 實 驗 動 物 選 用 成 年 動 物, 選 用 小 鼠 (26 2g) 或 大 鼠 (180 20g), 單 一 性 別, 大 鼠 每 組 8-12 只 小 鼠 每 組 只 1.2 材 料 試 劑 四 氧 嘧 啶 (C4H2N2O4 H2O, 分 子 量 ) 或 鏈 脲 佐 菌 素 地 塞 米 松 磷 酸 鈉 注 射 液 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 血 糖 測 定 試 紙 或 試 劑 盒, 胰 島 素 甘 油 三 酯 總 膽 固 醇 測 定 試 劑 盒 高 熱 能 飼 料 豬 油 10% 蔗 糖 15% 蛋 黃 粉 15% 酪 蛋 白 5% 膽 固 醇 1.2% 膽 酸 鈉 0.2% 碳 酸 氫 鈣 0.6% 石 粉 0.4% 鼠 維 持 料 52.6% 儀 器 血 糖 儀 全 自 動 生 化 儀 可 見 光 分 光 光 度 計 酶 標 儀 天 平 1.3 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 實 驗 設 三 個 劑 量 組 和 一 個 模 型 對 照 組, 以 人 體 推 薦 量 的 10 倍 ( 小 鼠 ) 或 5 倍 ( 大 鼠 ) 為 其 中 的 一 個 劑 量 組, 另 設 二 個 劑 量 組, 高 劑 量 一 般 不 超 過 30 倍, 必 要 時 設 空 白 對 照 組 同 時 設 給 予 受 試 樣 品 高 劑 量 的 正 常 動 物 組 受 試 樣 品 給 予 時 間 30 天, 必 要 時 可 延 長 至 45 天 1.4 實 驗 方 法 正 常 動 物 降 糖 實 驗 選 健 康 成 年 動 物 按 禁 食 3-5 小 時 的 血 糖 水 準 分 組, 隨 機 選 1 個 對 照 組 和 1 個 劑 量 組 對 照 組 給 予 溶 劑, 劑 量 組 給 予 高 劑 量 濃 度 受 試 樣 品, 連 續 30 天, 測 空 腹 血 糖 值 ( 禁 食 同 實 驗 前 ), 比 較 兩 組 動 物 血 糖 值 高 血 糖 模 型 降 糖 實 驗 方 案 一 32

33 胰 島 損 傷 高 血 糖 模 型 原 理 四 氧 嘧 啶 ( 或 鏈 脲 佐 菌 素 ) 是 一 種 細 胞 毒 劑, 可 選 擇 性 地 損 傷 多 種 動 物 的 胰 島 細 胞, 造 成 胰 島 素 分 泌 低 下, 引 起 實 驗 性 糖 尿 病 造 模 方 法 購 入 成 年 動 物, 適 應 1 天 后, 隨 機 取 15 只 動 物 禁 食 3-5 小 時, 測 空 腹 血 糖, 作 為 該 批 次 動 物 基 礎 血 糖 值 隨 後 動 物 禁 食 24 小 時 ( 自 由 飲 水 ), 注 射 四 氧 嘧 啶 ( 用 前 新 鮮 配 製 ) 造 模, 小 鼠 45-50mg/kg BW.iv 或 mg/kg BW.ip, 大 鼠 50-80mg/kg BW.iv 或 mg/kg BW.ip 5-7 天 后 動 物 禁 食 3-5 小 時, 測 血 糖, 血 糖 值 10-25mmol/L 為 高 血 糖 模 型 成 功 動 物 高 血 糖 模 型 動 物 降 糖 實 驗 選 高 血 糖 模 型 動 物 按 禁 食 3-5 小 時 的 血 糖 水 準 分 組, 隨 機 選 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 ( 組 間 差 不 大 於 1.1mmol/L) 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 溶 劑, 連 續 30 天, 測 空 腹 血 糖 值 ( 禁 食 同 實 驗 前 ), 比 較 各 組 動 物 血 糖 值 及 血 糖 下 降 百 分 率 ( 實 驗 前 血 糖 值 - 實 驗 後 血 糖 值 ) 血 糖 下 降 率 %= % 實 驗 前 血 糖 值 高 血 糖 模 型 動 物 糖 耐 量 實 驗 劑 量 分 組 及 受 試 樣 品 給 予 時 間 同 各 組 動 物 禁 食 3-5 小 時, 測 定 給 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 前 ( 即 0 小 時 ) 血 糖 值, 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑,15-20 分 鐘 後 各 組 經 口 給 予 葡 萄 糖 2.0g/kg BW 或 醫 用 澱 粉 3-5g/kg BW, 測 定 給 葡 萄 糖 後 各 組 小 時 的 血 糖 值 或 給 醫 用 澱 粉 後 1 2 小 時 的 血 糖 值, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 給 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 後 各 時 間 點 ( 小 時 ) 血 糖 值 及 血 糖 曲 線 下 面 積 的 變 化 (0 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 0.5 (2 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 1.5 血 糖 曲 線 下 面 積 = 方 案 二 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 ( 任 選 其 一 ) 地 塞 米 松 誘 導 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 原 理 糖 皮 質 激 素 具 有 拮 抗 胰 島 素 生 物 效 應 的 作 用, 可 抑 制 靶 組 織 對 葡 萄 糖 的 攝 取 和 利 用, 促 進 蛋 白 質 和 脂 肪 的 分 解 及 糖 異 生 作 用, 導 致 糖 脂 代 謝 紊 亂, 胰 島 素 抵 抗, 誘 發 實 驗 性 糖 尿 病 試 驗 方 法 購 入 健 康 雄 性 大 鼠 (150 20g), 普 通 維 持 料 適 應 飼 養 3-5 天, 禁 食 3-4 小 時, 取 尾 血, 測 定 空 腹 即 給 葡 萄 糖 前 (0 小 時 ) 血 糖 值, 給 2.5g/kgBW 葡 萄 糖 後 測 定 小 時 血 糖 值, 作 為 該 批 次 動 物 基 礎 值 以 小 時 血 糖 水 準 分 5 個 組, 即 1 個 空 白 對 照 組 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組, 每 組 15 只 空 白 對 照 組 不 做 處 理,3 個 劑 量 組 灌 胃 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 連 續 35 天 各 組 給 予 維 持 料 飼 養,1 周 後 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 更 換 高 熱 能 飼 料, 喂 飼 2 周 後, 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 在 高 熱 能 飼 料 基 礎 上 分 別 給 予 地 塞 米 松 0.8mg/kgBW 腹 腔 注 射 (0.008% 地 塞 米 松 注 射 量 1ml/100g 體 重 ), 每 日 1 次, 連 續 天 33

34 試 驗 結 束, 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 空 腹 血 糖 糖 耐 量 血 清 胰 島 素 及 膽 固 醇 甘 油 三 脂 水 準 觀 察 指 標 空 腹 血 糖 糖 耐 量 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 測 定 空 腹 血 糖 即 給 葡 萄 糖 前 (0 小 時 ) 血 糖 值, 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 空 白 對 照 組 不 做 處 理,15-20 分 鐘 後 各 組 經 口 給 予 葡 萄 糖 2.5g/kg BW, 測 定 給 葡 萄 糖 後 各 組 小 時 的 血 糖 值, 若 模 型 對 照 組 0.5 小 時 血 糖 值 10mmol/L, 或 模 型 對 照 組 0.5 小 時 2 小 時 任 一 時 間 點 血 糖 升 高 或 血 糖 曲 線 下 面 積 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 糖 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 空 腹 血 糖 給 葡 萄 糖 後 (0.5 2 小 時 ) 血 糖 及 小 時 血 糖 曲 線 下 面 積 的 變 化 ( 實 驗 前 血 糖 值 - 實 驗 後 血 糖 值 ) 血 糖 下 降 率 %= % 實 驗 前 血 糖 值 (0 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 0.5 (2 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 1.5 血 糖 曲 線 下 面 積 = 膽 固 醇 甘 油 三 脂 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 膽 固 醇 甘 油 三 脂, 若 模 型 對 照 組 血 清 膽 固 醇 或 甘 油 三 酯 明 顯 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 血 脂 變 化 胰 島 素 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 胰 島 素, 模 型 對 照 組 與 空 白 對 照 組 比 較 胰 島 素 抵 抗 指 數 無 明 顯 下 降, 且 動 物 糖 / 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 判 定 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 成 功 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 胰 島 素 抵 抗 情 況 血 糖 胰 島 素 胰 島 素 抵 抗 指 數 = 胰 島 素 /22.5e -ln 血 糖 四 氧 嘧 啶 誘 導 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 原 理 高 熱 能 飼 料 喂 飼 基 礎 上, 輔 以 小 劑 量 四 氧 嘧 啶 (C4H2N2O4 H2O, 分 子 量 ), 造 成 糖 / 脂 代 謝 紊 亂, 胰 島 素 抵 抗, 誘 發 實 驗 性 糖 尿 病 造 模 方 法 購 入 健 康 雄 性 大 鼠 (150 20g), 普 通 維 持 料 適 應 飼 養 3-5 天, 禁 食 3-4 小 時, 取 尾 血, 測 定 給 葡 萄 糖 前 ( 即 0 小 時 ) 血 糖 值, 給 2.5g/kgBW 葡 萄 糖 後 小 時 血 糖 值, 作 為 該 批 次 動 物 基 礎 值 以 小 時 血 糖 水 準 分 5 個 組, 即 1 個 空 白 對 照 組 1 個 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組, 每 組 15 只 空 白 對 照 組 不 做 處 理,3 個 劑 量 組 灌 胃 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 連 續 33 天 各 組 給 予 維 持 料 飼 養,1 周 後 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 組 更 換 高 熱 能 飼 料, 喂 飼 3 周 後, 模 型 對 照 組 和 3 個 劑 量 禁 食 24 小 時 ( 不 禁 水 ), 給 予 四 氧 嘧 啶

35 105mg/kgBW 腹 腔 注 射, 注 射 量 1ml/100g 體 重 注 射 後 繼 續 給 予 高 熱 能 飼 料 喂 飼 3-5 天 試 驗 結 束, 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 空 腹 血 糖 糖 耐 量 血 清 胰 島 素 及 膽 固 醇 甘 油 三 脂 水 準 觀 察 指 標 空 腹 血 糖 糖 耐 量 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 測 定 空 腹 血 糖 即 給 葡 萄 糖 前 (0 小 時 ) 血 糖 值, 劑 量 組 給 予 不 同 濃 度 受 試 樣 品, 模 型 對 照 組 給 予 同 體 積 溶 劑, 空 白 對 照 組 不 做 處 理,15-20 分 鐘 後 各 組 經 口 給 予 葡 萄 糖 2.5g/kg BW, 測 定 給 葡 萄 糖 後 各 組 小 時 的 血 糖 值, 若 模 型 對 照 組 0.5 小 時 血 糖 值 10mmol/L, 或 模 型 對 照 組 0.5 小 時 2 小 時 任 一 時 間 點 血 糖 升 高 或 血 糖 曲 線 下 面 積 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 糖 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 空 腹 血 糖 給 葡 萄 糖 後 (0.5 2 小 時 ) 血 糖 及 小 時 血 糖 曲 線 下 面 積 的 變 化 ( 實 驗 前 血 糖 值 - 實 驗 後 血 糖 值 ) 血 糖 下 降 率 %= % 實 驗 前 血 糖 值 (0 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 0.5 (2 小 時 血 糖 +0.5 小 時 血 糖 ) 1.5 血 糖 曲 線 下 面 積 = 膽 固 醇 甘 油 三 脂 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 膽 固 醇 甘 油 三 脂, 若 模 型 對 照 組 血 清 膽 固 醇 或 甘 油 三 酯 明 顯 升 高, 與 空 白 對 照 組 比 較, 差 異 有 顯 著 性, 判 定 模 型 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 在 此 基 礎 上, 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 血 脂 變 化 胰 島 素 各 組 動 物 禁 食 3-4 小 時, 檢 測 血 清 胰 島 素, 模 型 對 照 組 與 空 白 對 照 組 比 較 胰 島 素 抵 抗 指 數 無 明 顯 下 降, 且 動 物 糖 / 脂 代 謝 紊 亂 成 立, 判 定 胰 島 素 抵 抗 糖 \ 脂 代 謝 紊 亂 模 型 成 功 觀 察 模 型 對 照 組 與 受 試 樣 品 組 胰 島 素 抵 抗 情 況 血 糖 胰 島 素 胰 島 素 抵 抗 指 數 = 胰 島 素 /22.5e -ln 血 糖 資 料 處 理 及 結 果 判 定 一 般 採 用 方 差 分 析, 但 需 按 方 差 分 析 的 程 式 先 進 行 方 差 齊 性 檢 驗, 方 差 齊, 計 算 F 值,F 值 < F0.05, 結 論 : 各 組 均 數 間 差 異 無 顯 著 性 ;F 值 F0.05,P 0.05, 用 多 個 實 驗 組 和 一 個 對 照 組 間 均 數 的 兩 兩 比 較 方 法 進 行 統 計 ; 對 非 正 態 或 方 差 不 齊 的 資 料 進 行 適 當 的 變 數 轉 換, 待 滿 足 正 態 或 方 差 齊 要 求 後, 用 轉 換 後 的 資 料 進 行 統 計 ; 若 變 數 轉 換 後 仍 未 達 到 正 態 或 方 差 齊 的 目 的, 改 用 秩 和 檢 驗 進 行 統 計 指 標 判 定 正 常 動 物 降 糖 試 驗 血 糖 指 標 : 空 腹 血 糖 受 試 樣 品 劑 量 組 與 對 照 組 比 較 無 統 計 學 意 義, 判 定 對 正 常 動 物 血 糖 無 35

36 影 響 高 血 糖 模 型 降 糖 試 驗 空 腹 血 糖 指 標 : 模 型 成 立 的 前 提 下, 受 試 樣 品 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 空 腹 血 糖 下 降 或 血 糖 下 降 百 分 率 升 高 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 空 腹 血 糖 指 標 結 果 陽 性 糖 耐 量 指 標 : 模 型 成 立 的 前 提 下, 受 試 樣 品 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 在 給 葡 萄 糖 或 醫 用 澱 粉 後 小 時 任 一 時 間 點 血 糖 下 降 ( 或 血 糖 下 降 百 分 率 升 高 ) 有 統 計 學 意 義, 或 小 時 血 糖 曲 線 下 面 積 降 低 有 統 計 學 意 義, 判 定 該 受 試 樣 品 糖 耐 量 指 標 結 果 陽 性 血 脂 指 標 : 模 型 成 立 的 前 提 下, 受 試 樣 品 劑 量 組 與 模 型 對 照 組 比 較, 血 清 膽 固 醇 或 甘 油 三 酯 下 降 有 統 計 學 意 義, 可 判 定 該 受 試 樣 品 降 血 脂 指 標 陽 性 結 果 判 定 方 案 一 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 且 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 方 案 二 : 空 腹 血 糖 和 糖 耐 量 二 項 指 標 中 一 項 指 標 陽 性, 且 血 脂 ( 總 膽 固 醇 甘 油 三 酯 ) 無 明 顯 升 高, 對 正 常 動 物 空 腹 血 糖 無 影 響, 即 可 判 定 該 受 試 樣 品 輔 助 降 血 糖 功 能 動 物 實 驗 結 果 陽 性 1.6 注 意 事 項 為 了 使 實 驗 動 物 糖 代 謝 功 能 狀 態 儘 量 保 持 一 致, 也 為 了 準 確 地 按 體 重 計 算 受 試 樣 品 的 用 量, 實 驗 前 動 物 應 嚴 格 禁 食 ( 不 禁 水 ), 實 驗 前 後 禁 食 條 件 應 一 致, 鼠 類 在 禁 食 的 同 時 應 更 換 襯 墊 物 如 用 血 清 樣 品 進 行 測 定, 應 於 取 血 後 30 分 鐘 內 分 離 血 清, 分 離 後 血 清 的 含 糖 量 在 6 小 時 內 不 變 用 血 清 製 備 的 無 蛋 白 血 濾 液 可 保 存 48 小 時 以 上 高 濃 度 的 還 原 性 物 質 如 Vit C 亦 能 與 色 素 原 競 爭 游 離 氧, 干 擾 反 應, 使 結 果 偏 低 血 紅 蛋 白 能 使 過 氧 化 氫 過 早 分 解, 亦 干 擾 反 應, 致 使 測 得 血 糖 值 偏 低 故 對 已 溶 血 的 全 血 或 血 清 必 須 製 備 無 蛋 白 濾 液 後, 再 進 行 測 定 1.7 血 糖 測 定 方 法 用 試 紙 或 試 劑 盒, 按 說 明 書 操 作 ; 若 自 行 配 製 試 劑, 按 下 列 方 法 操 作 : 原 理 葡 萄 糖 氧 化 酶 是 一 種 需 氧 脫 氫 酶, 能 催 化 葡 萄 糖 生 成 葡 萄 糖 酸 和 過 氧 化 氫, 後 者 在 過 氧 化 物 酶 作 用 下 放 出 氧, 使 4- 氨 基 安 替 比 林 與 酚 氧 化 縮 合, 生 成 紅 色 醌 類 化 合 物, 可 在 波 長 505nm 比 色 測 定 葡 萄 糖 氧 化 酶 葡 萄 糖 葡 萄 糖 酸 + 過 氧 化 氫 過 氧 化 物 酶 過 氧 化 氫 + 酚 +4- 氨 基 安 替 比 林 紅 色 醌 類 化 合 物 36

37 1.7.2 試 劑 配 製 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (0.2mol/L,pH7.0) 0.2mol/L Na2HPO461mL,0.2mol/L KH2PO439mL 混 合 即 可 酶 試 劑 葡 萄 糖 氧 化 酶 400u, 過 氧 化 物 酶 0.6mg,4- 氨 基 安 替 比 林 10mg, 疊 氮 鈉 100mg, 加 磷 酸 鹽 緩 衝 液 至 100mL,PH 調 至 7 冰 箱 存 放 至 少 可 穩 定 2 個 月 酚 試 劑 酚 100mg 溶 於 100mL 蒸 餾 水 中 酶 混 合 試 劑 取 等 量 酶 試 劑 和 酚 試 劑 混 合 在 冰 箱 中 可 存 放 1 個 月 葡 萄 糖 標 準 液 儲 存 液 : 無 水 D- 葡 萄 糖 (A.R.) 在 烤 箱 中 80 烤 4 小 時, 冷 卻 後, 存 放 於 乾 燥 器 中 至 恒 重 精 確 稱 取 2g 以 0.25% 苯 甲 酸 溶 液 溶 解 並 移 入 100mL 容 量 瓶 中, 再 用 苯 甲 酸 溶 液 稀 釋 至 100mL 應 用 液 : 在 100mL 容 量 瓶 中 準 確 加 入 儲 存 液 5mL, 再 用 0.25% 苯 甲 酸 溶 液 稀 釋 至 100mL, 即 1mg/mL 應 用 液 蛋 白 沉 澱 劑 溶 解 磷 酸 氫 二 鈉 10g 鎢 酸 鈉 10g 氯 化 鈉 9g 於 800mL 蒸 餾 水 中, 加 入 1mol/L 鹽 酸 125mL, 並 用 蒸 餾 水 稀 釋 至 1000mL 操 作 步 驟 取 蛋 白 沉 澱 劑 1mL 加 入 血 漿 ( 血 清 )50μL 混 勻 室 溫 放 置 7 分 鐘 後, 離 心, 取 上 清 液 ( 無 蛋 白 血 濾 液 ) 測 定 葡 萄 糖 標 準 應 用 液 亦 進 行 同 樣 處 理 測 定 管 標 準 管 空 白 管 無 蛋 白 血 濾 液 ml 處 理 後 的 葡 萄 糖 標 準 液 ml 蛋 白 沉 澱 液 ml 0.5 酶 混 合 試 劑 ml 混 勻 後,37 水 浴 保 溫 15 分 鐘, 用 空 白 管 調 零 點, 在 波 長 505nm 處 比 色 結 果 計 算 測 定 管 OD 血 糖 含 量 (mmol/l)= 100/18 標 準 管 OD 2 人 體 試 食 試 驗 2.1 試 驗 設 計 試 驗 採 用 隨 機 分 組, 組 間 和 自 身 兩 種 對 照 設 計 2.2 受 試 產 品 37