1502 林 伟, 等 基 因 芯 片 分 析 RNA 干 涉 MSP58 后 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 的 变 化 微 小 球 蛋 白 (58 kda microspherule protein, MSP58) 是 一 个 细 胞 周 期 依 赖 性 的 转 录 因 子, 已 经 有

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1 中华肿瘤防治杂志 ２０１０ 年 １０ 月第 １７ 卷第 １９ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｏ ｂ ２０１０ Ｖ １７ Ｎ １９ １５０１ 前沿报道 基因芯片分析 ＲＮＡ 干涉 ＭＳＰ５８ 后细胞周期 相关基因表达的变化 林伟１ 章翔１ 张瞡２ 费舟１ 刘卫平１ 药立波２ 第四军医大学西京医院神经外科 陕西 西安 ７１００３２ ２ 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西 西安 ７１００３２ Ｃｇ ｇｘｐ ＭＳＰ５８ｇＲＮＡ 犔犐犖 犠 １ 犣犎犃犖犌犡 犪狀犵１ 犣犎犃犖犌犑 狀犵２ 犉犈犐犣犺狅狌１ 犔犐犝 犠 狆 狀犵１ 犢犃犗犔 犫 狅２ 犇狆犪狉 犿狀 狅犳 犖狌狉 狅 狌狉犵 狉狔 犡 狀犵 犎狅 狆 犪 犉狅狌狉 犺犕 犪狉狔 犕犱 犮犪 犝狀 狏 狉 犪狀７１００３２ 犘 犚 狀犪 犼 狔 犡 ２ 犇狆犪狉 犿狀 狅犳 犅 狅 犮犺犿 狉狔犪狀犱 犕狅 犮狌 犪狉犅 狅 狅犵狔 犛犮犺狅 狅 狅犳 犅犪 犮犕犱 犮 狀 犉狅狌狉 犺犕 犪狉狔 犕犱 犮犪 犝狀 狏 狉 狔 犡 犪狀７１００３２ 犘 犚 狀犪 摘要 目的 采用 基 因 芯 片 技 术 观 察 ＲＮＡ 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｇ ｇ 干涉法抑制 人 脑 胶 质 瘤 Ｕ２５１ 细 胞 ＭＳＰ５８ 基 ｇｘｐ ｐｐ ＭＳＰ５８ｂ 因表达后细胞周期相关基因的 变 化 从 而 了 解 ＲＮＡ Ｕ２５１ ｇｄｎａ ｍ ＭＳＰ５８ 在细胞周期 相 关 基 因 通 路 中 的 可 能 定 ＭＳＰ５８ ｇｐ 位 方 法 将 特 异 性 的 ＭＳＰ５８ 干 涉 表 达 载 体 ｗ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｈｍｇ ｍ Ｕ２５１ ｗ ３ １ ＭＳＰ５８ 转 染 人 脑 胶 质 瘤 细 胞 系 ｐｓ ３ １ ＭＳＰ ｗ ｐ ＲＮＡ ｘｐ ｐｓ Ｕ２５１ 同时构建相应 的 阴 性 对 照 载 体 ｐｓ ５８ ｇ ＭＳＰ５８ ｍｒｎａ Ａ ｐ ｇ ｇ ｇ ３ １ ＮＣ 以 及 空 载 体 ｐｓ ３ １ Ｈ１ ｍ ｗ ｇ ｐｓ 运用半定量 ＲＴＰＣＲ 及蛋白质印迹法 检测稳 ３ １ ＮＣ Ｔｘｐ ＭＳＰ５８ｍＲＮＡ ｐ 定转 染 和 未 转 染 干 涉 载 体 的 胶 质 瘤 细 胞 ｍｇ ｂ ｗ ＭＳＰ５８ 的 ｍｒｎａ 和 蛋 白 表 达 水 平 运 用 基 ｂ ｍ ＲＴＰＣＲ Ｗ ｂ ｇ ｑ 因 芯 片 技 术 分 析 ｐｓ ３ １ ＭＳＰ５８ 转 染 后 ｐ ｂ Ｕ２５１ Ｓ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔ 细胞周期相关基因的变化 结 果 成 功 建 立 了 ｗ ｐｓ ３ １ ＭＳＰ８ Ｕ２５１ ＮＣ ｗ ｐｓ ３ １ ＮＣ 具有稳定 下 调 ＭＳＰ５８ 基 因 表 达 的 Ｕ２５１ Ｓ 细 Ｕ２５１ Ｈ１ ｗ ｍｐ ｐｓ ３ １ Ｈ１ 胞 阴性 对 照 Ｕ２５１ ＮＣ 细 胞 以 及 含 有 空 载 体 ｗ ｂ Ｔｘｐ ＭＳＰ５８ｇｍＲＮＡ 的 Ｕ２５１ Ｈ１ 细胞 干涉组细胞 ＭＳＰ５８ 的 ｐ Ｕ２５１ Ｓ ｗ ｗ ｇ 表达无论在 ｍｒｎａ 水平还是 在 蛋 白 质 水 平 均 Ｕ２５１ ＮＣ Ｕ２５１ Ｈ１ Ｕ２５１ 较阴性对照组及 空 载 体 组 细 胞 显 著 降 低 犘 犘 ０ ０１ Ａ １２８ｇ ｗ ｗ ｘ ０ ０１ 基因芯 片 技 术 共 筛 选 细 胞 周 期 相 关 基 ｍ ｂｄｎａ ｍ Ｔ ｗ ｐ ｇ ３３ｇ 因 １２８ 个 其中上调及下调 ２ 倍的共有 ３３ 个 ｗ ｇ ｂｍ ２ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 Ｔ 基因 结论 干涉 ＭＳＰ５８ 基因表 达 后 胶 质 瘤 ｂ ｍｇ ｍ ｐ ｂ ＭＳＰ５８ｇＲＮＡ 细胞增殖的 抑 制 与 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 的 ｍｂ ｇ 变化有关 ｇｘｐ 中华肿瘤防治杂志 ２０１０ １７ １９ １５０１ １５０５ 狀犑犆犪狀犮 狉犘狉 狏犜狉 犪 ２０１０ １７ １９ １５０１ １５０５ 关键词 基因表达 ＲＮＡ 干扰 神经胶质瘤 细胞周期 印迹法 ＲＮＡ ＲＮＡ ｍ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｇｘｐ ｇ ｂ ｇ 中图分类号 Ｒ７３９ ４１ 文献标识码 Ａ 文章编号 １６７３ ５２６９ ２０１０ １９ １５０１ ０５ 基金项目 国家自然科学基金 ３９９７０７５２ 陕西省科技计划项目资助 ２００８Ｋ０９ ０９ 第一作者简介 林伟 男 江苏无锡人 博士 讲师 主治医师 主要从事颅脑战 创伤以及神经系统疾病的基础与临床研究工作 Ｔ ８６ ２９ ８４７７５３３０ Ｅ ｍ ｗ ｍｍ 通讯作者简介 章翔 男 湖南长沙人 主任医师 教授 博士生导师 主要从事颅脑战 创伤以及 神 经 系 统 疾 病 的 基 础 与 临 床 研 究 工作 Ｔ ８６ ２９ ８４７７５３２３ Ｅ ｍ ｘ ｚｇ ｍｍ

2 1502 林 伟, 等 基 因 芯 片 分 析 RNA 干 涉 MSP58 后 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 的 变 化 微 小 球 蛋 白 (58 kda microspherule protein, MSP58) 是 一 个 细 胞 周 期 依 赖 性 的 转 录 因 子, 已 经 有 报 道 MSP58 与 核 蛋 白 p120 Mi 2β 以 及 转 录 因 子 Daxx STRA13 均 有 相 互 作 用 [1 4] 这 些 发 现 提 示, MSP58 在 细 胞 核 及 核 仁 中 具 有 转 录 调 节 功 能, 从 而 提 示 它 在 恶 性 肿 瘤 的 发 生 与 发 展 过 程 中 可 能 发 挥 着 重 要 作 用 最 新 报 道 发 现, 在 结 肠 直 肠 癌 和 肝 癌 细 胞 中 MSP58 的 表 达 显 著 增 加 [5 6], 先 前 的 研 究 表 明, 应 用 RNA 干 涉 方 法 下 调 人 脑 胶 质 瘤 U251 细 胞 MSP58 基 因 的 表 达 后, 可 明 显 抑 制 人 脑 胶 质 瘤 细 胞 的 增 殖, 并 可 [7] 显 著 抑 制 胶 质 瘤 细 胞 的 迁 移 及 侵 袭 能 力 为 进 一 步 了 解 MSP58 基 因 在 细 胞 周 期 调 节 通 路 中 的 可 能 定 位, 本 研 究 利 用 基 因 芯 片 技 术, 观 察 运 用 RNA 干 涉 法 抑 制 人 脑 胶 质 瘤 U251 细 胞 MSP58 基 因 表 达 后 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 的 变 化 1 材 料 与 方 法 1.1 细 胞 系 和 菌 种 以 及 质 粒 人 脑 胶 质 母 细 胞 瘤 U251 细 胞 源 自 美 国 模 式 培 养 物 收 集 中 心 (american type culture colection, ATCC), 并 由 本 研 究 所 冻 存 大 肠 埃 希 菌 XL10 菌 种 由 基 础 部 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 教 研 室 张 健 博 士 提 供 干 涉 质 粒 psilencer3.1 H1neo 载 体 及 阴 性 对 照 载 体 psilencer3.1 H1neo Negtive 均 购 自 Ambion 公 司 1.2 主 要 试 剂 限 制 性 核 酸 内 切 酶 BamHⅠ HindⅢ T4 DNA 连 接 酶 及 PCR 试 剂 盒 为 日 本 TaKaRa 公 司 产 品 ; 质 粒 提 取 试 剂 盒 及 凝 胶 回 收 纯 化 试 剂 盒 为 U gene 公 司 产 品 ;Lipofectamine TM 2000 G418 及 Trizol 均 为 美 国 Invitrogen 公 司 产 品 ; 兔 抗 人 MSP58 多 克 隆 抗 体 为 加 拿 大 人 类 分 子 研 究 中 心 Davidovic 教 授 惠 赠 小 鼠 抗 人 β actin 单 抗 及 蛋 白 质 印 迹 法 试 剂 盒 为 美 国 Sigma 公 司 产 品 基 因 功 能 分 类 芯 片 为 美 国 SuperArray 公 司 产 品 1.3 人 MSP58 基 因 特 异 性 RNAi 片 段 的 设 计 及 合 成 采 用 VectorNTI5.0 软 件, 根 据 人 MSP58 基 因 的 cdna 序 列 和 干 涉 载 体 的 设 计 要 求, 设 计 2 条 寡 核 苷 酸 链, 序 列 1:5 GATCCGCAGCTCATCATCG AACTTCTTCAAGAGAGAAGTTCGATGATGAG CTGTTTTTTGGAAA 3, 序 列 2:5 AGCTTTTC CAAAAAACAGCTCATCATCGAACTTCTCTCTT GAAGAAGTTCGATGATGAGCTGCG 3, 每 条 寡 核 苷 酸 链 长 64nt, 含 有 19nt MSP58 特 异 性 序 列 (Genebank 登 录 号 :AF015308, 编 码 区 序 列 的 165~ 183 位 ), 两 端 分 别 含 有 BamHⅠ 和 HindⅢ 的 酶 切 位 点, 序 列 由 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 合 成 1.4 人 MSP58 基 因 shrna 真 核 表 达 载 体 的 构 建 和 鉴 定 将 合 成 的 2 条 寡 核 苷 酸 链 进 行 退 火 后 储 存 于 -20 备 用 限 制 性 内 切 酶 BamHⅠ 和 HindⅢ 对 psilencer3.1 H1neo 载 体 做 双 酶 切, 酶 切 后 用 凝 胶 纯 化 试 剂 盒 回 收 质 粒 片 段 将 退 火 产 物 与 胶 回 收 的 psi lencer3.1 H1neo 质 粒 片 段 用 T4DNA 连 接 酶 于 16 连 接 过 夜 将 连 接 产 物 转 化 大 肠 埃 希 菌 XL10( 感 受 态 细 胞 ), 铺 于 含 有 氨 苄 青 霉 素 的 LB 培 养 基 平 板 上, 挑 取 单 菌 落 扩 大 培 养, 质 粒 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒, 用 限 制 性 内 切 酶 PstⅠ 对 候 选 的 阳 性 克 隆 质 粒 进 行 单 酶 切 鉴 定, 酶 切 产 物 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 电 泳 结 果 阳 性 的 候 选 质 粒 菌 种 送 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 测 序, 对 测 序 结 果 正 确 的 质 粒 用 紫 外 分 光 光 度 计 进 行 质 粒 浓 度 和 纯 度 的 定 量, 命 名 为 psilencer MSP58,-20 冻 存 备 用 1.5 细 胞 转 染 及 稳 定 转 染 细 胞 系 的 建 立 按 Lipofectamine TM 2000 脂 质 体 转 染 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作, 将 干 涉 载 体 psilencer MSP58 和 阴 性 对 照 载 体 质 粒 分 别 于 6 孔 板 中 转 染 适 量 的 U251 胶 质 瘤 细 胞, 同 时 设 立 U251 的 平 行 对 照 组 转 染 后 48h, 以 1 6 稀 释 传 代 至 另 一 6 孔 板 中, 待 细 胞 贴 壁 后, 用 含 有 800mg/L 的 G418 的 DMEM 完 全 培 养 基 持 续 筛 选 4 周 待 长 出 细 胞 克 隆 后, 随 机 挑 取 30 个 克 隆 继 续 扩 大 培 养, 并 维 持 800 mg/l 的 G418 压 力 筛 选, 等 待 干 涉 效 果 鉴 定 1.6 RT PCR 检 测 MSP58mRNA 表 达 水 平 按 Trizol 试 剂 盒 说 明 书 分 别 提 取 U251 对 照 组 psilencer MSP58 干 涉 载 体 组 和 阴 性 对 照 载 体 组 细 胞 的 总 RNA RT PCR 反 应 按 照 Takara 反 转 录 PCR 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作 1.7 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 MSP58 蛋 白 表 达 水 平 分 别 收 集 25cm 2 培 养 瓶 中 的 U251 对 照 组 psi lencer MSP58 干 涉 载 体 组 和 阴 性 对 照 载 体 组 细 胞, 提 取 蛋 白 进 行 蛋 白 定 量, 按 照 蛋 白 定 量 结 果 进 行 加 样, 行 12%SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳, 采 用 半 干 法 将 蛋 白 转 移 至 硝 酸 纤 维 素 膜 (nitrocelulosemembrane,nc) 上 NC 膜 用 5% 脱 脂 奶 封 闭, 加 入 MSP58pAb(1 200) 或 β actinmab(1 5000) 工 作 液,4 过 夜, 山 羊 抗 兔 或 山 羊 抗 小 鼠 二 抗 (1 4000) 于 室 温 下 孵 育 1h, 用 ECL 发 光, 胶 片 显 色, 分 析 结 果 以 β actin 作 为 内 参 照 1.8 基 因 芯 片 分 析 提 取 稳 定 转 染 干 涉 载 体 psilencer3.1 MSP58 的 U251 S 细 胞 和 转 染 阴 性 对 照 质 粒 psilencer3.1 NC 的 U251 NC 细 胞 RNA, 运 用 美 国 SuperArray 公 司 基 因 功 能 分 类 芯 片 进 行 检 测, 由 上 海 康 成 生 物 基 因 公 司

3 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No 进 行 实 验 主 要 操 作 步 骤 如 下 :1) 提 取 纯 化 RNA 并 测 定 浓 度 ;2) 标 记 荧 光 cdna 探 针 ;3) 荧 光 标 记 的 探 针 与 基 因 芯 片 杂 交 荧 光 扫 描 仪 扫 描 已 杂 交 的 芯 片, 并 采 用 基 因 芯 片 图 像 分 析 软 件 作 数 据 分 析 1.9 统 计 学 方 法 应 用 SPSS11.0 软 件 包 进 行 统 计 学 分 析, 组 间 差 异 采 用 单 因 素 方 差 分 析 (ANOVA) 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 人 MSP58 基 因 shrna 真 核 表 达 载 体 psineo MSP 58 的 构 建 和 鉴 定 将 合 成 的 2 条 寡 核 苷 酸 链 退 火 后 形 成 的 双 链 DNA 片 段, 从 BamHⅠ 和 HindⅢ 2 个 酶 切 位 点 克 隆 到 质 粒 载 体 psilencer3.1 H1neo 载 体 中, 新 的 质 粒 命 名 为 psineo MSP58 用 内 切 酶 BamHⅠ 和 HindⅢ 对 psineo MSP58 进 行 双 酶 切 鉴 定, 阳 性 克 隆 切 下 约 64bp 片 段, 用 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 初 步 证 明 克 隆 正 确 将 得 到 的 阳 性 克 隆 质 粒 的 菌 株 送 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 公 司 测 序, 进 一 步 证 明 了 克 隆 结 果 正 确 2.2 稳 定 转 染 细 胞 系 的 建 立 通 过 脂 质 体 介 导 的 基 因 转 染 方 法 将 构 建 好 的 干 涉 载 体 psineo MSP58 和 阴 性 对 照 载 体 分 别 转 染 入 U251 细 胞, 经 G418 筛 选, 只 有 稳 定 整 合 有 靶 向 MSP58 基 因 的 RNAi 载 体 psineo MSP58 的 细 胞, 因 其 中 neo 基 因 的 表 达 赋 予 的 G418 抗 性, 才 使 其 能 在 G418 存 在 的 培 养 条 件 下 生 长, 其 余 细 胞 则 缺 乏 分 解 G418 特 性 而 死 亡 2.3 RT PCR 检 测 MSP58mRNA 的 表 达 水 平 半 定 量 RT PCR 结 果 显 示, 干 涉 载 体 psineo MSP 58 转 染 组 细 胞 的 MSP58 mrna 表 达 水 平 受 到 明 显 抑 制 ( 犘 <0.01), 而 U251 平 行 对 照 组 以 及 空 载 体 转 染 组 细 胞 MSP58 mrna 表 达 水 平 无 明 显 变 化, 犘 >0.05( 图 1) 2.4 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 MSP58 蛋 白 表 达 水 平 蛋 白 质 印 迹 法 结 果 显 示, 干 涉 载 体 psineo MSP58 转 染 组 细 胞 的 MSP58 蛋 白 表 达 水 平 受 到 明 显 抑 制 ( 犘 <0.01), 而 U251 平 行 对 照 组 以 及 空 载 体 转 染 组 细 胞 的 MSP58 蛋 白 表 达 水 平 无 明 显 变 化, 犘 >0.05 ( 图 2) 2.5 基 因 芯 片 实 验 结 果 分 析 运 用 基 因 芯 片 技 术, 观 察 稳 定 转 染 干 涉 载 体 psi lencer3.1 MSP58 的 U251 S 细 胞 和 转 染 阴 性 对 照 质 粒 psilencer3.1 NC 的 U251 NC 细 胞 的 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 的 变 化 ( 图 3) 共 检 测 与 细 胞 周 期 相 关 基 因 128 个, 其 中 上 调 >2 倍 的 有 30 个, 下 调 >2 倍 的 有 3 个 ( 表 1) 图 1 RT PCR 检 测 MSP58mRNA 在 各 组 细 胞 中 的 表 达 M:DL2000 标 记 ;1:U251 细 胞 组 ;2:pSineo MSP58 干 涉 载 体 转 染 组 ; 3:pSilencer3.1 H1neo 空 载 体 转 染 组 图 2 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 MSP58 蛋 白 在 各 组 细 胞 中 的 表 达 A:MSP58 蛋 白 ;B: β actin( 内 参 照 );1:U251 细 胞 组 ;2:pSineo MSP58 干 涉 载 体 转 染 组 ;3:pSilencer3.1 H1neo 空 载 体 转 染 组 图 3 细 胞 周 期 相 关 基 因 芯 片 扫 描 结 果 3 讨 论 MSP58 是 一 种 能 够 通 过 调 节 基 因 转 录 和 翻 译 水 平 来 改 变 细 胞 恶 性 表 型 的 癌 基 因, 在 研 究 NDRG2 基 因 (N mycdownstream regulatedgene2) 功 能 的 过 程 中, 以 NDRG2 为 诱 饵, 用 酵 母 双 杂 交 的 方 法 筛 选 成 人 脑 cd NA 文 库, 证 明 MSP58 是 一 个 与 NDRG2 相 互 作 用 的 分 [8] 子, 但 其 在 肿 瘤 发 生 与 发 展 中 所 起 的 作 用 仍 不 十 分 清 楚 本 实 验 根 据 MSP58 基 因 序 列, 设 计 并 合 成 了 针 对

4 1504 林 伟, 等 基 因 芯 片 分 析 RNA 干 涉 MSP58 后 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 的 变 化 MSP58mRNA 的 特 异 性 RNAi 片 断, 并 克 隆 入 psilenc er3.1 H1neo 载 体, 构 建 了 MSP58shRNA 真 核 干 涉 表 达 载 体 psilencer MSP58, 经 酶 切 鉴 定 证 实 克 隆 正 确 通 过 脂 质 体 介 导, 将 psilencer MSP58 载 体 和 空 载 体 psilencer3.1 H1neo 以 及 阴 性 对 照 载 体 psilencer NC, 分 别 转 染 入 人 脑 胶 质 母 细 胞 瘤 细 胞 U251, 经 G418 筛 选, 建 立 了 稳 定 转 染 的 细 胞 系 U251 S 以 及 U251 NC U251 H1neo RT PCR 检 测 证 实,U251 S 细 胞 MSP58 mrna 表 达 受 到 明 显 抑 制 ; 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 证 实, U251 S 细 胞 MSP58 蛋 白 表 达 也 受 到 明 显 抑 制 已 有 的 研 究 表 明, 稳 定 下 调 MSP58 基 因 表 达 的 U251 S 细 胞 与 阴 性 对 照 U251 NC 细 胞 及 空 载 体 的 U251 H1neo 细 [7,9] 胞 相 比, 细 胞 的 增 殖 能 力 明 显 降 低, 在 细 胞 周 期 方 面 发 生 了 显 著 的 G 1 期 阻 滞, 细 胞 的 迁 移 及 侵 袭 能 力 均 受 [10] 到 明 显 抑 制 表 1 基 因 芯 片 技 术 检 测 与 细 胞 周 期 相 关 的 上 调 及 下 调 基 因 基 因 编 号 基 因 名 称 基 因 缩 写 比 值 上 调 基 因 NM Anaphasepromotingcomplexsubunit2 ANAPC NM Anaphasepromotingcomplexsubunit4 ANAPC NM Anaphasepromotingcomplexsubunit5 ANAPC NM DIRASfamily,GTP bindingras like3 DIRAS NM Ataxiatelangiectasemutated(includescomplementationgroupsA,C,D) ATMs 3.77 NM AtaxiatelangiectaseandRad3related ATR NM BRCA2andCDKN1Ainteractingprotein BCCIP 2.19 NM Breastcancer1,earlyonset BRCA NM CyclinC CCNC 2.21 NM CyclinD1 CCND NM CyclinG1 CCNG NM CyclinG2 CCNG NM CyclinH CCNH 3.42 NM Celdivisioncycle16homolog CDC NM Celdivisioncycle6homolog CDC NM Cyclin dependentkinase7 CDK NM Cyclin dependentkinase8 CDK NM Cyclin dependentkinaseinhibitor2c CDKN2C 5.62 NM Culin2 CUL NM Culoin4A CUL4A 4.51 NM Culin5 CUL NM DEAD/Hboxpolypeptide11 DDX NM E2F2transcriptionfactor5,p130 binding E2F NM GrowtharrestandDNA damage inducible,alpha GADD45A 4.06 NM MCM4minichromosomemaintenancedeficient4 MCM NM Proteinkinase,membraneassociatedTyrosine.threonine1 PKMYT NM RAD1homolog RAD NM Retinoblastoma like2 RBL NM SMT3suppressorofmiftwo3homolog1 SUMO NM Tumorproteinp53 TP 下 调 基 因 NM Cyclin dependentkinaseinhibitor2d CDKN2D 0.46 NM E2F2transcriptionfactor2 E2F NM AntigenidentifiedbymonoclonalAntibodyki 67 MKI 本 实 验 运 用 功 能 分 类 基 因 芯 片 作 细 胞 周 期 相 关 基 因 表 达 分 析, 观 察 RNA 干 涉 法 抑 制 U251 细 胞 MSP58 基 因 表 达 后 细 胞 周 期 相 关 基 因 的 变 化, 从 而 了 解 MSP58 在 细 胞 周 期 相 关 基 因 通 路 中 的 可 能 定 位 功 能 分 类 基 因 芯 片 通 常 只 有 几 百 个 或 更 少 的 基 因, 这 些 基 因 包 括 了 那 些 与 研 究 对 象 有 确 定 关 系 的 基 因, 或 至 少 是 与 研 究 对 象 的 关 系 有 待 考 证 的 基 因, 而 剔 除 了 大 量 与 研 究 对 象 无 意 义 的 基 因, 从 而 比 使 用 高 密 度 表 达 谱 芯 片 更 加 有 效 便 利 由 于 功 能 分 类 基 因 芯 片 采 用 了 预 先 经 过 科 学 验 证 的 标 准 和 知 识, 因 此 对 于 研 究 的 准 确 可 靠 性 是 十 分 有 益 的 本 实 验 运 用 细 胞 周 期 相 关 基 因 芯 片, 观 察 MSP58 表 达 下 调 对 细 胞 周 期 调 节 信 号 通 路 上 相 关 分 子 的 影 响 共 筛 选 细 胞 周 期 相 关 基 因 128 个, 其 中 上 调 >2 倍 的 有 30 个, 下 调 >2 倍 的 有 3 个 结 果 表 明,MSP58 基 因 功 能 的 下 调, 引 起 与 G 1 / S 期 转 换 抑 制 有 利 于 DNA 修 复 的 相 关 基 因, 如

5 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No ATM ATR CyclinG1 CyclinG2 Culin4A 和 Cul in5 等 上 调 ; 一 些 与 G 2 /M 期 转 换 有 密 切 关 系 的 基 因, 如 ANAPC2 ANAPC4 和 ANAPC5 出 现 上 调 ; 在 细 胞 周 期 调 节 中 有 重 要 作 用 的 BRCA1 上 调,E2F2 下 调 BRCA1 的 表 达 上 调 了 倍,BRCA1 是 细 胞 周 期 检 测 点 调 控 的 重 要 因 子, 通 过 对 基 因 表 达 转 录 水 平 的 调 控 而 维 持 正 常 的 细 胞 周 期 在 BRCA1 的 BRCT 结 构 域 有 p53 结 合 位 点, 结 合 后 p53 被 激 活, 可 [11] 对 其 下 游 基 因 的 转 录 进 行 调 控, 而 人 脑 胶 质 瘤 组 织 p53 的 表 达 明 显 增 高, 且 与 胶 质 瘤 组 织 的 病 理 恶 性 度 成 正 相 关 [12] 此 外,BRCA1 通 过 Gadd45 可 诱 导 G 2 / [13] M 期 阻 滞, 抑 制 细 胞 的 生 长 ;BRCA1 还 参 与 基 因 转 录 调 控 DNA 损 伤 修 复 及 细 胞 凋 亡 等 多 种 重 要 的 细 胞 [14] 活 动 E2F2 是 一 种 转 录 因 子, 通 过 调 节 控 制 细 胞 DNA 的 合 成 及 与 细 胞 增 殖 有 关 的 基 因 表 达 参 与 细 胞 [15] 周 期 的 调 控 大 多 数 受 E2F2 调 控 的 基 因 参 与 调 控 细 胞 周 期 的 早 期 阶 段, 即 从 G 0 期 进 入 G 1 期 和 S 期 的 过 程, 因 此,E2F2 表 达 的 下 调 将 使 细 胞 停 留 在 G 1 期, 抑 制 细 胞 的 增 殖 [16] 本 研 究 结 果 表 明, 运 用 RNA 干 涉 法 抑 制 人 脑 胶 质 瘤 细 胞 U251 的 MSP58 基 因 表 达 后, 细 胞 增 殖 能 力 的 明 显 降 低 与 多 个 细 胞 周 期 相 关 基 因 的 表 达 发 生 改 变 有 关 参 考 文 献 [1] RenY,BuschPK,PerlakyL,etal.The58 kdamicrospherule protein (MSP58),anucleolarprotein,interactswithnucleolar proteinp120[j].eurjbiochem,1998,253(3): [2] Shimono K,Shimono Y,Shimokata K,etal.Microspherule protein1,mi 2beta,andRETfingerproteinassociateinthenu cleolusandup regulateribosomalgenetranscription[j].jbiol Chem,2005,280(47): [3] LinD Y,ShihH M.Essentialroleofthe58 kdamicrospherule proteininthe modulationofdaxx dependenttranscriptionalre pressionasrevealedbynucleolarsequestration[j].jbiolchem, 2002,277(28): [4] IvanovaA V,IvanovS V,Lerman M L.Association,mutual stabilization,andtranscriptionalactivity ofthe STRA13 and MSP58proteins[J].CelMolLifeSci,2005,62(4): [5] ShiH,ChenS,JinH,etal.DownregulationofMSP58inhibits growthofhumancolorectalcancercelsviaregulationofthecyc lind1 cyclin dependentkinase4 p21pathway[j].cancersci, 2009,100(9): [6] 何 芸, 张, 杨 怡, 等.MSP58 基 因 在 肝 癌 中 的 表 达 分 析 [J]. 科 学 技 术 与 工 程,2009,9(12): [7] Lin W,ZhangJ,ZhangJ,etal.MSP58geneRNAinterference inhibitsproliferationandinvasioningliomacellineu251[j]. ChinJNeurosurgDisRes,2008,7(6): [8] ZhangJ,LiuJ,LiX,etal.Thephysicalandfunctionalinterac tionofndrg2with MSP58incels[J].Biochem BiophysRes Commun,2007,352(1):6 11. [9] 王 江, 林 伟, 章 翔, 等.MSP58 基 因 小 干 扰 RNA 对 胶 质 瘤 细 胞 系 U251 增 殖 的 影 响 [J]. 中 华 神 经 外 科 疾 病 研 究 杂 志,2009, 8(12): [10] Lin W,ZhangJ,ZhangJ,etal.RNAi mediatedinhibitionof MSP58decreasestumourgrowth,migrationandinvasionina humangliomacelline[j].jcelmolmed,2009,13(11 12): [11] MaclachlanT K,DashBC,DickerD T,etal.Repressionof BRCA1throughafeedbackloopinvolvingp53[J].JBiolChem, 2000,275(41): [12] 曾 义, 龙 晓 东, 游 潮, 等. 脑 胶 质 瘤 组 织 MDM2 和 p53 及 p21 WAF1 蛋 白 表 达 及 其 临 床 意 义 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2009,16 (12): [13] 宋 咏 梅, 童 彤, 付 明, 等.Gadd45 介 导 抑 癌 基 因 BRCA1 诱 导 的 G2/M 期 阻 滞 [J]. 癌 症,2004,23(5): [14] 周 颉, 王 恩 礼.BRCA1 的 DNA 损 伤 修 复 与 启 动 子 甲 基 化 的 研 究 进 展 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008,15(11): [15] vanduijnp W,Ziel vandermadeac,vanderkorputja,et al.pten mediatedg1cel cyclearrestinlncapprostatecanc ercelsisassociatedwithalteredexpressionofcel cycleregula tors[j].prostate,2010,70(2): [16] TalackM R,KeysJR,HumbertPO,etal.EKLF/KLF1con trolscelcycleentryviadirectregulationofe2f2[j].jbiol Chem,2009,284(31): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 杨 靖 )

6 唐焱 等 新疆克拉玛依油田 １９９７ ２００６ 年恶性肿瘤发病率及流行病学动态分析 １５０６ 流行病学研究 新疆克拉玛依油田 １９９７ ２００６ 年恶性肿瘤发病率及 流行病学动态分析 唐焱１ 沈彬华１ 陈恭信２ 克拉玛依市中心医院 血液肿瘤科 唐焱 信息科 沈彬华 新疆 克拉玛依 ８３４０００ ２ 克拉玛依市抗癌康复协会 新疆 克拉玛依 ８３４０００ Ａ ｍ ｐ ｍ ｇ ｍ ｍ１９９７ ｇ ２００６ Ｋ ｍ Ｘ ｇ ｊ 犜犃犖犌犢犪狀１ 犛犎犈犖犅 狀 犺狌犪１ 犆犎犈犖犌狅狀犵 狓 狀犵２ 犆狀 狉犪 犎狅 狆 犪 狅犳 犓 犪犿犪狔 犓 犪犿犪狔 ８３４０００ 犘 犚 狀犪 ２ 犜狌犿狅 狉犘狉 狏 狀 狅狀犪狀犱犚 犮 狅狏 狉狔犆狀 狉狅犳 犓 犪犿犪狔 犓 犪犿犪狔 ８３４０００ 犘 犚 狀犪 摘要 目 的 研 究 新 疆 克 拉 玛 依 油 田 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｍ ｍ ｇ ｇ 市 恶 性 肿 瘤 １０ 年 １９９７ ２００６ 年 发 １９９７ ２００６ Ｋ ｂ １０ 病率及 主 要 恶 性 肿 瘤 发 病 率 变 化 趋 势 ｗ ｍ ｍ Ｘ ｇ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｔ ｊ 方法 统计本 市 ４ 家 医 院 病 例 资 料 及 社 ４ ｐ Ｋ ｍ ｍｍ 区逐户调查资 料 资 料 完 整 可 靠 应 用 中 ｗ ｇ ｂ Ｔ ｗ 国 ２００４ 年全国 人 口 数 标 化 发 病 率 采 用 ｚ ｗ ｍ ｗ ｚ ｂ 时间趋 势 检 验 法 分 析 发 病 率 １０ 年 变 化 ｍ １０ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔｐ 趋势 结 果 共 有 恶 性 肿 瘤 患 者 ４４００ ｗ ｍｗ ４４００ ２５８５ ｗ ｍ １８１５ｗ 例 男 ２５８５ 例 女 １８１５ 例 男 女 为 ｍ ｐ ｐ ｂ ｗ ｍ ｍ ｗ １ ４２ １ 年 均 发 病 率 １５２ ８０ １０ 万 男 ４２ Ｔ ｇ ｗ １５２ ８０ｐ １０００００ 为 １７６ ０３ １０ 万 女 为 １２８ ６４ １０ 万 男 ｍ ｍ ｗ １７６ ０３ｐ １０００００１２８ ６４ｐ １０００００ 女为 ２３ １ 均 随 年 龄 增 高 而 上 升 ｍ ｐ ｐ ｗ ２３ １ ｇ Ｔｐ 男性人群中肺 癌 为 第 １ 位 其 次 是 胃 癌 ｇ ｋ ｗ ｗｂ ｇ 肝癌 结 直 肠 癌 食 管 癌 膀 胱 癌 及 淋 ｍ ｐｇ ｂ 巴瘤 女性人群 中 第 １ 位 是 宫 颈 癌 其 次 ｍ Ｃ ｗ ｇ ｍｐｍ 是乳腺癌 结 直 肠 癌 胃 癌 肺 癌 食 管 ｍ ｍ ｗ ｗｂ ｂ 癌及 卵 巢 癌 汉 族 肺 癌 肝 癌 发 病 率 明 ｇ ｐｇ Ｔ ｇ 显高于维吾!族 犘 ０ ０１ 胃 癌 食 管 癌 Ｈ ｗ Ｕｇ ｇ ｇ 及宫 颈 癌 发 病 率 维 吾! 族 明 显 高 于 汉 犘 ０ ０１ Ｔ Ｕｇ ｗ 族 犘 ０ ０１ 结 论 克 拉 玛 依 油 田 与 其 ｐｇ Ｈ ｇ ｇ 他地区相比 不 是 肿 瘤 高 发 区 造 成 不 同 犘 ０ ０１ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 Ｔ ｍ 民族间某些恶 性 肿 瘤 发 病 率 相 差 明 显 的 Ｋ Ｔ ｇ 原因 除种族间 遗 传 基 因 的 差 别 外 与 生 ｍｍ ｍ ｂ ｗ Ｈ Ｕｇ ｇ 活习惯 饮食方 式 嗜 好 不 同 及 民 风 民 俗 ｍｂ ｍ ｋ ｗ ｂ 有关 中华肿瘤防治杂志 ２０１０ １７ １９ １５０６ １５０９ 狀犑犆犪狀犮 狉犘狉 狏犜狉 犪 ２０１０ １７ １９ １５０６ １５０９ 关键词 肿瘤 流行病学 克拉玛依 发病率 ｐ 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｐ ｍ ｍ ｇ Ｋ ｍ 中图分类号 Ｒ７３ ３１ 文献标识码 Ａ 文章编号 １６７３ ５２６９ ２０１０ １９ １５０６ ０４ 通讯作者简介 唐焱 男 湖南株洲人 副主任医师 主要从事肿瘤放化疗的研究工作 Ｔ ８６ ９９０ ６８６１１７６ Ｅ ｍ ｇ ０９９０ １２６ ｍ

7 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No 新 疆 克 拉 玛 依 油 田 地 处 祖 国 西 北 边 陲 准 噶 尔 盆 地 西 北 缘, 为 干 旱 少 雨 以 及 多 风 沙 的 典 型 大 陆 性 气 候, 因 盛 产 石 油 而 成 为 闻 名 于 世 界 的 油 城 油 城 居 民 均 自 20 世 纪 五 六 十 年 代 后, 来 自 于 祖 国 各 地, 均 为 城 市 户 口, 居 住 集 中 社 区 化 管 理 50 年 来, 汉 维 哈 等 20 多 个 民 族, 共 同 生 活 共 同 工 作 相 互 渗 透 而 形 成 本 地 区 独 特 的 生 活 习 惯 和 文 化 环 境 为 给 本 地 区 居 民 恶 性 肿 瘤 防 治 宣 传 教 育 提 供 科 学 依 据, 在 市 ( 局 ) 科 协 ( 处 ) 的 支 持 下, 由 市 抗 癌 康 复 协 会 油 田 总 医 院 ( 市 中 心 医 院 ) 血 液 肿 瘤 科 共 同 完 成 了 本 市 10 年 ( 年 ) 恶 性 肿 瘤 的 流 行 病 学 调 查, 结 果 总 结 报 道 如 下 1 对 象 与 方 法 1.1 病 例 资 料 来 源 全 部 病 例 资 料 来 自 于 三 甲 石 油 总 医 院 ( 克 拉 玛 依 市 中 心 医 院 ) 3 个 区 级 二 甲 医 院 ( 克 拉 玛 依 区 医 院 白 碱 滩 区 医 院 和 独 山 子 区 医 院 ) 病 案 电 脑 登 记 处 和 市 卫 生 局 医 政 科 病 案 统 计 管 理 室 及 市 内 各 社 会 服 务 中 心 人 口 登 记 处 经 市 抗 癌 康 复 协 会 事 先 经 过 培 训 的 流 调 人 员 复 核 剔 除 重 复 登 记, 并 由 居 委 会 专 干 会 同 流 调 人 员 走 访 居 民 区, 对 年 肿 瘤 死 亡 和 生 存 患 者 逐 个 落 实, 确 保 了 资 料 的 完 整 性 和 可 靠 性 三 甲 医 院 诊 断 占 89.1%, 二 甲 医 院 诊 断 占 10.9% 诊 断 依 据 为 病 理 + 细 胞 学 诊 断 占 76.5%, 临 床 + 理 化 诊 断 占 22.7%, 临 床 诊 断 占 0.8% 1.2 人 口 资 料 来 源 由 市 ( 局 ) 公 安 局 户 籍 管 理 科 提 供 年 每 年 全 市 常 住 居 民 人 口 数, 计 算 出 各 年 度 平 均 人 口 数 按 市 计 划 处 提 供 的 本 市 2007 年 全 年 人 口 性 别 族 别 以 及 各 年 龄 组 人 口 构 成, 计 算 出 各 年 度 的 ( 年 ) 不 同 民 族 不 同 性 别 以 及 各 年 龄 组 人 口 数 1.3 统 计 学 方 法 采 用 SPSS11.0 统 计 软 件 进 行 统 计 分 析, 计 数 资 料 用 χ 2 检 验, 主 要 肿 瘤 年 度 间 发 病 率 的 变 化 比 较 用 时 [1] 间 趋 势 检 验 法 检 验 水 准 α= 结 果 新 疆 克 拉 玛 依 油 田 ( 市 )10 年 内 恶 性 肿 瘤 患 者 共 4400 例, 其 中 男 2585 例, 女 1815 例, 男 女 为 若 去 除 女 性 的 特 发 肿 瘤, 男 性 患 者 人 数 是 女 性 患 者 的 2.5 倍, 年 平 均 发 病 率 为 /10 万 (4400/ ), 其 中 男 /10 万 (2 585/ ), 女 /10 万 (1815/ ) 2.1 年 龄 组 发 病 率 全 部 恶 性 肿 瘤 发 病 率 随 年 龄 增 长 而 升 高 自 15~ 年 龄 段 开 始 >10/10 万, 自 35~ 年 龄 段 开 始 >100/10 万,70~ 年 龄 段 >1000/10 万 ( 表 1) 表 1 克 拉 玛 依 市 前 5 位 恶 性 肿 瘤 年 龄 段 发 病 率 (1/10 万 ) 年 龄 ( 岁 ) 全 部 肿 瘤 肺 癌 胃 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 肝 癌 食 管 癌 0~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 合 计 前 5 位 恶 性 肿 瘤 的 发 病 率 同 样 是 随 年 龄 增 长 而 升 高 自 40~ 年 龄 段 >10/10 万 的 有 原 发 性 肝 癌 肺 癌 胃 癌 及 结 ( 直 ) 肠 癌 而 食 管 癌 >50 岁 才 出 现 升 高 分 析 其 原 因, 可 能 是 本 地 区 居 民 均 为 石 油 职 工 由 外 地 迁 移 而 来, 造 成 人 口 构 成 中 老 年 人 口 比 例 较 少 所 致 2.2 主 要 恶 性 肿 瘤 发 病 率 位 次 及 性 别 间 差 异 患 者 中, 肺 癌 为 第 1 位, 其 次 是 胃 癌 原 发 性 肝 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 食 管 癌 膀 胱 癌 及 淋 巴 瘤 ; 女 性 患 者 中, 第 1 位 的 是 宫 颈 癌, 其 次 是 乳 腺 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 胃 癌 肺 癌 食 管 癌 及 卵 巢 癌 除 肾 癌 淋 巴 癌 及 白 血 病 性 别 间 发 病 率 差 异 无 统 计 学 意 义 外 ( 犘 >0.05), 其 他 恶 性 肿 瘤 男 性 明 显 高 于 女 性, 犘 <0.05( 表 2)

8 1508 唐 焱, 等 新 疆 克 拉 玛 依 油 田 年 恶 性 肿 瘤 发 病 率 及 流 行 病 学 动 态 分 析 2.3 民 族 间 恶 性 肿 瘤 发 病 率 比 较 汉 族 全 部 恶 性 肿 瘤 发 病 率 为 /10 万 (3604/ ), 维 吾 尔 族 为 /10 万 (678/ ), 哈 萨 克 族 为 49.88/10 万 (118/236879) 经 统 计 学 处 理, 维 吾 尔 族 汉 族 两 民 族 间 差 异 无 统 计 学 意 义, χ 2 =2.46, 犘 >0.05; 而 均 明 显 高 于 哈 萨 克 族, χ 2 = , 犘 <0.01 单 病 种 相 比 较, 肺 癌 肝 癌 发 病 率 汉 族 明 显 高 于 维 吾 尔 族 ( 犘 <0.01), 而 胃 癌 食 管 癌 宫 颈 癌 维 吾 尔 族 明 显 高 于 汉 族 ( 犘 <0.01), 卵 巢 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 鼻 咽 癌 白 血 病 膀 胱 癌 肾 癌 淋 巴 瘤 和 乳 腺 癌, 汉 维 两 民 族 间 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05 哈 萨 克 族 肺 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 鼻 咽 癌 膀 胱 癌 肾 癌 乳 腺 癌 宫 颈 癌 的 发 病 率 明 显 低 于 汉 族 和 维 吾 尔 族, 犘 < 0.01; 而 食 管 癌 发 病 率 明 显 高 于 汉 族 ( 犘 <0.01), 但 与 维 吾 尔 族 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05; 卵 巢 癌 白 血 病 发 病 率 与 汉 族 维 吾 尔 族 两 民 族 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05( 表 3) 表 2 克 拉 玛 依 主 要 恶 性 肿 瘤 发 病 率 位 次 及 性 别 间 差 异 (1/10 万 ) 肿 瘤 男 性 女 性 发 病 率 标 化 率 发 病 率 标 化 率 犘 值 肺 癌 <0.001 胃 癌 <0.01 结 ( 直 ) 肠 癌 <0.05 肝 癌 <0.001 食 管 癌 <0.01 鼻 咽 癌 <0.05 白 血 病 >0.05 膀 胱 癌 <0.01 肾 癌 >0.05 淋 巴 瘤 >0.05 乳 腺 癌 <0.000 宫 颈 癌 卵 巢 癌 用 中 国 2004 年 全 国 人 口 构 成 比 调 整 肿 瘤 表 3 克 拉 玛 依 市 不 同 民 族 间 常 见 恶 性 肿 瘤 发 病 率 的 比 较 (1/10 万 ) 汉 族 发 病 率 标 化 率 维 吾 尔 族 发 病 率 标 化 率 哈 萨 克 族 发 病 率 标 化 率 肺 癌 胃 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 肝 癌 食 管 癌 鼻 咽 癌 白 血 病 膀 胱 癌 肾 癌 淋 巴 瘤 乳 腺 癌 宫 颈 癌 卵 巢 癌 用 中 国 2004 年 全 国 人 口 构 成 比 调 整 2.4 主 要 恶 性 肿 瘤 发 病 率 时 间 趋 势 分 析 前 5 位 恶 性 肿 瘤 及 女 性 乳 腺 癌 宫 颈 癌 占 全 部 恶 性 肿 瘤 的 68.77%, 故 作 为 该 项 分 析 的 重 点 全 部 恶 性 肿 瘤 在 男 性 人 群 中 有 上 升 趋 势 ( 狌 =2.236, 犘 < 0.05), 造 成 上 升 的 主 要 原 因 是 肝 癌 的 发 病 率 明 显 上 升 ( 狌 =2.671, 犘 <0.01), 其 次 是 肺 癌, 其 他 恶 性 肿 瘤 如 结 ( 直 ) 肠 癌 食 管 癌 发 病 率 虽 略 有 上 升, 但 差 异 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05; 胃 癌 明 显 下 降, 犘 <0.01 女 性 全 部 肿 瘤 发 病 率 有 上 升 趋 势 ( 狌 =2.772, 犘 <0.01), 造 成 女 性 全 部 肿 瘤 发 病 率 上 升 的 主 要 原 因 是 乳 腺 癌 发 病 率 的 上 升 ( 狌 =2.841, 犘 <0.01), 其 次 是 原 发 肝 癌 ( 狌 = 2.326, 犘 <0.05) 宫 颈 癌 ( 狌 =1.981, 犘 <0.05) 和 肺 癌 ( 狌 =1.91, 犘 <0.05), 胃 癌 结 ( 直 ) 肠 癌 食 管 癌 其 时 间 趋 势 变 化 差 异 均 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05( 表 4) 以 上 结 果 说 明, 克 拉 玛 依 油 城 10 年 内 ( 年 ) 全 部 恶 性 肿 瘤 发 病 率 虽 有 升 高 趋 势, 但 前 5 位 恶 性 肿 瘤 除 原 发 肝 癌 和 肺 癌 外 均 为 持 平 状 态, 造 成 全 部 肿 瘤 发 病 率 升 高 的 原 因, 主 要 是 原 发 肝 癌 肺 癌 及 女 性 中 的 乳 腺 癌 和 宫 颈 癌 发 病 率 逐 年 升 高

9 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No 时 间 ( 年 ) 男 全 部 肿 瘤 女 男 肺 癌 表 年 克 拉 玛 依 市 主 要 肿 瘤 发 病 率 趋 势 女 男 胃 癌 女 男 肝 癌 女 结 ( 直 ) 肠 癌 狌 值 犘 值 <0.05 <0.01 <0.05 <0.05 <0.01 >0.05 <0.01 <0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 <0.01 <0.05 男 女 男 食 管 癌 女 乳 腺 癌 女 宫 颈 癌 女 3 讨 论 新 疆 克 拉 玛 依 油 田 年 恶 性 肿 瘤 总 体 发 病 率 男 性 明 显 高 于 女 性, 而 男 性 恶 性 肿 瘤 发 病 率 呈 缓 慢 上 升 趋 势, 女 性 则 上 升 较 为 明 显 通 过 时 间 趋 势 检 验 可 以 看 出, 造 成 总 体 恶 性 肿 瘤 发 病 率 上 升 的 主 要 原 因 是 肝 癌 肺 癌 和 女 性 乳 腺 癌 及 宫 颈 癌 上 升 明 显 本 地 区 原 发 肝 癌 女 性 乳 腺 癌 上 升 较 快, 其 次 是 肺 癌, 女 性 宫 颈 癌 略 有 上 升, 胃 癌 发 病 率 明 显 下 降, 而 其 他 主 要 恶 性 肿 瘤 均 为 持 [2] 平 状 态 这 一 结 果 与 李 晓 静 等 报 道 有 相 似 之 处, 与 李 [3] 连 弟 等 报 道 有 差 异 分 析 原 因 可 能 是 本 地 区 居 民 居 住 集 中, 几 乎 是 全 民 享 受 公 费 医 疗, 既 往 人 们 对 乙 肝 感 染 途 径 均 无 认 知, 没 有 纳 入 计 划 免 疫, 医 疗 活 动 不 可 避 免 地 成 为 乙 肝 病 毒 (hepatitisbvirus,hbv) 或 丙 肝 病 毒 (hepati tiscvirus,hcv) 的 传 播 途 径 HBV 病 毒 感 染 的 家 庭 聚 集 性 也 是 造 成 HBV 传 播 的 另 一 种 途 径, 流 行 病 学 研 究 已 经 证 实,HBV 感 染 与 原 发 肝 癌 (hepatocelularcarcinoma, [4 5] HCC) 呈 正 相 关 虽 然 早 已 引 起 人 们 的 警 惕, 预 防 HBV 感 染 纳 入 计 划 免 疫, 医 疗 活 动 中 的 严 格 检 测 阻 断 了 HBV 传 播 途 径, 但 既 往 HBV 感 染 者 仍 是 HCC 的 高 危 人 群 汉 族 HCC 明 显 高 于 少 数 民 族 的 原 因, 即 少 数 民 族 在 无 生 命 危 险 时 很 难 接 受 他 人 的 血 液 及 成 分 输 注, 故 其 HBV HCV 感 染 率 明 显 低 于 汉 族 居 住 条 件 的 改 善, 经 济 条 件 的 提 高, 女 性 保 健 品 的 使 用, 行 经 期 限 的 延 长, 造 成 体 内 雌 性 激 素 升 高, 可 能 是 导 致 乳 腺 癌 发 病 率 逐 年 升 高 的 主 要 原 因 宫 颈 癌 的 病 因 主 要 是 宫 颈 炎 症 宫 颈 糜 烂 及 病 毒 感 染 所 致, 与 其 居 住 环 境 和 生 活 习 惯 有 关 应 加 强 宣 传 教 育, 提 高 人 们 的 科 学 保 健 知 识 长 期 生 活 在 同 一 地 区 不 同 民 族 生 活 习 惯 文 化 虽 有 不 同 程 度 的 融 合, 但 仍 保 留 这 本 民 族 的 基 本 特 色, 故 在 肿 瘤 的 发 病 病 谱 上 仍 有 所 不 同 汉 族 的 肺 癌 肝 癌 发 病 率 明 显 高 于 维 吾 尔 族 哈 萨 克 族 为 主 的 少 数 民 族, 而 胃 癌 食 管 癌 宫 颈 癌 发 病 率 维 吾 尔 族 远 远 高 于 汉 族 造 成 不 同 民 族 间 某 些 恶 性 肿 瘤 发 病 率 相 差 悬 殊 的 原 因 甚 多 分 析 不 同 民 族 间 的 人 群 除 种 族 间 遗 传 基 因 的 差 别 [6] 外, 主 要 是 生 活 习 惯 饮 食 方 式 嗜 好 不 同 家 庭 成 员 的 家 庭 地 位 不 同 的 风 俗 而 造 成 的 少 数 民 族 的 主 食 多 是 经 过 熏 烤 的 馕 ( 一 种 面 食 ) 和 肉 食 摄 入 远 远 高 于 汉 [7] 族, 而 相 对 蔬 菜 摄 入 较 少 动 物 性 食 物 和 高 动 物 性 脂 肪 及 人 乳 头 状 瘤 病 毒 感 染 等 是 造 成 消 化 系 统 肿 瘤, 尤 其 [8 9] 是 食 管 癌 发 病 的 危 险 因 素 所 以, 应 宣 传 防 癌 知 识, 改 善 不 利 健 康 的 生 活 习 惯 和 方 式, 有 条 件 的 单 位 和 个 人 做 到 定 期 健 康 体 检, 开 展 行 之 有 效 的 预 防 和 干 预 措 施, 不 利 于 健 康 的 生 活 方 式 和 习 惯 也 应 改 变 参 考 文 献 [1] 杨 树 勤. 中 国 医 学 百 科 全 书 医 学 统 计 分 册 [M]. 上 海 : 上 海 科 学 出 版 社,1985: [2] 李 晓 静, 张 成 军, 文 茂 林, 等. 湖 北 省 沙 洋 县 年 农 村 恶 性 肿 瘤 发 病 率 及 其 时 间 趋 势 调 查 分 析 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008,15(21): [3] 李 连 弟, 饶 克 勤, 张 思 维, 等. 中 国 12 市 县 年 肿 瘤 发 病 与 死 亡 登 记 资 料 统 计 分 析 [J]. 中 国 肿 瘤,2002,11(9): [4] 苏 洪 英, 刘 静, 何 苗, 等. 乙 肝 病 毒 感 染 与 原 发 性 肝 癌 相 关 的 危 险 度 分 析 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008,15(18): [5] 唐 焱, 沈 彬 华, 钱 丽 娟, 等. 克 拉 玛 依 地 区 高 危 人 群 监 测 对 肝 癌 早 期 诊 断 的 对 比 分 析 [J]. 中 华 医 药 卫 生 研 究 杂 志,2003,1(6): [6] 马 玉 泉, 刘 晔, 贾 涛, 等.P21 基 因 多 态 性 与 华 北 地 区 食 管 癌 的 关 系 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2009,16(1): [7] 张 力 为, 伊 力 亚 尔. 夏 合 丁, 吴 明 拜, 等.MTHFR 基 因 98A C 多 态 与 新 疆 哈 萨 克 族 食 管 癌 风 险 关 系 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008,15(17): [8] 丁 广 成, 王 立 东, 李 韶 华, 等. 河 南 地 区 食 管 鳞 癌 和 贲 门 腺 癌 与 人 乳 瘤 病 毒 感 染 相 关 性 的 分 析 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2009, 16(4): [9] 耿 饮 燕, 胡 冰. 血 清 叶 酸 和 同 型 半 胱 氨 酸 及 维 生 素 B12 与 男 性 食 管 癌 发 病 风 险 相 关 性 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2008, 15(11): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 史 本 玲 )

10 １５１０ 张海利 等 ４ＮＱＯ 致舌鳞癌小鼠黏膜形态学以及黑色素瘤抗原基因 Ａ１ 和 Ａ３ 表达的研究 实验研究 ４ＮＱＯ 致舌鳞癌小鼠黏膜形态学以及黑色素瘤 抗原基因 Ａ１ 和 Ａ３ 表达的研究 张海利 王斌全 温树信 马琴 冀洁 张春明 山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科 山西 太原 ０３０００１ Ｃｇ ｇｍｍ ｇｍａｇｅａ１ Ａ３ ｐ ｂ ｇ ｐ ｍ ｍ ｇｑｍ ｍ 犣犎犃犖犌 犎犪 犠犃犖犌犅 狀 狓 狀 犕犃犙 狀 犑犐犑 犣犎犃犖犌狌狀 犿 狀犵 狇狌犪狀 犠犈犖 犛犺狌 犇狆犪狉 犿狀 狅犳 犗 狅 犪狉狔狀犵狅 狅犵狔 犎犪犱犪狀犱 犖 犮 犽犛狌狉犵 狉狔 犉 狉 犎狅 狆 犪 犛犺犪狀狓犕犱 犮犪 犝狀 狏 狉 狔 犜犪 狔狌犪狀 ０３０００１ 犘 犚 狀犪 摘要 目 的 ４ＮＱＯ 饮 水 法 建 立 舌 鳞 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｂ ｍ ｍ ｇ 癌小鼠模型 观 察 舌 黏 膜 病 变 形 态 学 及 ｍ ＳＣＣ ｂ ｋ ｇ ｗ ｑｍ 其肿瘤特异 性 抗 原 性 的 变 化 特 征 探 索 ４ＮＱＯ ｂ ｇ ４ ｑ １ ｘ 建立 模 型 理 想 的 ４ＮＱＯ 浓 度 方 法 ｇｍ ｍ ｇ ｘｐ ＭＡＧＥＡ１ ＭＡ ｐ Ｂ ｂ 小鼠 ７０ 只 随机分为 Ａ ３０ 只 ＧＥＡ３ｘｐ ｐ ｍ ４ＮＱＯ ｂ ｍ Ｂ ３０ 只 Ｃ １０ 只 组 分 别 用 犕犈犜犎犗犇犛 Ｓ ｂ ｍ ｗ ｍ Ｂ ０ ０１０ ０ ００５ 的 ４ＮＱＯ 水 溶 液 与 蒸 ｐａ ３０ Ｂ ３０ Ｃ １０ Ｔｍ ｇ ｐａｂ ｋ ｇ 馏水喂 养 Ａ Ｂ 组 各 分 为 Ａ１ ２０ 只 ｐ ００５ ０ ０１０ ｗ ４ＮＱＯ ０ Ａ２ １０ 只 与 Ｂ１ ２０ 只 Ｂ２ １０ 只 两 ｗ ｗ ｍ ｇ ｐｃ Ｇ ｐａｂ ｗ ｐ 组 １２ 周开始 每 ２ 周 处 死 Ａ１ 与 Ｂ１ 小 ２０ Ａ２ １０ Ｂ１ ２０ Ｂ２ １０ ｗｂｇ ｐａ１ 鼠 ３２ 周后处 死 全 部 小 鼠 舌 黏 膜 镜 检 Ｆ ｍ １２ ｗ ｋ ｗｍ ｗ ｇ 观察不同阶段病变舌黏膜的 形 态 学 变 化 ｋ ｇ ｐａ１ｂｔ ｍ ｗ ｐ ｗｗ 及 ＭＡＧＥＡ１ ＭＡＧＥＡ３ 蛋 白 表 达 结 ３２ ｗ ｋｂ ｇ ｍ ｇ ｐ 果 Ａ Ｂ 组 分 别 于 ９ １２ 周 开 始 出 现 舌 ｘｐ ＭＡＧＥＡ１ ＭＡＧＥＡ３ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｔｍ 黏膜 的 轻 度 变 化 在 １９ ２４ 周 出 现 黏 膜 Ａ Ｂｇ ｐｐｐ ｐ ｇｍ ｐ ９ 的 重 度 改 变 实 验 结 束 时 Ａ２ 组 小 鼠 １２ ｗ ｋｗ ｐ ＳＤＰ １９ ２４ ｗ ｋ 死亡 １ 只 的浸润癌 原 位 癌 重 度 非 典 Ｗ ｘｐ ｍ ｗ Ｔ ｍ ｇ ｐ Ａ２ｗ 型增生分别为 ７ １ 和 １ 只 Ｂ２ 组 则 分 别 ｍ ＥＩＣ ７ ｍ Ｉ ＳＣ １ ＳＤＰ 为 ６ ２ 和 ２ 只 其 中 Ａ２ 组 并 发 食 管 鳞 ｐｇ ｍ１ ｐｇ １ ｂ ｑｍ 癌与食管平滑肌肉瘤各 １ 只 正 常 舌 黏 ｍ ｍ１ １ Ｔ ｍ Ｂ２ｇ ｐ 膜 轻中 度 重 度 非 典 型 增 生 舌 鳞 癌 组 ｗｅｉｃ６ Ｉ ＳＣ２ ＳＤＰ２ Ｔｐ ｘ 织的 ＭＡＧＥＡ１ 阳 性 率 分 别 为 ０ ０ ３０ ＭＡＧＥＡ１ ｍ ｇ ｍ ｍ ｍ ｐ 和 ５５ ２ 犘 ０ ０００ ＭＡＧＥＡ３ 阳 性 率 ＳＤＰ ＳＣＣ ｗ ｐ ２ 犘 ｐ ０ ０ ３０ ５５ 分 别 为 １０ ０ １０ ０ ４０ ０ 和 ０ ０００ ＭＡＧＥＡ３ ｗ ｐ ０ １０ ０ １０ ４８ ３ 犘 ０ ０５５ 结 论 肿 瘤 特 异 性 ４０ ０ ４８ ３ 犘 ０ ０５５ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖犛 Ｔｘｐ 抗原 ＭＡＧＥＡ１ ＭＡＧＥＡ３ 表 达 是 舌 鳞 癌 ＭＡＧＥＡ１ ＭＡＧＥＡ３ ｍｐｗ ｇ ｂ 发生的伴随事件 与黏膜的形态学改变有 ｍ ｍ ｍ ｇｓｃｃ ｗ ｍ 相似的过 程 ０ ０１０ ０ ００５ 的 ４ＮＱＯ ｇ ｍ ｇ ０ ０１０ ０ ００５ ｐ 水溶液均可成功建立舌鳞癌小鼠模型 ４ＮＱＯ ｍ ｍ ｇｓｃｃ 中华肿瘤防治杂志 ２ ０ １ ０ １ ７ １ ９ １ ５ １ ０ １ ５ １ ３ 狀犑犆犪狀犮 狉犘狉 狏犜狉 犪 ２０１０ １７ １９ １５１０ １５１３ 第一作者简介 张海利 女 山西朔州人 硕士 主治医师 主要从事耳鼻咽喉头颈外科疾病与微创治疗的研究工作 ｍ Ｅ ｍ ｚｇ １９７５ 通讯作者简介 王斌全 男 山西沁源人 博士 主任医师 主要从事头颈肿瘤的基础与临床研究工作 Ｅ ｍ ｗｂｑ ｘ ｍ

11 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No 关 键 词 舌 肿 瘤 ;4 硝 基 喹 啉 1 氧 化 物 ; 疾 病 模 型, 动 物 ; 黑 色 素 瘤 ; 基 因 表 达 ; 抗 原, 肿 瘤 [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] tongueneoplasms;4 nitroquinoline 1 oxide;diseasemodels,animal;melanoma;geneexpression;anti gens,neoplasm 中 图 分 类 号 R73-3 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (2010) 肿 瘤 的 实 验 动 物 模 型 对 研 究 人 类 恶 性 肿 瘤 的 发 生 机 制 生 物 学 特 征 以 及 临 床 诊 治 方 法 发 挥 着 非 常 重 要 的 作 用 化 学 致 癌 剂 可 以 在 实 验 动 物 中 复 制 出 多 种 人 类 恶 性 肿 瘤, 其 诱 发 动 物 肿 瘤 的 发 生 及 细 胞 生 物 学 等 [1] 特 性 与 人 类 肿 瘤 非 常 相 似 研 究 发 现, 化 学 致 癌 剂 4 硝 基 喹 啉 1 氧 化 物 (4 nitroquinoline 1 oxide, [2 3] 4NQO) 作 用 于 舌 黏 膜 可 以 导 致 小 鼠 舌 鳞 癌 发 生 黑 色 素 瘤 抗 原 基 因 (melanomaantigengene,mage) 家 族 是 一 类 肿 瘤 特 异 性 抗 原 基 因, 除 胎 盘 组 织 与 男 性 生 殖 细 胞 外, 在 正 常 组 织 中 不 表 达, 但 可 以 特 异 性 地 在 多 种 不 同 类 型 的 肿 瘤 组 织 与 肿 瘤 细 胞 中 表 达 本 研 究 拟 采 用 不 同 浓 度 4NQO 水 溶 液 喂 养 小 鼠, 复 制 小 鼠 舌 鳞 癌 发 生 的 过 程, 并 检 测 MAGEA1 及 A3 在 小 鼠 舌 鳞 癌 发 生 的 不 同 阶 段 组 织 中 的 表 达, 观 察 舌 鳞 癌 发 生 过 程 中 黏 膜 病 变 的 形 态 学 及 其 肿 瘤 特 异 性 抗 原 的 变 化 特 征, 为 了 解 人 头 颈 鳞 癌 的 发 生 机 制 研 究 寻 找 其 特 异 性 的 标 志 以 及 免 疫 治 疗 方 法 提 供 实 验 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 动 物 分 组 6 周 龄 雄 性 Balb/c 近 交 系 小 鼠 70 只 ( 山 西 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供,SPF 级, 许 可 证 号 :SCXK ), 体 质 量 (23.81±1.21)g 室 温 20, 湿 度 40%,24h 光 暗 循 环, 小 鼠 饲 料 喂 养 随 机 分 为 A(30 只 ) B(30 只 ) C (10 只 ) 组, 分 别 用 0.010% 0.005% 的 4NQO( 美 国 Sigma 公 司 ) 水 溶 液 与 蒸 馏 水 喂 养,A B 组 各 分 为 A1(20 只 ) A2(10 只 ) 与 B1(20 只 ) B2(10 只 ) 两 组 ( 表 1) 表 1 实 验 动 物 分 组 及 4NQO 浓 度 A 组 B 组 小 鼠 分 组 C 组 A1 A2 B1 B2 数 量 ( 只 ) NQO 浓 度 (%) 试 剂 及 仪 器 4NQO 购 于 美 国 Sigma 公 司 ; 兔 抗 鼠 MAGEA1 多 克 隆 抗 体 购 自 晶 美 生 物 公 司, 工 作 浓 度 为 1 50; 兔 抗 鼠 MAGEA3 多 克 隆 抗 体 购 自 北 京 西 美 杰 科 技 有 限 公 司, 工 作 浓 度 为 MICROMAP 280 组 织 包 埋 机 ;O LYMPUS CX3 显 微 镜 ;ZEISSHM325 组 织 切 片 机 等 1.3 小 鼠 舌 黏 膜 观 察 及 标 本 留 取 每 周 观 察 小 鼠 舌 黏 膜 变 化,12 周 后 每 2 周 各 取 A1 与 B1 组 黏 膜 改 变 明 显 的 2 只 小 鼠 处 死 常 规 固 定 包 埋 小 鼠 舌 体, 切 片,HE 染 色, 显 微 镜 下 观 察 黏 膜 病 理 变 化 32 周 后 处 死 全 部 小 鼠 解 剖, 显 微 镜 下 观 察 舌 颊 及 食 管 黏 膜 等 标 本 的 病 理 改 变 1.4 SP 法 检 测 MAGEA1 及 MAGEA3 的 表 达 镜 下 确 定 小 鼠 正 常 舌 黏 膜 黏 膜 的 单 纯 增 生 轻 中 度 重 度 非 典 型 增 生 原 位 癌 与 早 期 浸 润 癌 标 本 切 片 免 疫 组 化 检 测 标 本 的 肿 瘤 特 异 性 抗 原 MA GEA1 MAGEA3 的 蛋 白 表 达 切 片 常 规 脱 蜡 至 水 化, 热 修 复, 滴 加 一 抗 4 过 夜, 以 PBS 代 替 一 抗 作 空 白 对 照, 以 睾 丸 组 织 作 阳 性 对 照, 滴 加 二 抗 37 温 箱 30 min, 显 色, 复 染, 脱 水, 透 明, 封 片 1.5 结 果 判 定 上 皮 异 常 增 生 病 理 改 变 分 为 单 纯 性 增 生 和 轻 中 重 度 非 典 型 增 生 以 及 舌 鳞 癌 鳞 状 上 皮 不 典 型 增 生 轻 度 : 细 胞 异 形 轻, 主 要 累 犯 上 皮 的 下 1/3; 重 度 : 细 胞 异 形 重, 可 累 犯 上 皮 全 层 ; 中 度 : 细 胞 异 形 改 变 介 于 轻 度 [4] 和 重 度 之 间 免 疫 组 织 化 学 结 果 判 定 :MAGEA1 MAGEA3 蛋 白 表 达 主 要 位 于 细 胞 质 中, 阳 性 表 达 细 胞 质 呈 棕 黄 色 颗 粒, 组 织 中 未 着 黄 色 的 细 胞 为 阴 性, 胞 质 着 色 呈 黄 [5] 棕 色 者 为 阳 性 1.6 统 计 学 方 法 数 据 分 析 应 用 统 计 软 件 SPSS15.0, 采 用 χ 2 检 验 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 舌 鳞 癌 小 鼠 模 型 舌 黏 膜 形 态 学 变 化 小 鼠 舌 黏 膜 病 变 以 人 字 沟 处 明 显 A B 组 小 鼠 分 别 在 第 9 12 周 最 早 出 现 舌 黏 膜 轻 度 改 变, 即 黏 膜 粗 糙 不 光 滑 以 后 黏 膜 改 变 进 行 性 加 重, 分 别 在 周 出 现 黏 膜 的 重 度 改 变, 即 黏 膜 粗 糙 不 平 局 限 性 隆 起 或 浅 溃 疡 形 成, 以 后 逐 渐 形 成 肿 物 或 溃 疡 病 变 ( 图 1A 和 图 1B) 对 应 于 肉 眼 观 察 的 轻 到 重 度 的 黏 膜 改 变, 显 微 镜 下 表 现 为 黏 膜 的 单 纯 增 生 轻 中 度 重 度 非 典 型 增 生 原 位 癌 与 早 期 鳞 癌 ( 见 图 1C 和 图 1D) 实 验 结 束 时,A2 组 小 鼠 死 亡 1 只, 尸 检 证 实 为 肺 炎, 另 外 9 只 中, 舌 部 浸 润 癌 7 只 原 位 癌 1 只 重 度 非 典 型 增 生 1 只, 并 发 1 例 食 管 鳞 癌 与 1 例 食 管 平 滑 肌 肉 瘤 ;B2 组 10 只 小 鼠 舌 部 浸 润 癌 6 只, 原 位 癌 2 只, 重 度 非 典 型 增 生 2 只

12 张海利 等 ４ＮＱＯ 致舌鳞癌小鼠黏膜形态学以及黑色素瘤抗原基因 Ａ１ 和 Ａ３ 表达的研究 １５１２ 依次 为 １ １０ １ １０ ４ １０ １４ ２９ ４８ ３ 见 表 ２ 统 计学分析 结 果 示 ＭＡＧＥＡ１ 蛋 白 在 舌 鳞 癌 不 同 进 展 阶 段 黏 膜 组 织 中 的 表 达 差 异 有 统 计 学 意 义 χ２ １６ ５３０ 犘 ０ ０００ 而 ＭＡＧＥＡ３ 蛋白有 明显 的趋 势 ２ 但差异无统计学意义 ９３９ 犘 ０ ０５５ χ ７ 图 ２ ＭＡＧＥＡ１ 和 ＭＡＧＥＡ３ 蛋白在舌鳞癌组织中 的表达 ＤＡＢ ４００ Ａ ＭＡＧＥＡ１ 蛋白 Ｂ ＭＡＧＥＡ３ 蛋白 表 ２ 小鼠舌黏膜组织中 ＭＡＧＥＡ１ 和 ＭＡＧＥＡ３ 蛋白的表达 病理类型 狀 正常黏膜 １０ 轻中度非典型增生 １０ 重度非典型增生 １０ 舌鳞癌 图 １ 舌鳞癌小鼠模型舌黏膜形态学表现 Ａ 小鼠舌大体标本 舌背人字沟黏 膜 粗 糙 隆 起 Ｂ 小 鼠 舌 大 体 标 本 舌 体可见 有 菜 花 样 新 生 物 Ｃ 小 鼠 标 本 镜 下 结 构 细 胞 异 形 重 累 犯 上 皮 全层 基底膜完整 ＨＥ ４００ Ｄ 小鼠标 本 的 镜 下 结 构 高 分 化 鳞 状 细 胞癌 ＨＥ ４００ ２９ 阳性率 阳性率 ０ １０ ０ １０ ０ １ ９ １０ ０ ０ １ ９ ３ １０ ０ ７ ３０ ０ ４ ６ １６ ４０ ０ １３ ５５ ２ １４ １５ ４８ ３ ＭＡＧＥＡ１ ＭＡＧＥＡ３ ３ 讨论 化学致癌剂 芳 香 胺 杂 环 化 合 物 ４ＮＱＯ 在 体 内 代 谢形成亲电子衍生物 易 与 细 胞 的 核 酸 与 蛋 白 质 发 生 相互作用 损伤 ＤＮＡ 最 终 导 致 细 胞 癌 变 Ｂ ｂ 小 ２ ２ ＭＡＧＥＡ１ 和 ＭＡＧＥＡ３ 蛋白在舌 上皮 异 常 增 生 不 同时期的表达 鼠对致癌因子敏感 可 以 用 于 多 种 肿 瘤 动 物 模 型 的 研 ＭＡＧＥＡ１ ＭＡＧＥＡ３ 蛋 白 表 达 主 要 位 于 细 胞 质 中 阳性表达细 胞 质 呈 棕 黄 色 颗 粒 图 ２ 将 建 立 小 生 ３ ８ 本实 验 用 ４ＮＱＯ 饮 水 法 成 功 建 立 了 Ｂ ｂ 鼠舌鳞癌模型不同时期的舌标本整理 显微镜下分类 可用 于 行 免 疫 组 化 的 正 常 舌 黏 膜 １０ 例 轻中 度 １０ 例 重 度 非 典 型 增 生 １０ 例 舌 鳞 癌 ２９ 例 这 些 标 本 ＭＡＧＥＡ１ 的 蛋 白 表 达 阳 性 率 依 次 为 ０ １０ ０ １０ ３ １０ １６ ２９ ５５ ２ ＭＡＧＥＡ３ 的 蛋 白 表 达 阳 性 率 究 ６７ ４ＮＱＯ 可 以 导 致 实 验 动 物 口 腔 鳞 癌 的 发 近交系小鼠舌鳞癌模型 文献 报 道 建 立 头 颈 部 鳞 癌 实 验 动 物 模 型 时 ４ＮＱＯ 浓度一般为 ０ ００１ ０ ００２ 可 观 察 到 舌 黏 膜癌变发生 发展的形态学过程 但一般需要的时间较 长 ２ ８ 机体肿瘤的发 生 风 险 与 机 体 所 接 触 化 学 致 癌 剂的量及暴 露 的 时 间 是 相 关 的 为 了 了 解 ４ＮＱＯ 诱

13 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No 发 实 验 动 物 头 颈 鳞 癌 的 剂 量 及 时 间 等 参 数, 本 实 验 中 采 用 较 高 浓 度 4NQO 饮 水 诱 发 小 鼠 头 颈 部 鳞 癌 结 果 发 现,0.010% 0.005% 的 4NQO 水 溶 液 均 可 在 32 周 建 立 理 想 的 舌 鳞 癌 小 鼠 模 型 但 是,4NQO 浓 度 为 0.010% 的 实 验 组 10 只 小 鼠 中,1 只 死 于 肺 炎, 还 有 2 只 分 别 并 发 食 管 的 鳞 癌 与 平 滑 肌 肉 瘤 因 此, 可 推 测 4NQO 浓 度 高 时 可 增 加 肿 瘤 发 生 的 非 特 异 性, 也 可 能 增 加 了 小 鼠 的 感 染 风 险 4NQO 饮 水 法 舌 鳞 癌 小 鼠 模 型 的 成 功 建 立, 为 研 究 头 颈 鳞 癌 发 生 发 展 过 程 中 细 胞 的 形 态 学 及 其 生 物 学 特 性 提 供 了 良 好 的 条 件 小 鼠 舌 黏 膜 病 变 以 人 字 沟 处 明 显 随 着 小 鼠 饮 用 4NQO 时 间 的 延 长, 可 以 观 察 到 舌 黏 膜 逐 渐 出 现 轻 到 重 度 的 黏 膜 改 变 : 黏 膜 粗 糙 不 光 滑 粗 糙 不 平 局 限 性 隆 起 或 浅 溃 疡, 最 后 出 现 肿 物 或 溃 疡 对 应 于 肉 眼 观 察 的 轻 到 重 度 的 黏 膜 改 变, 显 微 镜 下 表 现 为 黏 膜 的 单 纯 增 生 轻 中 度 重 度 非 典 型 增 生 原 位 癌 以 及 早 期 浸 润 癌 [9] 自 1991 年 vanderbruggen 等 报 道 了 第 1 个 黑 色 素 瘤 抗 原 基 因 MAGEl 后,MAGE 家 族 很 快 成 为 研 究 的 热 点 MAGE 家 族 包 括 MAGE A MAGE B MAGE C 和 MAGE D 等 亚 家 族 [10] 随 着 对 MAGE 基 因 家 族 研 究 的 深 入, 有 学 者 建 议 将 MAGE1~ MAGE12 基 因 依 次 命 名 为 MAGEA1~ MAGEA12 目 前 已 经 在 黑 色 素 瘤 肺 癌 乳 腺 癌 食 管 癌 和 头 颈 部 鳞 癌 等 多 种 恶 性 肿 瘤 组 织 中 检 测 到 了 MAGE 基 因 的 [5,11 14] 表 达 Kienstra 等 [15] 用 RT PCR 方 法 检 测 头 颈 鳞 癌 组 织 中 MAGEA1 与 MAGEA3 表 达 发 现,MAGEA1 和 MAGEA3 的 阳 性 率 分 别 为 40.0% 与 44.4% 本 研 究 显 微 镜 下 对 小 鼠 舌 鳞 癌 模 型 建 立 过 程 不 同 时 期 的 黏 膜 进 行 了 分 析 归 类, 即 正 常 舌 黏 膜 轻 中 度 非 典 型 增 生 重 度 非 典 型 增 生 以 及 鳞 状 细 胞 癌 标 本 MAGEA1 的 蛋 白 表 达 阳 性 率 依 次 为 0/10 0/10 3/10 和 16/29(55.2%);MAGEA3 的 蛋 白 表 达 阳 性 率 依 次 为 1/10 1/10 4/10 和 14/29(48.3%) 实 验 结 果 显 示, 小 鼠 舌 鳞 癌 组 织 中 的 MAGEA1 与 MA GEA3 表 达 与 人 头 颈 鳞 癌 组 织 有 相 似 的 阳 性 率 两 种 抗 原 在 正 常 黏 膜 组 织 中 几 乎 不 表 达, 随 着 黏 膜 组 织 病 变 加 重, 抗 原 表 达 逐 渐 增 高, 在 舌 鳞 癌 组 织 中 表 达 率 明 显 增 高, 表 明 在 舌 鳞 癌 的 发 生 过 程 中, 肿 瘤 特 异 性 抗 原 表 达 改 变 与 黏 膜 形 态 学 改 变 有 相 似 的 过 程, 是 舌 鳞 癌 发 生 的 伴 随 事 件 实 验 结 果 也 表 明, 与 正 常 黏 膜 组 织 的 表 达 相 比 较, 舌 鳞 癌 组 织 中 肿 瘤 特 异 性 抗 原 MAGEA1 与 MA GEA3 表 达 有 很 好 的 特 异 性, 两 者 均 可 能 是 舌 鳞 癌 发 生 监 测 与 临 床 诊 断 很 有 价 值 的 指 标 肿 瘤 的 发 生 是 一 个 多 因 素 参 与 多 阶 段 进 行 和 多 基 因 改 变 的 非 常 复 杂 的 过 程 小 鼠 舌 鳞 癌 模 型 成 功 地 复 制 了 鳞 癌 发 生 的 全 过 程 本 实 验 在 观 察 形 态 学 改 变 的 同 时, 对 头 颈 鳞 癌 发 生 发 展 过 程 中 病 变 细 胞 的 肿 瘤 特 异 性 抗 原 的 改 变 也 进 行 了 研 究 发 现 肿 瘤 特 异 性 抗 原 MAGEA1 与 MAGEA3 表 达 是 鳞 癌 的 伴 随 事 件, 证 实 抗 原 MAGEA1 与 MAGEA3 的 鳞 癌 特 异 性 本 研 究 为 进 一 步 探 讨 舌 鳞 癌 的 发 生 发 展 提 供 了 一 个 较 好 的 方 法, 也 为 肿 瘤 特 异 性 抗 原 MAGEA1 与 MA GEA3 应 用 于 病 变 的 诊 断 与 治 疗 提 供 了 实 验 依 据 参 考 文 献 [1] 林 东 昕. 肿 瘤 的 病 因 // 董 志 伟, 谷 铣 之. 临 床 肿 瘤 学 [M]. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2002: [2] KanojiaD,Vaidya M M.4 Nitroquinoline 1 oxideinducedex perimentaloralcarcinogenesis[j].oraloncol,2006,42(7): [3] HawkinsB L,HenifordB W,AckemannD M,etal.4NQO carcinogenesis:amousemodeloforalcavitysquamouscelcarci noma[j].headneck,1994,16(5): [4] 孙 保 存. 喉 部 疾 病 // 李 青, 周 晓 军, 苏 敏. 临 床 病 理 学 [M]. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,2009: [5] 刘 庆 伦, 张 昌 卿, 冯 凯 涛. 非 小 细 胞 肺 癌 MAGE 基 因 产 物 的 表 达 [J]. 中 华 肿 瘤 杂 志,2000,22(2): [6] 范 萍, 王 冰, 查 小 明, 等.BALB/C 小 鼠 乳 腺 癌 移 植 模 型 的 研 究 [J]. 中 华 实 验 外 科 杂 志,2004,21(7):873. [7] 徐 惠 绵, 陈 峻 青, 何 三 光, 等. 胃 癌 Balb/c 小 鼠 腹 膜 移 植 模 型 建 立 及 生 物 学 特 性 的 研 究 [J]. 中 国 医 科 大 学 学 报,1998,27(5): [8] 李 晓 杰, 马 国 武, 李 武 伟.4NQO 饮 水 法 诱 发 小 鼠 舌 鳞 癌 动 物 模 型 建 立 的 研 究 [J]. 口 腔 医 学 研 究,2006,22(5): [9] vanderbruggenp,traversaric,chomezp,etal.ageneen codinganantigenrecognizedbycytolytictlymphocytesonahu manmelanoma[j].science,2007,178(5): [10] Scanlan MJ,GureA O,JungbluthA A,etal.CancerTestis Antigen:anexpandingfamilyoftargetsforimmunotherapy[J]. ImmunolRev,2002,188(1): [11] LurquinC,DeSmetC,BraseurF,etal.Twomembersofthehuman MAGEBgenefamilylocatedinXp21.3areexpresedintumorsofvari oushistologicalorigins[j].genomics,1997,46(3): [12] LucasS,DeSmetC,ArdenK C,etal.Identificationofanew MAGEgenewithtumor specificexpressionbyrepresentational diferenceanalysis[j].cancerresearch,1998,58(4): [13] DePlaenE,ArdenK,TraversariC,etal.Structure,chromosom allocalization,andexpressionof12genesofthe MAGEfalily [J].Immunogenetics,1994,40(5): [14] FigueiredoDL,MamedeRC,Proto SiqueiraR,etal.Expres sionofcancertestisantigensinheadandnecksquamouscelcar cinomas[j].headneck,2006,28(7): [15] Kienstra M A,NeelH B,StromeSE,etal.Identificationof NY ESO 1,MAGE 1,andMAGE 3inheadandnecksquamous celcarcinoma[j].headneck,2003,25(6): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 高 磊 )

14 陈卫国 等 ＺＤ６４７４ 对鼻咽癌细胞株 ＣＮＥ２ 抑制作用及其机制的探讨 １５１４ 实验研究 ＺＤ６４７４ 对鼻咽癌细胞株 ＣＮＥ２ 抑制作用 及其机制的探讨 陈卫国１ ２ 袁亚维１ 南方医科大学南方医院放疗科 广东 广州 ５１０５１５ ２ 萍乡市人民医院消化科 江西 萍乡 ３３７０００ Ｉ ｂ ＺＤ６４７４ｐ ｍ ＣＮＥ２ ｍ ｍ ｇ 犆犎犈犖 犠 犵狌狅１ ２ 犢犝犃犖 犢犪 狑 １ 犇狆犪狉 犿狀 狅犳 犚犪犱 狅 犺 狉犪狆狔 犖犪狀犳犪狀犵 犎狅 狆 犪 犛狅狌 犺 狉狀犕犱 犮犪 犝狀狏 狉 犚 狀犪 狔 犌狌犪狀犵狕犺狅狌５１０５１５ 犘 ２ 犇狆犪狉 犿狀 狅犳 犇犵 狅狀 犘 狀犵狓 犪狀犵犘 狅狆 犎狅 狆 犪 犘 狀犵狓 犪狀犵３３７０００ 犘 犚 狀犪 摘要 目的 研究 ＺＤ６４７４ 对鼻 咽 癌 细 胞 株 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｇ ＣＮＥ２ 的 抑 制 作 用 方 法 采 用 ＭＴＴ 法 测 ＺＤ６４７４ ｋ ｂ ｐ ｍ ｇ 定 ＺＤ６４７４ 的 抑 制 浓 度 ＩＣ５０ 流 式 细 胞 仪 ＣＮＥ２ 犕犈犜犎犗犇犛 Ｔ ｐ ｐｐ ｐ 检测 ＺＤ６４７４ 的 凋 亡 率 及 细 胞 周 期 分 布 结 ＺＤ６４７４ ＣＮＥ２ ｗ ｗ ＭＴＴ 果 ＭＴＴ 数据 显 示 ＣＮＥ２ 细 胞 的 抑 制 率 与 ｍ ｗ ｍ 犚犈犛犝犔犜犛 Ｗ ＺＤ６４７４ 浓度成正相关 随 ＺＤ６４７４ 浓 度 升 高 ＺＤ６４７４ ｐ ｇ ｗ ｂ ｗ ｂ 抑制作用越明显 ＩＣ５０ ２ Ｌ 流 式 ５３１μｍ Ｌ ＣＮＥ２ ＩＣ５０ ｗ ２ ５３１ μｍ Ｆ ｗ 细胞术分析显示 ＺＤ６４７４ 处 理 ４８ 使 ＣＮＥ２ ｍ ｗ ＺＤ６４７４ ｍ ４８ ＣＮＥ２ 细胞凋亡率 明 显 升 高 ２４ ０２±５ ９０ 且 ２４ ０２±５ ９０ ｐｐ ｇ 随 浓 度 升 高 凋 亡 率 升 高 越 明 显 犘 ０ ００１ ｐｐ ｗ ｍ ｇ 细胞周期结果显示 ＺＤ６４７４ 使 细 胞 周 期 Ｓ 期 犘 ０ ００１ Ｔ ｗ ＺＤ６４７４ ３４ ９６±５ ３７ 比 例 下 降 Ｇ０ Ｇ１ 期 ｐ Ｓｐ ３４ ９６±５ ３７ ｇ ５６ ２５±１ ４５ 和 Ｇ２ Ｍ 期 １７ ３６± Ｇ０ Ｇ１ ｐ ５６ ２５± ４５ Ｇ２ Ｍ ｐ ｐ ｇ ５ ７３ 比例升高 结论 ＺＤ６４７４ 能明 显 抑 １７ ３６±５ ７３ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 Ｔ ｗｚｄ６４７４ 制 ＣＮＥ２ 细胞 的 增 殖 促 进 其 凋 亡 并 改 变 其 ｍ ｋ ｂ ｐ ｐ ｐ ｐｐ ｇ 细胞周期的分布 ｍ ＣＮＥ２ 中华肿瘤防治杂志 ２０１０ １７ １９ １５１４ １５１６ 狀犑犆犪狀犮 狉犘狉 狏犜狉 犪 ２０１０ １７ １９ １５１４ １５１６ 关键词 鼻咽肿瘤 细胞系 细胞周期 细胞凋亡 受体蛋白质酪氨酸激梅类 流式细胞术 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｐ ｐ ｍ ｐｐ ｐ ｐ ｋ ｗ ｍ ｇ 中图分类号 Ｒ７３９ ６ 文献标识码 Ａ 文章编号 １６７３ ５２６９ ２０１０ １９ １５１４ ０３ 鼻咽癌是我国南方最常见的肿瘤之一 有研究结 果表明 鼻咽癌肿瘤 分 子 靶 向 治 疗 具 有 较 好 的 安 全 性 ＶＥＧＦ 受体 ＶＥＧＦＲ 的 酪 氨 酸 激 酶 从 ２ 个 途 径 影 响肿瘤细胞生长和肿 瘤 血 管 形 成 从 而 发 挥 抗 肿 瘤 作 及一定的有效 性 １ ＺＤ６４７４ ｚ ｍ 是 一 种 口 服 小 用 ２４ 本研究观察了 ＺＤ６４７４ 对于鼻咽癌细胞 ＣＮＥ２ 分子酪氨酸激酶抑制 剂 能 同 时 抑 制 表 皮 生 长 因 子 受 株的生长抑 制 作 用 拟 为 ＺＤ６４７４ 用 于 临 床 鼻 咽 癌 的 体 ｐ ｍ ｇ ｗ ｐ ＥＧＦＲ 和 血 管 分子靶向治疗提供一定依据 内皮 生 长 因 子 ｇ ｗ 第一作者简介 陈卫国 男 江 西 萍 乡 人 硕 士 副 主 任 医 师 主要从事肿瘤防治的研究工作 Ｔ ８６ ７９９ ６８８１７５５ Ｅ ｍ ｗｇ６５６６ １６３ ｍ 通讯作者简介 袁亚维 女 广东 广 州 人 博 士 教 授 博 士 生 导师 主要从事肿瘤放疗的研究工作 Ｔ ８６ ２０ ６１６４１８８７ Ｅ ｍ ｗ６６ １ 材料与方法 １ 药品及试剂 ＺＤ６４７４ 由中山大学惠赠 ＭＴＴ 及碘化丙啶 ＰＩ 为Ｓ ｇｍ公司产品 用 ＰＢＳ 液 配 制 成 ５ ｍｇ ｍｌ 的 溶 液 Ａｘ ⅤＦＩＴＣ 凋亡检测试剂 Ｂ Ｄ ｋ Ｇ ｍ 二 甲 基 亚 砜 ＤＭＳＯ 购 于 Ｓ ｇｍ 公 司

15 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No RPMIMedium1640 为 Gibco 公 司 产 品 1.2 细 胞 系 及 培 养 鼻 咽 癌 细 胞 系 CNE2 由 南 方 医 科 大 学 南 方 医 院 肿 瘤 中 心 实 验 室 提 供 ; 细 胞 培 养 在 含 10% 小 牛 血 清 及 作 用 时 间 两 因 素 存 在 交 互 效 应, 犉 =9.579, 犘 =0.000; 不 同 浓 度 细 胞 生 存 率 之 间 差 异 有 统 计 学 意 义, 犉 = , 犘 =0.000; 不 同 时 间 作 用 时 间 对 细 胞 生 存 率 的 影 响 差 异 有 统 计 学 意 义, 犉 =83.500, 犘 = U/mL 青 霉 素 和 100 mg/l 链 霉 素 的 RPMI1640 培 养 液 中, 置 100% 湿 度 37 5% CO 2 的 恒 温 箱 中 培 养 取 对 数 生 长 期 细 胞 进 行 实 验 1.3 MTT 实 验 检 测 IC 50 细 胞 消 化 计 数, 按 每 孔 个 细 胞 均 匀 接 种 于 96 孔 培 养 板,24h 细 胞 贴 壁 后, 将 10 倍 稀 释 不 同 浓 度 的 ZD6474 分 别 加 入 各 孔 内, 每 浓 度 设 5 个 复 孔, 并 设 不 加 药 的 细 胞 对 照 和 空 白 对 照 药 物 作 用 72h 后, 每 孔 加 入 5mg/mL 的 MTT 溶 液 20μL, 继 续 孵 育 4h 终 止 培 养, 离 心 半 径 15cm,1500r/min 离 心 10min 后 弃 上 清, 用 DMSO150μL 溶 解 沉 淀, 550nm 波 长 测 量 吸 光 度, 计 算 细 胞 抑 制 率 抑 制 率 (%)= 对 照 组 吸 光 值 (A)- 实 验 组 吸 光 值 (A) 对 照 组 吸 光 值 (A) 100% 计 算 半 数 抑 制 浓 度 (IC 50 ), 实 验 重 复 3 次, 计 算 IC 50 平 均 值 1.4 流 式 细 胞 术 分 析 细 胞 凋 亡 和 细 胞 周 期 实 验 分 为 对 照 组 和 ZD6474(IC 50 ) 处 理 组 两 组 取 对 数 生 长 期 的 CNE2 细 胞, 分 别 根 据 实 验 分 组 进 行 相 应 处 理,24h 后 消 化 计 数, 取 个 细 胞,70% 乙 醇 固 定 过 夜, 加 入 1%RNA 酶 37 消 化 15 min, 然 后 加 入 20mg/L 碘 化 丙 啶 (PI) 染 色 15min,300 目 尼 龙 网 过 滤, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 和 周 期 细 胞 凋 亡 的 早 期, 细 胞 膜 上 磷 脂 酰 丝 氨 酸 (PS) 从 膜 内 侧 翻 到 膜 外 侧, 连 接 荧 光 素 FITC 的 Annexin Ⅴ 蛋 白 可 与 PS 结 合, 从 而 检 测 到 PS 的 变 化 而 另 一 方 面, 坏 死 细 胞 的 胞 膜 完 整 性 受 到 破 坏, 细 胞 不 需 要 固 定 即 可 被 DNA 染 料 PI 染 色, 活 细 胞 及 无 凋 亡 细 胞 胞 膜 完 整, 不 被 PI 着 色, 因 此, 结 合 使 用 这 两 种 染 料 可 把 凋 亡 细 胞 和 继 发 坏 死 细 胞 区 分 出 来 1.5 统 计 学 方 法 使 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 分 析,MTT 法 测 得 吸 光 度 A 值 的 数 据 统 计 采 用 重 复 测 量 的 方 差 分 析, 实 验 数 据 用 狓 - ± 表 示, 各 组 间 细 胞 存 活 分 数 采 用 重 复 测 量 的 方 差 分 析, 方 差 齐 性 时 采 用 LSD 法, 方 差 不 齐 采 用 Dunnet st3 方 法 检 验 水 准 α=0.05 图 1 MTT 实 验 检 测 ZD6474 对 CNE2 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 2.2 流 式 细 胞 术 分 析 细 胞 凋 亡 情 况 Annexin Ⅴ FITC 和 PI 染 色 将 细 胞 分 为 4 种 属 性, 其 中 Ⅰ 象 限 Annexin Ⅴ 和 PI 均 高 染, 为 凋 亡 晚 期 或 坏 死 细 胞 ;Ⅱ 象 限 Annexin Ⅴ 高 染 PI 低 染, 为 早 期 凋 亡 细 胞 ;Ⅲ 象 限 Annexin Ⅴ 和 PI 均 低 染, 为 正 常 细 胞 ;Ⅳ 象 限 Annexin Ⅴ 低 染 PI 高 染, 为 细 胞 碎 片 ( 图 2) 流 式 细 胞 术 分 析 显 示, 对 照 组 和 ZD6474 处 理 组 细 胞 凋 亡 率 分 别 为 (6.23±0.85)% 和 (24.02± 5.90)%,ZD6474 处 理 48h 使 CNE2 细 胞 凋 亡 率 显 著 升 高, 且 随 浓 度 升 高 凋 亡 率 升 高 越 明 显, 犘 < 对 细 胞 周 期 的 影 响 正 常 状 态 下 的 CNE2 细 胞 大 多 数 处 于 G 1 和 S 期,G 2 /M 期 最 少 经 ZD6474 处 理 后,S 期 细 胞 的 比 例 显 著 减 少,G 0 /G 1 和 G 2 /M 期 细 胞 的 比 例 显 著 增 加, 且 随 着 药 物 浓 度 的 增 加 而 逐 渐 明 显, 犘 均 <0.001 ( 表 1) 2 结 果 2.1 MTT 实 验 检 测 ZD6474 对 CNE2 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 不 同 浓 度 的 ZD6474 作 用 于 人 鼻 咽 癌 CNE2 细 胞 和 72h 后 细 胞 生 存 率 见 图 1 ZD6474 不 同 浓 度 图 2 流 式 细 胞 术 分 析 对 照 组 和 ZD6474 组 细 胞 的 凋 亡 情 况 A: 对 照 组 ;B: 药 物 组

16 1516 陈 卫 国, 等 ZD6474 对 鼻 咽 癌 细 胞 株 CNE2 抑 制 作 用 及 其 机 制 的 探 讨 表 1 IC50 剂 量 组 CNE2 细 胞 的 周 期 分 布 (%, 狓 - ±, 狀 =3) 分 组 G0/G1 S G2/M 对 照 组 47.13± ± ±0.21 ZD6474 组 56.25± ± ± 讨 论 ZD6474 是 一 种 苯 胺 基 喹 唑 啉 化 合 物, 为 口 服 的 小 分 子 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂, 由 AstraZeneca 制 药 公 司 研 [5] 发, 目 前 处 于 Ⅲ 期 临 床 试 验 阶 段 VEGF 是 目 前 发 现 的 参 与 肿 瘤 血 管 形 成 作 用 最 强 和 最 特 异 的 生 长 因 子, 故 VEGF 及 其 VEGFR 被 认 为 是 最 有 前 途 的 抗 肿 [6] 瘤 血 管 生 成 靶 点 ZD6474 可 高 选 择 性 抑 制 血 管 内 皮 细 胞 生 长 因 子 受 体 2(VEGFR2/KDR) 酪 氨 酸 激 酶 活 性, 阻 断 VEGF 介 导 的 内 皮 细 胞 信 号 转 导 从 而 抑 制 [7] 血 管 生 成 有 研 究 表 明,ZD6474 通 过 这 种 广 谱 的 抗 血 管 生 成 作 用 可 以 抑 制 多 种 不 同 组 织 来 源 的 恶 性 肿 瘤 [8] 裸 鼠 移 植 瘤 模 型 生 长 此 外,ZD6474 对 EGFR 酪 氨 酸 激 酶 活 性 也 有 一 定 的 抑 制 作 用 已 经 发 现 多 种 恶 性 肿 瘤 中 有 EGFR 或 其 配 体 的 过 度 表 达, 异 常 高 活 性 的 EGFR 酪 氨 酸 激 酶 与 肿 瘤 细 胞 的 增 殖 生 存 转 移 及 分 泌 促 血 管 生 成 因 子 密 切 相 关 因 此,ZD6474 有 望 通 过 选 择 性 抑 制 VEGFR2 和 EGFR 酪 氨 酸 激 酶 双 靶 点 遏 制 肿 瘤 生 长 已 有 研 究 表 明, 其 对 非 小 细 胞 肺 癌 以 及 晚 期 乳 腺 癌 晚 期 多 发 性 骨 髓 瘤 甲 状 腺 癌 等 都 有 [1 4] 一 定 的 疗 效 本 研 究 表 明, 在 体 外 实 验 中 ZD6474 可 抑 制 鼻 咽 癌 细 胞 株 的 生 长, 而 且 存 在 着 时 间 与 剂 量 依 赖 性 同 时, 本 研 究 也 发 现, 不 同 浓 度 的 ZD6474 作 用 于 鼻 咽 癌 细 胞 CNE2 后,S 期 细 胞 的 比 例 减 少,G 0 /G 1 和 G 2 /M 期 的 比 例 增 加, 表 明 ZD6474 抑 制 鼻 咽 癌 CNE2 细 胞 的 生 长 可 能 与 细 胞 周 期 的 G 0 /G 1 期 及 G 2 /M 期 阻 滞 [7] 有 关 与 Xia 等 关 于 ZD6474 能 延 缓 G 2 M 期 的 移 行 和 抑 制 细 胞 的 有 丝 分 裂, 引 起 M 早 中 期 细 胞 的 阻 断, 使 G 2 M 期 细 胞 聚 集 的 结 论 相 一 致 此 外, 也 有 研 究 报 道, 用 ZD6474 诱 导 肝 癌 细 胞 HCC 9204 凋 亡, 使 Bcl 2 蛋 白 表 达 明 显 减 少, 细 胞 凋 亡 率 明 显 升 高, 提 示 ZD6474 诱 导 细 胞 凋 亡 的 机 制 也 可 能 与 其 下 调 Bcl 2 [8] 表 达 有 关 这 些 结 果 将 为 ZD6474 用 于 鼻 咽 癌 的 治 疗 提 供 理 论 依 据 ZD6474 作 为 一 种 双 途 径 阻 抑 药, 代 表 了 未 来 靶 向 治 疗 药 物 的 发 展 方 向, 即 多 途 径 全 面 干 扰 肿 瘤 的 发 生 和 发 展, 多 种 靶 向 药 物 的 联 合 使 用, 开 发 具 有 多 途 径 抑 制 药 物 / 复 合 制 剂 势 必 成 为 未 来 的 研 究 热 点 参 考 文 献 [1] NataleR,BodkinD,GovindanR,etal.Acomparisonofthean titumoureficacyofzd6474andgefitinib (Iressa)inpatients withnsclc:resultsofarandomized,double blind Phase Ⅱ study[j].lungcancer,2005(suppl2): [2] AnnunizataC M,WalkerAJ,MinasianL,etal.Vandetanib, designedtoinhibitvegfk2andegfrsignaling,hadnoclinical activityasmonotherapyforrecurrentovariancancerandnode tectablemodulationofvegfr2[j].clin CancerRes,2010, 16(2): [3] ShenJ,HeBF,RuanJ,etal.InhibitoryefectofZD6474com binedwithadriamycinon Mcf 7 human breastcancercelsin vitro[j].nanfangyikedaxuexuebao,2010,30(3): [4] RobinsonB G,Paz AresL,KrebsA,etal.Vandetanib (100 mg)inpatients withlocalyadvancedor metastatichereditary [J].ClinEndocrinolMetab,2010,95(6): [5] HerbstRS,SunY,EberhardtW E,etal.Vandetanibplusdo cetaxelversusdocetaxelassecond linetreatmentforpatients withadvancednon smal cellungcancer(zodiac):adouble blind,randomised,phase 3 trial[j].lancet Oncol,2010, 11(7): [6] AzamfireiL,GurzuS,SolomonR,etal.Vascularendothelial growthfactor:apossiblemediatorofendothelialactivationina cuterespiratory distresssyndrome[j]. Minerva Anestesiol, 2010,76(8): [7] XiaX,WuJX,ZhuXF,etal.Inductionofcelcyclearrestand apoptosisinhumannasopharyngealcarcinomacelsbyzd6474, aninhibitorofvegfrtyrosinekinasewithadditionalactivitya gainstegfrtyrosinekinase[j].intjcancer,2007,121(9): [8] RyanAJ,WedgeSR.ZD6474 novelinhibitorofvegfrand EGFR tyrosine kinase activity [J]. Br J Cancer,2005, 92(Suppl1):6 13. 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 马 骏 )

17 中华肿瘤防治杂志 ２０１０ 年 １０ 月第 １７ 卷第 １９ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｏ ｂ ２０１０ Ｖ １７ Ｎ １９ １５１７ 实验研究 过氧化物还原酶 １ 对蛋白酶体抑制剂诱导未分化 甲状腺癌 ＦＲＯ 细胞凋亡作用的研究 都镇先１ 高雁艳２ 刘宝琴２ 张海燕１ 王华芹２ 中国医科大学附属第一医院 内分泌科 都镇先 老年病干诊科 张海燕 辽宁 沈阳 １１０００１ ２ 中国医科大学基础医学院生物化学生化与分子生物教研室 辽宁 沈阳 １１０００１ Ｅ ｐ ｘ ｘ １ｐｐ ＦＲＯ ｍ ｂｐ ｍ ｂ 犇犝犣犺狀 狓 犪狀１ 犌犃犗犢犪狀 狔犪狀２ 犔犐犝犅犪狅 狀２ 犣犎犃犖犌 犎犪 狔犪狀１ 犠犃犖犌 犎狌犪 狀２ 狇 狇 犉 狉 犃犳犳 犪 犱 犎狅 狆 犪 狀犪犕犱 犮犪 犝狀 狏 狉 犚 狀犪 狔 犛犺狀狔犪狀犵１１０００１ 犘 ２ 犇狆犪狉 犿狀 狅犳 犅 狅 犮犺犿 狉狔犪狀犱 犕狅 犮狌 犪狉犅 狅 狅犵狔 犆狅 犵狅犳 犅犪 犮犕犱 犮犪 犛犮 狀犮 狀犪犕犱 犮犪 犝狀 狏 狉 狔 犛犺狀狔犪狀犵１１０００１ 犘 犚 狀犪 摘要 目的 探讨蛋白酶体抑制剂对 未 分 化 甲 犃犅犛犜犚犃犆犜 犗犅犑犈犆犜犐犞犈 Ｔ ｐ ｇ 状腺癌 ＦＲＯ 细胞中过氧 化 物 还 原 酶 １ Ｐ ｘ１ 表 ｘ ｘ １ Ｐ ｘ１ ｂｐ 达 的 影 响 以 及 Ｐ ｘ１ 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 ｍ ｂ 犕犈犛犝犜犔犛 Ｔ ＦＲＯ 细胞凋 亡 中 的 作 用 方 法 选 取 人 甲 状 腺 ｍ ｂ ＦＲＯ ｗ ｗ ｐ 未分化癌 细 胞 系 ＦＲＯ 分 别 设 培 养 液 处 理 空 白 ＭＧ１３２ ＰＳ Ｉ Ｐ ｘ１ｘｐ ｗ 对照组 蛋白酶 体 抑 制 剂 ＭＧ１３２ ＰＳ Ｉ Ｌ ＲＮＡ Ｐ ｘ１ ｍｒｎａ ｋ ｋｗｂ ＲＮＡ 处 理 组 利 用 ＲＮＡ 干 扰 技 术 降 低 Ｐ ｘ１ 的 表 ｗ ｚ ｂ ｇ ｍｒｔｐｃｒ ｐ 达 实时定量 ＲＴＰＣＲ 法 蛋 白 质 印 迹 法 分 别 检 ｐ ｐｐ ｗ ｚ ｂ Ｗ ｂ 测各组细胞 Ｐ ｘ１ｍｒｎａ 及 蛋 白 表 达 流 式 细 胞 ｇ ｗ ｍ ＦＣＭ 犚犈犛犝犔犜犛 ＭＧ１３２ ＰＳ Ｉ 仪 ＦＣＭ 检 测 细 胞 凋 亡 率 结 果 与 空 白 对 照 ｍｒｎａｐ ｇ 组相 比 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 ＭＧ１３２ ＰＳ Ｉ和 Ｌ Ｐ ｘ１ 犘 ０ ０１ ＦＲＯ 均显著 增 加 ＦＲＯ 细 胞 系 中 Ｐ ｘ１ 基 因 表 ｍ ｇｒｎａｇ Ｐ ｘ１ Ｐ ｘ１ ｍ ｋ 达水平 犘 ０ ０１ 与 空 白 对 照 组 和 随 机 序 列 核 Ｐ ｘ１ ｍｒｎａ ｐ ｗ ｍｐ 酸 ＲＮＡ 组相比 Ｐ ｘ１ 处 理 组 中 Ｐ ｘ１ ｍｒｎａ ｗ ｍｂ ＲＮＡ 犘 ０ ０１ 及蛋白表达水平显著降 低 犘 ０ ０１ 其 凋 亡 率 Ｐ ｘ１ ｍ ＭＧ１３２ ＰＳ Ｉ ｍ 显著增加 犘 ０ ０１ 结 论 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 能 犘 ０ ０１ 犆犗犖犆犔犝犛 犐犗犖 ｐｐ 够上调甲状 腺 未 分 化 癌 ＦＲＯ 细 胞 系 中 Ｐ ｘ１ 基 Ｐ ｍ ｂ Ｐ ｘ１ｘｐ 因的 表 达 水 平 Ｐ ｘ１ 具 有 特 异 性 降 低 Ｐ ｘ１ 基 ｐｐ Ｐ ｘ１ ＦＲＯ 因表达的作用 同时增加蛋白酶体抑制剂 诱 导 甲 ｘｐ ｂ Ｐ ｘ１ ｐｐ ｇ 状腺癌 ＦＲＯ 细胞凋亡作用 ＦＲＯ ｂｐ ｍ ｂ 中华肿瘤防治杂志 ２０１０ １７ １９ １５１７ １５２０ 狀犑犆犪狀犮 狉犘狉 狏犜狉 犪 ２０１０ １７ １９ １５１７ １５２０ 关键词 甲状腺肿瘤 过氧化物酶 蛋白酶抑制药 基因表达 细胞凋亡 犓犈犢犠犗犚犇犛 ｐ ｍ ｐ ｘ ｐ ｂ ｐｐ ｇｘｐ 中图分类号 Ｒ７３ ３ 文献标识码 Ａ 文章编号 １６７３ ５２６９ ２０１０ １９ １５１７ ０４ 基金项目 辽宁省科技攻关项目 ２００９２２５０１２ 辽宁省教育 泛素蛋白酶体通路参与细 胞内 蛋白 代谢 调节 细 胞周期 细胞分化 ＤＮＡ 修 复 和 抗 原 呈 递 等 多 种 信 号 厅项目 ２００９Ａ７６５ 转导途径 蛋白酶 体 已 成 为 肿 瘤 化 疗 的 新 靶 点 体 内 通讯作者简介 都镇先 男 辽宁 沈 阳 人 博 士 副 教 授 副 主 外实验发现 多种可 渗 透 的 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 能 够 抑 制 任医师 主要从事内分泌肿瘤的分子生物学研究工作 Ｅ ｍ ｚｘ ｍ ｍ 肿瘤细胞生长 促进 细 胞 凋 亡 干 扰 细 胞 周 期 进 程 提 高肿瘤细胞对化疗和 放 疗 的 敏 感 性 等 成 为 非 常 有 前

18 1518 都 镇 先, 等 过 氧 化 物 还 原 酶 1 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 未 分 化 甲 状 腺 癌 FRO 细 胞 凋 亡 作 用 的 研 究 [1 2] 景 的 肿 瘤 治 疗 新 药 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 很 可 能 影 响 许 多 细 胞 死 亡 相 关 的 信 号 转 导 通 路, 包 括 肿 瘤 抑 制 基 因 p53 Caspase 以 及 核 因 子 NF κb 抑 制 分 子 IκBα 等, 扰 乱 这 些 中 的 任 何 一 个 蛋 白 的 正 常 降 解 都 可 能 会 使 肿 瘤 细 胞 倾 向 凋 亡 然 而, 现 已 观 察 到 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 也 能 自 相 矛 盾 地 上 调 某 些 抗 凋 亡 蛋 白, 降 低 了 其 抗 肿 [3 5] 瘤 的 效 果 前 期 研 究 表 明, 氧 化 应 激 在 蛋 白 酶 体 抑 [6] 制 剂 诱 导 未 分 化 甲 状 腺 癌 细 胞 凋 亡 中 起 重 要 作 用 过 氧 化 物 氧 化 还 原 酶 (Peroxiredoxins,Prx) 是 新 近 发 现 的 抗 氧 化 酶 蛋 白, 在 生 物 体 中 普 遍 存 在 本 研 究 探 讨 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 对 过 氧 化 物 还 原 酶 1(Prx1) 表 达 的 影 响, 及 Prx1 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 未 分 化 甲 状 腺 癌 FRO 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 人 甲 状 腺 未 分 化 癌 细 胞 株 (FRO) 由 日 本 长 崎 大 学 大 学 院 生 物 医 学 研 究 科 山 下 俊 一 先 生 赠 予 主 要 试 剂 :DMEM 培 养 液 (Sigma 公 司 ) sirna 序 列 脂 质 转 染 体 2000 (Invitrogen 公 司 ) 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 lactacystin 和 PSI(Calbiochem 公 司 ) 膜 联 蛋 白 V FITC 和 碘 化 丙 啶 双 标 记 试 剂 (BD 生 命 科 学 公 司 ) 鼠 抗 人 Prx1(Abcam) 鼠 抗 人 γ Tubulin 单 克 隆 抗 体 (Sigma Aldrich); 主 要 仪 器 设 备 分 别 为 FAC SARIA2 流 式 细 胞 仪 (BD 生 命 科 学 公 司 ) ABI prism7000 自 动 序 列 分 析 系 统 (Biosystems) 1.2 方 法 细 胞 培 养 人 甲 状 腺 未 分 化 癌 细 胞 系 FRO 于 含 10% 胎 牛 血 清 DMEM 培 养 基,37 5% CO 2 饱 和 湿 度 下 培 养,2~3d 传 代 1 次, 选 用 对 数 生 长 期 细 胞 进 行 实 验 细 胞 分 组 及 干 预 处 理 设 培 养 液 处 理 空 白 对 照 组 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 处 理 组, 分 别 向 各 组 细 胞 中 加 入 各 种 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 及 培 养 液 平 行 操 作 siprx1 (CAGAUGGUCAGUUUAAAGAUA) 随 机 序 列 核 酸 (CCGUAUCGUAAGCAGUACU) 由 金 思 特 科 技 ( 南 京 ) 有 限 公 司 合 成 ; 进 一 步 设 空 白 对 照 组 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 组 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 +siprx1 组 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 + 随 机 序 列 核 酸 (scramble) 组, 利 用 微 小 RNA 干 扰 (smalinterferingrna,sirna) 技 术, 应 用 脂 质 转 染 体 2000, 参 照 有 关 说 明 书 操 作, 分 别 用 siprx1 随 机 序 列 核 酸 sirna 培 养 液 同 步 进 行 细 胞 转 染 24h 后, 以 MG132(2μmol/L) 或 培 养 液 继 续 培 养 24h 应 用 GFP 质 粒 转 染, 荧 光 显 微 镜 观 察 发 现 FRO 细 胞 转 染 率 为 70%~80% 实 时 定 量 RT PCR 法 检 测 各 组 细 胞 Prx1 mrna 表 达 收 集 各 组 细 胞, 参 照 相 关 文 献 [5], 采 用 异 硫 氰 酸 肌 法 提 取 总 RNA, 用 12~18 的 Oligo(dT) 和 SuperscriptⅡ 进 行 逆 转 录, 用 双 标 记 荧 光 探 针 混 合 物 在 ABIprism7000 自 动 序 列 分 析 系 统 中 进 行 实 时 PCR 分 析, 每 组 重 复 3 次 Prx1 基 因 引 物 特 异 序 列 为 5 CACAGCTGTTATGCCAGATG 3 ( 上 游 ) 和 5 ACTGAAAGCAATGATCTCCG 3 ( 下 游 ) β ac tin 作 为 内 参 照, 其 引 物 特 异 序 列 为 5 GAGACCT TCAACACCCCAGCC 3 ( 上 游 ) 和 5 GGATCTTC ATGAGGTAGTCAG 3 ( 下 游 ) Prx1 扩 增 结 果 用 β actin 进 行 标 化 流 式 细 胞 仪 (FCM) 检 测 细 胞 凋 亡 用 胰 蛋 白 酶 消 化 并 收 集 各 组 细 胞, 以 PBS 清 洗 2 次, 加 入 膜 联 蛋 白 V 和 碘 化 丙 啶 双 标 记 试 剂, 按 试 剂 盒 说 明 书 对 样 本 进 行 处 理 后, 避 光 15 min 通 过 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡, 每 一 组 至 少 检 测 500 个 细 胞, 重 复 3 次 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 Prx1 蛋 白 表 达 收 集 各 组 细 胞, 用 含 有 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 裂 解 缓 冲 液 (20 mmol/l Tris HCl;150 mmol/l NaCl;2 mmol/l EDTA;1% Triton X 100) 裂 解 破 碎 离 心 后, 用 BCA 蛋 白 分 析 试 剂 盒 对 上 清 蛋 白 进 行 定 量 以 20μg 等 量 的 蛋 白 上 样, 用 12%SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 和 电 转 移 法 转 至 硝 酸 纤 维 素 膜 上, 以 5% 脱 脂 奶 粉 TBST 封 闭 后, 依 次 进 行 一 抗 鼠 抗 人 Prx1,4 孵 育 过 夜, 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 二 抗 室 温 孵 育 1h, 进 行 ECL 化 学 发 光 显 像 以 鼠 抗 人 γ Tubulin 单 克 隆 抗 体 作 为 内 参 照, 应 用 NIHIMAGE 1.4 软 件 进 行 计 算 机 图 像 分 析 ; 以 γ Tubulin 标 化 后 各 实 验 组 与 对 照 组 蛋 白 吸 光 度 比 值 作 为 产 物 相 对 含 量 1.3 统 计 学 方 法 所 有 的 实 验 均 重 复 3 次, 数 据 用 狓 - ± 表 示, 数 据 处 理 采 用 SPSS13.5 软 件, 采 用 单 因 素 方 差 分 析 (one wayanova posthocdunnet stest) 检 验 水 准 α= 结 果 2.1 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 对 FRO 细 胞 Prx1 基 因 表 达 的 影 响 实 时 定 量 RT PCR 法 检 测 结 果 表 明, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 MG132 PSI 和 lactacystin 均 增 加 FRO 细 胞 Prx1 mrna 的 表 达 水 平, 犘 <0.01( 图 1A) 与 实 时 定 量 RT PCR 结 果 类 似, 蛋 白 质 印 迹 法 分 析 表 明, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 增 加 Prx1 的 蛋 白 表 达 水 平, 犘 <0.01( 图 1B) 2.2 siprx1 对 FRO 细 胞 Prx1 基 因 表 达 的 影 响 实 时 定 量 RT PCR 结 果 表 明, 以 Prx1 特 异 性 sir NA(siPrx1) 或 随 机 核 酸 序 列 sirna 同 步 转 染 细 胞 24h, 再 分 别 用 MG132 培 养 液 培 养 24h 后,siPrx1 部 分 抑 制 MG132 PSI 和 lactacystin 诱 导 的 Prx1 mrna 水 平 增 加, 而 随 机 核 酸 序 列 sirna 无 明 显 作 用 ( 图 2A) 蛋 白

19 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 2010 年 10 月 第 17 卷 第 19 期 CHINJCANCERPREV TREAT,October2010,Vol.17 No 质 印 迹 法 分 析 也 表 明, 细 胞 中 由 MG132 PSI 和 lacta cystin 诱 导 的 Prx1 蛋 白 表 达 被 转 染 的 siprx1 部 分 抑 制, 而 随 机 核 酸 序 列 sirna 无 明 显 作 用, 提 示 siprx1 降 低 Prx1 表 达 具 有 特 异 的 靶 向 作 用 ( 图 2B) siprx1 也 增 加 FRO 细 胞 对 其 他 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 包 括 PSI 和 lactacystin 的 敏 感 性, 犘 <0.01( 图 3B) 图 1 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 上 调 甲 状 腺 未 分 化 癌 FRO 细 胞 中 Prx1 的 表 达 水 平 A: 各 种 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 处 理 FRO 细 胞 24h, 实 时 定 量 RT PCR 检 测 Prx1mRNA 的 表 达 水 平, 狏 对 照 组, 犘 <0.01;B: 各 种 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 处 理 FRO 细 胞 24h, 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 Prx1 蛋 白 的 表 达 水 平, 以 β tubulin 为 管 家 基 因 对 照 图 3 微 小 RNA 干 扰 Prx1 表 达 增 加 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 的 FRO 细 胞 凋 亡 A:siPrx1 或 对 照 sirna(scramble) 转 染 FRO 细 胞 24h, 对 照 或 MG132 处 理 24h,FCM 检 测 细 胞 凋 亡 率 ;B:siPrx1 或 对 照 sirna(scramble) 转 染 FRO 细 胞 24h, 对 照 或 PSI 或 lactacystin 处 理 24h,FCM 检 测 细 胞 凋 亡 率 ; 狏 scramble 转 染 组, 犘 < 讨 论 图 2 siprx1 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 FRO 细 胞 凋 亡 的 影 响 A:siPrx1 或 对 照 sirna(scramble) 转 染 FRO 细 胞 24h, 对 照 MG132 PSI 或 lactacystin 处 理 24h, 实 时 定 量 RT PCR 检 测 Prx1 的 mrna 水 平 ; B:siPrx1 或 对 照 sirna(scramble) 转 染 FRO 细 胞 24h, 对 照 MG132 PSI 或 lactacystin 处 理 24h, 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 Prx1 蛋 白 的 表 达 水 平 2.3 siprx1 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 FRO 细 胞 凋 亡 的 影 响 FCM 检 测 结 果 显 示,siPrx1 明 显 增 加 MG132 诱 导 的 细 胞 凋 亡, 而 随 机 核 酸 sirnas 转 染 组 对 MG132 诱 导 的 细 胞 凋 亡 没 有 影 响, 犘 <0.01( 图 3A) 另 外, 泛 素 蛋 白 酶 体 通 路 参 与 细 胞 内 绝 大 多 数 蛋 白 质 的 降 解, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 可 以 通 过 干 涉 一 些 重 要 调 节 蛋 白 质 的 降 解, 触 发 肿 瘤 下 表 的 周 期 阻 滞, 诱 导 肿 瘤 细 [1 2] 胞 凋 亡, 是 一 类 有 前 景 的 新 型 抗 肿 瘤 药 物 然 而, 这 些 药 物 诱 导 细 胞 凋 亡 的 机 制 尚 未 完 全 阐 明, 可 能 是 复 杂 的 级 联 事 件 产 物 另 外, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 也 会 矛 盾 地 激 活 某 些 生 存 信 号 途 径, 激 活 生 存 信 号 级 联 反 应 可 能 减 弱 其 对 肿 瘤 的 细 胞 毒 效 应 因 此, 发 现 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 激 活 的 存 活 信 号 途 径, 可 以 指 导 设 计 合 理 的 辅 助 治 疗 方 案, 提 高 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 的 抗 肿 瘤 效 果 前 期 研 究 表 明, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 通 过 氧 化 应 激 途 [6] 径 诱 导 未 分 化 甲 状 腺 癌 细 胞 凋 亡, 本 研 究 从 一 个 新 的 角 度 出 发 探 讨 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 对 抗 氧 化 应 激 蛋 白 Prx1 表 达 的 影 响, 以 期 进 一 步 阐 明 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 未 分 化 甲 状 腺 癌 细 胞 凋 亡 的 可 能 机 制 本 研 究 首 次 发 现, 未 分 化 甲 状 腺 癌 FRO 细 胞 中 Prx1 的 mrna 和 蛋 白 表 达 水 平 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 作 用 后 明 显 增 加 Prxs 是 新 发 现 的 一 类 过 氧 化 物 酶, 广 泛 存 在 于 原 核 和 真 核 生 物 中, 在 消 除 代 谢 产 生 的 过 氧 化 物 中 具 有 重 要

20 1520 都 镇 先, 等 过 氧 化 物 还 原 酶 1 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 未 分 化 甲 状 腺 癌 FRO 细 胞 凋 亡 作 用 的 研 究 [7] 作 用 除 了 在 清 除 活 性 氧 中 发 挥 作 用 外,Prx1 还 具 有 其 他 多 种 功 能, 如 刺 激 细 胞 增 殖 与 分 化 参 与 细 胞 信 [8] 号 转 导 及 保 护 其 他 蛋 白 的 氧 化 等 功 能 包 括 甲 状 腺 癌 的 许 多 肿 瘤 组 织 中 Prx1 高 表 达, 并 且 与 肿 瘤 细 胞 对 [9 11] 化 疗 药 物 的 耐 药 性 有 关 这 些 表 明, 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 产 生 的 Prx1 上 调 可 能 消 减 凋 亡 级 联 反 应 的 某 些 环 节, 从 而 降 低 了 该 类 药 物 的 抗 肿 瘤 效 应 为 明 确 Prx1 表 达 水 平 对 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 细 胞 凋 亡 的 影 响, 本 研 究 进 一 步 利 用 微 小 干 扰 RNA(siRNA) 技 术 抑 制 Prx1 表 达 结 果 发 现,Prx1 特 异 性 sirna 不 仅 靶 向 特 异 性 下 调 了 Prx1mRNA 和 蛋 白 的 表 达, 并 且 明 显 增 加 MG132 lactacystin 和 PSI 诱 导 的 细 胞 凋 亡 这 些 研 究 结 果 提 示,Prx1 表 达 增 加 是 蛋 白 酶 体 功 能 抑 制 时 细 胞 的 保 护 性 反 应 之 一, 可 以 抑 制 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 的 促 FRO 细 胞 凋 亡 作 用 本 研 究 还 发 现,Prx1 是 另 外 一 个 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 抗 肿 瘤 治 疗 中 上 调 的 存 活 蛋 白, Prx1 的 上 调 消 减 了 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 的 抗 肿 瘤 效 果, 表 明 靶 向 Prx1 可 能 成 为 增 敏 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 药 物 开 发 的 新 靶 点 参 考 文 献 [1] WoodsDC,LiuH K,NishiY,etal.Inhibitionofproteasome activitysensitizeshuman granulosetumorcelsto TRAIL in ducedceldeath [J].CancerLet,2008,260(1 2): [2] Halet W H,AmesE,MotarjemiM,etal.Sensitizationof tumorcelstonkcel mediatedkilingbyproteasomeinhibition [J].JImmuno,2008,180(1): [3] 都 镇 先, 刘 宝 琴, 张 海 燕, 等. 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 甲 状 腺 癌 细 胞 凋 亡 机 制 的 初 步 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2010,17(2): [4] 张 海 燕, 邓 娓 娓, 都 镇 先, 等.GRP78 在 蛋 白 酶 体 抑 制 剂 诱 导 甲 状 腺 癌 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2009,16(18): [5] PodarK,GouilSL,ZhangL,etal.ApivotalroleforMcl 1inBort ezomib inducedapoptosis[j].oncogene,2008,27(6): [6] DuZX,Zhang H Y,MengX,etal.Roleofoxidativestress andintracelularglutathioneinthesensitivitytoapoptosisin ducedbyproteasomeinhibitorinthyroidcancercels[j].bmc Cancer,2009,9(16): [7] KimSU,HwangCN,SunH N,etal.Peroxiredoxin Ⅰisan indicatorof microgliaactivationandprotectsagainsthydrogen peroxide mediatedmicroglialdeath [J].BiolPharmBul,2008, 31(5): [8] LeeY M,ParkSH,ShinDI,etal.Oxidativemodificationof peroxiredoxinisassociatedwithdrug inducedapoptoticsignaling inexperimentalmodelsofparkinsondisease [J].JBiolChem, 2008,283(15): [9] Kim HJ,ChaeHZ,KimYJ,etal.PreferentialelevationofPrxI andtrxexpressioninlungcancercelsfolowinghypoxiaandinhu manlungcancertissues[j].celbioltoxicol,2003,19(5): [10] KimJH,BognerPN,RamnathN,etal.Elevatedperoxiredox in1,butnotnf E2 relatedfactor2,isanindependentprognos ticfactorfordiseaserecurrenceandreducedsurvivalinstage Ⅰ non smalcellungcancer[j].clincancerres,2007,13(13): [11] Kim YJ,Lee W S,IpC,etal.Prx1suppressesradiation in ducedc Jun NH2 terminalkinasesignalinginlungcancercels throughinteraction withtheglutathiones transferasepi/c Jun NH2 terminalkinasecomplex [J].CancerRes,2006,66(14): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 史 本 玲 )