5,(5) 戴琨等 : 乙酸对重组大肠杆菌 BL 产酶的影响及作用机理研究 7 目前, 随着重组 DNA 技术与发酵培养技术的迅速发展, 利用基因工程菌获得所需产品的技术日趋成熟由于

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璎薛
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1 研究报告生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 5, (5):- 乙酸对重组大肠杆菌 BL 产酶的影响及作用机理研究戴琨王腾飞郝昭程汤丹丹刘红娟王瑞明 ( 齐鲁工业大学生物工程学院, 济南 55) 摘要 : 旨在研究发酵过程中产生的乙酸对重组大肠杆菌 BL(DE)/pET5b-TreS 的生长以及重组海藻糖合酶基因表达的影响, 并对其作用机理进行探讨通过外源添加乙酸 ( 钠 ) 的方法, 研究了乙酸钠对重组菌 BL(DE)/pET5b-TreS 生长曲线的影响 ; 利用环境扫描电子显微镜, 观察了重组菌形态的变化情况 ; 通过测定菌液的电导率值变化菌液上清中 OD 的变化, 研究了乙酸 ( 钠 ) 对菌体细胞膜渗透性完整性的影响 ; 通过测定菌液上清中 β- 半乳糖苷酶的活性检测了乙酸钠对菌体细胞内膜的影响 ; 利用荧光分析法检测了乙酸对菌体膜蛋白构象的影响 ; 采用 SDS-PAGE 电泳研究了乙酸钠对菌体重组海藻糖合酶表达量的影响结果表明, 乙酸 ( 钠 ) 会对重组菌的生长产生一定的抑制作用, 可以导致菌体细胞的表面出现凹陷皱缩 ; 并会影响细胞膜的渗透性完整性, 使得一些细胞内容物发生泄漏 ; 影响细胞膜上的膜蛋白构象, 对膜的结构造成一定程度的破坏 ; 对重组海藻糖合酶的表达产生影响乙酸 ( 钠 ) 对重组菌菌体的生长及重组海藻糖合酶基因的表达有影响, 并且菌体细胞膜是其作用的一个靶点关键词 : 乙酸 ; 重组大肠杆菌 ; 抑菌机理 ; 细胞膜 ; 海藻糖合酶 DOI :.5/j.cnki.biotech.bull Study on Effects of Acetic Acid on Enzyme Production of the Recombinant Escherichia coli BL and Its Action Mechanism Dai Kun Wang Tengfei Hao Zhaocheng Tang Dandan Liu Hongjuan Wang Ruiming (Department of Biology Engineering,QILU University of Technology,Ji nan 55) Abstract: Our objective is to study the effects of acetic acid from fermentation on the growth of the recombinant Escherichia coli BL (DE)/pET5b-TreS as well as the expression of the recombinant trehalose synthase gene, and the action mechanism was also discussed. Firstly, we studied the effect of acetic acid on the growth of recombinant Escherichia coli by experiments with adding acetic acid(sodium acetate), and observed the morphological changes of recombinant bacteria by using environmental scanning electron microscope. Then, the effects of acetic acid(sodium acetate)on the permeability and the integrity of cell membrane were studied through the determination of electrical conductivity of the broth and the changes of OD of the supernatant. The activity of β-galactosidase in the supernatant was measured to determine the effect of sodium acetate on intracellular membrane, and then the influence of acetic acid on the conformation of membrane protein by using fluorescence analysis were detected. Finally, the effect of sodium acetate on the expression of the recombinant trehalose synthase gene by SDS-PAGE was studied. Results showed that the acetic acid(sodium acetate)could have certain inhibition effects on the recombinant bacteria growth, and caused cell surface to be depressed and shrinkage. The permeability and integrity of cell membranes were affected by the acetic acid(sodium acetate), leading some substances in cells to leak out. And experiments also revealed that the acetic acid could make effects on the conformation of the membrane protein in the cell membrane, which caused a certain degree of damages to the membrane structure. SDS-PAGE analysis suggested that the sodium acetate had impacts on the expression of the recombinant trehalose synthase gene. The acetic acid (sodium acetate)was confirmed to affect the cell growth and the expression of the recombinant trehalose synthase gene, and the cell membrane was a target of its function. Key words: acetic acid ;Recombinant Escherichia coli ;antimicrobial mechanism ;cell membrane ;trehalose synthase 收稿日期 :-8- 基金项目 : 山东省科技发展计划 (GGB) 作者简介 : 戴琨, 女, 硕士研究生, 研究方向 : 微生物酶技术 ; daikun989@.com 通讯作者 : 王瑞明, 博士, 教授, 研究方向 : 微生物酶技术 ; ruimingk@.com

观察了重组菌形态的变化情况 ; 通过测定菌液的电导率值变化菌液上清中 OD 的变化, 研究了乙酸 ( 钠 ) 对菌体细胞膜渗透性完整性的影响 ; 通过测定菌液上清中 β- 半乳糖苷酶的活性检测了乙酸钠对菌体细胞内膜的影响 ; 利用荧

2 5,(5) 戴琨等 : 乙酸对重组大肠杆菌 BL 产酶的影响及作用机理研究 7 目前, 随着重组 DNA 技术与发酵培养技术的迅速发展, 利用基因工程菌获得所需产品的技术日趋成熟由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚易培养发酵周期短并能实现目的基因的高效表达等特性, 因而被广泛应用于基因工程菌的构建 [] 而重组菌的高细胞密度发酵是获得高外源蛋白产量的一种重要手段, 能够提高单位时间单位体积的外源蛋白产率, 重组大肠杆菌的高密度培养一般指培养液中菌体干细胞重量 (dry cell weight,dcw) 达 5 g/l 以上 [] 利用重组大肠杆菌进行高密度发酵可以有效地提高外源基因表达产物的产量, 但是, 大肠杆菌在进行高密度发酵时会产生代谢副产物乙酸,Han [] 认为细菌在低比生长速率条件下通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求, 不会产生乙酸, 而在高比生长速率时, 大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量, 必须通过乙酸生成途径储备 ATP 和 NADH 乙酸的生成需要两个关键性的酶, 磷酸转乙酰酶 (Pta) 和乙酰激酶 (Ack), 它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶 A 生成乙酸的两步酶促反应 [] 然而, 乙酸的产生和积累不仅会影响菌体生长, 还会对菌体生长和重组基因的表达产生抑制 [5] EL-Mansi [] 和 Luli [7] 假设的乙酸抑制机理为 : 乙酸在中性 ph 环境中以离子化 (CH COO - ) 和质子化 (CH COOH) 两种形式存在, 质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内, 在胞内 (ph7.5) 解离成 CH COO - 和 H +, 这样就降低了膜内的 ph 值, 使膜内外的 ph 差 (ΔpH) 减小, 减弱了质子推动力, 产生的能量就被大大减少了, 扰乱了细胞的正常代谢和生理活性而阴离子增加了细胞内部渗透压, 并干扰甲硫氨酸的合成 [8] 有试验证明, 培养时 ph 越低, 乙酸未解离形式含量越高, 乙酸抑制作用就越强 [9-] 此外, 研究表明, 乙酸会影响数种蛋白和基因, 特别是那些涉及大肠杆菌转录及翻译机制一般应激反应和调节的蛋白和基因 [] 而且, 乙酸对产重组蛋白的细胞抑制作用比对野生型的细胞抑制作用更强 [], 同时细胞诱导表达蛋白后产生乙酸的临界比生长速率更低 [] 在利用重组大肠杆菌 BL(DE)/pET5b-TreS 进行高密度发酵生产海藻糖合酶的过程中, 发酵液中会有大量代谢副产物乙酸的积累, 而且会影响海藻糖合酶的酶活根据这些检测结果, 本研究采取外源添加的方法, 研究乙酸对重组大肠杆菌的生长及外源海藻糖合酶基因表达的影响, 并分析其对细胞的抑制机理, 包括对细胞膜目的蛋白表达量的抑制作用, 旨在为了解发酵过程中乙酸对菌体作用的机理, 以控制培养条件, 降低对菌体生长及产物产量的影响材料与方法. 材料.. 试验菌株大肠杆菌 BL(DE)/pET5b-Tres ( 本实验室构建菌种 ).. 培养基 LB 液体培养基 (%): 酵母浸粉.5, 蛋白胨.,NaCl. M9 乳糖诱导培养基 (%):Na HPO H O.7,KH PO.,NaCl.5,NH Cl.,MgSO.5, CaCl., 乳糖.5 β- 半乳糖苷酶反应缓冲液 (%):NaCl.8, KCl.,Na HPO H O.9,KH PO., MgSO 7H O.5,β- 巯基乙醇.9 氨苄青霉素 (Amp):5 ml 无菌水中加入.5 g 氨苄西林钠 (.5 g/ 瓶 ) 其他试剂均为分析纯.. 仪器振荡培养箱 ( 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ); 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 ( 上海申安医疗器械厂 ); 标准型净化工作台 ( 苏州安泰技术有限公司 ); 电子天平 ( 上海天平仪器厂 ); 隔水式恒温培养箱 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); 往复式水浴恒温振荡器 ( 江苏正基仪器有限公司 );DDS-A 电导率仪 ( 上海第二分析仪器厂 ); 紫外可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限公司 );ChampGel5 5 生物电泳凝胶成像分析系统 (SAGECREATION); F-5 荧光分光光度计 ( 日立 );58R 高速冷冻离心机 ( 德国 Eppendorf 公司 ). 方法.. 菌种的活化培养配制 LB 液体培养基经灭菌 min 后, 冷却, 于培养基中加入 Amp( 终浓度为 mg/l) 后接菌,7 8 r/min 的条件下培养 h 取菌液在加有 Amp 的固体培养基上进

体干细胞重量 (dry cell weight,dcw) 达 5 g/l 以上 [] 利用重组大肠杆菌进行高密度发酵可以有效地提高外源基因表达产物的产量, 但是, 大肠杆菌在进行高密度发酵时会产生代谢副产物乙酸,Han [] 认为细菌在低比生长速率条件

3 8 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 5,Vol.,No.5 行划线培养, 挑取生长状况较好的单个菌落进行液体培养基扩增.. 对生长曲线的影响取活化后的大肠杆菌 BL(DE)/pET5b-TreS 按 % 的接种量分别接种于 9 个 ml 加有 Amp 的 LB 培养基中, 加入灭菌的乙酸钠溶液, 使其终浓度分别为.5 5 和 g/l, 于 7 8 r/min 的条件下培养, 并在不同的时间点取样测 OD 值, 绘制生长曲线.. 对细胞显微特征的影响将培养至对数生长期的重组菌于 5 r/min, 条件下离心 min, 弃上清, 收集菌体, 用无菌生理盐水洗涤次, 并稀释至菌体浓度约为 7 CFU/mL 取制备的重组菌菌悬液 ml, 分别加入乙酸 ( 使其终浓度分别为.5 g/l 和 5 g/l) 乙酸钠溶液 ( 使其终浓度分别为.7 g/l 和.88 g/l), 同时设置无菌生理盐水对照组,7 孵育 h 将对照组和试验组的重组菌菌液离心收集菌体, 洗涤后用.5% 的戊二醛于条件下固定 h 后涂片, 使样品自然风干制备的样品用环境扫描电子显微镜观察重组菌形态的变化情况.. 对菌体细胞膜通透性的影响将培养至对数期的重组菌菌体, 用无菌水稀释至菌液浓度为 7 CFU/mL, 取稀释后的菌液 7 ml, 加入 ml 抑菌成分, 分别为乙酸 ( 终浓度分别为 : 和 5 g/l) 乙酸钠 ( 终浓度分别为 :..7. 和.88 g/l), 同时设置无菌水对照组, 置于 7 恒温水浴振荡器中, 然后分别在 5 和 8 min 时测定其电导率值..5 对菌体细胞膜完整性的影响将培养至对数期的重组菌菌体, 用生理盐水稀释至菌体浓度为 7 CFU/mL 左右, 取稀释后的菌液 5 ml, 加入 5 ml 不同浓度的抑菌成分, 分别为乙酸 ( 终浓度分别为 : 和 5 g/l) 乙酸钠 ( 终浓度分别为 :..7. 和.88 g/l), 并设置空白对照组, 然后置于 7 恒温水浴振荡器中, 分别在不同时间点取样, 并在 r/min 的条件下, 离心 5 min, 取上清用紫外分光光度计测其在 nm 处的吸光值.. 对细胞内膜的渗透性影响培养重组菌至对数生长期, 取菌液 ml 进行离心, 菌体用无菌生理盐水洗涤两次, 转移至 ml 的 M9 乳糖诱导培养基中, 于 7 恒温振荡培养 h, 然后离心, 收集菌体, 用 β- 半乳糖苷酶反应缓冲液重悬至 OD 为. 左右取 9 ml 反应缓冲液重悬的菌液, 分别加入 ml 不同浓度的乙酸钠 ( 终浓度分别为 :..7. 和.88 g/l) 混匀,7 孵育 h 后离心菌体, 取上清.5 ml, 再加入 5 μl mg/ml 的邻硝基苯 -β-d- 吡喃半乳糖苷 (ONPG), 置于 7 恒温水浴中, 孵育 h 后, 于 nm 的波长下测其吸光值 []..7 荧光分析法测乙酸对菌体膜蛋白构象的影响将重组菌培养至对数生长期, 离心洗涤菌体, 用生理盐水重悬, 浓度约为 7 CFU/mL, 分别在 5 ml 灭菌的 EP 管中加入 ml 的菌悬液, 然后加入 ml 不同浓度的冰乙酸 ( 乙酸的终浓度依次为和 5 g/l), 于 7 恒温水浴锅中保温 h 后, 置于日立 F-5 荧光分光光度计上进行检测..8 对蛋白质合成的影响将重组菌培养至对数生长期, 按 % 接种量分别接种于 ml 加 Amp 的 LB 液体培养基中, 同时分别加入. g/l 灭菌的乙酸钠溶液, 使得乙酸钠的终浓度分别为.5 和 5 g/l, 并设置对照组, 培养 8 h 后, 加入乳糖诱导, 诱导 h 后, 收集菌体, 并进行洗涤, 将洗涤后的菌体用 ph7. 的磷酸缓冲液悬浮至吸光值相同, 经超声破碎后离心取上清, 进行 SDS-PAGE 配制浓度为 5% 的浓缩胶和浓度为 % 的分离胶进行蛋白电泳, 取上清液样品 μl 与 μl 上样缓冲液混合, 于沸水中煮沸 min 后, 进行点样结果. 对生长曲线的影响在一定范围内, 菌液的细胞浓度与吸光度值 (OD 值 ) 成正比, 试验中采用 OD 来衡量重组大肠杆菌的细胞密度因此, 通过测定 OD 值的变化来间接地表示乙酸钠对重组菌生长的抑制情况乙酸根对重组大肠杆菌生长曲线的影响结果 ( 图 ) 显示, 在培养基中加入乙酸钠对 BL (DE)/pET5b-Tres 的生长会产生影响, 菌体的生长明显受到抑制, 使得菌体生长的延滞期延长, 且

5 5 和 g/l, 于 7 8 r/min 的条件下培养, 并在不同的时间点取样测 OD 值, 绘制生长曲线.

4 戴琨等乙酸对重组大肠杆菌 BL 产酶的影响及作用机理研究 5,(5) 抑制作用随浓度的增大而增强而乙酸钠浓度为.5 A- 9 A- g/l 时对菌体生长的抑制较弱其他浓度下 - h 内生长较缓慢在 h 之后较低浓度乙酸钠浓度低于 5 g/l 下菌体生长受到的抑制减弱而在较高浓度乙酸钠浓度为和 g/l 下菌体生长被严重抑制生长依然缓慢 g/l.5 g/l g/l g/l 5 g/l g/l g/l g/l g/l B C D E OD 8 䰤 h 图不同浓度乙酸钠对重组菌生长曲线的影响. 对细胞显微特征的影响经电子显微镜观察对照组的重组大肠杆菌的形 A- A- 对照组 B.5 g/l 的乙酸处理试验组 C 5 g/l 的态如图中 A- A- 所示其细胞形态比较完整乙酸处理试验组 D.7 g/l 的乙酸钠处理实验组 E.88 g/l 饱满而试验组中用不同浓度的乙酸乙酸钠处理过的重组菌形态发生了不同的变化其中用浓的乙酸钠处理试验组图度为.5 g/l 和 5 g/l 的乙酸处理过的菌体形态如环境扫描电子显微镜观察乙酸钠对重组菌形态结构的影响图 -B -C 所示用浓度分别为.7 g/l 和.88 g/l 的乙酸钠溶液处理过的菌体形态如图 -D -E 所子运动速率降低电导率也降低相同浓度的菌液示图 -B 显示菌体基本形态没有较大变化只加入不同浓度的乙酸钠后电导率也变得不同浓出现较小的褶皱而图 -C 中显示菌体出现皱缩度为. g/l 时电导率最大浓度继续升高电导菌体的形态受到较大影响乙酸钠处理后的细胞率先降低后升高可能是由于电解质解离程度高使图 -D -E 显示细胞会发生凹陷随着乙酸得乙酸根由于外界压力进入细胞内部导致其先下钠浓度的增大细胞受损情况加重降而其他浓度的乙酸钠加入后会使得电导率有. 对菌体细胞膜通透性的影响所升高这说明乙酸根导致了细胞膜的通透性发生通过测定菌液电导率的变化可以反映细菌细胞变化内容物电解质泄露到胞外其电导率的变化膜通透性的变化情况重组菌经不同浓度的乙酸程度相差不大而图 -B 显示加入乙酸后菌液乙酸钠处理后其菌液电导率的变化情况图 -A 的电导率均升高初始电导率随浓度的增大而增大表明菌体加入无菌水的空白对照组电导率很低升高程度也随浓度增大而略有增大说明细胞膜的而且变化不大而实验组加入不同浓度的乙酸钠后破坏程度略有增加菌液的电导率发生了不同的变化乙酸钠是一种强. 电解质强电解质溶液的电导率随着浓度的增加而升高当浓度增加到一定程度后解离度下降离对菌体细胞膜完整性的影响通过测定经不同处理后的菌液上清在 nm 处的吸光度值变化推测菌体细胞膜的完整性变化情况

88 g/l 饱满而试验组中用不同浓度的乙酸乙酸钠处理过的重组菌形态发生了不同的变化其中用浓的乙酸钠处理试验组图度为.5 g/l 和 5 g/l 的乙酸处理过的菌体形态如环境扫描电子显微镜观察乙酸钠对重组菌形态结构的影响图 -B -C 所示用浓度分别为.7 g/l 和.

5 生物技术通报 Biotechnology Bulletin A オⲭሩ A オⲭሩ 5 7 B オⲭ OD ሬ μs cm B.5 オⲭ.8 OD ሬ μs cm 7 5,Vol.,No 分别对应乙酸钠浓度为和. g/l 5-8 分别对应乙酸的浓度为和.5 g/l 图不同浓度乙酸钠 A 及乙酸 B 对菌体细胞膜通透性的影响 - 分别对应乙酸钠浓度为和. g/l 5-8 分别对应乙酸的浓度为和.5 g/l 图.5 重组菌经不同浓度的乙酸钠处理后菌液上清的不同浓度乙酸钠 A 及乙酸 B 对重组菌细胞膜完整性的影响对细胞内膜的渗透性影响通过测定菌液上清中的 β-半乳糖苷酶的活性 OD 变化情况图 -A 表明空白对照组的菌来检测胞内大分子渗透至胞外的情况进而说明细液上清 OD 没有升高且变化较小而实验组的胞内膜的受损情况菌液添加乙酸钠作用后离心 OD 变化比较大且高于对照组说明实验组的菌菌体取上清测定 β-半乳糖苷酶的酶活性结果图体细胞膜完整性受到影响有 DNA 等物质的泄露 5 显示加入乙酸钠作用于菌体后上清中 β-半乳由于乙酸钠是强电解质浓度太高会抑制其电解率糖苷酶的酶活高于对照组说明乙酸根对于细胞内而浓度为.88 g/l 和.7 g/l 时趋势相似变化膜有一定的破坏作用导致 β-半乳糖苷酶渗漏到胞程度接近推测其电解率相近而浓度为. g/l 外而不同浓度的乙酸钠对其作用效果相差不大和. g/l 时 OD 值变化不大浓度为. g/l 时. 可能是由于乙酸钠的电离及乙酸根的水解程度较荧光分析法测乙酸对菌体膜蛋白构象的影响通过荧光分析法检测乙酸对菌体上的膜蛋白及大会有大量的质子化的乙酸根进入细胞对膜的细胞膜结构的影响结果图表明 KI 作用后完整性影响较小而浓度为. g/l 时浓度较低荧光强度降低说明能与细胞膜表面的蛋白质色氨则对膜完整性的影响较小乙酸添加情况图 -B 酸 Trp 残基结合同时荧光强度逐渐降低由此可表明前 min 变化情况较复杂无明显的趋势以推断色氨酸 Trp 残基位于细胞膜的表面和内部之后可以看到试验组的 OD 高于对照组且随浓当细胞膜结构发生变化时膜内部的 Trp 残基就会度增大而升高说明乙酸会影响菌体细胞膜的完整暴露出来与 KI 结合图 7 结果显示随着乙酸浓度性导致 DNA 等大分子物质的泄露且随浓度升高的增大 Trp 残基的荧光强度相应的依次减少表明作用增强乙酸对 Trp 的荧光特性具有淬灭作用而激发峰的

不同浓度乙酸钠 A 及乙酸 B 对菌体细胞膜通透性的影响 - 分别对应乙酸钠浓度为.88..7 和. g/l 5-8 分别对应乙酸的浓度为 5.5.5 和.5 g/l 图.

6 オⲭ. 的表达量会增大推测是由于乙酸根进入胞内会作为碳源参与到菌体的代谢中因而其表达量增大. 但随着浓度的继续增大乙酸的抑制作用也会表现. OD 戴琨等乙酸对重组大肠杆菌 BL 产酶的影响及作用机理研究 5,(5) 出来海藻糖合酶的表达量则随着乙酸钠浓度的增. 大而减小说明乙酸钠会对海藻糖合酶的表达产生. 抑制 M 5 海藻糖合酶 - 分别对应乙酸钠的浓度为和. g/l 图5 乙酸钠对细胞内膜通透性的影响 kd 8 5 位置和图形基本上没有变化这表明乙酸能够改变细胞膜的结构使位于细胞膜内的 Trp 残基暴露于 ሩᕪᓖ 细胞膜外 M 标准蛋白 -7 分别对应加入乙酸钠的浓度为.5 和 5 g/l 图8 发酵液中会有代谢副产物乙酸的积累乙酸的存在 5 䮯 nm 5 ሩᕪᓖ KI 对重组菌膜蛋白荧光特性的影响抑制工程菌的生长及外源基因的表达 5 乙酸对重组大肠杆菌的抑制作用已有报道本研究根据实验中出现的这一现象进行了更加深入的理论基础研究对乙酸的抑制作用机理进行了探讨研究中发现在加入乙酸钠的环境中菌体会出现一定的适应期较低浓度.5 和 g/l 的乙酸钠对菌体影响较小并且可能是由于质子化的乙酸根进入细胞后可以作为碳源参与到细胞内的代谢中供菌体生长所用所以会对菌体生长稍有促进而在较高乙酸钠浓度下菌体细胞或其代谢过程可能会被破坏因而菌体生长受到严重抑制本研究首先研究了乙酸乙酸钠对重组大肠杆菌细 5 5 䮯 nm 添加乙酸的浓度由上到下依次为和 5 g/l.7 讨论在利用重组大肠杆菌进行高密度发酵的过程中 KI 的浓度由上到下依次为...5 和. mol/l 图乙酸钠作用后的重组菌蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱胞形态及显微特征的影响发现菌体会发生皱缩或者凹陷有些菌体周围可以看出类似发生了内容物图 7 乙酸对重组菌膜蛋白荧光发射强度的影响的外泄这可能是由于乙酸乙酸钠引起了菌体细对蛋白质合成的影响物的外泄图 8 显示加入低浓度的乙酸钠海藻糖合酶胞膜的破坏进而导致了菌体形态的变化甚至内容根据上述现象通过实验进一步研究了乙酸

5 和 5 g/l 图8 发酵液中会有代谢副产物乙酸的积累乙酸的存在 5 䮯 nm 5 ሩᕪᓖ KI 对重组菌膜蛋白荧光特性的影响抑制工程菌的生长及外源基因的表达 5 乙酸对重组大肠杆菌的抑制作用已有报道本研究根据实验中出现的这一现象进行了更加深入的理论基础研究对乙酸的抑制作用机理进行了探讨研究中发现在加入乙酸钠的环境中菌体会 9 8 7 5 出现一定的适应期较低浓度.

7 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 5,Vol.,No.5 乙酸钠对于菌体细胞膜的影响, 细菌的细胞膜具有一定的流动性, 当细菌细胞膜遭到破坏, 使得其半透性及流动性降低时, 细胞的内环境稳定性会被破坏, 从而导致内部的电解质 ( 如 K + ) 外渗, 培养液的电导率上升 [] 细菌细胞膜是细菌的结构组分, 不仅是细胞的保护屏障, 也是在细胞的生命活动中有着复杂功能的重要结构当细胞膜遭到破坏时, 首先细胞内的小分子物质外渗出来, 然后是 DNA 和 RNA 等一些大分子的外渗, 而 DNA 和 RNA 在 nm 处有强吸收, 因此, 对 nm 吸收物质的检测被广泛应用于测定细胞膜的完整性 [7] 测定处理后菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化, 通过测定处理后菌液上清在 nm 处的吸光度值变化推测菌体细胞膜的完整性变化, 而这两个实验结果比较复杂, 分析可能涉及到乙酸乙酸钠的解离和水解问题, 但结果说明菌体细胞膜的通透性与完整性都会受到一定的影响细菌在受到乳糖诱导后均可产生 β- 半乳糖苷酶, β- 半乳糖苷酶是位于细胞内的水解酶, 能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖邻硝基苯 β-d- 半乳吡喃糖苷 (ONPG) 是乳糖的类似物,β- 半乳糖苷酶可以将 ONPG 水解成半乳糖和黄色的邻 - 硝基苯酚, 因此可以通过颜色的变化测知 β- 半乳糖苷酶的活性 [8] 实验通过测定菌液上清中的 β- 半乳糖苷酶的活性, 来检测胞内大分子渗透至胞外的情况, 进而说明细胞内膜的受损情况, 不同浓度的乙酸钠对其作用后会有影响, 但差别较小蛋白质分子中因含有色氨酸 (Trp) 酪氨酸 (Tyr) 和苯丙氨酸 (Phe) 等氨基酸残基而产生内源性荧光在大多数情况下, 可以认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基, 其变化直接反映了蛋白质中色氨酸残基本身及其周围环境的变化当某些小分子如药物等物质与蛋白质结合时, 导致其荧光强度下降, 称为荧光淬灭作用 [9] 根据 Trp 的激发波长 Ex, 固定 Ex, 通过日立 F-5 荧光分光光度计在 -5 nm 范围内扫描即可确定 Trp 在重组大肠杆菌膜蛋白中的发射波长 Em 为了确定 Trp 在重组大肠杆菌膜中的位置, 需要将猝灭剂 KI( mol/l) 稀释成不同浓度 (...5 和. mol/l) 加入, 检测对 Trp 发射波长 Em 的峰位和峰高的影响如果 Em 迅速降低, 则表明该氨基酸残基位于表面, 如果 Em 变化不大, 则表明该氨基酸残基位于膜内, 如果 Em 逐渐降低, 就表明该氨基酸残基的位置有两种可能, 可能是在膜内也有可能是在膜外 [] 结果表明乙酸能够改变细胞膜的结构, 使位于细胞膜内的 Trp 残基暴露于细胞膜外这个结论比较明确地说明了乙酸会对细胞膜产生影响, 进而影响其功能在研究乙酸钠对蛋白合成的影响时, 可以看到明显的趋势, 低浓度下乙酸钠的添加会促进海藻糖合酶的表达量, 而高浓度的乙酸钠又会起到抑制作用其原因可能是乙酸根会影响 DNA 的复制或表达, 也可能是乙酸钠使菌体细胞膜受到损坏, 导致一部分酶发生了外泄造成的在研究过程中, 采用的是菌液中外源添加乙酸乙酸钠的方法, 由于乙酸在溶液中的存在形式有乙酸分子形式及乙酸根形式, 则试验中分别对两种形式进行了研究, 添加乙酸乙酸钠至所需的浓度后, 菌液的 ph 变化与对照组相差较小, 因此主要考虑了乙酸乙酸根的影响据已有的研究表明, 某些抑菌剂可与细菌染色体 DNA 发生相互作用, 导致 DNA 的复制转录以及表达受到抑制 [,] 本试验中乙酸会影响海藻糖合酶的表达量, 这可能是由于乙酸对胞内 DNA RNA 等产生抑制作用直接影响其表达量, 也可能是由于随着乙酸浓度的增大, 重组菌细胞的通透性结构等发生变化, 导致部分蛋白发生泄露, 因而影响了目的蛋白的含量具体的机制还需要今后做进一步研究, 进行验证结论根据发酵过程中的检测初步研究了乙酸 ( 钠 ) 对重组大肠杆菌的抑制作用及部分作用机理通过外源添加乙酸 ( 钠 ) 的方法, 对重组菌的生长曲线细胞膜通透性细胞膜结构细胞超微结构蛋白表达等方面进行了研究, 结果表明, 乙酸 ( 钠 ) 作用于重组菌后, 可使其生长受到抑制, 且随浓度的不同而发生变化 ; 细胞膜的通透性会有所增加, 细胞膜的完整性及膜的结构受到破坏, 导致部分细胞内容物发生泄露 ; 菌体正常形态发生变化 ; 重组海

是细菌的结构组分, 不仅是细胞的保护屏障, 也是在细胞的生命活动中有着复杂功能的重要结构当细胞膜遭到破坏时, 首先细胞内的小分子物质外渗出来, 然后是 DNA 和 RNA 等一些大分子的外渗, 而 DNA 和 RNA 在 nm 处有强吸收, 因此,

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