中图分类号：；文献标识码：；文章篇号: (2004)01-000#-0#

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之荣
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1 姜酚的抑菌机制研究刘伟 1, 赵婧 1, 陈冬 1, 周春丽 1,2 1, 李全宏 (1. 中国农业大学食品科学与工程学院, 北京 )( 2. 江西科技师范学院生命科学学院, 江西南昌 ) 摘要 : 试验研究了姜酚对 6 种食品相关的微生物的抑制活性姜酚对试验目标微生物金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌痢疾志贺氏菌酿酒酵母和黑曲霉菌的最低抑制浓度在 8.0 到 22.0 μg/ml 范围内, 表明姜酚可以有效的抑制所有的供试微生物通过时间 - 杀菌试验表明不同浓度的姜酚可以有效延迟金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的延滞期电子显微图证实了姜酚对金黄色葡萄球菌痢疾志贺氏菌和黑曲霉的外部形态和超微结构的改变经过姜酚作用的细胞或菌丝可以在电子显微图中发现异常形态的改变, 如 : 收缩局部变形细胞壁和细胞膜的破坏细胞质的损耗等细胞形态的改变可能是由于姜酚直接作用于细胞膜的结果 DNA 损伤试验表明在试验设定浓度下姜酚对于微生物没有基因毒性, 姜酚的作用机制需要进一步研究关键词 : 姜酚 ; 抑菌 ; 生姜文章篇号 : (2015) DOI: /j.mfst Antibacterial Mechanism of Gingerols LIU Wei 1, ZHAO Jing 1, CHEN Dong 1, ZHOU Chun-li 1,2, LI Quan-hong 1 (1.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing , China) (2. School of Life Science, Jiangxi Science &Technology Normal University, Nanchang , China) Abstract: The antimicrobial potential of gingerols against six food-related bacteria was investigated in this study. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of gingerols against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Saccharomyces cereviseae, and Aspergillus niger ranged from 8.0 to 22.0 μg/ml, showing that gingerols could effectively inhibit the growth of all test bacterial pathogens. The time-kill assay demonstrated that the lag phase of S. aureus and S. dysenteriae were apparently delayed by the different concentrations of gingerols. Electron micrographs confirmed the effects of gingerols on the morphological and ultrastructural characteristics of S. aureus, S. dysenteriae, and A. niger. Electron micrographs revealed that gingerols induced morphological changes to the cell or mycelia, such as shrinkage, local deformation, damage to cell wall and membranes, and loss of cytoplasm. These morphological alterations might be due to the direct effect of gingerols on the cell membrane. DNA damage assay revealed that gingerols had no genotoxic effect on the microbes within the test concentration range, and the functional mechanism of gingerols needs to be explored by further studies. Key words: gingerols; antibacterial; ginger; 生姜 (Zingibe officinale. Roscoe) 通过溶剂萃取的方法可以得到姜油树脂, 相关研究表明姜油树脂的含量约占生姜的 5%~8%, 其中由姜酚组成的辛辣成分约占姜油树脂的 25%, 而 6-gingerol 是姜酚中含量最多 [1] 的成分张鲁明等发现通过超临界 CO 2 萃取的得到的姜油树对大肠杆菌沙门氏菌痢疾志贺杆菌苏门金杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用, 抑 [2] 菌最低质量浓度为 0.5~1.0 mg/ml Park 等研究了生姜的乙醇和正己烷提取物对可以引起牙周病的牙龈卟啉菌 (ATCC 53978), 牙髓卟啉单胞菌 (ATCC 35406) 收稿日期 : 基金项目 : 十二五科技支撑计划项目 (2011BAD23B01); 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项项目 ( ) 作者简介 : 刘伟 (1984-), 男, 博士, 研究方向 : 农产品贮藏及加工通讯作者 : 李全宏 (1966-), 男, 教授, 研究方向 : 农产品贮藏及加工和中间普氏菌 (ATCC 25611) 的抑制作用, 结果发现 10-gingerol 和 12-gingerol 在最低抑制浓度为 4~0 μg/ml 的条件下可以有效的抑制这些口腔病原菌, 在 [3] 6~30 μg/ml 的条件下可以致其死亡 Ficker 等发现 6-gingerol,8-gingerol,10-gingerol 是生姜中抗真菌的主要成分, 这些化合物在浓度小于 1 mg/ml 的条件下, 对白色念珠菌在内的 13 种人类病原细菌有抑制作用尽管国内外的研人员对生姜提取物 ( 生姜水提取姜油树脂姜油姜辣素或姜酚 ) 的抑菌功能展开了一些研究, 但是对于姜酚 (gingerols) 抑菌机制的深入研究很少, 而且不同的试验由于缺乏统一的标准而影响其科学价值和应用前景生姜提取物中最主要的功能成分为姜酚 [4], 为了更加准确而系统地研究姜酚的抗菌活性, 为其以后在食品中的实际应用打下基础, 本试验拟首先采用牛津 92

2 杯双层平板法和最低抑制浓度测定姜酚对一些常见细菌和真菌的抗菌效果, 然后采用生长曲线抑制细胞膜渗透性测定透射电子显微镜扫描扫描电子显微镜扫描等方法对金黄色葡萄球菌痢疾志贺氏菌和黑曲霉菌液的抑制机理进行深入研究 1 材料与方法 1.1 原料山东莱芜姜购自当美廉美地超市,D101 型大孔树脂均购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司试验目标微生物金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)( AS 1.89), 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)( AS ), 大肠杆菌 (Escherichia coli)( AS 1.90), 志贺氏菌 ( Shigella dysenteriae )( AS ), 酿酒酵母 (Saccharomyces cereviseae)( AS 2.430) 和黑曲霉 (Aspergillus niger)( AS ) 均购自中国科学院微生物研究所水解酪蛋白肉汤培养基 (MHB) 水解酪蛋白琼脂培养基 (MHA) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA) 马铃薯葡萄糖肉汤培养基 (PDB) 购自北京奥博星生物技术责任有限公司葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司, 吖啶橙 (AO) 染液溴乙锭 (EB) 染液刚果红染液购自美国 Sigma 公司, 细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 1.2 主要仪器设备激光共聚焦显微镜 (LSM710) 购自德国 Zeiss 公司 ; 扫描电镜 (Quanta 200) 购自捷克 FEI 公司 ; 透射电镜 (H-7650B) 购自日本日立公司 ; 荧光光度计 (Cary Eclipse) 购自美国 Varian 公司 ; 电导率仪 (EC 215) 购自美国 Hanna 公司 1.3 试验方法 [5] 姜酚制备采用 D101 型大孔树脂对姜油树脂提取液进行纯化, 上样液质量浓度 2 mg/ml, 流速 2 ml/min,3 BV 去离子水洗脱, 然后用体积分数为 80% 乙醇以 2 ml/min 的流速洗脱 4 BV 然后在 40 真空旋转蒸发除去姜酚溶液中的乙醇, 然后将其溶解于含有 1% 吐温 -80 的无菌水中, 配制成浓度为 50 mg/ml 的待测原液, 于 4 放置待用牛津杯双层平板扩散试验将预先配置并灭菌的 MHA 或 PDA 培养基加热融化, 无菌条件下向培养皿 (90 mm) 加入 10 ml, 待其充分冷却凝固后用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯 (φ mm) 置于培养基表面, 然后向平板倒入 5 ml 融化的培养基, 待培养基冷凝后, 用无菌镊子取出牛津杯取 50 μl 培养至对数生长期的供试细菌或酵母菌液, 用无菌涂布棒均匀的涂布于培养基的表面 ; 取保存于斜面的黑曲霉, 用接菌环粘取黑曲霉在 PDA 培养基表面划线培养取 50 μl 浓度为 100 μg/ml 姜酚溶液加入到相应的孔中, 以无菌的 1% 吐温 80 溶剂作为对照细菌在 37 恒温培养箱中培养 24 h, 酵母在 28 恒温培养箱中培养 48 h, 黑曲霉在 28 恒温培养箱中培养 96 h, 观察菌株的生长情况及有无抑菌圈, 并用游标卡尺测量抑菌圈直径最低抑制浓度 (MIC) 采用梯度稀释的方法测定姜酚对不同菌株的 MIC 值取 5 ml 的 MHB 或 PDB 培养基倒入试管中, 121 蒸气灭菌 20 min 冷却至室温后, 取不同体积的姜酚溶液加入到培养基中, 使其终浓度为 1~100 μg/ml 取 100 μl 对数期菌液加入溶有姜酚的培养基中在摇床中恒温培养, 细菌在 37 培养 24 h, 酿酒酵母和黑曲霉孢子在 28 培养 48 h 不含有菌液的培养基作为阴性对照 MIC 值定义为可以抑制微生物生长的最低浓度姜酚对微生物生长曲线抑制作用姜酚对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的生长曲线抑制作用的测定方法如下 : 将供试细菌培养至对数期, 按 2% 接种量加入到 MHB 培养基中, 根据实验结果中姜酚对于金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的 MIC 值确定姜酚的浓度, 以不加姜酚组作为对照经 r/min 摇床培养 24 h, 每隔 2 h 取 5 ml 菌液在波长为 600 nm 下用分光光度计测定其 OD 值以时间 (h) 为横坐标,OD 值为纵坐标, 绘制姜酚对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌抑制作用的生长曲线姜酚对黑曲霉的生长曲线抑制作用的测定通过测定黑曲霉菌丝的干重来计算取 2% 黑曲霉孢子接入 50 ml PDB 培养基中培养 48 h 作为供试菌液, 根据实验结果中的 MIC 值确定姜酚终浓度, 对照不加入姜酚溶液经 r/min 摇床培养 96 h, 每隔 12 h 取供试菌液在 r/min 下离心 10 min, 除去上清, 用无菌生理盐水洗涤两遍菌体后, 将菌丝置于不锈钢容器中,80 烘干至恒重测定菌丝的重量以时间 (h) 为横坐标, 菌丝干 (g) 重为纵坐标, 绘制姜酚对黑曲霉的抑制作用的生长曲线活菌计数法测定时间 - 杀菌曲线姜酚对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的时间 - 杀菌曲线的测定方法如下 : 将供试细菌培养至对数期, 93

89), 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)( AS 1.1849), 大肠杆菌 (Escherichia coli)( AS 1.90), 志贺氏菌 ( Shigella dysenteriae )( AS 1.1869 ), 酿酒酵母 (Saccharomyces cereviseae)( AS 2.

3 取一定量菌液接种于 MHB 培养基中使细菌浓度达到 10 8 CFU/mL 根据实验结果中姜酚对于金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的 MIC 值, 配置培养基中姜酚的浓度达到 1 MIC 或 2 MIC, 经 r/min 摇床培养 24 h, 每隔 2 h 取 1 ml 菌液进行梯度稀释, 用 MHA 培养基进行活菌计数, 对照组不添加姜酚以时间为横坐标, 各时间点测得的平均菌落数的对数值作为纵坐标, 绘制时间 - 抑菌曲线图细胞膜渗透性测定姜酚对微生物细胞膜的渗透性的通过相对电导率值进行测定将培养至对数期的金黄色葡萄球菌痢疾志贺氏菌和黑曲霉菌液分别在 r/min 下离心 10 min 去除上清液收集菌体, 将菌体用 5% 的葡萄糖溶液反复清洗, 直到其电导率接近 5% 的葡萄糖溶液, 从而获得等渗细胞根据实验结果中的 MIC 值配制向 50 ml 5% 的葡萄糖溶液中加入姜酚溶液, 测定其电导率并计为 L 1 将加入姜酚的 50 ml 等渗细胞溶液, 分别经孵育 6 h, 每隔 1 h 取测定溶液的电导率计为 L 2 等渗细胞溶液在沸水中加热 5 min 作为对照, 计为 L 0 通过下面公式计算相对电导率 : 相对电导率 (%)= 100 (L 2 -L 1 )/L 几丁质测定将培养至对数期的黑曲霉菌液, 按 2% 接种量加入到 PHB 培养基中, 根据实验结果中的 MIC 值, 配制培养基中姜酚的浓度达到 1 MIC 或 2 MIC, 对照组不添加姜酚,28 培养 48 h 后, 在 r/min 下离心 10 min, 除去上清, 将黑曲霉菌丝用 0.025% 刚果红染色黑暗中孵育 5 min 最后用蒸馏水清洗三次后, 通过荧光分光光度计测定菌丝激发波长为 540 nm, 发射波长为 560~900 nm 透射电子显微镜 (TEM) 检测将经过方法处理过的金黄色葡萄球菌痢疾志贺氏菌和处理过的黑曲霉菌液分别在 r/min 下离心 10 min, 去除上清液收集菌体菌体首先用含有 3% 戊二醛的 0.1 mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.2) 室温条件下固定 3 h 然后, 用 0.1 mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.2) 漂洗 3 次, 再用含有 1% 的四氧化锇的 0.1 mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.2) 室温条件下固定 1 h 用 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 丙酮, 顺序脱水各一次, 每次 60 min, 再用 100% 丙酮脱水 180 min 脱水后的样品嵌入到环氧树脂 812 中处理 h, 然后聚合到斯珀尔树脂中 ( 含有 1.50% 硬化剂 DMP-30 的环氧树脂 812) 处理 h 超薄切片机上切成约 50 nm 薄片用 1% 磷钨酸染色在 94 透射电镜上观察并采集图像扫描电子显微镜 (SEM) 检测将经过方法处理过的金黄色葡萄球菌痢疾志贺氏菌和处理过的黑曲霉菌液分别在 r/min 下离心 10 min, 去除上清液收集菌体首先用戊二醛固定, 然后用四氧化锇固定, 与 TEM 处理方法相同用 25% 50% 75% 75% 和 100% 乙醇, 顺序脱水各一次, 每次 10 min 以 50% 70% 90% 和 100% 乙酸异戊酯逐级取代乙醇, 每级置换 3 min 临界点干燥之后将样品用双面导电胶粘贴在样品台上, 离子溅射喷金, 厚度在 1 μm 左右处理完的样品可自加速电压 12 kv 下观察, 选择典型视野采集图像姜酚对细菌基因组 DNA 的影响将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌以 2% 接种至姜酚浓度分别为 10 μg/ml 20 μg/ml 50 μg/ml 100 μg/ml 的 MHA 培养基中, 对照组不加入姜酚, 经 r/min 摇床培养 24 h 在 r/min 下离心 10 min, 去除上清液收集菌体参照细菌基因组 DNA 提取试剂盒方法提取 DNA, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测激光共聚焦显微镜检测将 10 mg 吖啶橙 (AO) 和 10 mg 溴化乙啶 (EB) 溶解于 10 ml 磷酸盐缓冲溶液 (PBS,0.01 mol/l,ph 7.4) 中获得荧光染色溶液分别取培养至对数期生长期的金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌液 1.5 ml 在 r/min 下离心 10 min, 去除上清液收集菌体, 用 PBS 洗涤 3 遍菌体后重悬根据实验结果中的 MIC 值, 向菌液中加入姜酚使其终浓度为 MIC 2 MIC, 对照组未添加姜酚溶液, 作用 1 h 后, 取 100 μl 菌体悬浮液, 加入 AO/EB 混合荧光染料, 在室温下暗处孵育 15 min, 用 PBS 洗涤 2 次,10 μl 样品置于载玻片, 用盖玻片覆盖,AO/EB 荧光通过激光共聚焦显微镜 400 进行观察并采集图片数据分析所有试验均至少重复三次数据方差分析 (ANOVA) 采用 SPSS 17.0 软件数学模型拟合及绘图使用 Origin 8.5 软件 2 结果与讨论 2.1 牛津杯双层平板扩散试验通过牛津杯双层平板扩散试验得到姜酚对大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌痢疾志贺氏菌酿酒酵母和黑曲霉的抑菌圈效果如图 1 所示姜酚对

以时间为横坐标, 各时间点测得的平均菌落数的对数值作为纵坐标, 绘制时间 - 抑菌曲线图 1.3.

4 6 种微生物的抑菌圈直径和最低抑制浓度如表 1 所示由表 1 的结果表明姜酚对 6 种微生物均有较强的抑制作用抑菌圈的大小一方面受到抑菌成分的影响, 另一方面还受到溶剂扩散的速度的影响因此, 牛津杯双层平板扩散试验只能定性判断姜酚溶液有无抑菌效果菌的繁殖图 1 姜酚对不同微生物的抑制作用 Fig.1 Inhibitory activity of gingerols against different microbes 表 1 姜酚对不同微生物的抑菌圈直径和最低抑制浓度 Table 1 Inhibitory zone diameters and MICs of gingerols against different microbes 抑菌圈直径 MIC 菌种 /mm /(μg/ml) 金黄色葡萄球菌 S. aureus ± ±0.8 图 2 姜酚对金黄色葡萄球菌 (a) 和痢疾志贺氏菌 (b) 的生长曲线抑制作用 Fig.2 Inhibitory effect of gingerols on the growth curves of S. aureus (a) and S. dysenteriae (b) 枯草芽孢杆菌 B. subtilis ± ±1.4 大肠杆菌 E. coli ± ±1.8 痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae ± ±1.2 酿酒酵母 S.cereviseae ± ±2.6 黑曲霉 A. niger 9.41 ± ±3.2 通过最低抑制浓度实验表明姜酚溶液对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的抑制作用最强, 枯草芽孢杆菌和大肠杆菌次之, 对酿酒酵母和黑曲霉的抑制作用 [1] 相对最弱张鲁明等采用滤纸片法发现通过丙酮溶解的姜油树脂对苏云金杆菌痢疾志贺菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌沙门氏菌均有一定的抑制作用, 抑制效果为苏云金杆菌 > 痢疾志贺菌 > 金黄色葡萄球菌 > 大肠杆菌 > 沙门氏菌, 最低抑制浓度分别为 mg/ml 2.2 姜酚对微生物生长曲线抑制作用姜酚对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的生长曲线抑制作用如图 2 所示, 对照组中的两种细菌分别经过短暂的迟滞期后进入快速生长的对数期, 然后分别经过 10 h 和 8 h 后进入稳定期当培养基中姜酚的浓度达到 MIC 值时, 两种细菌的 OD 值都几乎没有改变, 表明姜酚可以有效抑制金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏图 3 姜酚对黑曲霉菌的生长曲线抑制作用 Fig.3 Inhibitory effect of gingerols on the growth curve of A. niger 姜酚对黑曲霉菌的生长曲线抑制作用如图 3 所示对照组经过 36 h 快速繁殖后进入稳定期,36 h 到 96 h 黑曲霉菌丝生物量基本保持稳定当培养基中姜酚的浓度达到 MIC 值时, 黑曲霉菌丝的干重在 36 h 之前与对照的增加的趋势相一致, 然后突然减少,60 h 后进入稳定的阶段, 表明姜酚影响了黑曲霉菌丝的繁殖 2.3 活菌计数法测定时间 - 抑菌曲线 95

1 Inhibitory activity of gingerols against different microbes 表 1 姜酚对不同微生物的抑菌圈直径和最低抑制浓度 Table 1 Inhibitory zone diameters and MICs of gingerols against different microbes 抑菌圈直

5 呈现荧光深浅不一的结构样特征因此, 可以根据荧光发射和细胞核染色的形态学特征对不同状态的细胞进行区分具有统一的绿色细胞核和有序的结构可以被认定为正常的细胞, 其具有完整的膜结构 ; 具有统一的橘红色到红色的细胞核并具有橘红色的结构可以被认定为凋亡的细胞, 细胞膜遭到破坏 [6] 图 5 痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌受到不同浓度姜酚作用图 4 活菌计数法测定姜酚对金黄色葡萄球菌 (a) 和痢疾志贺氏菌 (b) 的时间 - 杀菌曲线 Fig.4 Time-kill curves of gingerols against S. aureus A and S. dysenteriae B obtained using the plate counting technique 通过活菌计数法测定姜酚对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的时间 - 杀菌曲线如图 4 所示对照组中金黄色葡萄球菌经过 12 h 培养后增加了 2.9 个对数值 ; 当培养基中姜酚的浓度达到 MIC 值时, 活菌数量经过 12 h 缓慢的增加了 1.1 个对数值, 说明在该浓度下姜酚没有完全抑制细菌的生长, 但是延长了其延滞期当培养基中姜酚的浓度达到 2 倍 MIC 值时, 活菌数量经过 24 h 降低了 0.28 个对数值对照组中痢疾志贺氏菌经过 24 h 培养后增加了 1.75 个对数值 ; 当培养基中姜酚的浓度达到 MIC 值时, 活菌数量经过 24 h 降低了 1.19 对数值, 减少了 19.67%; 当培养基中姜酚的浓度达到 2 倍 MIC 值时, 活菌数量经过 24 h 降低了 4.89 对数值, 减少了 80.83% 结果表明姜酚的浓度和作用时间对于细菌的抑制作用都有影响 2.4 激光共聚焦显微镜检测结果分析痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌受到不同浓度姜酚作用后经过的 AO&EO 荧光染色的荧光显微图如图 5 所示吖啶橙 (AO) 能透过胞膜完整的细胞, 嵌入细胞核 DNA, 使之发出明亮的绿色荧光溴乙锭 (EB) 仅能透过胞膜受损的细胞, 嵌入核 DNA, 发橘红色荧光凋亡的细胞呈现为染色增强, 荧光更为明亮, 均匀一致的圆状或固缩状团块状结构非凋亡细胞核的荧光显微图 Fig.5 Fluorescence micrographs of S. dysenteriae and S. aureus after treatment with different concentrations of gingerols 表 2 荧光染色法测定不同浓度姜酚对痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用 Table 2 Inhibitory effect of different concentrations of gingerols on S. aureus A and S. dysenteriae B detected by fluorescence staining 姜酚痢疾志贺氏菌金黄色葡萄球菌浓度凋亡细胞个数 % 凋亡细胞个数 % 对照 13 ± ± MIC 78 ± ± MIC 114 ± ± 在荧光显微镜下观察结果如图所示, 根据颜色特征进行计数如表 2 所示对照组中痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌绝大部分细胞均发出明亮的绿光 ; 经过 1 倍 MIC 浓度姜酚处理后, 标记为橘红色荧光的细胞比例达到 60.65% 和 15.34% 部分呈现黄色荧光可能是细胞膜受损程度较低,EB 仅能部分取代 AO 与 DNA 结合, 于是部分细胞同时发出红色和绿色荧光, 并因两种染料的结合量和相对荧光强度的不同呈现出中间状态的黄色经过 2 倍 MIC 浓度姜酚处理后, 标记为红色和橘红色荧光的细胞比例升高至 85.62% 和 69.21% 结果表明痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌经过姜酚作用后, 大部分的细胞膜遭到破坏, 进而发生凋亡 96

4 Time-kill curves of gingerols against S. aureus A and S.

6 2.5 SEM 结果分析图 6 金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌受到姜酚作用 24 h 的 SEM 图 Fig.6 SEM images of S. aureus and S. dysenteriae treated with gingerols for 24 h 金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌受到浓度达到 MIC 值的姜酚作用 24 h 后的 SEM 图如图 6 所示从图中可以看到, 金黄色葡萄球菌经过姜酚的作用后, 其形态与对照组相比较有明显的改变未经过姜酚作用的金黄色葡萄球菌保持完整的细胞结构, 形态饱满, 具有光滑的表面 ; 而经过姜酚处理 24 h 后, 部分菌体的形态发生改变, 细胞表明有不规则的突起, 在细胞周围有很多碎片, 表明姜酚可以破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁的通透性和完整性化合物, 通过扫描电镜发现活性成分可以通过破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁, 抑制其繁殖一般来讲, 酚类化合物的抑菌作用主要通过在细胞膜聚集, 破坏结构组织, 引起通透性的增加, 导致细胞内部组分的泄漏, 或与蛋白质的非特异性结合破坏微生物酶系统, 导致细胞的死亡 [8] 对照组中的痢疾志贺氏菌为典型的棒状长杆型, 经过姜酚处理 24 h 后菌体呈现为球形或短杆型, 表明姜酚可以影响痢疾志贺氏菌细胞的分裂黑曲霉菌丝受到不同浓度姜酚作用 24 h 后的 SEM 图如图 7 所示 A 为对照组 (5000 ), 黑曲霉菌丝形态饱满, 具有典型的锥形结构和光滑的表面 B 为经过 1 倍 MIC 浓度姜酚作用 48 h 后黑曲霉菌丝形态 (5000 ), 可以观察到黑曲霉菌丝的形态发生一致的变化, 菌丝的结构发生收缩变形, 表面变得粗糙, 有明显的褶皱 C 为经过 2 倍 MIC 浓度姜酚作用 48 h 后黑曲霉菌丝形态 (2000 ), D 同样是经过 2 倍 MIC 浓度姜酚作用 48 h 后黑曲霉菌丝形态 (5000 ), 可以发现黑曲霉菌丝发生进一步形态的变化, 变为干瘪的条状形态黑曲霉菌丝发生的逐步的形态变化, 可以归结为姜酚使菌丝体中细胞质的流失造成的结果 [9] Plodpai 等发现 125 μg/ml 假鹰爪 (Desmos chinensis) 提取物可以改变立枯丝核 (Rhizoctonia solani) 菌丝的形态, 使其变得粗糙并产生颗粒 [10] Rittiwong 等发现高浓度的苯甲酸酯衍生物和双黄酮可以通过改变细胞膜的通透性而影响真菌的结构形态 2.6 TEM 结果分析图 7 黑曲霉菌丝受到姜酚作用 48 h 的 SEM 图 Fig.7 SEM images of A. niger hyphae treated with gingerols for 48 h 注 :A:Control B:MIC C:2 MIC D: 2 MIC [7] Shan 等研究了虎杖根提取物的抑菌功能, 通过 LC-MS 测定其主要成分为芪类化合物和羟基蒽醌类图 8 金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌受到姜酚作用 24 h 的 TEM 图 Fig.8 TEM images of S. aureus and S. dysenteriae treated with gingerols for 24 h 痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌受到姜酚作用 97

改变未经过姜酚作用的金黄色葡萄球菌保持完整的细胞结构, 形态饱满, 具有光滑的表面 ; 而经过姜酚处理 24 h 后, 部分菌体的形态发生改变, 细胞表明有不规则的突起, 在细胞周围有很多碎片, 表明姜酚可以破坏金黄色葡萄球菌的

7 24 h 的 TEM 图如图 8 所示对照组中金黄色葡萄球菌保持正常的形态, 细胞壁细胞膜结构完整, 胞壁和胞膜结合紧密, 细胞质中电子密度比较均匀经过姜酚作用 24 h 的金黄色葡萄球菌的形态与对照组相比较有明显的改变, 细胞壁遭到破坏, 发生细胞溶解, 细胞内部产生空腔, 说明经历了细胞降解细胞质从细胞内部向周围环境释放的过程对照组中的痢疾志贺氏菌呈现长棒状的形态, 而且其正处于分裂的状态, 细胞壁细胞膜结构完整, 细胞质细胞器完整的存在于细胞中 ; 而经过姜酚处理 24 h 的痢疾志贺氏菌呈现短杆的形态, 发生质壁分离, 在破坏的细胞周围散布着细胞碎片细胞内含有少量细胞器, 但是细胞质大量损失,TEM 结果与 SEM 结果相一致 [11] Zeng 等研究了鼠曲草精油的抑菌功能, 通过 GC-MS 分析其主要成分为丁子香酚 (18.24) 芳樟醇 (10.62%) 石竹烯 (8.86%) 等, 通过透射电镜发现精油可以使枯草芽孢杆菌细胞发生溶解, 导致细胞内部组分泄露到周围的环境环境中网和线粒体溶解, 导致大量空泡的形成, 从而抑制黑曲霉菌丝的繁殖 2.7 电导率测定图 9 黑曲霉菌丝受到姜酚作用 48 h 的 TEM 图 Fig.9 TEM images of A. niger hyphae treated with gingerols for 48 h 注 :A:Control B:MIC C:2 MIC D: 2 MIC 黑曲霉菌丝受到不同浓度姜酚作用 48 h 的 TEM 图如图 9 所示对照组中黑曲霉菌丝横切面图中的细胞壁均一完整, 由完整的纤维层包裹细胞质膜与细胞壁附着紧密细胞质内部的主要的细胞器如 : 细胞核线粒体囊泡等都呈现正常的状态经过 1 倍 MIC 浓度姜酚作用 48 h 后, 黑曲霉菌丝纵切面图中显示菌丝体内部的形态发生改变, 细胞质膜与细胞壁逐渐分离, 可能是细胞质部分降解, 使得空泡面积增大经过 2 倍 MIC 浓度姜酚作用 48 h 后, 菌丝细胞的外部形态发生收缩, 细胞壁失去完整性, 但是没有完全的分解菌丝内部细胞质和细胞器包括细胞核内质图 10 痢疾志贺氏菌金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌生长过程中受到姜酚作用的相对电导率 Fig.10 Relative electrical conductivity during the growth of S. dysenteriae, S. aureus, and A. niger in the presence of gingerols 痢疾志贺氏菌金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌生长过程中受到姜酚作用的相对电导率如图 10 所示细胞膜通透性的改变直接影响电导率的测定结果, 因此通过电导率的测定可以反映姜酚对于微生物的细胞膜通透性的影响与对照组相比, 三种供试微生物在 MIC 浓度姜酚的作用 6 h 后的相对电导率都有显著的增加, 其中金黄色葡萄球菌的相对电导率最高达到 18.1%, 而黑曲霉的的相对电导率最低为 1.12% 试验表明痢疾志贺氏菌金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌生长过程中的微生物膜的细胞膜受到姜酚的作用 98

中 ; 而经过姜酚处理 24 h 的痢疾志贺氏菌呈现短杆的形态, 发生质壁分离, 在破坏的细胞周围散布着细胞碎片细胞内含有少量细胞器, 但是细胞质大量损失,TEM 结果与 SEM 结果相一致 [11] Zeng 等研究了鼠曲草精油的抑菌功能, 通

8 都逐渐增加, 可能导致细胞内组分的泄漏, 例如 K + Ca 2+ Na + 等 [12] 2.8 几丁质含量测定 dysenteriae 酿酒酵母 S.cereviseae 黑曲霉 A. niger 均有较强的抑制作用最低抑制浓度试验表明姜酚溶液对痢疾志贺氏菌的抑制作用最强,MIC 为 8 μg/ml, 对黑曲霉的抑制作用相对最弱,MIC 为 22 μg/ml 根据试验结果, 建议食品中姜酚的用量至少达到 50 μg/ml 可以保证其抑菌的效果图 11 分光光度法测定黑曲霉菌丝受到姜酚作用 48 h 几丁质含量变化 Fig.11 Spectrophotometric profiles of chitin in A. niger hyphae treated with gingerols for 48 h 分光光度法测定黑曲霉菌丝受到姜酚作用 48 h 几丁质含量变化如图 11 所示刚果红可以同多糖类化合物 ( 如纤维素 ) 合成红色复合物, 在特定波长处具有吸收值, 却不与纤维素水解后产物发生反应几丁质为 N- 乙酰葡糖胺通过 β 连接聚合而成的结构同多糖, 是黑曲霉菌丝体细胞壁的主要组成成分因此, 可以通过该方法测定黑曲霉菌丝中几丁质含量的变化与对照组相比较, 黑曲霉菌丝受到 MIC 2 MIC 浓度姜酚作用 48 h 后, 通过比较 608 nm 波长吸收值的变化, 发现几丁质的含量分别减少了 22.86% 和 42.41% 结果说明姜酚使黑曲霉菌丝的通透性增强, 使细 [13] 胞壁遭到破坏, 从而减少了几丁质的含量 Wu 等发现多甲氧基黄酮可以破坏黑曲霉细胞壁的通透性, 一方面使黑曲霉的几丁质含量减少, 另一方面通过电导率的测定说明其通透性增强 2.9 姜酚对细菌 DNA 基因组的影响姜酚对痢疾志贺氏菌金黄色葡萄球菌的 DNA 损伤试验如图 12 所示超过 MIC 值的不同浓度姜酚对两种细菌的 DNA 基因组的电泳条带与对照组比较没有明显差异结果表明姜酚没有对细菌的 DNA 基因组造成破坏, 所以姜酚对微生物的细胞壁细胞膜的破坏作用是抑制其繁殖的主要原因 3 结论 3.1 姜酚对金黄色葡萄球菌 S. aureus 枯草芽孢杆菌 B. subtilis 大肠杆菌 E. coli 痢疾志贺氏菌 S. 图 12 姜酚对痢疾志贺氏菌金黄色葡萄球菌的 DNA 损伤试验 Fig.12 DNA damage assay of S. dysenteriae and S. aureus treated with gingerols 注 :1:Marker DL 15000;2:0 μg/ml;3:20 μg/ml;4: 40 μg/ml;5:60 μg/ml;6:100 μg/ml 3.2 姜酚可以破坏金黄色葡萄球菌 S. aureus 的细胞壁的通透性和完整性, 使细胞发生溶解, 产生空腔姜酚可以可以影响痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae 细胞的分裂, 使细胞发生质壁分离但是姜酚对细菌的 DNA 基因组没有影响 3.3 姜酚可以使黑曲霉菌丝的结构发生收缩变形, 表面变得粗糙, 甚至变为干瘪的条状形态, 使菌丝内部细胞质和细胞器包括细胞核内质网和线粒体溶解, 导致大量空泡的形成, 从而抑制黑曲霉菌丝的繁殖, 同时降低几丁质的含量参考文献 [1] 张鲁明, 王龙厚, 陈雪香, 等. 姜油树脂的超临界 CO 2 萃取条件及其抑菌活性 [J]. 作物研究,2011,25(2): ZHANG Lu-ming, WANG Long-hou, CHEN Xue-xiang, et al. Ginger oleoresins extraction with sfe-co 2 and its antimicrobial activity [J]. Crop Research, 2011, 25(2): [2] Park M, Bae J, Lee DS, et al. Antibacterial activity of [10]-gingerol and [12]-gingerol isolated from ginger rhizome against periodontal bacteria [J]. Phytotherapy Research, 2008, 22(11): [3] Ficker C, Smith ML, Akpagana K, et al. Bioassay-guided isolation and identification of antifungal compounds from 99

的效果图 11 分光光度法测定黑曲霉菌丝受到姜酚作用 48 h 几丁质含量变化 Fig.11 Spectrophotometric profiles of chitin in A.

9 ginger [J]. Phytotherapy Research, 2003, 17(8): Polyphenols on the Ability of Fungi to Produce Lovastatin. [4] Nagendra KL, Manasa D, Srinivas P, et al. Enzyme-assisted Modern Food Science and Technology, 2014, 30(2): extraction of bioactive compounds from ginger (Zingiber [9] Plodpai P, Chuenchitt S, Petcharat V, et al. Anti-rhizoctonia officinale Roscoe) [J]. Food Chemistry, 2013, 139(1-4): solani activity by Desmos chinensis extracts and its mechanism of action [J]. Crop Protection, 2013, 43: [5] 刘伟, 周春丽, 赵婧, 等. 大孔吸附树脂纯化生姜提取物中 6- [10] Rittiwong T, Mutarapat T, Ponglimanont C, et al. Saiyutones 姜酚工艺优化. 农业机械学报,2014,45(6): A-D: four new unusual biflavones from Desmos chinensis [J]. LIU Wei, ZHOU Chun-li, ZHAO Jing, et al. Purification of Tetrahedron, 2011, 67(30): gingerol from Oleoresin with Macroprous Resin [J]. [11] Zeng WC, Zhu RX, Jia LR, et al. Chemical composition, Transactions of the Chinese Society for Agricultural antimicrobial and antioxidant activities of essential oil from Machinery, 2014, 45(6): Gnaphlium affine [J]. Food and Chemical Toxicology, 2011, [6] Mei L, Lu Z, Zhang W, et al. Bioconjugated nanoparticles for 49(6): attachment and penetration into pathogenic bacteria [J]. [12] Diao WR, Hu QP, Zhang H, et al. Chemical composition, Biomaterials, 2013, 34(38): antibacterial activity and mechanism of action of essential oil [7] Shan B, Cai YZ, Brooks JD, et al. Antibacterial properties of from seeds of fennel (Foeniculum vulgare Mill.) [J]. Food Polygonum cuspidatum roots and their major bioactive Control, 2014, 35(1): constituents [J]. Food Chemistry, 2008, 109(3): [13] Wu T, Cheng D, He M, et al. Antifungal action and inhibitory [8] 赵振军, 刘勤晋, 黎星辉. 茶多酚对真菌合成洛伐他汀能力 mechanism of polymethoxylated flavones from Citrus 的影响 [J]. 现代食品科技,2014,30(2): reticulata Blanco peel against Aspergillus niger [J]. Food ZHAO Zhen-jun, LIU Qin-jin, LI Xing-hui. Effect of Tea Control, (1):

Anti-rhizoctonia officinale Roscoe) [J]. Food Chemistry, 2013, 139(1-4): solani activity by Desmos chinensis extracts and its 509-514 mechanism of action [J].

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说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基内部资料东北师范大教运行基本状态据报告 2015 年春季期教务处 2015 年 10 月 27 日说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度,

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