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1 利 用 饋 料 醱 酵 生 產 納 豆 激 酶 之 研 究 Production of Nattokinase by Fed-batch Fermentation 研 究 生 : 范 瓊 藝 (Chiung-Yi Fan) 指 導 教 授 : 段 國 仁 (Prof. Kow-Jen Duan) 大 同 大 學 生 物 工 程 研 究 所 碩 士 論 文 Thesis for Master of Science Department of Bioengieering Tatung University 中 華 民 國 九 十 五 年 七 月 July 2006

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3 謝 致 本 論 文 感 謝 恩 師 段 國 仁 教 授 悉 心 指 導 與 教 誨, 無 論 在 學 業 待 人 處 事 上 的 提 點, 都 令 學 生 受 益 良 多, 且 對 於 論 文 的 撰 寫 更 是 詳 加 校 閱, 使 本 論 文 得 以 順 利 完 成, 對 學 生 付 出 的 ㄧ 切, 學 生 心 裡 由 衷 感 激, 謹 此 致 上 最 深 摯 的 敬 意 此 外 在 論 文 發 表 時 承 蒙 王 鐘 毅 博 士 及 長 庚 大 學 蔡 少 偉 教 授, 對 本 論 文 的 指 正 與 賜 教, 並 賜 與 諸 多 寶 貴 意 見, 使 論 文 更 加 完 善, 在 此 致 上 無 限 謝 意 研 究 期 間, 更 感 謝 實 驗 室 學 長 - 洲 獎 芢 葦 清 安 世 佑 金 煌 學 長 們 的 指 導 ; 郁 沛 田 甜 淑 玲 阿 德 同 學 以 及 學 弟 建 男 其 宗 的 幫 助 與 鼓 勵, 有 大 家 的 幫 助 及 照 顧, 使 得 我 在 實 驗 過 程 中 能 順 利 且 開 心 的 度 過 研 究 生 活, 使 我 得 以 完 成 本 實 驗 最 後, 謹 將 此 論 文 獻 給 一 直 以 來 在 背 後 默 默 支 持 我 的 父 母 姐 妹 們 及 關 心 我 的 朋 友, 感 謝 他 們 的 支 持 與 鼓 勵, 願 你 們 與 我 ㄧ 起 分 享 這 份 得 之 不 易 的 榮 譽 與 喜 悅 I

4 中 文 摘 要 從 市 售 納 豆 健 康 食 品 中 分 離 篩 選 出 可 生 產 納 豆 激 酶 ( Nattokinase ) 的 菌 株 A, 藉 由 液 態 搖 瓶 培 養 生 產 納 豆 激 酶, 其 最 適 條 件 以 3% 黃 豆 粉 3% 葡 萄 糖, 並 額 外 添 加 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 和 0.1% MgSO 4 7H 2 O 為 培 養 基, 在 溫 度 rpm 的 條 件 下 進 行 培 養, 經 醱 酵 培 養 48 小 時 之 後 得 到 酵 素 最 佳 活 性 值 27 U/mL 批 次 醱 酵 試 驗 結 果 指 出, 接 種 10% 的 種 菌 液, 以 1 vvm 之 通 氣 量, 配 合 300 rpm 的 攪 拌 速 度, 於 37 下 進 行 放 大 培 養, 結 果 指 出 菌 株 A 於 培 養 第 42 小 時 出 現 最 佳 之 酵 素 活 性 ( 81.3 U/mL ) 饋 料 批 次 醱 酵 分 為 兩 階 段, 第 一 階 段 以 葡 萄 糖 為 主, 目 的 是 要 提 高 細 胞 濃 度, 接 著 以 黃 豆 粉 為 氮 源 以 及 酵 素 生 產 的 誘 導 劑, 在 醱 酵 培 養 第 48 小 時 出 現 最 佳 之 酵 素 活 性 ( 330 U/mL ) 在 酵 素 的 ph 穩 定 性 及 溫 度 穩 定 性 實 驗 中, 粗 酵 素 液 之 最 穩 定 的 ph 值 在 6.0~7.0, 將 粗 酵 素 一 保 存 在 4,1 個 月 後, 仍 可 維 持 65% 的 活 性 II

5 Abstract We isolate a strain A from natto purchased from the local market. It was employed for the production of nattokinase by shaking culture at 180 rpm and 37 C. The optimum medium for the shaking culture was (g/l) : 3% soybean flour, 3% glucose, 0.5% CaCO 3, 0.5% KH 2 PO 4, 0.1% MgSO 4.7 H 2 O. The nattokinase activity of 27 unit/ml was achieved after 48 h shaking culture. The batch fermentation was performed using the same medium as the shaking culture at 300 rpm, 1 vvm of aeration, 37 C unit/ml of nattokinase activity was achieved after 42 h cultivation. Fed-batch fermentation was initialized by using the batch fermentation. Various concentrations of glucose, yeast extract and soybean flour were employed to formulate the feeding medium. 330 unit/ml nattokinase was achieved after 48 h cultivation for the fed-batch fermentation. The crude enzyme was stable at ph 6~7, and 65 % activity retained for the crude enzyme stored at 4 C for 1 month. III

6 目 錄 致 謝.....I 中 文 摘 要.....II Abstract...III 目 錄.....IV 圖 目 錄....VIII 表 目 錄......IX 第 一 章 前 言....1 第 二 章 文 獻 回 顧 地 方 性 醱 酵 食 品 多 功 能 保 健 食 品 - 納 豆 納 豆 的 起 源 納 豆 菌 的 命 名 食 用 納 豆 之 益 處 納 豆 含 有 豐 富 的 營 養 物 質 具 有 降 低 血 壓 減 少 膽 固 醇 的 作 用 納 豆 菌 的 特 殊 分 子 結 構 溶 解 血 栓 的 功 用 預 防 骨 質 疏 鬆 對 預 防 老 年 癡 呆 症 及 養 顏 美 容 亦 有 成 效...13 IV

7 2.5.7 改 善 便 秘 預 防 糖 尿 病 抗 癌 對 Escherichia coli O-157 之 抗 菌 功 效 對 皮 膚 之 影 響 - 保 濕 美 白 抗 老 化 納 豆 激 酶 (Nattokinase) 血 栓 溶 解 酵 素 - 納 豆 激 酶 含 有 血 栓 溶 解 酵 素 之 醱 酵 產 品 納 豆 醱 酵 條 件 27 第 三 章 材 料 與 方 法 實 驗 材 料 菌 種 培 養 基 藥 品 儀 器 設 備 實 驗 方 法 篩 菌 菌 種 的 保 存 及 活 化 液 體 醱 酵 培 養 基 不 同 培 養 基 濃 度 對 酵 素 生 產 之 影 響 V

8 3.3.5 批 次 醱 酵 培 養 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 分 析 方 法 酵 素 活 性 測 定 酵 素 特 性 探 討 酵 素 之 ph 穩 定 性 探 討 粗 酵 素 液 在 熱 處 理 24 小 時 後 的 相 對 活 性 酵 素 之 熱 穩 定 性 酵 素 貯 存 之 安 定 性.. 40 第 四 章 結 果 與 討 論 種 菌 篩 選 培 養 基 不 同 培 養 基 濃 度 對 酵 素 生 產 之 影 響 批 次 醱 酵 培 養 饋 料 批 次 醱 酵 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 I 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 II 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 III 酵 素 特 性 探 討 酵 素 之 ph 穩 定 性 探 討.. 55 VI

9 4.5.2 酵 素 之 熱 穩 定 性 酵 素 貯 存 之 安 定 性 59 第 五 章 結 論 第 六 章 參 考 文 獻.. 62 VII

10 圖 目 錄 圖 2.1 攝 取 血 栓 溶 解 酵 素 之 後, 對 人 體 血 壓 所 產 生 的 效 果.10 圖 2.2 對 於 病 原 性 大 腸 菌 O-157, 納 豆 所 產 生 的 發 育 阻 礙 作 用 圖 2.3 納 豆 激 酶 之 結 構...19 圖 2.4 納 豆 激 酶 在 血 栓 溶 解 系 統 中 之 直 接 與 間 接 作 用 圖 2.5 血 栓 溶 解 酵 素 在 血 栓 平 板 上 作 用 之 情 形. 25 圖 4.1 納 豆 激 酶 在 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph DO 及 總 菌 數 的 變 化 情 形 圖 4.2 納 豆 激 酶 在 饋 料 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph 值 DO 及 總 菌 數 的 變 化 形 圖 4.3 納 豆 激 酶 在 饋 料 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph DO 及 總 菌 數 的 變 化 情 形 圖 4.4 納 豆 激 酶 在 饋 料 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph DO 及 總 菌 數 的 變 化 情 形 圖 4.5 酵 素 之 ph 穩 定 性...56 圖 4.6 酵 素 之 熱 穩 定 性 圖 4.7 酵 素 貯 存 之 安 定 性 VIII

11 表 目 錄 表 4.1 固 定 單 一 種 培 養 基 對 不 同 菌 株 的 活 性 測 試.. 41 表 4.2 不 同 培 養 基 濃 度 對 酵 素 生 產 之 影 響..42 IX

12 第 一 章 前 言 近 年 來, 慢 性 疾 病 已 經 超 過 急 性 傳 染, 成 為 國 人 健 康 最 大 的 殺 手 引 起 慢 性 疾 病 的 原 因 很 多, 飲 食 是 其 中 重 要 的 因 素 之 一, 均 衡 的 飲 食 可 以 促 進 健 康, 飲 食 不 當 卻 是 各 種 慢 性 病 的 來 源 長 期 以 來 國 人 因 為 營 養 過 剩, 飲 食 習 慣 趨 向 於 西 式 飲 食, 因 此, 像 肥 胖 症 糖 尿 病 及 心 血 管 疾 病 等 慢 性 疾 病 的 罹 患 率, 都 逐 年 增 加 中 年 以 後 各 種 生 理 機 能 逐 漸 衰 退, 各 種 慢 性 疾 病 逐 漸 出 現, 所 謂 預 防 勝 於 治 療, 為 了 維 持 正 常 的 生 理 機 能, 預 防 慢 性 疾 病, 日 常 飲 食 保 健 更 為 重 要 在 日 本, 納 豆 是 1000 年 以 上 的 養 生 食 品, 至 今 沒 有 發 現 副 作 用, 故 是 一 種 安 全 的 醱 酵 食 品 納 豆 中 所 含 的 納 豆 激 酶 (nattokinase, NK ) 具 有 很 強 的 血 纖 維 蛋 白 (fibrin) 溶 解 能 力 它 主 要 是 利 用 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 的 類 緣 菌, 俗 稱 納 豆 菌, 以 大 豆 原 料 進 行 醱 酵 生 成 的 一 種 蛋 白 質, 它 最 重 要 的 功 能 則 是 在 於 它 是 可 以 分 解 不 溶 性 血 纖 維 蛋 白 質 的 酵 素, 因 此 可 以 減 低 不 溶 性 血 纖 維 蛋 白 在 血 管 中 的 存 在, 進 而 減 低 血 栓 症 的 發 生 納 豆 激 酶 是 屬 於 一 種 絲 胺 酸 蛋 白 酶 (serine protease), 可 運 用 於 血 栓 症 中 風 等 心 血 管 疾 病 的 預 防 及 治 療 1

13 1986 年 時 日 本 生 理 學 教 授 須 見 洋 行 博 士 曾 將 腦 血 栓 患 者 常 服 用 的 溶 血 栓 藥 物 放 在 一 定 份 量 的 人 造 血 栓 上, 結 果 耗 費 一 個 晚 上 的 時 間 才 能 完 全 溶 解, 而 以 同 樣 方 法 換 上 一 粒 納 豆 菌 食 品 則 只 需 3 小 時 便 可 完 成 這 項 實 驗 讓 納 豆 菌 引 起 國 際 的 重 視 並 深 入 的 研 究 其 製 法 乃 是 將 納 豆 枯 草 菌 -Bacillus subtilis var. natto 接 種 於 蒸 熟 之 大 豆 中, 再 以 稻 草 包 覆, 進 而 保 持 一 定 溫 度 促 使 納 豆 菌 大 量 繁 殖 並 充 分 醱 酵 所 製 成, 成 品 外 表 黏 稠 但 風 味 獨 特 納 豆 具 有 預 防 與 治 療 心 臟 血 管 疾 病 的 功 效, 主 要 是 在 經 過 微 生 物 醱 酵 後 所 附 在 大 豆 表 面 的 黏 性 物 質 中 所 含 之 納 豆 激 酶 的 緣 故, 許 多 學 者 研 究 結 果 亦 指 出 納 豆 激 酶 具 有 提 高 血 漿 中 血 纖 維 蛋 白 水 解 活 性, 且 可 直 接 水 解 血 纖 維 蛋 白 在 納 豆 菌 之 相 關 報 告 中, 對 納 豆 菌 的 醱 酵 培 養 大 多 以 固 態 醱 酵 來 進 行, 但 此 一 方 法 較 不 經 濟, 且 容 易 受 雜 菌 污 染, 因 此 本 研 究 擬 以 液 態 培 養 的 方 式 來 進 行 納 豆 菌 的 培 養, 且 利 用 醱 酵 槽 進 行 擴 大 培 養, 以 提 高 納 豆 激 酶 的 產 量 2

14 第 二 章 文 獻 回 顧 血 栓 症 是 為 血 管 內 血 液 凝 固, 形 成 不 溶 性 血 纖 維 蛋 白 之 ㄧ 種 病 症 當 血 管 受 到 活 性 氧 等 因 素 的 損 傷 ( 如 : 出 血 ), 身 體 就 會 反 應 而 產 生 血 纖 維 蛋 白 原 及 凝 血 酵 素 成 為 血 纖 維 蛋 白 ( 及 血 栓 ) 來 抵 禦, 等 到 止 血 後, 人 體 則 會 產 生 纖 維 蛋 白 溶 解 酵 素 來 使 血 栓 溶 解 所 以 血 栓 原 本 就 經 常 在 人 體 中 形 成 與 分 解, 但 隨 著 年 齡 的 增 長 及 長 期 壓 力 及 緊 張 的 影 響 下, 血 栓 的 形 成 會 加 快, 分 解 會 變 慢 血 栓 累 積 後 即 轉 化 成 一 種 不 溶 性 蛋 白 質 的 蛋 白 纖 維 進 而 在 血 管 中 阻 塞 而 引 起 心 血 管 方 面 疾 病 例 如 : 中 風 中 風 原 因 可 能 是 : 血 栓 形 成 ; 腦 或 頸 動 脈 逐 漸 變 窄 並 最 終 阻 塞, 通 常 由 膽 固 醇 和 脂 肪 澱 粉 物 慢 慢 堆 積 所 致, 大 約 有 60% 的 中 風 由 血 栓 形 成 引 起 ; 另 一 為 栓 塞 : 一 種 由 凝 塊 或 栓 子 造 成 的 腦 或 頸 動 脈 堵 塞 血 凝 塊 可 能 是 在 體 內 其 他 地 方 ( 通 常 是 心 臟 ) 形 成, 然 後 在 抵 達 腦 部 的 血 凝 塊, 也 可 能 是 動 脈 內 壁 脂 肪 沉 澱 物 脫 落 下 來 的 小 塊, 大 約 20% 的 中 風 由 栓 塞 引 起 ( 蔡,2003) 中 風 是 現 代 社 會 的 一 種 嚴 重 病 症, 要 減 低 中 風 的 禍 害 必 須 從 預 防 著 手 因 此 尋 找 一 種 無 副 作 用 便 宜 有 效 的 保 健 食 品 是 很 重 要 的 3

15 2.1 地 方 性 醱 酵 食 品 1. 納 豆 ( Natto ) 日 本 的 納 豆 是 少 有 的 黃 豆 產 品 之 一, 這 是 利 用 細 菌 醱 酵 製 程 即 將 侵 濕 煮 熟 的 黃 豆, 以 傳 統 的 方 法 用 稻 桿 包 裹, 置 於 溫 暖 處 一 至 兩 天 稻 桿 被 認 為 具 有 許 多 功 能 它 可 提 供 醱 酵 所 需 的 微 生 物, 並 產 生 令 人 喜 歡 的 氣 味, 同 時 吸 掉 醱 酵 期 間 所 放 出 氨 臭 醱 酵 所 必 須 的 微 生 物 的 納 豆 芽 孢 桿 菌 ( Bacillus natto ), 也 是 屬 於 枯 草 桿 菌 ( B. subtilis ) 的 一 種 ( Hesseltine & Wang, 1972 ) 於 醱 酵 期 間, 黃 豆 被 濃 稠 度 很 濃 而 且 很 黏 的 聚 合 物 所 覆 蓋 如 果 分 開 製 品 時, 兩 個 豆 仁 間 有 很 長 的 黏 絲 產 生, 這 表 示 品 質 很 好 納 豆 的 外 表 稍 黏 並 呈 灰 色, 它 的 風 味 強 烈 而 且 持 續 一 般 它 和 米 一 同 食 用 或 當 小 菜 ( Side dish ) 雖 然 納 豆 具 有 特 殊 的 性 質, 在 日 本 為 人 所 熟 知 不 過 他 還 不 像 其 他 醱 酵 黃 豆 食 品, 如 味 噌 醬 油 來 的 受 人 歡 迎 如 同 其 他 日 本 醱 酵 食 品, 納 豆 已 被 科 學 的 方 法 研 究, 以 現 代 化 的 科 技 生 產, 並 利 用 純 種 的 菌 種 培 養 另 外 一 種 新 發 展 出 來 的 產 品 是 粉 狀 的 納 豆, 可 以 加 入 點 心 或 湯 中 ( Hesseltine & Wang, 1972 ) 2. Thua-nao 4

16 Thua-nao 是 泰 國 的 產 品, 和 納 豆 極 為 相 似 但 不 像 納 豆,thua-nao 被 壓 碎 後 加 入 食 鹽 和 其 他 調 味 料 而 呈 糊 狀 ( Ko & Hesseltine, 1979) 的 總 論 上 曾 提 過 這 類 產 品 3. Dage Dage 是 一 種 印 尼 食 品, 由 數 種 脂 肪 含 量 高 的 不 同 種 子 ( Mucuna pruriens, Aleurites moluccana, Arachis hypogaea 或 其 它 ) 及 它 們 的 搾 渣 所 製 成 與 傳 統 的 納 豆 ㄧ 樣, 也 是 利 用 細 菌 經 過 自 然 醱 酵 而 成 ( Vorderman, 1902 ; Heyne, 1950 ; Saono et al., 1974 ) 在 極 有 限 的 規 模 下,dage 可 在 一 般 家 庭 中 製 造, 並 當 作 小 菜, 也 可 以 來 準 備 其 他 菜 2.2 多 功 能 保 健 食 品 - 納 豆 納 豆 的 原 料 是 黃 豆, 黃 豆 有 田 裡 的 肉 類 之 稱, 是 優 質 蛋 白 質 的 寶 藏, 而 且 含 有 人 類 不 可 或 缺 的 八 種 必 需 胺 基 酸 現 在 藥 理 研 究 表 明, 黃 豆 有 降 血 膽 固 醇 作 用, 長 期 食 用 以 黃 豆 為 主 要 蛋 白 質 來 源 的 食 物, 血 膽 固 醇 明 顯 低 於 動 脈 硬 化 的 人 可 多 吃 ㄧ 些 黃 豆 製 品, 以 取 代 動 物 蛋 白 質 另 外, 飲 用 豆 漿 為 主 可 以 治 療 妊 娠 毒 血 症, 可 以 降 血 壓 消 水 腫 的 作 用, 但 豆 漿 中 含 有 一 種 胰 蛋 白 酶 抑 制 劑, 它 對 腸 胃 有 刺 激 作 用, 且 會 降 低 胰 蛋 白 酶 的 活 性, 使 胃 腸 消 化 功 能 減 弱, 但 其 能 被 高 溫 破 壞, 5

17 故 豆 漿 加 熱 時 要 多 煮 一 會 兒, 以 破 壞 其 活 性, 以 免 產 生 消 化 不 良 的 副 作 用 黃 豆 的 營 養 雖 高, 可 是 因 為 黃 豆 的 質 地 很 硬, 再 加 上 食 物 纖 維 含 量 很 高, 因 此 不 太 容 易 消 化, 就 以 最 簡 單 的 煮 黃 豆 而 言, 吃 下 去 之 後, 吸 收 率 僅 有 七 成 左 右 而 已 所 以, 黃 豆 的 加 工 食 品 納 豆, 其 消 化 吸 收 率 高 達 八 ~ 九 成, 比 黃 豆 本 身 高 出 許 多 這 是 因 為 納 豆 菌 的 醱 酵 作 用, 已 經 某 種 程 度 分 解 了 黃 豆 蛋 白 質 所 致 ( 須 見 洋 行,2006 ) 2.3 納 豆 的 起 源 根 據 歷 史 文 獻 記 載 中 國 唐 代 高 僧 鑒 真 和 尚 東 渡 日 本 傳 經 時, 在 其 東 征 傳 一 書 裡 記 載 著 他 攜 帶 甜 豉 三 十 石 到 日 本, 這 種 甜 豉 可 能 是 日 本 納 豆 的 前 身 在 日 本 有 關 納 豆 的 紀 錄 是 公 元 1286 年 藤 原 明 衡 在 新 猿 樂 記 一 書 中 提 及 納 所 ( 寺 廟 廚 房 的 意 思 ) 之 豆, 第 一 次 出 現 了 納 豆 的 名 詞 ( 蘇,2003 ) 納 豆 應 該 就 是 被 日 本 化 的 中 國 豆 豉, 蒸 熟 後 的 大 豆 接 觸 菌 落 醱 酵, 再 用 鹽 水 浸 泡 熟 成 後 乾 燥 保 存 就 可 以 食 用, 此 種 方 法 在 古 代 日 本 的 寺 院 被 僧 侶 們 廣 為 使 用, 所 以 納 豆 也 稱 為 寺 納 豆 後 來, 日 本 人 把 大 豆 蒸 熟 後 用 稻 草 包 起 來, 以 保 持 一 定 溫 度 促 使 納 豆 菌 大 量 繁 殖 並 充 分 醱 酵, 就 變 成 現 在 之 外 表 黏 稠 但 風 味 獨 特, 筷 6

18 子 夾 起 時 會 拖 著 長 長 細 絲 的 納 豆 ( 許,2003 ) 納 豆 在 日 本 是 一 種 具 有 悠 久 歷 史 的 傳 統 醱 酵 食 品, 在 三 千 年 至 四 千 年 繩 文 時 代 即 用 於 日 本 的 餐 點 中, 在 民 間 普 遍 認 為 經 常 食 用 這 種 食 品 具 有 預 防 與 治 療 心 臟 血 管 疾 病, 可 恢 復 疲 勞 與 抗 腳 氣 病 的 功 能, 因 此 長 期 被 認 為 是 一 種 保 健 食 品, 而 納 豆 之 所 以 功 效 神 奇 風 味 獨 特 歷 久 不 衰, 且 長 久 以 來 深 刻 牽 繫 著 日 本 人 的 長 壽 健 康, 最 大 之 功 臣 乃 是 納 豆 中 蘊 藏 的 神 奇 微 生 物 - 納 豆 菌 ( 廖,2002 ) 2.4 納 豆 菌 的 命 名 納 豆 菌 早 期 被 命 名 為 納 豆 桿 菌 ( Bacillus natto ), 是 日 本 傳 統 食 品 納 豆 的 主 要 醱 酵 菌 種, 在 1905 年 由 Shin Sawamura 分 離 並 鑑 定 經 數 十 年 的 微 生 物 鑑 定 研 究, 其 結 果 顯 示 Shin Sawamura 當 初 所 命 名 的 Bacillus natto, 應 歸 類 於 Bacillus subtilis 菌 種 因 此 近 年 來 日 本 所 發 表 納 豆 相 關 文 獻 皆 亦 改 稱 納 豆 菌 Bacillus natto 為 Bacillus subtilis, 其 為 一 不 產 生 毒 素 和 對 人 體 沒 有 病 原 性 的 安 全 菌 株 ( GRAS ) 黃 等 ( 1977a ) 在 納 豆 菌 之 研 究 I. 納 豆 菌 培 養 條 件 之 檢 討 中 指 出, 納 豆 菌 在 固 態 培 養 基 上, 菌 落 呈 淡 褐 色 扁 平 乾 燥 粉 狀 組 織, 整 個 菌 落 帶 有 不 規 則 皺 紋, 細 胞 呈 短 桿 狀, 大 小 為 2~3 μ, 對 革 蘭 染 色 7

19 呈 陽 性, 其 孢 子 形 狀 呈 橢 圓 形, 大 小 約 1.2~1.5 μ, 且 其 為 一 種 生 物 素 ( biotin ) 要 求 菌 株, 所 以 必 須 在 生 物 素 存 在 之 下, 方 能 有 效 的 利 用 培 養 基 中 的 氮 源 及 碳 源, 故 可 藉 此 特 徵 與 其 他 相 近 似 的 桿 菌 加 以 區 分 同 年, 黃 等 人 於 納 豆 菌 之 研 究 II. 引 絲 納 豆 之 製 造 中 指 出, 納 豆 製 造 時, 在 高 溫 接 種 ( 80~100 ) 有 利 於 黏 性 物 質 之 產 生, 而 此 黏 性 物 質 為 一 含 果 糖 之 麩 胺 酸 多 縮 胜 肽, 同 時 在 納 豆 中 添 加 0.1~1% 的 食 鹽 或 0.1~ 3% 的 蔗 糖, 均 可 提 高 納 豆 之 黏 性 物 質 熟 成 的 引 絲 納 豆 產 品, 需 保 存 於 低 溫 條 件 下, 以 減 少 納 豆 臭 之 發 生, 或 添 加 1% 的 蔗 糖, 更 具 相 乘 之 效 果 且 在 加 工 過 程 中, 應 避 免 因 雜 菌 之 污 染 或 處 理 不 當, 導 致 黏 性 物 之 分 泌 不 足 及 納 豆 臭 等 不 良 現 象 發 生 2.5 食 用 納 豆 之 益 處 納 豆 含 有 豐 富 的 營 養 物 質 多 年 的 研 究 中, 納 豆 的 營 養 價 值 及 保 健 功 效 逐 步 被 發 現, 其 營 養 價 值 及 生 理 活 性 物 質 皆 超 越 大 豆 及 其 製 品 生 理 活 性 物 質 包 括 : 納 豆 激 酶 SOD ( 超 氧 歧 化 酶 ) 異 黃 酮 卵 磷 脂 維 生 素 B 群 維 生 素 E 維 生 素 K2 蛋 白 酶 澱 粉 酶 必 需 胺 基 酸 等 物 質 ( Esaki et al., 1994 ) 營 養 豐 富 的 大 豆 很 難 消 化, 因 此 維 持 原 始 狀 態 進 入 體 內, 只 能 消 化 60~ 70%, 但 經 過 加 工 之 後 能 夠 促 進 消 化 吸 收, 尤 其 在 蒸 煮 過 的 大 豆 中 加 入 8

20 納 豆 菌 做 成 的 醱 酵 食 品 納 豆, 其 所 含 有 的 蛋 白 質 可 以 達 到 90% 以 上 被 消 化 吸 收 納 豆 菌 所 具 有 的 強 力 蛋 白 酵 素 分 解 作 用, 能 促 進 大 豆 組 織 的 分 解 及 蛋 白 質 的 消 化, 其 消 化 性 遠 比 大 豆 高, 而 且 大 豆 中 原 含 有 的 異 黃 酮 經 納 豆 菌 醱 酵 後, 轉 化 為 游 離 型 異 黃 酮, 較 易 於 人 體 吸 收 納 豆 菌 能 維 持 消 化 道 機 能 健 康 的 效 果 及 作 用 時 間, 皆 優 於 乳 酸 菌, 可 壓 制 腸 內 腐 敗 菌 的 時 間 也 比 乳 酸 菌 長 ; 在 腸 內 可 消 滅 傷 寒 菌 或 赤 痢 之 類 病 原 菌, 或 對 於 病 毒 具 有 抑 制 效 果 ( 廖,2002 ) 具 有 降 低 血 壓 減 少 膽 固 醇 的 作 用 讓 羅 患 高 血 壓 的 成 年 人, 服 用 經 過 酒 精 分 離 的 納 豆 成 分, 食 用 納 豆 之 後 的 成 績 由 圖 2-1 可 看 出 來, 經 過 納 豆 的 食 用 之 後, 羅 患 高 血 壓 的 成 年 人 的 收 縮 壓 ( SBP ) 及 舒 張 壓 ( DBP ) 都 接 近 正 常 值 這 種 作 用 物 質, 在 腎 臟 所 釋 放 出 的 凝 乳 酵 素 ( 一 種 蛋 白 質 分 解 酵 素 ) 的 作 用 之 下, 會 抑 制 血 液 中 所 製 造 出 來 的 高 血 壓 因 子 血 管 收 縮 素 ( angiotensin ) 而 且, 這 種 作 用 物 質 的 分 子 比 較 小, 遇 熱 也 不 會 變 質, 因 此 跟 血 栓 溶 解 酵 素 不 同, 即 使 把 納 豆 加 熱, 也 不 用 擔 心 失 去 其 活 性 ( 須 見 洋 行,2006 ) 9

21 圖 2.1 攝 取 血 栓 溶 解 酵 素 之 後, 對 人 體 血 壓 所 產 生 的 效 果 參 與 實 驗 的 人, 在 實 驗 之 前 並 沒 有 攝 取 任 何 藥 物 再 測 定 上 手 腕 部 分 血 壓, 記 號 的 部 份 是 攝 取 後 的 變 化, 虛 線 部 分 代 表 臨 界 血 壓 ( 須 見 洋 行,2006 ) 10

22 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 (FDA) 於 1999 年 認 同 每 日 攝 食 25 公 克 大 豆 蛋 白, 在 低 膽 固 醇 低 飽 和 脂 肪 的 飲 食 下, 有 可 能 降 低 心 臟 病 的 危 害, 因 而 引 起 食 品 業 界 的 高 度 注 目 大 豆 蛋 白 中 所 含 生 理 活 性 成 分 包 括 皂 苷 異 黃 酮 植 酸 胰 蛋 白 酶 抑 制 物 質 等, 特 別 是 對 血 管 性 疾 病 具 有 生 理 活 性 機 能 的 異 黃 酮, 而 在 臨 床 試 驗 結 果 指 出, 攝 食 大 豆 蛋 白 前 後 總 膽 固 醇 值 LDL ( 低 密 度 脂 蛋 白 ) 膽 固 醇 值 及 中 性 脂 肪 皆 下 降 10 %,HDL ( 高 密 度 脂 蛋 白 ) 膽 固 醇 值 則 上 升 2.4 % ( 張,2000) 納 豆 菌 的 特 殊 分 子 結 構 納 豆 激 酶 是 從 納 豆 菌 之 中 製 造 出 來 的 酵 素 ; 而 酵 素 是 ㄧ 種 在 生 物 上 產 生 出 來, 能 夠 促 使 化 學 反 應 進 行 的 觸 媒 在 生 物 體 內, 不 斷 有 各 式 各 樣 的 化 學 反 應 在 同 時 進 行 著, 酵 素 的 任 務 就 是 負 責 讓 這 些 化 學 反 應 能 夠 適 時 地 依 照 生 物 自 身 的 生 理 指 令, 順 利 地 進 行 著 我 們 可 以 拿 生 物 體 內 都 擁 有 的 消 化 機 能 為 例, 當 我 們 嚼 碎 食 物 的 同 時, 也 將 唾 液 與 從 口 腔 進 入 與 食 物 混 合, 以 及 食 物 進 一 步 被 送 到 胃 裡 時, 唾 液 和 胃 液 裡 面 都 含 有 所 謂 的 消 化 酵 素, 就 會 產 生 作 用, 將 食 物 分 解, 以 利 身 體 可 以 從 腸 子 肝 臟 等 器 官 吸 收 11

23 納 豆 激 酶 的 特 殊 作 用, 再 進 ㄧ 步 觀 察 納 豆 激 酶 的 分 子 構 造 時, 可 以 發 覺 即 是 起 因 於 它 的 特 殊 形 狀 尿 激 酶 和 t-pa ( tissue plasminogen activator, 血 栓 溶 解 劑 ) 等 一 般 常 見 用 來 做 血 栓 溶 解 劑 的 酵 素, 其 分 子 結 構 全 部 都 是 兩 個 分 子 聚 合 在 一 起 的 結 合 方 式, 納 豆 菌 卻 不 是 這 樣 一 回 事, 每 個 分 子 以 非 常 鬆 散 的 狀 態 連 結 在 一 起, 這 種 構 造 在 生 化 領 域 上, 稱 之 為 單 鎖 環 狀 桿 菌 素 構 造 納 豆 菌 是 隸 屬 於 枯 草 桿 菌 的 細 菌, 不 過 觀 察 納 豆 菌 之 外 的 枯 草 菌 屬, 甚 至 大 腸 菌 等 等 在 其 他 的 生 物 體 內 製 造 出 來 的 酵 素 裡 面, 都 沒 有 發 現 和 納 豆 激 酶 一 樣 的 分 子 排 列 方 式 ( 須 見 洋 行, 2005 ) 溶 解 血 栓 的 功 用 納 豆 激 酶 是 血 栓 之 溶 解 酵 素, 不 只 對 於 防 止 或 改 善 腦 中 風 心 肌 梗 塞 等 心 血 管 疾 病 有 效, 對 於 因 腦 內 細 小 血 管 阻 塞 而 引 起 的 老 人 性 癡 呆 症 ( 60% 的 癡 呆 症 都 是 由 血 栓 所 造 成 ) 也 具 有 很 大 效 果 預 防 骨 質 疏 鬆 隨 著 年 齡 之 增 加, 鈣 質 的 代 謝 機 能 會 逐 漸 降 低, 且 能 強 化 骨 骼 的 女 性 賀 爾 蒙 ( estrogen ) 分 泌 也 會 急 遽 減 少, 形 成 骨 質 疏 鬆 症, 即 骨 頭 變 的 脆 弱 不 堪 容 易 發 生 骨 折 現 象 嚴 重 時 背 部 會 變 成 駝 背, 也 可 12

24 能 有 連 動 都 不 能 動 只 能 坐 著 的 情 形 發 生 欲 充 分 攝 食 鈣 質 來 補 充 人 體 所 需 時, 也 需 注 意, 不 可 攝 食 過 量, 以 免 鈣 質 尚 未 消 化 吸 收 就 排 泄 出 體 外, 過 量 的 鈣 質 也 可 能 會 牢 牢 的 吸 附 在 肺 臟 或 心 臟 的 細 胞 組 織 中, 進 一 步 使 內 臟 原 本 之 機 能 性 喪 失, 而 導 致 死 亡 ( 鄭,1999;Sato et al., 2001) 納 豆 菌 醱 酵 所 產 生 之 納 豆 產 品 具 有 大 量 維 生 素 K2, 可 以 增 進 骨 鈣 吸 收, 預 防 骨 質 疏 鬆 對 預 防 老 年 癡 呆 症 及 養 顏 美 容 亦 有 成 效 納 豆 激 酶 對 心 肌 梗 塞 及 腦 栓 塞 等 危 及 性 命 地 血 栓 症 之 治 療 及 預 防, 出 現 重 大 突 破 相 較 於 尿 激 酶 t-pa 等 的 血 栓 溶 解 劑, 屬 於 直 接 注 射 在 患 部 的 及 效 性 使 用, 納 豆 激 酶 則 能 運 用 在 日 常 生 活 當 中 尤 其 納 豆 激 酶 具 又 經 口 服 用 就 可 以 產 生 作 用 的 特 性, 使 其 能 夠 非 常 便 利 的 充 分 發 揮, 因 此 能 夠 做 為 產 生 預 防 保 健 作 用 的 機 能 性 食 品, 可 以 溶 解 血 管 中 的 血 栓, 有 清 除 血 液 中 的 廢 物, 幫 助 我 們 確 保 血 管 通 暢 的 功 用 造 成 老 人 癡 呆 症 的 主 要 因 素, 是 因 為 血 栓 所 引 起 的 腦 細 胞 內 血 液 循 環 不 良, 德 國 在 萃 取 銀 杏 葉 的 精 華 成 分 已 經 通 過 藥 用 認 可, 被 檢 驗 為 治 療 癡 呆 症 有 效 的 藥 品 但 是, 銀 杏 葉 精 華 成 分 的 效 果 僅 僅 止 於 不 讓 血 液 凝 固 而 已, 並 不 如 納 豆 具 有 溶 解 血 栓 的 作 用, 而 且 銀 杏 葉 不 是 可 以 拿 來 13

25 食 用 的 食 物, 所 以 有 過 量 攝 取 會 造 成 問 題 的 危 險 性 存 在, 納 豆 激 酶 雖 然 仍 在 藥 用 標 準 的 審 查 過 程 中, 目 前 還 未 獲 得 任 何 國 家 的 藥 品 許 可, 不 過 以 食 用 的 安 全 性 考 量 來 看, 是 沒 有 問 題 的 等 到 藥 品 許 可 通 過, 用 納 豆 激 酶 來 治 療 以 及 預 防 老 人 癡 呆 症, 都 會 得 到 很 好 的 效 果 須 見 教 授 依 舊 持 續 專 注 地 投 入 相 關 的 研 究, 當 包 含 豐 富 納 豆 激 酶 的 納 豆 菌 進 入 肚 子 之 後, 腸 道 中 的 乳 酸 菌 竟 然 也 會 有 增 加 的 現 象 可 見 納 豆 菌 還 具 有 降 低 腸 道 內 壞 菌 的 數 量, 增 加 乳 酸 菌 等 益 菌 數 量 的 功 效, 能 夠 調 整 腸 道 內 的 細 菌 維 持 在 良 好 的 平 衡 狀 態 ( 須 見 洋 行,2005 ) 改 善 便 秘 預 防 糖 尿 病 抗 癌 近 年 來 國 人 在 飲 食 上 開 始 重 視 食 物 纖 維 的 重 要 性, 因 其 具 有 延 緩 動 脈 硬 化 降 低 膽 固 醇 防 止 糖 尿 病 預 防 高 血 壓 清 除 腸 內 道 有 害 細 菌 促 進 腸 胃 蠕 動 預 防 便 秘 等 功 效 ( 林 和 黃,1994 ), 而 在 一 般 飲 食 中 是 以 穀 物 為 主, 所 攝 取 到 之 食 物 纖 維 含 量 並 不 充 足, 因 此 許 多 企 業 為 使 國 人 能 夠 得 到 足 夠 的 食 物 纖 維, 於 是 製 造 出 一 些 方 便 食 用 的 食 物 纖 維 飲 料, 但 這 些 飲 料 一 瓶 大 約 只 含 有 五 公 克 的 食 物 纖 維, 且 飲 用 時 也 同 時 攝 取 了 相 當 多 的 碳 水 化 合 物 進 入 體 內, 而 大 豆 含 有 28% 的 碳 水 化 合 物, 其 中 約 三 分 之 二 是 半 纖 維 素 纖 維 素 及 木 質 素 等 食 物 纖 維, 這 些 食 物 纖 維 14

26 於 醱 酵 後, 仍 會 殘 留 於 納 豆 中, 直 接 攝 食, 即 可 防 止 便 秘 預 防 大 腸 癌 及 直 腸 癌, 降 低 血 液 中 之 三 酸 甘 油 脂 及 膽 固 醇 的 含 量 ( 廖,2002 ) 對 Escherichia coli O-157 之 抗 菌 功 效 學 者 將 病 原 性 E. coli O-157 ( 濃 度 為 109 cells/ml ) 與 納 豆 菌 混 合 進 行 液 態 培 養 結 果 如 圖 2.2 指 出, 病 原 性 E. coli O-157 的 生 菌 數 隨 著 培 養 時 間 之 增 加 而 隨 之 降 低, 於 培 養 第 四 天 後, 病 原 性 E. coli O-157 之 生 菌 數 降 至 為 零, 未 與 納 豆 菌 混 合 培 養 者, 於 培 養 第 四 天, 尚 有 約 107 cells/ml ( 須 見,1993) 由 此 得 知, 攝 食 經 納 豆 菌 醱 酵 之 納 豆, 可 抑 制 E. coli O-157, 預 防 其 對 人 體 所 造 成 之 危 害 對 皮 膚 之 影 響 - 保 濕 美 白 納 豆 亦 被 發 現 能 清 除 體 內 物 質 養 顏 美 容 保 持 肌 膚 ( 吳,2003 ) 採 用 國 產 的 青 仁 黑 豆 ( 台 南 3 號 ) 為 材 料, 植 入 納 豆 菌 並 分 別 利 用 三 種 不 同 配 方 的 液 體 培 養 基 進 行 發 酵, 經 過 濾 離 心 和 冷 凍 乾 燥 後, 製 得 Fermented I Fermented II 和 Fermented III 等 三 種 液 態 黑 納 豆, 再 進 行 三 種 功 能 性 測 試 (1) 黑 色 素 生 成 反 應 的 實 驗 結 果 顯 示 : 三 種 液 態 黑 納 豆 均 有 促 進 Dopachrome 生 成 的 作 用, 即 表 示 有 促 進 黑 色 素 生 成 的 作 用, 其 中 以 Fermented I 最 為 顯 著 (2) 紫 外 線 吸 收 的 實 驗 結 果 顯 示 : 三 種 液 態 黑 15

27 納 豆 在 紫 外 線 A 和 紫 外 線 B 的 範 圍 內, 均 有 吸 收 紫 外 線 的 作 用, 其 中 以 Fermented III 最 為 顯 著 (3) 保 濕 效 能 的 實 驗 結 果 顯 示 : 三 種 液 態 黑 納 豆 具 有 良 好 的 吸 濕 性, 能 夠 降 低 皮 膚 脫 水 的 速 度, 減 少 皮 膚 水 份 的 散 失, 增 加 皮 膚 角 質 的 水 和 量, 並 能 提 高 皮 膚 的 保 水 能 力, 其 中 以 Fermented III 最 為 顯 著 抗 老 化 以 大 麥 黃 豆 麩 皮 黑 豆 薏 仁 等 基 質, 經 特 殊 微 生 物 發 酵 後, 會 產 生 具 有 高 抗 氧 化 活 性 物 質 - SOD ( 超 氧 歧 化 酶 ), 而 攝 食 這 些 發 酵 產 品, 可 相 對 提 高 血 液 中 SOD 的 濃 度, 以 改 善 體 內 因 過 多 過 氧 化 物 質 而 導 致 細 胞 組 織 的 傷 害 ( 王 等,1999 ) 16

28 圖 2.2 對 於 病 原 性 大 腸 菌 O-157, 納 豆 所 產 生 的 發 育 阻 礙 作 用 ( 須 見,1996 ) 17

29 2.6 納 豆 激 酶 ( Nattokinase ) 1988 年 日 本 富 崎 醫 科 大 學 的 須 見 博 士 從 200 多 種 食 品 中 發 現, 納 豆 中 含 有 天 然 的 纖 維 蛋 白 酶 ( plasmin ), 並 命 名 為 nattokinase ( 納 豆 激 酶 ), 而 大 豆 中 本 身 並 未 含 有 此 種 激 酶, 必 需 經 過 Bacillus subtilis 接 種 於 蒸 煮 過 之 大 豆 中 進 行 醱 酵 才 會 產 生, 且 nattokinase 主 要 分 佈 在 納 豆 表 面 之 黏 性 物 質 中 ( Sumi et al., 1987 ) 濕 納 豆 每 一 公 克 (3~4 粒 ) 所 含 血 纖 維 蛋 白 溶 解 的 活 性, 相 當 於 纖 維 蛋 白 溶 酶 (plasmin)40 個 單 位 或 臨 床 使 用 的 尿 激 酶 ( urokinase ) 1600 IU, 在 日 本 醫 師 提 供 200,000~300,000 單 位 的 urokinase 給 具 有 心 肌 梗 塞 的 病 患, 進 行 血 栓 的 治 療, 如 果 以 一 般 的 納 豆 產 品 來 計 算, 約 攝 食 100 克 的 納 豆, 就 可 達 到 上 述 之 治 療 效 果 納 豆 激 酶 是 由 275 個 胺 基 酸 所 組 成 ( 圖 2-3), 其 活 性 部 位 為 Asp 32 His 64 及 Ser 221 ( Sumi et al., 1990) 此 活 性 部 位 與 人 類 血 纖 維 蛋 白 溶 酶 之 活 性 部 位 ( His 603 Asp 646 及 Ser 741 ) 相 似 ( 陳,2002 ) 18

30 圖 2.3 納 豆 激 酶 之 ㄧ 級 結 構 ( Sumi et al., 1990 ) 19

31 2.7 血 栓 溶 解 酵 素 - 納 豆 激 酶 血 栓 乃 是 血 纖 維 蛋 白 原 (fibrinogen) 被 凝 血 酶 原 (prothrombin) 等 酵 素 作 用 所 形 成, 但 此 種 血 液 的 凝 集 會 被 血 清 中 的 血 纖 維 蛋 白 酶 ( 胞 漿 素 ) 酵 素 溶 解, 其 通 常 是 屬 於 不 活 性 之 血 纖 維 蛋 白 酶 原 (plasminogen) 的 狀 態, 需 靠 組 織 中 之 某 因 子 使 活 性 化 變 成 胞 漿 素, 人 為 的 活 性 化 則 以 chloroform protamine staphylokinase streptokinase 等 使 之 活 性 化 ; 另 外 Bacillus subtilis 的 protease ( nattokinase ) 也 具 有 強 力 的 血 塊 溶 解 作 用 ( 圖 2-4 ) 納 豆 激 酶 會 直 接 作 用 於 血 栓 ( thrombus ) 產 生 血 栓 降 解 物 ( fibrin degradation products ), 或 間 接 的 與 尿 激 酶 前 驅 物 的 活 化 因 子 (pro-urokinase activator) 作 用 於 尿 激 酶 的 前 驅 物 ( pro-urokinase ), 產 生 尿 激 酶 (urokinase), 尿 激 酶 再 作 用 於 血 纖 維 蛋 白 酶 原, 形 成 胞 漿 素, 血 纖 維 蛋 白 酶 進 一 步 溶 解 血 栓, 形 成 血 栓 降 解 物 ; 再 者 納 豆 激 酶 也 可 促 進 體 內 組 織 型 蛋 白 酶 原 活 化 因 子 ( tissue plasminogen activator ) 的 釋 放, 增 加 血 纖 維 蛋 白 酶 的 產 生 不 具 活 性 之 血 管 收 縮 素 I ( angiotensin I ) 需 藉 由 血 管 收 縮 素 轉 換 酶 ( angiotensin converting enzyme;ace ) 之 作 用, 才 可 產 生 具 有 活 性 的 血 管 收 縮 素 II ( angiotensin II ), 以 進 行 其 生 理 機 能 納 豆 激 酶 可 抑 制 20

32 血 管 收 縮 素 轉 換 酶 之 活 性, 使 不 具 活 性 之 血 管 收 縮 素 I 無 法 活 化 成 具 活 性 之 血 管 收 縮 素 II, 而 達 到 預 防 高 血 壓 之 效 果 實 驗 證 實, 具 高 血 壓 疾 病 的 患 者, 在 食 用 納 豆 後 血 壓 變 化 之 情 形 有 明 顯 之 改 善, 無 論 是 收 縮 壓 或 舒 張 壓, 均 回 復 到 一 般 健 康 者 體 內 血 壓 之 範 圍 ( Maruyama and Sumi 1998;Vaughan 2001) 人 體 會 分 泌 一 種 稱 為 胞 漿 素 的 酵 素, 其 不 只 能 預 防 血 栓 的 形 成, 尚 可 分 解 已 形 成 的 血 栓, 將 胞 漿 素 及 納 豆 激 酶 經 純 化 及 特 性 分 析, 指 出 二 者 性 質 極 為 相 似 ( Sumi et al., 1989 ) 學 者 指 出 納 豆 中 所 含 的 血 栓 溶 解 酵 素 ( nattokinase ), 其 不 僅 能 溶 解 血 管 中 所 形 成 的 血 栓, 還 能 作 用 於 許 多 合 成 的 胺 基 酸, 如 :H-D-Val-Leu-Lys-pNA H-D-Val-Leu-Arg-pNA 及 H-D-Pro-Phe-Arg-pNA, 經 過 純 化 及 特 性 分 析 後, 證 明 此 激 酶 分 子 量 為 20,000, 等 電 點 為 8.6 ( Sumi,1990 ) 納 豆 菌 株 於 培 養 後, 發 現 至 少 能 產 生 兩 種 蛋 白 質 分 解 酵 素, 其 中 之 一 為 中 性 蛋 白 質 分 解 酵 素 ( neutral protease ), 其 作 用 最 適 酸 鹼 度 為 ph 7.0, 另 一 為 鹼 性 蛋 白 質 分 解 酵 素 ( alkaline protease ), 其 作 用 最 適 酸 鹼 度 為 ph 10.0, 而 CaCO 3 或 KCl 的 添 加, 對 納 豆 菌 蛋 白 質 分 解 酵 素 之 生 產, 具 有 促 進 的 效 果 ( 黃,1978 ) 21

33 圖 2.4 納 豆 激 酶 在 血 栓 溶 解 系 統 中 之 直 接 與 間 接 作 用 22

34 由 台 灣 土 壤 中 所 分 離 之 枯 草 菌 IMR-NK-1 (B. subtilis IMR-NK-1), 可 產 生 類 似 納 豆 激 酶 之 高 活 性 血 纖 維 蛋 白 酶 ( fibrinolytic enzyme ) 利 用 固 態 醱 酵 60 小 時, 來 生 產 血 纖 維 蛋 白 酶, 並 進 行 純 化, 證 明 此 酵 素 有 最 適 作 用 ph 7.8, 最 適 作 用 溫 度 55, 分 子 量 為 31.5 kda,pi 值 為 8.3 此 酵 素 對 血 纖 維 蛋 白 原 ( fibrinogen ) 酪 蛋 白 ( casein ) 及 一 些 合 成 之 蛋 白 基 質 皆 具 有 水 解 作 用, 其 中 最 易 分 解 之 合 成 基 質 為 N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA PMSF ( phenylmethyl sulfonylfluoride) 和 NBS ( N-bromosuccinimide ) 可 完 全 抑 制 該 酵 素 活 性, 經 實 驗 結 果 證 明 此 酵 素 類 似 於 subtilisin 的 蛋 白 酶, 且 類 似 從 Bacillus natto 所 取 得 的 納 豆 激 酶 ( 范 等,1994;Chang et al., 2000 ) Urano et al., ( 2001 ) 利 用 枯 草 菌 生 產 原 血 纖 維 水 解 酵 素 - subtilisin NAT 時, 亦 同 時 產 生 胞 漿 素 原 活 化 劑 之 抑 制 物 ( 簡 稱 PAI-1 ), 其 將 subtilisin NAT 先 行 純 化, 證 明 其 分 子 量 為 27.7 kda, 且 能 將 胞 漿 素 原 活 化 劑 切 成 較 小 之 分 子 片 段, 而 使 得 PAI-1 失 去 其 專 一 之 活 性, 間 接 使 胞 漿 素 原 受 組 織 中 之 plasminogen activator 作 用 成 胞 漿 素 ( plasmin ), 促 使 fibrin 之 分 解, 減 少 fibrin 之 聚 積 Sumi et al., ( 1987 ) 利 用 納 豆 及 納 豆 萃 取 液 進 行 實 驗, 以 人 工 血 栓 23

35 物 質 ( 纖 維 蛋 白 ) 為 測 試 對 象, 結 果 發 現 平 舖 於 含 人 工 血 栓 物 質 表 面 之 納 豆, 其 周 圍 的 血 栓 會 溶 解 ( 圖 2-5-A ) 另 將 等 量 的 納 豆 萃 取 液 (nattokinase;n) 尿 激 酶 ( urokinase;u ) 及 血 漿 纖 維 蛋 白 酵 素 (plasmin;p) 置 於 人 工 血 栓 上 ( 圖 2-5-B), 發 現 三 者 溶 解 度 之 差 異, 以 納 豆 萃 取 液 ( N ) 之 溶 解 度 最 佳 將 納 豆 萃 取 液 經 加 熱 10 分 鐘 後, 測 試 其 對 血 纖 維 蛋 白 ( fibrin ) 之 溶 解 度, 結 果 發 現 50 以 下 熱 處 理 對 納 豆 激 酶 活 性 並 無 任 何 影 響 ;60 熱 處 理 之 血 栓 溶 解 酵 素 其 活 性 有 下 降 的 趨 勢 ;70 以 上 之 熱 處 理 會 使 酵 素 失 去 活 性 ( 圖 2-5-C ) Sumi et al., ( 1989 ) 研 究 指 出, 攝 食 納 豆 後 第 4 個 小 時, 血 液 中 血 栓 降 解 產 物 ( fibrin degradation products;fdp ) 含 量 最 高, 表 示 血 栓 溶 解 酵 素 此 時 活 性 最 強 ; 而 在 血 栓 平 板 上, 血 液 溶 解 血 栓 作 用 後 產 生 之 透 明 圈 面 積 ( euglobulin fibrinolytic activity;efa ) 也 在 第 4 天 產 生 最 大 直 徑, 之 後 活 性 趨 於 平 緩, 再 者 於 酵 素 作 用 後 第 4 小 時, 作 用 速 率 最 快, 亦 指 此 時 酵 素 作 用 所 需 時 間 ( euglobulin lysis time;elt ) 最 短 24

36 (A) 直 接 將 納 豆 置 於 血 栓 平 板 上 (B) U 代 表 尿 激 酶 N 代 表 納 豆 激 酶 P 代 表 胞 漿 素 (C) 納 豆 萃 取 液 在 不 同 溫 度 加 熱 10 分 鐘, 再 置 於 血 栓 平 板 上 25

37 Sumi et al., ( 1990 ) 以 動 物 進 行 實 驗, 而 推 論 出 : 當 身 體 產 生 傷 口 時, 受 損 內 皮 細 胞 血 小 板 會 釋 放 出 凝 血 激 素, 對 血 液 中 纖 維 蛋 白 原 ( fibrinogen ) 作 用 而 形 成 fibrin, 進 而 凝 固 最 後 形 成 血 塊 形 成 的 血 塊, 正 常 血 管 細 胞 會 進 行 修 護 --- ( 體 內 plasmin 會 針 對 fibrin 進 行 分 解 而 排 出 體 外 ) plasmin 的 活 性 會 因 老 化 體 質 等 種 種 因 素 而 受 抑 制, 進 而 影 響 血 塊 的 分 解, 且 納 豆 激 酶 具 有 溶 解 fibrin 的 功 能, 亦 可 活 化 plasmin 的 能 力, 可 有 效 預 防 血 栓 的 形 成 2.8 含 有 血 栓 溶 解 酵 素 之 醱 酵 產 品 微 生 物 會 分 泌 某 特 殊 酵 素 來 分 解 凝 集 之 血 纖 維 蛋 白 以 Fusarium pallidoroseum 菌 株 進 行 固 態 及 液 態 振 盪 培 養, 結 果 發 現 此 菌 株 在 麥 麩 上 行 固 態 醱 酵 後 會 產 生 血 纖 維 蛋 白 溶 解 酵 素, 且 活 性 比 液 態 振 盪 培 養 佳 ( Samy & Aassar, 1995 );Shiokara 是 日 本 以 柴 魚 為 原 料 之 傳 統 醱 酵 食 品, 是 由 Katsuwonus pelamis 菌 株 醱 酵 而 成, 此 一 醱 酵 食 品 中, 也 被 發 現 含 有 一 血 纖 維 蛋 白 溶 解 酵 素 - Katsuwokinase ( KK ) ( Sumi et al., 1995 );Chungkook-Jang 利 用 Bacillus sp. CK 11-4 菌 株 進 行 醱 酵 所 製 成 之 韓 國 傳 統 醬 油, 經 研 究 報 告 指 出 Bacillus sp. CK 11-4 亦 會 產 生 血 纖 維 蛋 白 酶, 此 酵 素 從 N 端 起, 其 14 個 胺 基 酸 分 子 之 順 序 依 序 為 Ala-Gln-Thr-Val-Pro-Tyr-Gly-Ile-Pro-Leu-Ile-Lys-Ala-Asp, 與 枯 草 菌 素 26

38 Carlsberg 相 似, 但 其 對 血 纖 維 蛋 白 水 解 活 性 卻 高 於 枯 草 菌 素 8 倍 之 多 ( Kim et al., 1996 ) ; 以 米 糠 當 基 質, 將 其 浸 漬 於 含 礦 物 質 之 溶 液 中, 再 接 種 Fusariun oxysporum 乾 燥 孢 子 於 濕 的 米 糠 上 進 行 醱 酵, 如 此 重 覆 進 行 批 式 醱 酵 31.5 天 後, 其 總 血 纖 維 蛋 白 酶 活 性 可 達 15,4500 IU/L, 此 發 展 出 之 新 型 固 態 式 醱 酵 系 統, 可 重 覆 生 產 工 業 上 有 用 的 血 纖 維 蛋 白 酶 ( Sun et al., 1998 ) ; 以 Bacullus amyloliquefaciens DC-4 菌 株 醱 酵 製 成 之 中 國 傳 統 大 豆 醱 酵 製 品 douchi 中, 亦 含 有 血 纖 維 蛋 白 溶 解 酶 - subtilisin DFE ( Peng et al., 2003 ) 2.9 納 豆 醱 酵 條 件 納 豆 菌 生 長 所 需 要 基 質 之 條 件 與 納 豆 激 酶 生 產 之 條 件 亦 有 相 關 之 文 獻 加 以 探 討 利 用 液 態 醱 酵 培 養 方 式 進 行 其 納 豆 激 酶 粗 酵 素 活 性 等 培 養 條 件 之 探 討 結 果 顯 示, 最 佳 培 養 基 組 成 分 為 8.0% 葡 萄 糖 3.0% 大 豆 脫 脂 粉 2.0% 酵 母 抽 出 物 0.4% 磷 酸 氫 二 鉀 0.2% 碳 酸 鈣 時, 在 300 rpm 轉 速 與 2 vvm 通 氣 量 調 控 下, 溫 度 與 酸 鹼 值 分 別 控 制 在 37 與 ph 6.5, 培 養 48 hrs 後, 其 醱 酵 液 中 的 NK 粗 酵 素 活 性 可 達 900~1000 FU/mL ( 蘇 等, 2005) 27

39 利 用 一 株 來 自 納 豆 食 品 中 篩 選 的 北 海 道 納 豆 菌, 以 500 ml 的 三 角 錐 瓶 內 含 200 ml 基 礎 培 養 基, 進 行 以 醱 酵 培 養 生 產 NK 之 研 究 最 後 以 糖 蜜 (20 g/l) peptone (20 g/l) MgSO 4 (1 g/l) CaCl 2 (1 g/l) 和 K 2 HPO 4 (2 g/l) 為 培 養 基, 在 醱 酵 溫 度 37, 轉 速 180 rpm, 培 養 47.5 小 時 會 有 最 高 活 性 ( 63 U/mL ) 酵 素 最 適 ph 值 及 溫 度 分 別 為 10 與 37 ph-stat 的 饋 料 批 式 醱 酵 方 式, 初 期 以 糖 蜜 為 主 要 的 碳 源, 之 後 的 饋 料 主 要 是 增 加 細 胞 濃 度 為 主, 有 如 此 大 量 菌 體 就 可 產 生 較 多 的 酵 素 由 於 連 續 提 供 養 分 使 的 菌 得 以 長 時 間 生 長 及 分 泌 酵 素, 最 後 的 細 胞 濃 度 比 以 三 角 錐 瓶 醱 酵 培 養 增 加 了 3 倍, 而 酵 素 的 活 性 也 比 三 角 錐 瓶 醱 酵 培 養 提 高 了 2.7 倍, 酵 素 活 性 約 為 172 U/mL ( 吳,2005) 利 用 液 態 醱 酵 方 式, 探 討 納 豆 菌 生 長 之 條 件, 發 現 其 最 適 溫 度 在 40 最 適 ph 值 7.0 最 適 NaCl 濃 度 為 2% 而 最 佳 醱 酵 時 間 為 14 小 時 ( 陳,2001) 從 市 售 納 豆 產 品 中 分 離 出 納 豆 菌 株, 於 納 豆 菌 生 產 納 豆 激 酶 的 過 程 中 探 討 碳 氮 源 及 其 濃 度 接 種 量 及 培 養 溫 度 結 果 顯 示,3% 的 可 溶 性 澱 粉 與 1% 的 酵 母 萃 取 物 分 別 為 最 適 的 碳 氮 源 及 其 濃 度 ;3% 為 最 適 的 接 菌 量 ; 最 適 的 培 養 溫 度 為 31 另 一 方 面 探 討 熱 穩 定 劑 對 納 豆 激 酶 熱 穩 定 性 之 影 響 研 究 顯 示, 海 藻 醣 蔗 糖 乳 糖 及 明 膠 對 納 豆 激 酶 具 有 不 錯 的 熱 穩 定 效 果 ; 界 面 活 性 劑 及 聚 乙 二 醇 則 不 具 任 何 保 護 酵 素 之 能 28

40 力 鉀 鈉 及 鈣 離 子 可 有 效 的 增 加 納 豆 激 酶 之 熱 穩 定 性 ( 邱,2004) 發 現 豆 豉 中 之 溶 纖 酵 素 之 活 性, 以 ph 7~10 溫 度 40 之 條 件 醱 酵 時, 活 性 最 高 ( 劉,2000) 一 系 列 溶 血 栓 納 豆 菌 之 篩 選 與 醱 酵 特 性 之 報 告 ( 董,2000) 其 內 容 包 括 不 同 菌 株 納 豆 激 酶 活 力 之 比 較 碳 氮 源 對 酵 素 產 生 之 影 響 搖 瓶 速 度 醱 酵 時 間 之 影 響 等 對 豆 豉 溶 栓 酵 素 之 醱 酵 條 件, 尤 其 是 碳 氮 源 無 機 鹽 類 ph 值 溫 度 等 條 件 有 所 研 究 ( 彭 與 張,2002) 納 豆 菌 亦 常 用 以 作 為 產 生 抗 菌 物 質 之 菌 種 ( 鐘,2001 ) 近 來 發 表 以 納 豆 菌 培 養 抗 菌 物 質 之 條 件, 包 括 碳 源 氮 源 添 加 之 胺 基 酸 培 養 溫 度 ph 值 與 接 種 量 ( Ohno et al., 1993,1996 ) 則 探 討 利 用 Bacillus subtilis NB22 生 產 抗 生 素 物 質 ( iturin ) 之 各 種 醱 酵 條 件 探 討 Bacillus subtilis ( natto ) 最 適 培 養 基, 由 實 驗 得 知 最 適 培 養 基 組 成 為 soybean protein 2.8 % yeast extract 1.0 % 及 maltose 0.8 % ( ph=6 ), 種 菌 液 之 接 種 量 為 5 %, 最 適 培 養 條 件 為 37 下, 以 150 rpm 的 旋 轉 速 度, 進 行 迴 轉 是 震 盪 培 養 過 程 中, 其 納 豆 激 酶 活 性 在 培 養 到 第 6 小 時 後, 活 性 開 始 產 生, 在 第 24 時 後 活 性 則 趨 於 平 緩, 且 菌 株 於 培 養 到 第 32 至 36 小 時 後, 產 生 最 高 之 納 豆 激 酶 活 性, 活 性 介 於 2250 至 2600 FU/100mL 之 間 ( 謝,2004) 探 討 添 加 碳 源 的 種 類 及 碳 源 用 量 對 納 豆 品 質 特 性 的 影 響 以 及 成 品 29

41 在 保 藏 過 程 中 胺 基 酸 的 動 態 結 果 顯 示 : 當 在 黃 豆 中 添 加 10% 的 糯 米 時, 能 有 效 抑 制 納 豆 的 氨 臭, 並 且 其 他 性 狀 也 比 別 的 碳 源 好 納 豆 在 保 藏 的 過 程 中, 胺 基 酸 的 含 量 會 增 加 ( 譚,2003) 探 討 關 於 提 高 納 豆 激 酶 活 性 產 量 途 徑, 氮 源 方 面 以 黃 豆 蛋 白 作 氮 源 時, 產 量 高 而 且 醱 酵 時 間 短 ; 碳 源 方 面 以 木 糖 作 碳 源 效 果 最 好, 在 第 4 天 產 量 最 高 經 研 究 發 現, 當 碳 源 含 量 為 2% 氮 源 含 量 為 3% 時, 納 豆 菌 產 納 豆 激 酶 活 性 最 佳 ( 陳,2002) 探 討 氮 源 碳 源 及 離 子 組 成 對 產 生 納 豆 激 酶 活 性 的 影 響, 以 黃 豆 蛋 白 為 氮 源, 納 豆 菌 產 納 豆 激 酶 活 性 效 果 最 好, 醱 酵 時 間 3 天 時 達 到 最 大 值 而 其 黃 豆 蛋 白 濃 度 為 2% 時, 產 生 納 豆 激 酶 活 性 效 果 最 好 碳 源 以 木 糖 濃 度 為 2% 產 生 納 豆 激 酶 活 性 最 高, 醱 酵 時 間 3 天 時 達 到 最 大 值 產 生 納 豆 激 酶 活 性 最 高 離 子 組 成 對 產 生 納 豆 激 酶 活 性 影 響, 因 微 生 物 的 生 長 和 繁 殖, 需 要 抹 些 無 機 鹽 離 子, 而 由 研 究 結 果 得 知 Ca 2+ 的 影 響 最 大 ( 鮑, 2002) 探 討 以 液 態 培 養, 添 加 碳 源 和 氮 源 對 於 納 豆 菌 生 長 的 影 響, 蔗 糖 和 甘 油 為 較 好 的 碳 源, 濃 度 2% 較 好, 而 葡 萄 糖 等 單 醣 濃 度 高 反 而 會 抑 制 生 長 氮 源 為 2% 的 黃 豆 蛋 白 和 6% 的 豆 粕 時 總 生 菌 數 達 最 大 量, 黃 豆 成 分 的 有 機 氮 源 明 顯 比 其 他 氮 源 有 利 於 菌 的 生 長, 而 在 無 機 氮 源 下 幾 乎 不 能 生 長 ( 王,2003) 30

42 在 納 豆 菌 之 相 關 報 告 中, 對 納 豆 菌 的 醱 酵 培 養 大 多 以 固 態 醱 酵 來 進 行, 但 此 一 方 法 較 不 經 濟, 且 容 易 受 雜 菌 汙 染, 因 此 本 研 究 擬 以 液 態 培 養 的 方 式 來 進 行 納 豆 菌 的 培 養, 且 利 用 饋 料 醱 酵 進 行 擴 大 培 養, 以 提 高 納 豆 激 酶 活 性 31

43 第 三 章 材 料 與 方 法 3.1 實 驗 材 料 菌 種 從 五 種 品 牌 的 日 本 市 售 納 豆 食 品 ( 北 海 道 青 森 岡 山 黑 豆 黑 豆 信 玄 君 ) 中 篩 選 出 單 一 菌 種 的 納 豆 菌 培 養 基 培 養 基 Nutrient agar(na) ( Difco, USA ) Nutrient broth(nb) ( Difco, USA ) Milk agar 組 成 成 分 Peptone 5.0 g/l ; beef extract 3.0 g/l ; Agar 1.5 g/l ; distilled water, 1.0 L, 並 將 ph 控 制 於 7 Peptone 5.0 g/l ; beef extract 3.0 g/l ; distilled water, 1.0 L, 並 將 ph 控 制 於 7 Milk powder 100 g/l ; Agar 1.5 g/l 藥 品 1. Peptone agar Yeast extract, 購 自 DIFCO Chemical Co. 糖 蜜 購 自 台 糖 公 司 Azocasein Glucose Maltose, 購 自 Sigma Chemical Co. CaCO 3 MgSO 4.7H 2 O KH 2 PO 4 Trichloroacetic acid (TCA), 32

44 購 自 Wako Chemical Co. 黃 豆 粉 購 自 傳 統 超 市 2. Buffer solution : NaHCO 3 -NaOH buffer Tris-HCl buffer citric acid-na 2 HPO 4 buffer 33

45 3.2 儀 器 設 備 1. 攪 拌 式 醱 酵 槽 ( Ching-Chi CMF-5 ): 傳 統 攪 拌 式 五 公 升 醱 酵 槽, 一 般 都 是 立 式 圓 柱 形, 上 下 兩 端 用 橢 圓 槽 蓋 封 閉, 槽 內 有 攪 拌 翼 空 氣 分 散 裝 置 等, 於 槽 體 適 當 位 置 可 放 溫 度 感 應 器 ph 電 極 溶 氧 電 極 等 裝 置 2. 桌 上 型 離 心 機 ( Beckman Model J2-21M/E,U.S.A ) 3. 紫 外 光 可 見 光 分 光 光 度 計 ( Jasco Model V-550:Lnican UV300 ) 4. 恆 溫 水 浴 槽 ( ANCER ) 5. 恆 溫 震 盪 培 養 箱 ( Hotech Model-705 ) 6. 蠕 動 馬 達 ( Masterflex Model ) 7. 空 氣 馬 達 ( Iwaki Model APN-215NO-1 ) 8. ph 控 制 器 ( Mettler Toledo InPro3000 ) 9. ph meter ( Suntex PC-330 ) 10. 滅 菌 釜 ( Speedy Autoclave, TOMIN MEDICAL EQUIPMENT CO., LTD ) 11. 無 菌 操 作 台 (Laminar flow, 海 科 學 股 份 有 限 公 司 ) 12. 恆 溫 培 養 箱 ( AH ancer, 進 基 儀 器 股 份 有 限 公 司 ) 13. 純 水 製 造 機 ( Ultrapure water system, RT-735, PARK INTERNATIONAL CORP.) 34

46 14. 烘 箱 (Oven, FIRSTEK RI-100S) 35

47 3.3 實 驗 方 法 篩 菌 首 先 將 數 顆 市 售 納 豆 產 品 放 在 20 ml 含 0.85% NaCl 無 菌 水 中, 以 超 音 波 震 盪 30 分 鐘, 吸 取 懸 浮 液 30 μl 至 牛 奶 培 養 基 上, 再 以 無 菌 的 L 型 玻 棒 以 順 時 針 方 向 進 行 塗 佈, 放 入 37 的 恆 溫 培 養 箱 培 養 小 時 於 培 養 24 小 時 後 會 在 牛 奶 培 養 基 上 產 生 由 納 豆 菌 分 解 出 透 明 的 clear zone, 再 挑 選 出 clear zone 較 大 的 種 菌, 並 反 覆 多 次 接 種 在 新 的 牛 奶 培 養 基 上, 並 觀 察 其 生 長 型 態, 直 到 篩 選 出 單 一 純 菌 得 到 以 上 的 五 株 納 豆 菌 菌 種 的 保 存 及 活 化 將 篩 選 出 的 納 豆 菌, 以 NA ( Nutrient Agar ) 的 平 面 培 養 基 在 37 恆 溫 培 養 箱 培 養 24 小 時 後, 再 存 放 在 4 之 下 保 存, 每 二 星 期 繼 代 ㄧ 次 待 要 培 養 納 豆 菌 生 產 納 豆 激 酶 時, 再 將 納 豆 菌 轉 移 培 養 至 牛 奶 培 養 基 活 化 誘 導 生 產 納 豆 激 酶, 再 接 種 至 液 體 培 養 基 中 培 養 液 體 醱 酵 培 養 基 培 養 基 成 分 為 5% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O 將 之 前 所 篩 選 出 來 的 五 株 納 豆 菌, 分 別 培 養 於 溫 36

48 度 37, 轉 速 180 rpm 的 條 件 下, 培 養 48 小 時, 選 取 其 中 一 株 活 性 最 高 的 納 豆 菌, 進 行 後 續 相 關 研 究 再 以 NA 培 養 基 保 存 4 下 備 用 不 同 培 養 基 濃 度 對 酵 素 生 產 之 影 響 在 種 菌 篩 選 培 養 基 中, 選 取 活 性 較 高 的 單 一 菌 株 A ( 品 名 : 信 玄 君 ), 用 不 同 濃 度 碳 氮 源 的 培 養 基 濃 度 ( 如 下 表 ) 來 探 討 酵 素 生 產 活 性 之 影 響 : 黃 豆 粉 (%) Glucose (%) 批 次 醱 酵 培 養 批 次 醱 酵 的 培 養 基 的 成 分 : 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O 培 養 溫 度 37, 轉 速 300 rpm, 通 氣 量 1 vvm 種 菌 搖 瓶 是 以 NA 培 養 基 於 溫 度 37, 轉 速 180 rpm 的 條 件 下 培 養, 約 培 養 至 第 7 小 時 左 右 ( OD 600nm =1 ) 時, 接 種 入 醱 酵 槽, 醱 酵 槽 培 養 基 成 份 同 上, 體 積 為 1.5 公 升 37

49 3.3.6 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 饋 料 批 次 醱 酵 是 以 ph stat 為 醱 酵 策 略, 首 先 進 行 批 次 醱 酵 培 養, 培 養 基 的 成 分 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O 培 養 過 程 中 ph 值 會 下 降, 當 ph 值 降 低 到 設 定 的 數 值, 就 開 始 進 入 ph-stat 的 第 一 階 段 饋 料 醱 酵 第 一 階 段 饋 料 醱 酵 的 培 養 基 為 11.3% glucose 5.6% yeast extract 0.05% CaCl % NaH 2 PO % MgSO % NH 4 Cl 待 細 胞 濃 度 增 生 至 極 限, 轉 為 誘 導 酵 素 的 饋 料 醱 酵 培 養 基, 其 成 分 組 成 為 30% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O 其 策 略 是 當 醱 酵 液 中 的 碳 源 被 代 謝 殆 盡 時, 細 胞 轉 代 謝 有 機 酸, 促 使 ph 值 往 上 提 升, 達 到 我 們 設 定 點 的 饋 料 點 則 饋 入 氮 源 3.4 分 析 方 法 酵 素 活 性 測 定 Azocasein activity 0.33 ml 0.4% ( w/v ) azocasein ( 0.1M ph=7.4 tris ) 與 20 μl 酵 素, 在 37 反 應 10 分 鐘, 再 加 入 650 μl 10% ( w/v ) trichloroactic acid ( TCA ), 10 分 鐘 後, 以 10000g 離 心 20 分 鐘, 取 800 μl 上 清 液, 再 加 入 200 μl 2N NaOH, 測 OD 420nm ( Singh, 2001 ) 38

50 活 性 定 義 可 增 加 1 個 OD 420nm 每 毫 升 酵 素 稱 為 1 unit 在 結 果 與 討 論 中, 除 非 特 別 說 明, 否 則 皆 以 此 活 性 表 示 本 實 驗 活 性 單 位, 相 對 於 市 售 納 豆 食 品 標 示 定 義 之 活 性 單 位 Azocasein activity : Fibrinolytic activity(fu)=1 : 1.2 ( 吳,2005) 3.5 酵 素 特 性 探 討 酵 素 之 ph 穩 定 性 探 討 將 不 同 ph 值 的 緩 衝 溶 液 及 粗 酵 素 液 以 體 積 比 9:1 混 合, 置 於 4 下 保 存 24 小 時 每 天 取 樣, 連 續 7 天, 將 取 樣 的 樣 品 做 活 性 酵 素 測 試, 然 後 以 三 氯 醋 酸 終 止 反 應, 離 心 後 測 酵 素 作 用 所 產 生 降 解 產 物 在 OD 420nm 下 测 吸 光 值, 並 計 算 出 酵 素 之 活 性 酵 素 活 性 實 驗 結 果 以 相 對 活 性 百 分 比 (%) 來 表 示, 以 酵 素 活 性 最 高 的 一 組 是 為 100% 粗 酵 素 液 在 熱 處 理 24 小 時 後 的 相 對 活 性 將 緩 衝 溶 液 與 粗 酵 素 以 體 積 比 9:1 混 合, 分 別 置 於 下 作 用, 反 應 24 小 時 後, 取 樣 做 活 性 酵 素 測 試, 然 後 以 三 氯 醋 酸 終 止 反 應, 離 心 後 測 酵 素 作 用 所 產 生 降 解 產 物 在 OD 420nm 下 測 吸 光 值, 並 計 算 出 酵 素 之 活 性 酵 素 活 性 實 驗 結 果 以 相 對 活 性 百 分 比 (%) 39

51 來 表 示, 以 酵 素 活 性 最 高 的 一 組 是 為 100% 酵 素 之 熱 穩 定 性 將 緩 衝 溶 液 與 粗 酵 素 混 合, 分 別 置 於 下 作 用, 每 天 取 樣, 連 續 7 天, 取 樣 做 活 性 酵 素 測 試, 然 後 以 三 氯 醋 酸 終 止 反 應, 離 心 後 測 酵 素 作 用 所 產 生 降 解 產 物 在 OD 420nm 下 測 吸 光 值, 並 計 算 出 酵 素 之 活 性 酵 素 活 性 實 驗 結 果 以 相 對 活 性 百 分 比 ( % ) 來 表 示, 以 酵 素 活 性 最 高 的 一 組 是 為 100% 酵 素 貯 存 之 安 定 性 將 粗 酵 素 液 分 別 置 於 4 及 -20 之 環 境 下, 進 行 貯 存 試 驗, 每 天 取 樣, 測 其 殘 留 之 活 性, 以 了 解 不 同 的 貯 存 溫 度 下 酵 素 活 性 之 變 化 情 形, 酵 素 活 性 實 驗 結 果 以 相 對 活 性 百 分 比 ( % ) 來 表 示, 並 以 貯 存 0 日 之 酵 素 作 用 活 性 為 100% 40

52 第 四 張 結 果 與 討 論 4.1 種 菌 篩 選 培 養 基 固 定 一 種 培 養 基, 接 種 1 loop 的 種 菌 至 含 有 200 ml 培 養 基 的 三 角 搖 瓶 中, 其 培 養 基 成 分 為 5% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O, 於 溫 度 37, 轉 速 180 rpm 的 條 件 下 液 態 培 養 48 小 時, 選 取 其 中 活 性 最 高 表 現 的 一 菌 株, 其 中 以 信 玄 君 ( 菌 株 A) 擁 有 最 佳 的 活 性, 活 性 為 ( U/ml ), 後 續 相 關 研 究 就 選 用 菌 株 A 作 為 實 驗 探 討 的 種 菌 表 4.1 固 定 單 一 種 培 養 基 對 不 同 菌 株 的 活 性 測 試 醱 酵 時 間 48hr 活 性 青 森 北 海 道 信 玄 君 岡 山 黑 豆 黑 豆 (U/ml) 41

53 4.2 不 同 培 養 基 濃 度 對 酵 素 生 產 之 影 響 在 菌 種 篩 選 培 養 基 中, 選 取 活 性 較 高 的 菌 株 A, 以 不 同 碳 氮 源 濃 度 培 養 基 對 酵 素 生 產 之 影 響, 其 培 養 基 組 成 以 黃 豆 粉 為 氮 源, Glucose 為 碳 源, 其 結 果 顯 示 出 以 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O, 培 養 溫 度 37, 轉 速 180 rpm 的 條 件 下 液 態 振 盪 培 養 48 小 時 有 最 佳 活 性 為 ( U/ml ) 表 4.2 不 同 培 養 基 濃 度 對 酵 素 生 產 之 影 響 黃 豆 粉 (%) Glucose 活 性 (U/ml)

54 4.3 批 次 醱 酵 培 養 將 種 菌 以 NB 培 養 基 培 養 至 OD 600nm 接 近 1 時, 接 種 至 醱 酵 槽 中, 醱 酵 反 應 體 積 為 2 L, 接 種 量 約 為 反 應 體 積 的 10%, 進 行 批 次 醱 酵 ( 培 養 基 組 成 為 : 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O ), 並 於 醱 酵 過 程 中, 觀 察 並 測 定 納 豆 激 酶 活 性 ( nattokinase activity ) ph 值 溶 氧 值 及 總 菌 數 ( total count ) 的 變 化 情 形, 結 果 如 圖 4.1 所 示 納 豆 激 酶 在 醱 酵 培 養 第 6 小 時 後, 開 始 產 生 納 豆 激 酶 活 性, 細 胞 對 數 生 長 到 10 小 時 之 後, 生 長 的 速 度 變 慢, 直 到 33 小 時 細 胞 濃 度 最 高, 此 時 ph 值 也 最 低, 之 後 細 胞 便 有 死 亡 的 現 象,pH 值 慢 慢 升 高 而 納 豆 激 酶 的 活 性 則 一 路 升 高 到 最 後 醱 酵 結 束, 醱 酵 培 養 至 第 42 小 時 產 生 最 高 的 活 性, 活 性 為 81.3 U/mL ; 比 較 細 胞 生 長 與 活 性 的 生 產, 納 豆 激 酶 的 生 產 是 屬 於 生 長 連 動 型, 在 醱 酵 末 期 細 胞 死 亡 的 期 間, 納 豆 激 酶 的 活 性 增 加, 此 時 期 推 測 培 養 基 中 營 養 成 分 處 於 匱 乏 的 狀 態, 還 存 活 的 細 胞 釋 放 納 豆 激 酶 以 分 解 死 亡 細 胞 所 釋 放 出 來 的 胞 內 蛋 白 質 成 分 作 為 自 己 的 營 養 源, 這 在 許 多 枯 草 桿 菌 屬 常 見 到 此 些 情 形 ( Putten et al., 1995; Putten et al., 1996 ) 從 醱 酵 過 程 ph 值 的 變 化 可 以 推 測 碳 源 的 利 用 情 形,pH 下 降 代 表 碳 源 被 代 謝 產 酸, 直 到 33 小 時,pH 反 轉 向 上, 此 時 的 碳 源 應 該 是 被 代 謝 殆 盡 了 43

55 但 批 次 醱 酵 能 供 應 的 營 養 源 有 限, 導 致 無 法 進 一 步 將 細 胞 密 度 提 高, 所 以 後 續 用 饋 料 批 次 醱 酵 策 略 提 供 細 胞 密 度, 補 充 營 養 源, 提 高 納 豆 激 酶 活 性 44

56 Activity (U/mL) OD 600nm OD 600nm Activity ph DO (%) ph DO (%) Time (hr) 圖 4.1 納 豆 激 酶 在 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph DO 及 總 菌 數 的 變 化 情 形 45

57 4.4 饋 料 批 次 醱 酵 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 I 將 種 菌 以 NB 培 養 基 培 養 至 OD 600nm 接 近 1 時, 再 接 種 至 醱 酵 槽 中, 醱 酵 體 積 為 1.5 L, 接 種 量 約 為 反 應 體 積 的 10 %, 進 行 批 次 醱 酵, ㄧ 開 始 進 行 批 次 醱 酵 ( 培 養 基 組 成 為 : 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O ) 約 培 養 至 第 5.5 小 時, 開 始 進 入 以 ph-stat 為 控 制 策 略 之 第 一 階 段 的 饋 料 批 次 醱 酵 ( 饋 料 培 養 基 為 11. 3% glucose 5.63% yeast extract 0.05% CaCl % NaHPO % MgSO % NH 4 Cl, 總 體 積 為 1L ), 此 階 段 的 饋 料 醱 酵 主 要 在 增 加 細 胞 的 濃 度 為 主 饋 料 期 間 細 胞 一 路 成 長, 在 醱 酵 培 養 第 20 小 時, 總 菌 數 就 維 持 穩 定, 此 時 也 用 完 第 一 階 段 的 饋 料 瓶, 而 在 醱 酵 第 26.5 小 時 加 入 第 二 階 段 的 饋 料, 第 二 階 段 策 略 上 是 誘 導 生 產 納 豆 激 酶 為 主, 誘 導 型 饋 料 培 養 基 為 ( 30% 黃 豆 粉 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O, 總 體 積 為 0.5 L ), 總 共 0.5 公 升 的 饋 料 體 積 分 成 兩 次 添 加, 在 26.5 小 時 加 入 0.25 L, 剩 下 的 培 養 基 則 在 40 小 時 加 入, 圖 4.2 表 示 整 個 醱 酵 過 程 納 豆 激 酶 活 性 ph 值 及 總 菌 數 ( total count ) 的 變 化 情 形 由 圖 所 中 可 知, 納 豆 激 酶 在 醱 酵 培 養 第 5.5 小 時 饋 入 碳 源 後, 活 性 開 始 產 生, 醱 酵 培 養 第 45 小 時 產 生 最 高 的 活 性, 活 性 為 U/mL ; 而 總 菌 數 在 第 31 小 時 達 46

58 到 最 高, 為 OD 600nm 值 為 98 47

59 OD 600nm Activity ph 7.5 Activity (U/mL) OD 600nm ph Time (hr) 圖 4.2 納 豆 激 酶 在 饋 料 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph 值 總 菌 數 的 變 化 情 形 48

60 4.4.2 饋 料 批 次 醱 酵 培 養 II 此 實 驗 與 前 次 的 實 驗 大 致 相 同, 但 將 為 增 加 細 胞 濃 度 而 添 加 的 饋 料 培 養 基 中 的 yeast extract 濃 度 減 半 首 先 將 種 菌 以 NB 培 養 基 培 養 至 OD 600nm 接 近 1 時, 接 種 至 醱 酵 槽 中, 醱 酵 體 積 為 1.5 L, 接 種 量 約 為 反 應 體 積 的 10%, 進 行 批 次 醱 酵 ( 培 養 基 組 成 為 : 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O ) 約 培 養 至 第 6 小 時, 開 始 進 入 ph-stat 為 醱 酵 策 略 之 第 一 階 段 饋 料 批 次 醱 酵, 和 之 前 饋 料 醱 酵 不 同 之 處 在 於 yeast extract 的 添 加 濃 度 減 半 ( Glucose feed medium 為 11.3% glucose 2.81% yeast extract 0.05% CaCl % NaHPO % MgSO % NH 4 Cl, 總 體 積 為 1 L ), 在 醱 酵 培 養 至 第 25 小 時, 總 菌 數 就 維 持 穩 定, 而 在 醱 酵 第 32 小 時 加 入 第 二 階 段 的 饋 料 批 次 誘 導 酵 素 生 產 的 培 養 基 ( 30% 黃 豆 粉 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O ) 目 的 在 於 提 高 細 胞 數, 產 生 更 多 的 蛋 白 質, 並 觀 察 菌 液 在 醱 酵 過 程 中, 其 納 豆 激 酶 活 性 ( nattokinase activity ) ph 值 溶 氧 值 及 總 菌 數 ( total count ) 的 變 化 情 形, 結 果 如 圖 4.2 所 示 納 豆 激 酶 在 醱 酵 培 養 第 6 小 時 饋 入 碳 源 後, 活 性 開 始 產 生, 並 在 醱 酵 培 養 至 第 45 小 時 產 生 最 高 的 活 性, 活 性 為 65.9 U/mL ; 而 總 菌 數 在 第 25 小 時 達 到 最 高, 為 OD 600nm = 38, 與 前 一 饋 料 策 略 的 納 豆 激 酶 活 性 菌 數 比 較, 其 活 性 和 菌 數 大 幅 減 少, 得 知 此 醱 酵 培 養 49

61 的 培 養 基 並 不 理 想 50

62 Activity (U/mL) OD 600nm ph DO (%) 20 OD 600nm 10 Activity 10 ph DO (%) Time (hr) 0 圖 4.3 納 豆 激 酶 在 饋 料 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph DO 及 總 菌 數 的 變 化 情 形 51

63 4.4.3 批 次 饋 料 醱 酵 培 養 III 將 種 菌 以 NB 培 養 基 培 養 至 OD 600nm 接 近 1 時, 接 種 至 醱 酵 槽 中, 醱 酵 反 應 體 積 為 1.5 L, 接 種 量 約 為 反 應 體 積 的 10%, 進 行 批 次 醱 酵 ( 培 養 基 組 成 為 : 3% 黃 豆 粉 3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O ) 培 養 約 第 6 小 時, 開 始 進 入 以 ph-stat 為 饋 料 策 略 之 第 一 階 段 饋 料 批 次 醱 酵, 培 養 基 成 分 ( Glucose feed medium 為 11.3% glucose 5.63% yeast extract 0.05% CaCl % NaHPO % MgSO % NH 4 Cl, 總 體 積 為 1 L ), 在 醱 酵 培 養 至 第 12 小 時, 總 菌 數 持 續 增 加, 而 在 醱 酵 第 19 小 時, 加 入 第 二 階 段 饋 料 醱 酵 的 誘 導 型 培 養 基 0.25 L, 以 誘 導 生 產 納 豆 激 酶 ( 30% 黃 豆 粉 11.3% glucose 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4.7H 2 O, 總 體 積 為 0.5 L ), 在 23 小 時 又 加 入 0.25 L, 和 之 前 的 培 養 基 不 同 之 處 在 於 多 添 加 了 glucose, 目 的 在 於 提 高 總 菌 數, 生 產 更 多 的 蛋 白 質, 並 觀 察 醱 酵 過 程 中, 納 豆 激 酶 活 性 ( nattokinase activity ) ph 值 溶 氧 值 及 總 菌 數 ( total count ) 的 變 化 情 形 結 果 如 圖 4.4 所 示, 納 豆 激 酶 在 醱 酵 培 養 第 6 小 時 後 饋 入 碳 源, 活 性 開 始 產 生, 醱 酵 培 養 第 48 小 時 產 生 最 高 的 活 性, 活 性 330 U/mL ; 而 總 菌 數 在 第 23 小 時 達 到 最 高, 為 OD 600nm = 102,pH 的 低 點 在 26 小 時, 之 後 穩 定 上 升, 細 胞 的 濃 度 逐 漸 降 低, 顯 然 細 胞 開 始 死 亡, 但 納 豆 激 酶 的 活 性 仍 然 持 續 上 升 到 最 高 點, 此 饋 料 策 略 的 納 豆 激 酶 活 性 菌 數 大 幅 增 加, 是 目 前 實 52

64 驗 最 好 的 策 略 53

65 Activity (U/mL) OD 600nm ph DO (%) OD 600nm Activity ph DO Time (hr) 圖 4.4 納 豆 激 酶 在 饋 料 批 次 醱 酵 中 納 豆 激 酶 之 活 性 ph DO 及 總 菌 數 的 變 化 情 形 54

66 4.5 酵 素 特 性 探 討 酵 素 之 ph 穩 定 性 探 討 將 不 同 ph 值 的 緩 衝 溶 液 及 粗 酵 素 液 以 體 積 比 9:1 混 合, 置 於 4 下 保 存 24 小 時, 以 探 討 酵 素 之 ph 穩 定 性, 結 果 如 圖 4.5 表 示 粗 酵 素 液 在 酸 性 溶 液 中 反 應 24 小 時, 殘 存 的 活 性 為 40% 左 右, 而 粗 酵 素 液 保 存 在 ph 6~7 之 間, 其 所 殘 留 的 活 性 較 高, 維 持 在 95% 以 上, 但 粗 酵 素 液 在 鹼 性 溶 液 中 保 存, 仍 可 維 持 在 80~85% 之 間 的 殘 存 活 性 55

67 100 (%) Relative activ ity ph 圖 4.5 酵 素 之 ph 穩 定 性 56

68 4.5.2 酵 素 之 熱 穩 定 性 酵 素 在 不 同 溫 度 下 之 熱 穩 定 性 試 驗, 熱 穩 定 性 則 是 以 30 的 酵 素 活 性 維 持 最 好,7 天 後 仍 可 維 持 55% 的 酵 素 活 性,70,1 天 的 條 件 下 其 活 性 會 完 全 消 失, 隨 著 溫 度 的 增 加, 單 位 時 間 內, 活 性 具 有 下 降 的 趨 勢 57

69 Relative activity (%) day 圖 4.6 酵 素 之 熱 穩 定 性 58

70 4.5.3 酵 素 貯 存 之 安 定 性 將 粗 酵 素 液 進 行 貯 存, 每 隔 24 小 時, 測 其 殘 留 之 酵 素 活 性, 以 了 解 不 同 的 貯 存 溫 度 下 酵 素 活 性 的 之 變 化 情 形 酵 素 活 性 實 驗 結 果 以 相 對 活 性 百 分 比 ( % ) 來 表 示, 並 以 貯 存 0 日 之 酵 素 活 性 為 100%, 其 結 果 如 圖 4.7 表 示 由 圖 中 可 知, 將 粗 酵 素 液 置 於 -20 貯 存 28 天, 仍 可 維 持 68% 的 酵 素 活 性, 貯 存 於 4 者, 可 維 持 65% 的 酵 素 活 性, 由 以 上 的 實 驗 得 知, 隨 著 貯 存 的 溫 度 及 時 間 的 增 加, 酵 素 的 殘 存 活 性 隨 之 降 低 59

71 Relative activity (%) day 圖 4.7 酵 素 貯 存 之 安 定 性 60

72 第 五 張 結 論 本 研 究 中, 由 市 售 納 豆 食 品 中 所 篩 選 出 之 納 豆 菌 ( 菌 株 A ), 在 三 角 錐 形 瓶 的 液 態 培 養 下, 培 養 基 含 有 3% 黃 豆 粉 3 % glucose, 並 額 外 添 加 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 和 0.1% MgSO 4 7H 2 O, 在 溫 度 rpm 的 轉 速 下, 進 行 振 盪 培 養, 經 醱 酵 培 養 48 小 時 之 後 得 到 最 佳 的 納 豆 激 酶 活 性 27 U/mL 以 五 公 升 醱 酵 槽 進 行 放 大 培 養 試 驗 中, 批 次 醱 酵 結 果 指 出, 接 種 10% 的 種 菌 液, 以 1 vvm 之 通 氣 量, 配 合 300 rpm 的 攪 拌 速 度, 於 37 下 進 行 放 大 培 養, 實 驗 結 果 指 出 納 豆 菌 於 培 養 基 含 3 % 黃 豆 粉 3% glucose 及 並 添 加 0.5% CaCO 3 0.5% KH 2 PO 4 和 0.1% MgSO 4 7H 2 O 之 培 養 基 中 培 養 第 42 小 時 出 現 最 佳 之 酵 素 活 性 ( 81.3 U/mL ), 再 利 用 醱 酵 槽 進 行 饋 料 批 次 放 大 培 養, 不 僅 能 提 高 納 豆 激 酶 的 產 量, 還 可 增 酵 素 活 性, 在 醱 酵 培 養 第 48 小 時 出 現 最 佳 之 酵 素 活 性 ( 330 U/mL ) 在 酵 素 的 ph 穩 定 性 及 溫 度 穩 定 性 實 驗 中, 粗 酵 素 液 於 ph 值 在 6.0 ~7.0 的 緩 衝 液 中, 最 能 夠 維 持 其 酵 素 活 性 熱 穩 定 性 則 是 以 30 的 酵 素 活 性 穩 定 性 最 好,7 天 後 仍 可 維 持 55% 的 酵 素 活 性, 在 70 條 件 下,1 天 的 時 間 活 性 就 會 完 全 消 失 將 粗 酵 素 液 保 存 於 -20 及 4 的 條 件 下, 一 個 月 後 仍 可 維 持 約 65~68% 的 酵 素 活 性 61

73 第 六 章 參 考 文 獻 須 見 洋 行 2005 納 豆 青 蔬 汁 治 好 我 們 的 心 血 管 慢 性 病 心 肌 梗 塞 腦 中 風 糖 尿 病 痴 呆 症 世 茂 出 版 社 台 北, 台 灣 須 見 洋 行 2006 納 豆 激 酶 的 驚 異 效 果 蔡 忠 芬,2003 如 何 預 防 腦 中 風 耕 莘 醫 訊 敏 濤 2004 豆 製 品 治 病 養 生 妙 方 林 鬱 文 化 事 業 有 限 公 司 台 北, 台 灣 蘇 遠 志 2003 納 豆 菌 代 謝 產 物 的 開 發 與 應 用 生 物 產 業 14(2): 蘇 偉 迪,2005, 利 用 納 豆 菌 生 產 納 豆 激 酶 之 研 究 大 業 大 學 生 物 產 業 科 技 學 系 碩 士 論 文 許 元 勳 2003 現 代 生 物 科 技 的 新 寵 兒 - 神 奇 納 豆 菌 生 物 產 業 14(1): 53-9 廖 曉 玲 2002 新 世 紀 醫 學 - 納 豆 天 然 的 藥 用 食 品 安 立 出 版 社 台 北, 台 灣 黃 卓 治 辛 志 勳 張 文 重 1977a 納 豆 菌 之 研 究 I 納 豆 菌 培 養 條 件 之 檢 討 屏 東 農 專 學 報 18:69-75 邱 繼 正,2004, 影 響 納 豆 激 酶 生 產 之 液 態 發 酵 及 熱 穩 定 性 之 條 件 探 62

74 討 南 台 科 技 大 學 生 物 科 技 系 碩 士 論 文 吳 侑 軒,2003, 液 態 黑 納 豆 對 於 皮 膚 保 健 之 研 究 靜 宜 大 學 應 用 化 學 研 究 所 碩 士 論 文 吳 世 佑,2005, 從 市 售 納 豆 健 康 食 品 中 篩 選 納 豆 菌 並 探 討 最 適 化 生 產 納 豆 激 酶 之 培 養 條 件 大 同 大 學 生 物 工 程 研 究 所 碩 士 論 文 陳 麗 花 陳 有 容 齊 鳳 蘭,2001, 功 能 性 食 品 - 納 豆 的 研 制 上 海 水 產 大 學 學 報 10: 劉 宇 峰 王 金 英 孫 岸 王 占 斌 楊 洪 波,2000, 豆 豉 溶 纖 酵 素 保 健 功 能 食 品 的 研 制 黃 豆 通 報 2:22-23 董 明 盛 江 曉 劉 誠 江 漢 湖,2000, 胞 外 纖 溶 酵 素 產 生 菌 的 篩 選 及 其 產 酵 素 條 件 研 究 食 品 與 醱 酵 工 業 27:23-26 董 明 盛 江 曉 江 漢 湖 陳 伯 祥,2000, 溶 栓 納 豆 菌 的 篩 選 與 應 用 中 國 釀 造 109:11-13 董 明 盛 江 曉 江 漢 湖 陳 伯 祥,2001, 溶 栓 納 豆 菌 的 篩 選 鑑 定 及 其 發 酵 特 性 研 究 南 京 農 業 大 學 學 報 24(1):95-98 彭 勇 張 義 正,2002, 解 澱 粉 芽 孢 桿 菌 (Bacillus amyloliquefacines) DC-4 產 豆 豉 溶 栓 酵 素 發 酵 條 件 的 優 化 食 品 與 發 酵 工 業 28(4):19-23 鐘 青 萍 余 世 望 梁 生 媛,2001, 納 豆 菌 產 生 抗 菌 物 質 的 培 養 條 件 的 優 化 生 藥 學 雜 誌 18(6):

75 鐘 青 萍 余 世 望 梁 生 媛,2001, 納 豆 菌 產 生 抗 菌 物 質 的 培 養 條 件 的 優 化 食 品 工 業 科 技 22 (5) :20-22 謝 寶 全 鄧 德 豐 陳 武 元 林 麗 菁,2004 納 豆 菌 之 液 態 培 養 及 其 產 生 Nattokinase 之 探 討 九 十 一 年 度 國 科 會 專 題 研 究 計 畫 成 果 報 告 譚 周 進 周 傳 雲 廖 興 華 蕭 啟 明 黃 靜,2003 原 料 對 納 豆 品 性 的 影 響 食 品 科 學 24 (1) : 陳 志 文 徐 爾 尼 蕭 美 燕,2002 納 豆 激 酶 的 研 究 進 展 食 品 科 技 2 : 鮑 時 翔 田 艷 黃 惠 琴 凌 華 呂 嘉 森,2002 納 豆 菌 液 體 發 酵 生 產 納 豆 激 酶 的 研 究 藥 物 生 產 科 技 9 (6) : 王 發 祥 鐘 青 萍 鐘 士 清,2003 納 豆 菌 液 態 發 酵 條 件 的 初 步 研 究 廣 州 食 品 工 業 科 技 19 : 王 淑 貞 1999 黃 麴 菌 及 枯 草 菌 超 氧 歧 化 酶 之 研 究 靜 宜 大 學 食 品 營 養 系 碩 士 論 文 林 定 國 黃 暐 光 1994 如 何 攝 取 食 物 纖 維 生 活 醫 學 書 房 台 北, 台 灣 范 敏 慧 1994 枯 草 菌 IMR-NK-1 血 纖 維 蛋 白 酶 之 純 化 及 性 質 研 究 靜 宜 大 學 食 品 營 養 研 究 所 碩 士 論 文 張 壽 昌 2000 大 豆 蛋 白 健 康 機 能 解 讀 食 品 資 訊 178:

76 陳 婷 鈺 2002 鏈 激 酶 突 變 種 ( SKβK180A ) 的 蛋 白 結 晶 與 鏈 激 酶 / 人 類 血 纖 維 蛋 白 溶 酶 / 酶 原 作 用 結 構 型 之 建 立 台 大 醫 學 院 口 腔 生 物 科 技 學 研 究 所 碩 士 論 文 許 元 勳 2003 現 代 生 物 科 技 的 新 寵 兒 - 神 奇 納 豆 菌 生 物 產 業 14(1): 53-9 黃 天 守 1994 生 理 學 手 冊 合 記 圖 書 出 版 社 台 北, 台 灣 黃 卓 治 辛 志 勳 張 文 重 1977a 納 豆 菌 之 研 究 I 納 豆 菌 培 養 條 件 之 檢 討 屏 東 農 專 學 報 18:69-75 黃 卓 治 辛 志 勳 張 文 重 1978 納 豆 菌 之 研 究 III 納 豆 菌 蛋 白 質 分 解 酵 素 生 產 條 件 之 探 討 屏 東 農 專 學 報 19:92-8 黃 宗 慶 1999 攝 食 枯 草 菌 發 酵 大 豆 黑 豆 及 薏 仁 對 老 鼠 血 液 血 纖 維 蛋 白 水 解 活 性 及 凝 血 作 用 之 影 響 靜 宜 大 學 食 品 營 養 學 系 碩 士 論 文 廖 曉 玲 2002 新 世 紀 醫 學 - 納 豆 天 然 的 藥 用 食 品 安 立 出 版 社 台 北, 台 灣 鄭 奕 帝 1999 認 識 大 豆 異 黃 酮 與 骨 質 疏 鬆 症 食 品 資 訊 161:48-51 蘇 遠 志 2003 納 豆 菌 代 謝 產 物 的 開 發 與 應 用 生 物 產 業 14(2): Chang, C.T., M.H. Fan, F.C. Kuo, and H.Y. Sung, Potent 65

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79 of alkaline serine protease by Bacillus licheniformis. Analaly Chimica Acta 371: Putten, A.B. van, Spitzenberger, F., Kretzmer, G., Hitzmann, B., Dors, M., Simutis, R. and Schugerl, K Improvement of the production of subtilisin Carlsberg alkaline protease by Bacillus licheniformis by on-line process monitoring and cortrol in a stirred tank reactor. Journal of Biotechnology 49: Peng, Y., Q. Huang, R.H. Zhang, and Y.Z. Zhang, Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacullus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food. Comparative Biochemistry and Physiology Part B 134: Samy, A., and E. Aassar, Production and properties of fibrinolytic enzyme in solid state cultures of Fusarium pallidoroseum. Biotechnology Letters 17 : Saono, S., I. Gandjar, T. Basuki, and H. Karsono, Annales Bogoriensis 5, 187. Sato, T., Y. Yamada, Y. Ohtani, N. Mitsui, H. Murasawa, and S. Araki, 2001.Production of Menaquinone (Vitamin K2)-7 by Bacillus 68

80 subtilis. Journal of Bioscience and Bioengineering 91: Sumi, H., Nattokinase properties and recent application for heathy food. Biology Industrial 7: Sumi, H., H. Hamada, H. Mihara, K. Nakanishi, and H. Hiratani, Fibrinolytic effect of the Japanese traditional food Natto (Nattokinase). Thrombosis Haemostas 62:549. Sumi, H., H. Hamada, K. Nakanishi, and H. Hiratani, Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of Nattokinase I. Acta Haematol 84: Sumi, H., H. Hamada, H. Tsushima, and H. Mihara, A novel strong fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto. Fibrinolysis 2:67. Sumi, H., H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, and H. Muraki, A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experientia 43: Sumi, H., N. Nakajima, and C. Yatagai, A unique strong fibrinolytic enzyme ( katsuwokinase ) in skipjack Shiokara, a Japanese traditional fermented food. Compound Biochemistry 69

81 Physiological 112B: Sun, T., B. Liu, P. Li, D. Liu, and Z. Li, New solid-state fermentation process for repeated batch production of fibrinolytic enzyme by Fusarium oxysporum. Process Biochemistry 33(4): Vaughan, D.E., Angiotensin, fibrinolysis, and vascular homeostasis. American Journal of Cardiology 87:18C-24C. Vorderman, A.G., Geneeskundig Tijdschrift voor Nederlands Indie 42,