124 中 国 食 品 卫 生 杂 志 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年 第 26 卷 第 2 期 detection assay for cereal derived ingredients in dairy products. Key words: T
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- 韬 羊
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1 实 时 荧 光 PCR 法 检 测 奶 制 品 中 常 见 谷 物 成 分 刘 小 艳, 等 123 [ 5 ] Keramas G,Bang D D,Lund M,et al. Development of a sensitive DNA microarray suitable for rapid detection of Campylobacter spp. [ J]. Mol Cell Probes,2003,17(4): [ 6 ] Van de Giessen A W,Tilburg J J,Ritmeester W S,et al. Reduction of Campylobacter infections in broiler flocks by application of hygiene measures[j]. Epidemiol Infect,1998,121(1): [ 7 ] Vandamme P,Van Doorn L J,al Rashid S T,et al. Campylobacter hyoilei Alderton et al and Campylobacter coli Véron and Chatelain 1973 are subjective synonyms[ J]. Int J Syst Bacteriol, Int J Syst Bacteriol,1997,47(4): [ 8 ] 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部, 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会. GB / T 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 空 肠 弯 曲 菌 [ S]. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社,2008. [ 9 ] 杨 毓 环, 洪 锦 春, 张 巧 姬. 空 肠 和 结 肠 弯 曲 菌 鞭 毛 蛋 白 基 因 flaa 的 检 测 [J]. 中 国 食 品 卫 生 杂 志,2007,19(4): [10] 何 蕊, 黄 金 林, 许 海 燕, 等. 弯 曲 菌 多 重 PCR 检 测 方 法 的 建 立 及 其 初 步 应 用 [J]. 扬 州 大 学 学 报,2007,28(1):5 8. [11] 娜 仁 高 娃, 陈 霞, 吴 聪 明. 鸡 源 空 肠 弯 曲 菌 和 结 肠 弯 曲 菌 的 临 床 分 离 及 多 重 PCR 鉴 定 [J]. 中 国 兽 医 杂 志,2010,46(1): [12] Yamazaki W. Sensitive and rapid detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli using loop mediated isothermal ampli fication[ J]. Methods Mol Biol,2013,943: 论 著 实 时 荧 光 PCR 法 检 测 奶 制 品 中 常 见 谷 物 成 分 刘 小 艳 1, 傅 春 玲 1, 李 培 2, 丁 洪 流 2 2, 金 萍 (1. 苏 州 大 学 医 学 部 公 共 卫 生 学 院, 江 苏 苏 州 ; 2. 苏 州 市 产 品 质 量 监 督 检 验 所, 江 苏 苏 州 ) 摘 要 : 目 的 建 立 Taqman 实 时 荧 光 PCR 法 对 奶 制 品 中 掺 加 物 大 米 玉 米 小 麦 高 粱 大 麦 等 谷 物 源 性 成 分 的 初 筛 检 测 体 系 方 法 以 常 见 掺 加 物 大 米 玉 米 小 麦 高 粱 大 麦 等 谷 物 的 叶 绿 体 rbcl 基 因 作 为 靶 基 因, 通 过 BLAST 软 件 比 对, 选 择 其 同 源 保 守 区 域 设 计 引 物 和 探 针 经 通 用 性 特 异 性 灵 敏 性 试 验 对 探 针 和 引 物 可 行 性 进 行 验 证, 并 通 过 模 拟 含 谷 物 奶 粉 及 市 售 奶 类 制 品 检 测 对 其 实 际 检 测 能 力 进 行 验 证 结 果 所 建 立 体 系 可 扩 增 大 米 玉 米 小 麦 高 粱 大 麦 等 常 见 的 谷 物 掺 加 物 的 DNA 提 取 物, 与 市 售 奶 制 品 的 主 成 分 牛 奶 羊 奶 以 及 其 常 见 添 加 物 香 蕉 红 枣 菠 萝 草 莓 西 红 柿 花 生 大 豆 等 动 植 物 源 性 成 分 无 交 叉 扩 增 ( Ct > 35) 对 小 麦 纯 DNA 提 取 物 检 出 限 为 0 01 ng 对 分 别 掺 加 5 种 谷 物 成 分 的 模 拟 奶 制 品 检 出 限 均 可 达 0 5%, 对 市 售 的 14 份 奶 类 食 品 中 的 谷 类 成 分 的 检 测 结 果 均 与 食 品 标 签 相 符 结 论 本 研 究 建 立 的 Taqman 实 时 荧 光 PCR 体 系 具 有 通 用 相 对 特 异 灵 敏 实 用 等 优 点, 可 用 于 奶 制 品 中 掺 加 或 掺 杂 掺 假 谷 物 源 性 成 分 的 快 速 定 性 检 测 关 键 词 :Taqman 实 时 荧 光 PCR; rbcl 基 因 ; 谷 物 源 性 成 分 ; 奶 制 品 ; 掺 杂 掺 假 ; 食 品 安 全 中 图 分 类 号 :R155; R155 57; TS207 3 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2014) DOI: / j. cjfh Detection of common cereal ingredients in dairy products by real time PCR method LIU Xiao yan, FU Chun ling, LI Pei, DING Hong liu, JIN Ping ( School of Public Health, Medical College of Soochow University, Jiangsu Suzhou , China) Abstract: Objective A Taqman real time PCR was developed to detect cereal derived ingredients adulterated in dairy products. Methods The universal primers and probe for cereals were designed according to the homogeneous region of rbcl gene by blasting the rbcl gene of rice, maize, wheat, sorghum and barley. And the assay was evaluated by universality and sensitivity test. Meanwhile, its practicability was verified using simulated samples and market samples. Results implicated that the primers probe system could detect DNA fragments of rice, maize, wheat, sorghum and barley with no cross reaction to banana, jujube, pineapple, strawberry, tomato, peanut, soybean, bovine, ovine which may occur in dairy products (Ct > 35). The detection limit was 0 01 ng for pure wheat DNA and 0 5% for each of five cereals in dairy mixtures. 14 market dairy samples were analyzed for cereal ingredients, and were all consistent with their food labels. Conclusion The study suggested that the developed Taqman real time PCR method was a rapid, sensitive and efficacious 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 苏 州 市 科 技 支 撑 计 划 项 目 (SS201126) 作 者 简 介 : 刘 小 艳 女 硕 士 生 研 究 方 向 为 食 品 卫 生 E mail:girl_liu@ 126. com 通 讯 作 者 : 傅 春 玲 女 副 教 授 研 究 方 向 为 营 养 与 食 品 卫 生 E mail:fuchunling@ suda. edu. cn
2 124 中 国 食 品 卫 生 杂 志 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年 第 26 卷 第 2 期 detection assay for cereal derived ingredients in dairy products. Key words: Taqman real time PCR; rbcl gene; cereals; dairy; adulterats; food safety 奶 制 品 掺 杂 掺 假 以 次 充 好 一 直 是 影 响 奶 制 品 安 全 的 重 要 问 题 其 中 以 低 成 本 的 谷 物 源 性 成 分 掺 入 奶 制 品 中 冒 充 高 价 奶 成 分 最 为 常 见 从 掺 米 汤 面 粉 淀 粉 到 糊 精 植 物 蛋 白, 掺 加 手 段 越 来 越 复 杂 掺 假 方 式 也 呈 现 多 样 化 趋 势, 从 掺 单 一 物 质 到 同 时 掺 多 种 物 质 这 使 得 对 奶 制 品 的 掺 伪 鉴 别 和 安 全 监 管 变 得 越 来 越 困 难 目 前 对 奶 制 品 掺 谷 物 源 性 成 分 的 检 测 仍 以 传 统 化 学 方 法 最 为 常 [1 - 见 3] 化 学 方 法 虽 能 检 测 出 奶 制 品 中 掺 加 的 淀 粉 形 式 或 糊 精 形 式 的 谷 物 源 性 成 分, 但 灵 敏 度 低, 且 存 在 人 为 判 断 误 差, 对 于 非 淀 粉 形 式 的 谷 物 源 性 成 分 的 掺 假 难 以 检 出, 不 能 满 足 市 场 监 督 的 要 求 实 时 荧 光 PCR 方 法 是 以 DNA 为 基 础 的 一 种 检 测 技 术, 不 受 掺 加 形 式 的 影 响, 可 以 进 行 快 速 批 量 自 动 实 时 检 测 分 析, 具 有 灵 敏 度 高 准 确 性 [4 - 好 等 优 点, 已 广 泛 用 于 食 品 掺 杂 掺 假 的 检 测 5] 本 研 究 建 立 了 基 于 Taqman 实 时 荧 光 PCR 法 对 奶 制 品 中 掺 加 谷 物 源 性 成 分 的 通 用 性 检 测 方 法 1 材 料 与 方 法 1 1 材 料 样 品 香 蕉 菠 萝 红 枣 草 莓 西 红 柿 花 生 大 豆 小 麦 粉 大 米 高 粱 玉 米 大 麦 购 自 苏 州 各 大 型 超 市 ; 鲜 牛 奶 鲜 羊 奶 购 自 苏 州 某 奶 农 处, 于 - 20 保 存 备 用, 用 于 通 用 性 和 特 异 性 检 测 在 苏 州 市 选 取 不 同 的 大 中 小 型 超 市 分 别 抽 样 购 买 全 脂 奶 粉 婴 儿 配 方 奶 粉 纯 牛 奶 纯 羊 奶 粉 奶 酪 酸 奶 婴 儿 奶 米 粉 乳 清 蛋 白 米 粉 营 养 麦 芽 蛋 白 型 固 体 饮 料 共 14 份 奶 类 样 品, 用 于 方 法 的 实 际 应 用 检 测 主 要 仪 器 与 试 剂 Bio photometer plus 核 酸 蛋 白 含 量 测 定 仪 ( 德 国 Eppen dorf) 7500 fast real time PCR 仪 ( 美 国 ABI) DKB 1915 型 恒 温 水 浴 槽 JFSD 100 型 粉 碎 机 冷 冻 离 心 机 细 胞 组 织 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 均 购 自 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司, Taqman universal PCR master mix ( 美 国 ABI) PBS ( 磷 酸 盐 缓 冲 体 系,pH = 7 2) 购 自 友 康 基 业 生 物 科 技 ( 北 京 ) 有 限 公 司 无 水 乙 醇 ( 分 析 纯 ) 1 2 方 法 样 品 制 备 大 米 高 粱 玉 米 大 麦 大 豆 花 生 样 品 经 粉 碎 机 磨 成 粉, 过 80 目 筛, 备 用 ; 香 蕉 菠 萝 等 水 果 样 品 采 用 组 织 研 磨 器 加 液 氮 研 磨 成 粉, 备 用 ; 奶 酪 用 剪 刀 剪 成 细 小 颗 粒, 备 用 不 同 样 品 分 开 处 理, 以 防 交 叉 污 染 DNA 提 取 牛 奶 羊 奶 等 液 体 样 品 [6] : 取 10 ml 样 品,1 500 g 离 心 15 min, 去 上 清 ; 将 沉 淀 重 新 悬 浮 于 2 ml PBS 中, g 离 心 5 min, 如 此 重 复 3 次, 最 终 将 沉 淀 悬 浮 于 200 μl PBS 中 后 按 细 胞 组 织 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 说 明 书 操 作 步 骤 进 行 水 果 样 品 : 取 处 理 好 的 样 品 约 50 mg, 按 照 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 说 明 书 操 作 步 骤 进 行 奶 粉 谷 物 奶 酪 等 其 他 样 品 : 取 处 理 好 的 样 品 约 30 mg, 按 照 细 胞 组 织 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 说 明 书 操 作 步 骤 进 行, 略 作 修 改, 使 蛋 白 酶 K 消 化 时 间 由 1 ~ 3 h 延 长 至 消 化 过 夜 引 物 和 探 针 设 计 根 据 GenBank 所 公 布 的 大 米 玉 米 小 麦 高 粱 大 麦 ( D00207 Z11973 D00206 AM X00630) 的 rbcl 基 因 序 列, 经 BLAST 软 件 比 对 后, 取 同 源 保 守 区 域, 利 用 Primer express 3 0 软 件 设 计 引 物 及 探 针, 见 表 1 Table 1 表 1 引 物 探 针 序 列 Sequences of primers and probe 引 物 探 针 碱 基 序 列 (5 3 ) 片 段 大 小 / bp 上 游 引 物 TGTTGATTTATTGCGCGATGAT 下 游 引 物 CGGTATAACACCTGGCATGGA 94 探 针 FAM ATCGTTCTCGCGGTATCTTTTTCACTCAGG TAMARA 实 时 荧 光 PCR 反 应 反 应 体 系 :ABI Taqman Gene Expression Master Mix, 12 5 μl; 上 下 游 引 物 各 1 μl, 荧 光 标 记 探 针 1 μl, 终 浓 度 均 为 0 4 μmol / L; 模 板 DNA( ~ 25 ng / μl) 2 μl; 用 灭 菌 双 蒸 水 补 齐 至 25 μl 反 应 条 件 :50, 2 min;95,10 min;95,15 s;60,1 min,40 个 循 环 使 用 7500 software V2 0 6 进 行 数 据 分 析 通 用 性 和 特 异 性 试 验 取 小 麦 大 米 玉 米 大 麦 高 粱 香 蕉 红 枣 菠 萝 草 莓 西 红 柿 花 生 大 豆 鲜 牛 奶 鲜 羊 奶 样 品 提 取 DNA 模 板 调 整 模 板 浓 度 为 25 ng / μl, 各 取 2 μl, 分 别 进 行 实 时 荧 光 PCR 反 应, 以 验 证 所 设 计 的 引 物 探 针 的 通 用 性 和 特 异 性 灵 敏 度 试 验 取 小 麦 粉 提 取 DNA, 用 灭 菌 双 蒸 水 10 倍 倍 比
3 实 时 荧 光 PCR 法 检 测 奶 制 品 中 常 见 谷 物 成 分 刘 小 艳, 等 125 稀 释, 使 DNA 浓 度 为 ~ 5 ng / μl 取 2 μl 作 为 模 板, 每 个 浓 度 设 3 个 平 行, 分 别 进 行 实 时 荧 光 PCR 扩 增 为 进 一 步 检 测 该 引 物 探 针 体 系 的 灵 敏 度, 将 小 麦 粉 和 全 脂 牛 奶 粉 配 制 成 不 同 含 量 的 模 拟 样 品 使 小 麦 粉 在 混 合 样 中 所 占 的 质 量 分 数 分 别 为 30% 10% 5% 1% 0 5% 对 每 个 混 合 样 提 取 DNA 模 板 进 行 实 时 荧 光 PCR 反 应 模 拟 样 品 及 市 售 奶 制 品 中 谷 物 成 分 的 实 用 性 检 测 将 米 粉 玉 米 粉 高 粱 粉 大 麦 粉 分 别 用 全 脂 牛 奶 粉 配 制 成 0 5% (W / W) 的 模 拟 样 品 同 时, 收 集 市 场 常 见 奶 类 食 品 共 14 份 样 品 备 用 提 取 其 DNA 模 板 进 行 实 时 荧 光 PCR 反 应, 以 进 一 步 验 证 该 引 物 探 针 体 系 的 准 确 性 和 实 用 性 2 结 果 与 分 析 2 1 通 用 性 和 特 异 性 试 验 由 图 1 可 知, 所 设 计 的 引 物 探 针 体 系 对 奶 制 品 中 常 见 的 掺 加 物 小 麦 大 米 玉 米 大 麦 高 粱 5 种 谷 物 成 分 进 行 正 常 扩 增,Ct 值 在 18 ~ 22 之 间, 而 对 市 售 奶 制 品 的 主 成 分 牛 奶 羊 奶 及 其 常 见 添 加 物 香 蕉 红 枣 菠 萝 草 莓 西 红 柿 花 生 大 豆 等 动 植 物 源 性 成 分 未 见 有 效 扩 增, 其 Ct 值 均 > 35, 故 以 此 作 为 阴 性 样 品 判 断 标 准, 可 见 该 引 物 探 针 体 系 对 奶 制 品 中 常 见 的 谷 物 源 性 掺 加 成 分 小 麦 大 米 玉 米 大 麦 高 粱 等 的 扩 增 具 有 很 好 的 通 用 性, 而 与 奶 制 品 标 签 中 常 被 标 明 的 主 成 分 牛 奶 羊 奶 以 及 其 常 见 添 加 物 香 蕉 红 枣 菠 萝 草 莓 西 红 柿 花 生 大 豆 等 无 交 叉 扩 增, 表 现 较 好 的 相 对 的 特 异 性 这 说 明 该 引 物 探 针 体 系 的 通 用 性 和 相 对 特 异 性 结 果 能 满 足 奶 制 品 掺 加 谷 物 源 性 成 分 的 通 用 性 检 测 的 要 求 有 效 扩 增, 故 该 引 物 探 针 体 系 对 小 麦 DNA 的 灵 敏 度 确 定 为 0 01 ng 对 质 量 百 分 比 为 30% 10% 5% 1% 0 5% ( W / W) 的 小 麦 粉 和 奶 粉 混 合 样 品 DNA 均 出 现 扩 增 曲 线,Ct 值 在 19 3 ~ 26 0( 见 图 3), 可 将 该 引 物 探 针 体 系 对 模 拟 样 品 的 灵 敏 度 确 定 为 0 5% (W / W) 可 见 该 方 法 对 小 麦 DNA 和 掺 加 有 谷 类 的 奶 类 混 合 制 品 均 具 有 较 高 的 灵 敏 度, 可 以 满 足 定 性 检 测 需 要 图 2 小 麦 粉 DNA 的 实 时 荧 光 PCR 检 测 灵 敏 度 Figure 2 Sensitivity result of wheat DNA with real time PCR 图 3 奶 粉 中 不 同 质 量 分 数 的 小 麦 粉 成 分 的 实 时 荧 光 PCR 检 测 灵 敏 度 Figure 3 Amplification curve generated by different wheat powder percentage 2 3 模 拟 样 品 及 市 售 奶 制 品 中 谷 物 源 性 成 分 的 实 用 性 检 测 验 证 为 进 一 步 验 证 该 引 物 探 针 体 系 的 实 用 性 和 准 确 性, 用 所 建 立 的 引 物 探 针 体 系, 对 米 粉 玉 米 粉 高 粱 粉 大 麦 粉 4 种 谷 物 源 性 成 分 的 模 拟 混 合 样 品 进 行 检 测,0 5% (W / W) 的 米 粉 玉 米 粉 高 粱 粉 大 麦 粉 的 模 拟 奶 类 样 品 均 出 现 扩 增 ( 见 图 4) 这 进 一 步 证 实 了 该 引 物 探 针 体 系 的 灵 敏 度 为 0 5% 质 量 分 图 1 通 用 性 试 验 扩 增 结 果 Figure 1 The results for universality test 2 2 灵 敏 度 试 验 由 图 2 可 知, 小 麦 粉 DNA 10 ~ ng 均 出 现 扩 增 曲 线 根 据 通 用 性 试 验 中 的 Ct 值 > 35 阴 性 判 定 标 准, 因 ng 小 麦 DNA 的 Ct > 35 不 能 作 为 图 4 模 拟 样 品 的 实 时 荧 光 PCR 检 测 结 果 Figure 4 Amplification curve generated by model samples
4 126 中 国 食 品 卫 生 杂 志 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年 第 26 卷 第 2 期 数 的 奶 粉 混 合 模 拟 样 品, 同 时 也 验 证 了 该 引 物 探 针 体 系 在 对 奶 制 品 中 掺 加 的 谷 物 源 性 成 分 的 检 测 具 有 可 行 性 对 购 自 苏 州 各 不 同 超 市 的 14 份 奶 制 品 样 品 进 行 检 测 能 力 验 证, 结 果 见 表 2 该 引 物 探 针 体 系 对 含 有 大 米 成 分 和 麦 芽 提 取 物 成 分 的 含 谷 物 源 性 成 分 的 奶 制 品 样 品 出 现 阳 性 扩 增, 而 对 其 他 不 含 谷 物 源 性 成 分 的 样 品 均 无 阳 性 扩 增, 且 检 测 判 定 结 果 与 食 品 标 签 完 全 符 合 说 明 该 引 物 探 针 体 系 具 有 实 用 性, 可 用 于 奶 类 食 品 掺 加 谷 物 源 性 成 分 的 检 测 Table 2 表 2 市 售 样 品 检 测 结 果 Test results of commercial samples 样 品 名 称 标 识 主 成 分 样 品 数 / 份 Ct 值 检 测 结 果 判 定 结 果 纯 牛 奶 酸 奶 生 牛 乳 鲜 奶 等 4 ND - 与 标 识 相 符 全 脂 奶 粉 纯 羊 奶 粉 奶 酪 生 牛 乳 鲜 牛 奶 乳 粉 生 羊 乳 等 5 ND - 与 标 识 相 符 婴 儿 配 方 奶 粉 生 牛 乳 乳 清 蛋 白 粉 脱 脂 奶 粉 大 豆 磷 脂 等 2 35 ~ 39 - 与 标 识 相 符 婴 儿 奶 米 粉 乳 清 蛋 白 米 粉 大 米 全 脂 奶 粉 酸 奶 粉 大 豆 蛋 白 浓 缩 乳 清 蛋 白 等 2 21 ~ 23 + 与 标 识 相 符 营 养 麦 芽 蛋 白 型 固 体 饮 料 麦 芽 提 取 物 全 脂 奶 粉 乳 清 粉 大 豆 蛋 白 粉 等 1 29 ~ 30 + 与 标 识 相 符 注 :ND 为 未 检 测 到 ; - 为 未 检 测 出 谷 物 成 分 ; + 为 检 测 出 谷 物 成 分 3 讨 论 国 外 多 利 用 real time PCR 技 术 对 低 价 奶 代 替 高 价 奶 的 掺 假 行 为 进 行 检 测 [7-10], 但 涉 及 植 物 成 分 掺 假 的 研 究 较 少 ; 而 国 内 利 用 荧 光 PCR 方 法 对 奶 类 食 品 掺 假 的 研 究 主 要 是 针 对 植 物 类 中 大 豆 成 分 的 检 测 [11] 目 前 市 场 监 督 抽 查 奶 制 品 是 否 掺 杂 掺 假 面 粉 淀 粉 等 植 物 成 分 主 要 是 从 感 官 和 化 学 方 法 的 角 度 来 判 断 这 种 方 法 灵 敏 度 低 存 在 人 为 判 断 误 差, 且 对 于 奶 类 产 品 中 掺 加 非 淀 粉 形 式 的 谷 物 源 性 成 分 ( 如 蛋 白 类 物 质 ) 掺 假 不 能 检 出, 不 能 满 足 市 场 [12] 监 督 执 法 的 要 求 李 亮 等 利 用 近 红 外 光 谱 法 检 测 牛 奶 中 掺 植 物 性 填 充 物, 但 需 要 足 够 的 专 业 知 识 [13] 建 立 模 型 才 能 进 行 分 析 ; 覃 芳 芳 等 利 用 普 通 PCR 对 牛 奶 中 植 物 成 分 进 行 检 测, 但 此 方 法 具 有 普 通 PCR 低 通 量 特 异 性 差 易 污 染 需 电 泳 等 缺 点 本 研 究 建 立 的 对 奶 制 品 中 掺 加 谷 物 源 性 成 分 的 实 时 荧 光 PCR 法 可 以 弥 补 上 述 检 测 的 不 足 谷 物 成 分 是 奶 制 品 中 常 见 的 植 物 源 性 掺 杂 掺 假 物, 种 类 众 多 为 获 得 较 好 的 通 用 性, 本 研 究 选 择 通 用 性 较 好 的 叶 绿 体 rbcl 基 因 作 为 靶 基 因 [14] 因 大 米 玉 米 小 麦 高 粱 大 麦 最 为 常 见 且 具 有 代 表 性, 故 本 研 究 选 择 该 5 种 谷 物 成 分 进 行 通 用 性 检 测 经 试 验 证 实, 该 引 物 探 针 体 系 对 该 5 种 谷 物 都 具 有 较 好 的 扩 增, 但 对 市 场 上 奶 制 品 标 签 中 常 被 标 识 的 主 成 分 牛 奶 羊 奶 以 及 其 他 常 见 添 加 物 香 蕉 红 枣 菠 萝 草 莓 西 红 柿 花 生 大 豆 等 动 植 物 源 性 成 分 无 交 叉 扩 增, 表 现 出 较 好 的 相 对 特 异 性 进 一 步 经 灵 敏 度 试 验 和 实 用 性 检 测 验 证, 本 研 究 建 立 的 引 物 探 针 体 系 灵 敏 度 高, 对 小 麦 提 取 的 纯 DNA 检 出 限 为 0 01 ng, 对 模 拟 奶 制 品 中 5 种 谷 物 成 分 的 检 出 限 均 为 0 5% 质 量 分 数 本 方 法 实 用 性 强, 在 对 市 售 奶 制 品 的 检 测 中, 该 体 系 只 对 含 谷 物 源 性 成 分 的 奶 制 品 样 品 出 现 阳 性 扩 增, 而 对 其 他 不 含 谷 物 源 性 成 分 的 样 品 均 无 阳 性 扩 增, 且 检 测 结 果 均 与 其 食 品 标 签 相 符 因 此, 本 研 究 建 立 的 Taqman 实 时 荧 光 PCR 体 系 具 有 通 用 相 对 特 异 灵 敏 实 用 等 优 点, 可 用 于 奶 制 品 中 掺 加 谷 物 源 性 成 分 的 快 速 定 性 检 测, 为 市 场 监 督 部 门 和 检 验 检 疫 部 门 防 范 相 关 食 品 掺 假 提 供 技 术 手 段 参 考 文 献 [ 1 ] 赵 光 华, 胡 京 枝, 金 明 奎. 乳 品 中 常 见 掺 假 手 段 及 其 鉴 别 [ J]. 质 量 监 督 与 检 验,2007(4): [ 2 ] 邓 会 玲, 万 宇 平, 贾 芳 芳, 等. 乳 品 掺 假 快 速 检 测 的 研 究 进 展 [J]. 乳 品 科 学 与 科 技,2011,34(6): [ 3 ] 王 丹 慧, 王 春 苗, 李 梅, 等. 原 料 乳 及 乳 粉 中 糊 精 掺 假 的 检 测 方 法 [J]. 中 国 乳 品 工 业,2008,36(4): [ 4 ] Reid L M,Donnell C P,Downey G. Recent technological advances for the determination of food authenticity [ J]. Trends in Food Science & Technology,2006,17(7): [ 5 ] Logan J, Edwards K, Saunders N A. Real time PCR: current technology and applications[ M]. UK: Horizon Scientific Press, 2009: [ 6 ] Dalmasso A,Sacchi P,Bottero M T. Development of a real time PCR assay for the detection of cow and donkey milk [ J ]. European Food Research and Technology,2012,235(1): [ 7 ] López Calleja I,González I,Fajardo V,et al. Real time Taqman PCR for quantitative detection of cows milk in ewes milk mixtures [ J]. International Dairy Journal,2007,17(7): [ 8 ] Lopparelli R M,Cardazzo B,Balzan S, et al. Real time Taqman polymerase chain reaction detection and quantification of cow DNA in pure water buffalo mozzarella cheese:method validation and its application on commercial samples [ J ]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(9): [ 9 ] Dalmasso A,Civera T,Neve F L,et al. Simultaneous detection of cow and buffalo milk in mozzarella cheese by real time PCR assay [ J]. Food Chemistry,2011,124(1): [10] Mininni A N,Pellizzari C,Cardazzo B,et al. Evaluation of real time PCR assays for detection and quantification of fraudulent addition of bovine milk to caprine and ovine milk for cheese manufacture[j].
5 双 酚 A 对 小 鼠 睾 丸 组 织 的 损 伤 作 用 及 对 细 胞 凋 亡 的 影 响 包 汇 慧, 等 127 International Dairy Journal,2009,19(10): [11] 岳 巧 云, 陈 定 虎, 伍 朝 晖, 等. 实 时 荧 光 PCR 在 鉴 别 奶 粉 中 掺 入 大 豆 成 分 的 应 用 研 究 [J]. 食 品 科 学,2009,30(12): [12] 李 亮, 丁 武. 掺 有 植 物 性 填 充 物 牛 奶 的 近 红 外 光 谱 判 别 分 析 [J]. 光 谱 学 与 光 谱 分 析,2010,30(5): [13] 覃 芳 芳, 邓 鸿 铃, 郭 新 东, 等. 牛 奶 中 植 物 成 分 的 PCR 检 测 方 法 研 究 [J]. 食 品 科 学,2008,29(6): [14] 宁 淑 萍, 颜 海 飞, 郝 刚, 等. 植 物 DNA 条 形 码 研 究 进 展 [ J]. 生 物 多 样 性,2008,16(5): 论 著 双 酚 A 对 小 鼠 睾 丸 组 织 的 损 伤 作 用 及 对 细 胞 凋 亡 的 影 响 包 汇 慧 1,2, 佘 锐 萍 2, 耿 雪 1, 贾 旭 东 1, 田 纪 景 2, 夏 抗 抗 3, 高 贤 彪 2, 丁 叶 2, 肖 鹏 2, 杜 芳 2, 常 玲 玲 2, 岳 卓 2, 毛 晶 晶 2, 陈 建 2, 汪 会 玲 1 1, 支 媛 (1. 国 家 食 品 安 全 风 险 评 估 中 心 卫 生 部 食 品 安 全 风 险 评 估 重 点 实 验 室, 北 京 ; 2. 中 国 农 业 大 学 动 物 医 学 院, 北 京 ; 3. 北 京 市 丰 台 区 动 物 卫 生 监 督 所, 北 京 ) 摘 要 : 目 的 从 毒 性 病 理 学 角 度 了 解 双 酚 A(BPA) 对 小 鼠 睾 丸 组 织 病 理 损 伤 的 作 用, 为 研 究 BPA 毒 性 作 用 提 供 形 态 学 依 据 方 法 选 用 108 只 SPF 雄 性 CD 1 小 鼠, 称 重 后 随 机 分 为 4 个 剂 量 组 ( mg/ kg BW) BPA 经 口 染 毒 8 周, 取 睾 丸 组 织 固 定,HE 及 免 疫 组 化 染 色 后 进 行 光 镜 和 电 镜 观 察, 并 进 行 半 定 量 统 计 结 果 BPA 染 毒 8 周 后 与 对 照 组 比 较,BPA mg/ kg BW 组 小 鼠 体 重 降 低, 睾 丸 指 数 呈 现 下 降 趋 势 光 镜 观 察 发 现 BPA 染 毒 小 鼠 睾 丸 曲 精 小 管 支 持 细 胞 各 级 生 精 细 胞 变 性 坏 死 脱 落, 精 子 数 量 减 少 ; 透 射 电 镜 观 察 发 现 BPA 引 起 睾 丸 生 精 细 胞 出 现 核 固 缩 顶 体 囊 和 顶 体 帽 发 育 不 良 或 发 育 畸 形, 基 膜 增 厚 免 疫 组 化 检 测 结 果 表 明, 与 对 照 组 比 较,BPA 染 毒 组 小 鼠 睾 丸 组 织 NF κb 表 达 量 明 显 升 高 (P <0 01);BPA mg/ kg BW 剂 量 组 Caspase 3 表 达 量 明 显 升 高 (P < 0 01) TUNEL 检 测 表 明 BPA 染 毒 组 小 鼠 睾 丸 凋 亡 阳 性 信 号 与 对 照 组 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义 (P < 0 01) 结 论 上 述 结 果 表 明 经 口 染 毒 不 同 剂 量 BPA 对 小 鼠 睾 丸 组 织 均 产 生 了 不 同 程 度 的 损 伤, 诱 导 睾 丸 组 织 细 胞 凋 亡 关 键 词 : 双 酚 A; 小 鼠 ; 睾 丸 ; 经 口 毒 性 ; 病 理 损 伤 ; 细 胞 凋 亡 ; 食 品 污 染 物 ; 毒 理 学 实 验 中 图 分 类 号 :R155;R99;Q955 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2014) DOI: / j. cjfh Effects of bisphenol A on morphology and cells apoptosis of testicle in mice BAO Hui hui, SHE Rui ping, GENG Xue, JIA Xu dong, TIAN Ji jing, XIA Kang kang, GAO Xian biao, DING Ye, XIAO Peng, DU Fang, CHANG Ling ling, YUE Zhuo, MAO Jing jing, CHEN Jian, WANG Hui ling, ZHI Yuan ( Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Ministry of Health, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing , China) Abstract: Objective In order to investigate the effects of bisphenol A ( BPA) on testicle tissue of mice from toxicologic pathological perspective, and providd morphological evidences of BPA toxicity. Methods 108 SPF CD 1 male mice were randomly allocated into four groups with BPA concentration of 0, 100, 300 and 600 mg / kg BW. All BPA groups were administrated orally with different doses for 8 weeks continuously. Then testicles were taken and fixed to perform pathological observation and analysis. Results After 8 weeks of BPA administration, body weight and testicle index of BPA groups were decreased compared to control group. Degeneration and necrosis were observed in sustentacular cell of seminiferous tubule, and spermatozoon number decreased. Karyopyknosis and maldevelopment were occurred at acrosome vesicle and cap of spermatogenic cells observed by TEM. Immunohistochemistry test showed that NF κb and Caspase 3 expression were up regulated (P < 0 01 or P < 0 05) in BPA groups compared to control group. TUNEL test indicated that 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 教 育 部 长 江 学 者 和 创 新 团 队 发 展 计 划 支 持 项 目 (IRT0866); 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 (20B ) 作 者 简 介 : 包 汇 慧 女 助 理 研 究 员 研 究 方 向 为 毒 性 病 理 学 E mail:bhhdamao@ 126. com 通 讯 作 者 : 佘 锐 萍 女 教 授 研 究 方 向 为 动 物 病 理 学 分 子 黏 膜 免 疫 学 E mail:sheruiping@ 126. com
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