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1 中 国 农 学 通 报 204,30(26):27-32 Chinese Agricultural Science Bulletin 基 于 ITS 序 列 海 带 目 种 质 资 源 的 物 种 鉴 定 研 究 崔 翠 菊, 李 言, 张 立 楠, 潘 金 华, 李 晓 捷, 罗 世 菊, 孙 忠 民 2, 刘 延 岭, 田 萍 萍, 王 利 芹 ( 山 东 东 方 海 洋 科 技 股 份 有 限 公 司, 国 家 海 藻 工 程 技 术 研 究 中 心, 山 东 省 海 藻 遗 传 育 种 与 栽 培 技 术 重 点 实 验 室, 山 东 烟 台 ; 2 中 国 科 学 院 海 洋 研 究 所, 山 东 青 岛 26607) 摘 要 : 为 了 更 准 确 地 鉴 定 海 带 目 种 质 资 源, 为 种 质 保 存 和 保 护 提 供 依 据, 研 究 采 用 海 带 目 的 核 糖 体 DNA 内 转 录 间 隔 区 (Internal Transcribed Spacer,rDNA ITS 区 ) 的 通 用 引 物, 以 待 鉴 定 海 带 目 样 品 的 基 因 组 DNA 为 模 板 通 过 PCR 方 法 扩 增 出 ITS 序 列, 在 测 序 的 基 础 上 对 25 棵 分 别 采 自 日 本 和 烟 台 海 区 的 海 带 目 样 品 进 行 分 子 鉴 定 结 果 表 明,25 个 待 鉴 定 褐 藻 目 样 品 和 6 个 已 知 物 种, 通 过 ITS 序 列 聚 类 分 析, 分 别 聚 在 不 同 的 单 系 类 群 中 且 在 物 种 鉴 定 树 中 种 内 的 支 持 率 均 较 高, 分 属 于 2 科 3 属, 聚 类 为 7 个 不 同 的 种, 形 态 学 观 察 的 结 果 与 分 子 鉴 定 结 论 相 吻 合 海 带 目 ITS 序 列 引 物 通 用 性 强, 有 效 扩 增 率 高, 可 用 于 海 带 目 物 种 的 快 速 鉴 定 关 键 词 : 海 带 目 ;ITS 序 列 ; 物 种 鉴 定 中 图 分 类 号 :Q75 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 : Identification of Laminariales Germplasm Resources Based on Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence Cui Cuiju, Li Yan, Zhang Linan, Pan Jinhua, Li Xiaojie, Luo Shiju, Sun Zhongmin 2, Liu Yanling, Tian Pingping, Wang Liqin ( Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd, National Alage Project Technology Research Centre, Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province, Yantai Shandong ; 2 The Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao Shandong 26607) Abstract: The aims were to identify Laminariales germplasm resources accurately and provide the basis for germplasm conservation and protection. The universal primers of ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer (Internal Transcribed Spacer of rdna, ITS) were adopted to amplify the ITS sequences of the undetermined samples by PCR, on the basis of the sequencing, the molecular identification was carried out among 25 samples collected from Japan and Yantai sea area. The results showed that 25 undetermined samples and 6 known species were clustered in different groups by clustering analysis of ITS sequence. Within the species identification trees, the ratings are high. The 25 undetermined samples were clustered in three genera, two families and seven different species respectively. The results of morphological observation conformed to the molecular identification. The primers of Laminariales ITS sequence could be used in rapid species identification as its versatility and high efficient amplification rate. Key words: Laminariales; ITS sequence; species identification 基 金 项 目 : 国 家 863 重 大 项 目 基 于 全 基 因 组 信 息 的 藻 类 遗 传 选 育 (202AA0A406); 国 家 科 技 支 撑 计 划 海 藻 栽 培 新 种 质 苗 种 繁 育 与 栽 培 技 术 研 究 及 产 业 化 示 范 (202BAD55G0); 烟 台 市 科 技 发 展 计 划 项 目 药 用 和 食 用 海 藻 新 种 质 苗 种 繁 育 与 栽 培 技 术 研 究 及 产 业 化 示 范 (203LGS002) 第 一 作 者 简 介 : 崔 翠 菊, 女,984 年 出 生, 山 东 济 宁 人, 工 程 师, 博 士, 研 究 方 向 为 藻 类 遗 传 育 种 通 信 地 址 : 山 东 烟 台 莱 山 区 澳 柯 玛 大 街 8 号 东 方 海 洋 保 税 库 实 验 楼 303,Tel: , cuicuiju@63.com 收 稿 日 期 : , 修 回 日 期 :

2 28 中 国 农 学 通 报 0 引 言 海 带 目 (Laminariales) 是 褐 藻 纲 (Phaeophyceae) 藻 类 中 最 大 的 目 之 一, 其 中 的 海 带 属 藻 类 是 中 国 重 要 的 栽 培 海 藻, 海 带 从 20 世 纪 20 年 代 从 日 本 北 海 道 引 进, 至 今 也 有 90 多 年 的 历 史 [] 中 国 的 海 带 栽 培 在 生 产 应 用 中 取 得 了 很 大 的 进 展, 现 已 成 为 世 界 最 大 的 海 带 出 口 国 [2] 目 前 国 内 主 要 的 栽 培 品 种 大 都 是 用 最 初 从 日 本 引 进 的 真 海 带 进 行 杂 交 选 育 出 来 的, 现 在 市 场 对 具 有 不 同 优 良 性 状 的 品 种 的 需 求 越 来 越 多, 加 紧 具 有 不 同 优 良 性 状 的 新 品 种 培 育 成 为 现 在 的 重 要 任 务, 一 是 要 用 不 同 的 遗 传 育 种 手 段 对 现 有 的 种 质 资 源 进 行 性 状 改 良 ; 二 是 要 不 断 地 从 世 界 各 地 引 进 新 的 种 质 材 料 进 行 杂 交 选 育 因 此, 从 其 他 国 家 引 进 资 源 进 行 新 品 种 的 杂 交 选 育 是 最 直 接 有 效 进 行 品 种 改 良 的 方 法 由 于 海 藻 的 表 型 特 征 会 随 其 生 境 不 同 而 发 生 变 化, 仅 通 过 形 态 学 观 察 对 引 进 的 资 源 进 行 鉴 定 具 有 较 大 的 局 限 性 近 年 来, 随 着 分 子 生 物 学 和 生 物 信 息 学 技 术 的 发 展, 产 生 了 DNA 条 形 码 和 DNA 分 类 学, 基 于 DNA 条 形 码 的 分 类 系 统 在 一 定 程 度 上 克 服 了 传 统 的 外 部 形 态 学 在 分 类 中 的 缺 陷, 引 领 生 物 分 类 鉴 定 研 究 的 新 方 向 [3-4] 在 核 基 因 组 研 究 中, 核 糖 体 DNA 内 转 录 间 隔 区 (Internal Transcribed Spacer,rDNA ITS 区 ) 是 常 用 作 种 水 平 区 分 的 序 列 之 一, 在 漫 长 的 生 物 进 化 过 程 中,ITS 区 进 化 速 率 快, 在 大 部 分 真 核 生 物 中 具 有 广 泛 的 序 列 多 态 性, 在 GenBank 中 也 有 大 量 的 ITS 序 列 数 据 信 息, 亲 缘 关 系 较 近 的 2 个 种 都 能 通 过 ITS 序 列 进 行 区 分, 因 此, 研 究 人 员 常 将 ITS 序 列 应 用 于 物 种 的 鉴 定 和 进 化 [5-6] [7] 分 析 陆 地 植 物 中, 栗 丹 等 用 ITS 序 列 对 石 斛 材 料 [8] 进 行 鉴 定 及 系 统 进 化 分 析, 郑 方 圆 等 用 ITS 条 形 码 对 石 耳 属 物 种 进 行 快 速 鉴 定,ITS 序 列 也 用 于 西 红 柿 和 苦 荞 麦 的 种 质 资 源 鉴 定 和 亲 缘 关 系 分 析 [9-0] 在 褐 藻 的 应 用 中 也 有 相 关 报 道, 如 用 于 翅 藻 科, 海 带 科 与 巨 藻 科 之 间 的 进 化 关 系, 对 中 国 长 海 带 与 海 带 栽 培 品 系 的 进 化 关 系, 海 带 属 各 种 群 的 ITS 差 异 性 等 研 究 [-3] 研 究 以 2 棵 从 日 本 引 进 的 海 藻 和 4 棵 国 内 海 区 的 野 生 海 藻 为 实 验 材 料, 对 它 们 的 rdna ITS 序 列 区 进 行 PCR 扩 增, 测 序 及 序 列 分 析, 对 引 进 的 海 藻 资 源 进 行 分 类 鉴 定 与 聚 类 分 析, 从 分 子 水 平 上 为 后 续 的 种 质 资 源 保 存 和 杂 交 育 种 中 物 种 的 选 择 提 供 依 据 材 料 与 方 法. 样 品 采 集 及 DNA 提 取 2 棵 从 日 本 引 进 海 藻 于 202 年 2 月, 分 别 采 自 日 本 惠 山 室 兰 和 根 室 周 围 海 域,4 棵 野 生 海 藻 分 别 于 202 年 9 月 取 自 长 岛 和 烟 台 开 发 区 海 域, 各 取 其 健 康 藻 体 cm cm 大 小 组 织 块, 灭 菌 海 水 和 灭 菌 脱 脂 棉 擦 拭 干 净, 采 用 植 物 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 天 根, 中 国 ) 提 取 基 因 组 DNA,-20 保 存 备 用.2 ITS 区 片 段 的 PCR 扩 增 及 测 序 [4-5] ITS 区 片 段 引 物 参 考 褐 藻 目 ITS 扩 增 引 物 序 列, 由 上 海 捷 瑞 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成 引 物 序 列 为 : ITSF:5 -GGAAGGAGAAGTCTTAACAAGG-3 ITSR:5 -CTTTTCCTCCGCTTAGTTATATG-3 PCR 反 应 体 系 (50 μl): 灭 菌 双 蒸 水 35 μl,0 Buffer (+Mg 2+ ) 5 μl,dntp (2.5 mmol/l each) 2 μl, 引 物 ITSF 和 ITSR( 每 个 方 向 引 物 浓 度 为 0 μmol/l) 各 2 μl, 模 板 DNA 50 ng,taq DNA 聚 合 酶 U PCR 反 应 条 件 为 :94 预 变 性 5 min,94 变 性 min,45 退 火 45 s,72 复 性 2 min, 共 38 个 循 环, 72 延 伸 0 min,4 保 存 PCR 产 物 回 收 后 直 接 进 行 DNA 序 列 测 定 序 列 测 定 由 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 有 限 公 司 完 成.3 序 列 信 息 下 载 序 列 分 析 根 据 待 鉴 定 样 品 的 测 序 结 果 在 NCBI 数 据 库 中 的 初 步 比 对 结 果, 为 建 立 物 种 鉴 定 树, 从 GenBank 下 载 6 条 ITS 序 列, 共 5 个 种, 序 列 号 及 相 关 信 息 见 表 实 验 所 得 序 列 和 来 自 NCBI 的 序 列 用 Clustal X2 软 件 进 行 多 序 列 比 对, 用 MEGA 5.05 软 件, 选 择 Kimura-2 参 数 遗 传 距 离 (Kamura-2 parameter genetic distance), 用 NJ(Neighbor joining) 法 构 建 物 种 鉴 定 树, 系 统 树 各 分 支 的 置 信 度 用 bootstrap test 检 验, 共 进 行 000 次 循 环 2 结 果 与 分 析 2. 基 因 组 总 DNA 提 取 及 ITS 序 列 的 PCR 扩 增 应 用 上 述 方 法 提 取 的 部 分 待 鉴 定 海 藻 的 总 DNA 电 泳 图 谱 ( 图 A), 总 基 因 组 DNA 条 带 单 一 纯 净, 无 DNA 降 解, 无 蛋 白 和 RNA 污 染, 质 量 满 足 后 续 PCR 扩 增 的 要 求 应 用 褐 藻 ITS 序 列 引 物 进 行 PCR 扩 增 后 的 电 泳 图 ( 图 B),PCR 产 物 特 异 性 很 强, 条 带 清 晰, 只 出 现 一 条 带, 大 小 约 为 800 bp 2.2 物 种 鉴 定 树 的 建 立 测 序 结 果 经 手 动 编 辑, 去 除 大 小 亚 基 部 分 序 列 后 获 得 ITS 序 列, 包 括 ITS 5.8S ITS2, 长 度 变 化 范 围 在 658~702 bp 序 列 用 Clustal X2 软 件 比 对 后, 用 Mega 5.05 软 件 建 立 物 种 鉴 定 树 ( 图 2) ITS 序 列 可 以 将 待 鉴 定 的 25 棵 海 藻 较 好 的 区 分 开, 并 分 别 与 已 知 种 聚 在 一 起 4 条 ITS 序 列 基 本 聚 成 五 大 分 枝 :() 日 本 惠 山 采 集 的 hua 与 Alaria crassifolia 形 成 一 个 小 分 枝 ( 内

3 崔 翠 菊 等 : 基 于 ITS 序 列 海 带 目 种 质 资 源 的 物 种 鉴 定 研 究 29 表 从 NCBI 上 获 得 的 ITS 数 据 GenBank 序 列 号 物 种 属 科 AB Alaria marginata AF3900 Alaria crassifolia Alaria Alariaceae AF39002 Alaria esculenta AF3904 Laminaria digitata AF3905 Laminaria hyperborea AF3906 FJ Laminaria setchellii Laminaria yezoensis Laminaria FJ Laminaria solidungula AF3907 Laminaria sinclairii AF3908 Saccharina japonica AF3909 FJ Saccharina latissima Saccharina groenlandica Saccharina AY85789 Saccharina angustata AF39020 AB Saccharina sculpera Kjellmaniella crassifolia Saccharina AF39023 Arthrothamnus bifidus Arthrothamnus A 图 :~3 为 部 分 待 鉴 定 材 料,M,λDNA (50 ng);b 图 :C 为 阴 性 对 照,~3 为 A 图 中 对 应 材 料,M:DNA marker 图 部 分 待 鉴 定 材 料 的 基 因 组 DNA(A) 和 ITS 区 PCR 扩 增 产 物 (B) 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 部 支 持 率 95% ), 再 与 Alaria esculenta 和 Alaria marginata 一 起 形 成 单 系 类 群 ( 内 部 支 持 率 00%), 同 属 于 Alariaceae 科 Alaria 属 (2) 日 本 惠 山 采 集 的 HSZ-,HSZ-2,HSZ-4,HSZ-5,HSZ-6,HSZ-7,HSZ-8,2704 与 Saccharina angustata 聚 在 一 起 形 成 单 系 类 群 ( 内 部 支 持 率 98%); 在 烟 台 的 长 岛 和 开 发 区 海 域 分 别 采 集 的 changdao wild,slz-,slz- 2,kaifaqu wild, kaifaqu wild 2,kaifaqu wild 3 与 Saccharina japonica 聚 在 一 起 形 成 单 系 类 群 ( 内 部 支 持 率 88%); 采 集 自 日 本 根 室 的 25Z- 和 日 本 惠 山 的 26X 与 Saccharina latissima 在 一 起 形 成 单 系 类 群 ( 内 部 支 持 率 90%), 这 3 个 单 系 类 群 聚 为 一 大 分 枝 ( 内 部 支 持 率 00%), 同 属 于 科 的 Saccharina 属 (3) 采 自 日 本 根 室 的 mao zu 与 Athrothamnus bifidus 聚 在 一 起 形 成 单 系 类 群 ( 内 部 支 持 率 94%), 属 于 科 的 Athrothamnus 属 (4) 采 自 日 本 惠 山 的 HSLM- 4, HSLM- 5,HSLM- 8,LM yang,27lm02,27lm kuan 与 Kjellmaniella crassifolia 和 Saccharina sculpera 聚 为 一 分 枝 ( 内 部 支 持 率 为 99% ), 又 与 Saccharina groenlandica 结 合 形 成 单 系 类 群 ( 内 部 支 持 率 为 72%), 同 属 于 科 的 Saccharina 属 (5) 采 自 日 本 根 室 的 25-Z 与 Laminaria yezoensis 聚 为 一 枝 ( 内 部 支 持 率 为 99%), 结 合 Laminaria solidungula, Laminaria digitata,laminaria hyperborea,laminaria

4 30 中 国 农 学 通 报 setchellii,laminaria sinclairii 聚 成 一 大 分 枝 ( 内 部 支 持 率 89%), 同 属 于 科 的 Laminaria 属 其 中 第 (2)(3)(4)(5) 的 4 个 分 枝 同 属 于 科 研 究 待 鉴 定 的 25 个 样 品 和 6 个 从 数 据 库 下 载 的 序 列 均 为 褐 藻 纲 (Phaeophyceae) 海 带 目 (Laminariales) 在 之 前 的 分 类 研 究 中, 根 据 形 态 学,Kjellmaniella crassifolia 属 于 科 Kjellmaniella 属,2006 [5] 年 Lane 等 根 据 基 因 序 列 系 统 分 析 将 之 前 的 Laminaria 属 拆 分 为 Laminaria 和 Saccharina 两 个 属, 并 将 之 前 的 Kjellmaniella 属 归 于 Saccharina 属, 并 将 Kjellmaniella crassifolia 更 名 为 Saccharina sculpera 本 研 究 中 通 过 ITS 序 列 分 析 的 结 果 也 基 本 吻 合 图 2 25 棵 待 鉴 定 海 藻 与 6 个 已 知 物 种 的 ITS 序 列 的 物 种 聚 类 分 析 树

5 崔 翠 菊 等 : 基 于 ITS 序 列 海 带 目 种 质 资 源 的 物 种 鉴 定 研 究 种 间 及 种 内 的 遗 传 距 离 根 据 聚 类 分 析 树 可 以 看 出 待 鉴 定 的 25 个 样 品 分 属 于 海 带 目 的 2 个 科 ( Alariaceae)3 个 属 (Saccharina Laminaria Alaria) 的 7 个 种 (Saccharina angustata Saccharina latissima Saccharina japonica Athrothamnus bifidus Saccharina sculpera Laminaria yezoensis Alaria crassifolia) 采 用 Mega5.05 软 件, 基 于 Kamura-2 parameter 计 算 样 品 的 种 内 和 种 间 遗 传 距 离 结 果 表 明,hua 与 Alaria crassifolia 的 种 内 遗 传 距 离 为 0, 这 2 个 ITS 序 列 相 似 度 为 99%, 两 者 仅 有 个 碱 基 的 差 异 ; 与 Saccharina angustata 聚 类 在 一 起 的 8 个 样 品, 种 内 遗 传 距 离 平 均 值 低 于 0.00; 与 Saccharina japonica 聚 在 一 起 的 6 个 样 品, 分 别 来 自 日 本 室 兰 的 2 棵, 烟 台 开 发 区 海 域 的 4 棵 和 烟 台 长 岛 海 域 的 棵, 种 内 遗 传 距 离 均 为 0; 另 外,Saccharina latissima Athrothamnus bifidus Saccharina sculpera Laminaria yezoensis 这 几 个 种 的 种 内 遗 传 距 离 平 均 值 分 别 为 研 究 中 所 用 海 带 科 () 样 品 的 种 间 遗 传 距 离 平 均 值 为 0.04, 种 内 遗 传 距 离 平 均 值 为 0.002, 种 间 遗 传 距 离 是 种 内 的 20.5 倍 其 中 Saccharina sculpera 和 Kjellmaniella crassifolia 的 遗 传 距 离 为 0.009, 而 日 本 惠 山 采 集 的 6 个 样 品 LMyang 27LM02 27LMkuan HSLM- 5 HSLM- 8 HSLM- 4 之 间 的 遗 传 距 离 为 0, 它 们 与 Saccharina sculpera 和 Kjellmaniella crassifolia 的 遗 传 [6] 距 离 分 别 为 和 均 小 于 Hebert 等 推 荐 的 物 种 鉴 定 最 小 种 间 遗 传 距 离 0.02, 所 以 这 些 样 品 都 归 属 于 Saccharina sculpera 种 3 结 论 与 讨 论 研 究 对 采 自 日 本 的 2 个 海 藻 样 品 和 4 个 烟 台 周 边 海 区 的 样 品 进 行 物 种 鉴 定, 采 用 海 带 目 通 用 的 ITS 引 物 进 行 序 列 扩 增 和 测 定, 并 从 Genbank 数 据 库 中 下 载 6 个 已 知 海 带 目 种 类 的 ITS 序 列, 结 果 显 示,25 个 待 鉴 定 样 品 分 别 聚 类 在 不 同 的 单 系 类 群 中, 种 内 的 支 持 率 均 较 高 ( 图 2), 分 属 于 海 带 目 的 海 带 科 和 翅 藻 科 的 7 个 不 同 的 种 ( 表 ), 结 合 形 态 学 的 特 征, 可 以 准 确 地 鉴 定 这 些 种 质 资 源 应 用 ITS 序 列 对 引 进 的 海 带 目 种 质 资 源 进 行 分 子 鉴 定 有 效 可 行 由 于 中 国 不 是 海 带 原 产 国, 但 现 在 一 些 海 区 发 现 有 野 生 海 带 生 长 研 究 也 选 取 了 烟 台 周 边 的 长 岛 和 开 发 区 海 域 的 4 棵 野 生 海 带 进 行 物 种 鉴 定, 结 果 发 现, 这 4 棵 野 生 海 带 与 采 自 日 本 室 兰 的 2 棵 海 带 (SLZ- SLZ-2) 同 属 于 S.japonica, 也 是 目 前 国 内 的 主 要 栽 培 品 种, 可 知 这 些 海 带 并 非 野 生, 应 该 是 从 海 带 养 殖 区 漂 散 的 部 分 品 种 经 长 时 间 的 自 然 海 区 驯 化 而 来 的 在 形 态 上 与 养 殖 品 种 差 异 较 大, 但 ITS 序 列 没 有 变 化 这 说 明 自 日 本 海 带 引 进 中 国, 经 历 这 么 多 年 的 自 然 选 择, 其 ITS 序 列 并 没 有 发 生 明 显 变 异 这 部 分 研 究 结 果 与 汪 文 俊 [2] 等 的 结 论 一 致 采 自 日 本 惠 山 的 6 棵 海 藻 (LMyang 27LM02 27LM kuan HSLM-5 HSLM-8 HSLM-4) 从 形 态 学 上 观 察 符 合 笼 目 海 带 (Kjellmaniella crassifolia) 的 特 征, 经 ITS 序 列 鉴 定 确 实 与 笼 目 海 带 属 于 同 一 个 种 有 研 究 学 者 在 用 ITS 进 行 亲 缘 关 系 分 析 时 发 现,ITS 在 进 行 PCR 扩 增 时 个 别 个 体 会 出 现 多 态 性, 需 要 采 用 单 克 隆 测 序 法 进 行 ITS 序 列 的 测 序, 使 实 验 过 程 繁 琐 复 杂 [7] 但 在 褐 藻 目 样 品 的 分 析 中, 尚 未 发 现 此 类 问 题,25 个 样 品 的 扩 增 和 测 序 均 非 常 有 效 将 从 世 界 各 地 采 集 到 的 褐 藻 目 样 本, 提 取 DNA, 测 定 待 鉴 定 样 本 的 rdna-its 序 列, 与 NCBI 数 据 库 中 已 知 的 ITS 序 列 进 行 同 源 性 比 对, 下 载 相 似 度 高 的 已 知 物 种 ITS 数 据 信 息, 并 用 遗 传 分 析 软 件 进 行 物 种 鉴 定 树 的 建 立 和 遗 传 距 离 的 计 算, 可 以 快 速 鉴 定 未 知 样 [6] 品, 为 发 现 新 品 种 和 品 种 保 护 提 供 技 术 支 持 在 DNA 提 取 操 作 过 程 中, 有 时 会 引 入 外 界 基 因 的 污 染, 或 测 序 过 程 中 出 现 的 误 差, 都 有 可 能 会 影 响 鉴 定 结 果, 所 以 还 应 结 合 传 统 的 形 态 学 进 行 分 子 鉴 定 结 果 的 验 证, 才 能 得 出 更 为 准 确 的 结 论 参 考 文 献 [] 曾 呈 奎. 经 济 海 藻 种 质 种 苗 生 物 学 [M]. 济 南 : 山 东 科 学 技 术 出 版 社,999:-6. [2] Li B J, Shi Y Y, Yang G P, et al. Microsatellite DNA Variation of the Gametophyte Clones Isolated from Introduced Laminaria japonica (Phaeophyta) and L. longissima of China and Varieties derived from them [J]. Journal of Integrative Plant Biology,2008,50(3): [3] McDevit D C, Saunders G W. On the utility of DNA barcoding for species differentiation among brown macroalgae (Phaeophyceae) including a novel extraction protocol[j]. Phycological Research, 2009,57:3-4. [4] Vijayan K, Tsou C H. DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective[j]. Current Science,200,99(): [5] Inka B, Christian W, Kai B. The genus Laminaria sensu lato: recent insights and developments[j]. European Journal of Phycology,2008, 43():-86. [6] Alice V, Francois P, Pierre T. DNA barcoding for ecologists[j]. Trends in Ecology and Evolution,2009,24(2):0-7. [7] 粟 丹, 李 振 坚, 毛 萍, 等. 基 于 ITS 序 列 石 斛 材 料 的 鉴 定 及 系 统 进 化 分 析 [J]. 园 艺 学 报,202,39(8): [8] 郑 方 圆, 曹 叔 楠, 张 涛, 等. 石 耳 属 ITS 条 形 码 物 种 的 快 速 鉴 定 [J]. 菌 物 学 报,20,30(6): [9] 蒋 向 辉, 佘 朝 文, 许 栋, 等.ITS 序 列 在 西 红 柿 种 质 资 源 鉴 定 中 的 应

6 32 中 国 农 学 通 报 用 [J]. 中 国 农 学 通 报,200,26(5): [0] 邵 美 红, 吴 伟, 林 兵, 等.ITS 序 列 在 苦 荞 麦 种 质 资 源 鉴 定 中 的 应 用 [J]. 中 国 农 学 通 报,202,28(6):3-34. [] Yoon H S, Lee J Y, Boo S M, et al. Phylogeny of Alariaceae,, and Lessoniaceae (Phaeophyceae) based on plastidencoded Rubisco spacer and Nuclear- encoded ITS sequence comparisons[j]. Molecular Phylogenetics and Evolution,200,2(2): [2] 汪 文 俊, 王 广 策, 张 宝 玉, 等. 海 带 栽 培 品 系 和 长 海 带 ITS 区 的 PCR 扩 增 及 序 列 分 析 [J]. 高 技 术 通 讯,2005,5(4): [3] Yotsukura N, Denboh T, Motomura T, et al. Little divergence in ribosomal DNA internal transcribed spacer- and - 2 sequences among non- digitate species of Laminaria (phaeophyceae) from Hokkaido, Japan[J]. Phycological Research, 999,47(2):7-80. [4] Tai V, Lindstrom S, Saunders G W. Phylogeny of the Dumontiaceae (Gigartinales, Rhodophyta) and associataed families based on SSU rdna and internal transcribed spacer sequence data[j]. Journal of Phycology, 200,37: [5] Lane C E, Mayes C, Druehl L. A multi- gene molecular investigation of the kelp (Laminariales, Phaeophyceae) supports substantial taxonomic re- organization[j]. Journal of Phycology, 2006, 42: [6] Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L. Biological identifications through DNA barcodes[j]. Proceedings of the Royal Society B, 2003,270: [7] Lane C E, Lindstrom S C, Saunders G W. A molecular assessment of northeast Pacific Alaria species (Laminariales, Phaeophyceae) with reference to the utility of DNA barcoding[j]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2007, 44:

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